Выделение опухолевых стволовых клеток рака молочной железы с применением коллагеназы

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

Минздрав РФ

ФГБУ Ростовский научно-исследовательский онкологический институт

Ващенко Л.Н., Дашкова И.Р.

Кечеджиева Э.Э.

Аннотация

В работе дана оценка влияния режима культивирования ткани опухоли молочной железы с коллагеназой из гепатопанкреаса краба на показатели клеточного выхода, жизнеспособности полученных из ткани опухоли клеток и уровень экспрессии гликопротеинов CD24 и CD44, являющихся маркерами опухолевых стволовых клеток рака молочной железы. По данным проведенного исследования, фермент показал высокую эффективность по сравнению с простой механической диссоциацией ткани. Количество выделенных клеток увеличивалось пропорционально росту концентрации коллагеназы в среде, при этом жизнеспособность клеток не менялась и составляла около 50%, что почти на порядок больше, чем при механической диссоциации ткани. Тем не менее применение исследуемой коллагеназы для выделения опухолевых стволовых клеток возможно лишь с большой осторожностью, так как культивирование в растворе коллагеназы в течение 48 часов приводит к существенному уменьшению экспрессии CD24 и CD44, что может привести к снижению полноты и чистоты выделения таргетной популяции методами иммуномагнитного или флуоресцентно активированного клеточного сортинга. По результатам исследования рекомендовано применение комбинированного подхода к диссоциации ткани опухолей молочной железы, включающего сочетание механического измельчения ткани с культивированием в растворе исследуемого фермента, сокращенным до 12 и менее часов.

Filippova S.Yu., Sitkovskaya A.O., Sagakyants A.B., Bondarenko E.S., Vashchenko L.N., Kechedzhieva E.E., Dashkova I.R., Rostov research institute of oncology

Материал и методы исследования

Материалом для исследования послужил образец ткани рака молочной железы, полученный во время радикальной операции по удалению опухоли. Работа была одобрена этическим комитетом ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России, протокол №33/1 от 29.11.2018 г. Донор подписал информированное согласие. Ткань опухоли помещали в стерильный раствор Хэнкса («Биолот», Россия) в операционной непосредственно после иссечения и обрабатывали в течение 2 часов. В первый день производили измельчение ткани опухоли на фрагменты до 1 мм в диаметре при помощи стерильных хирургических лезвий, предварительно из образца удаляли участки некроза и здоровой ткани. Полученные фрагменты ткани опухоли равномерно распределяли на 4 чашки Петри диаметром 6 см и помещали в среду DMEM (Gibco, США) в следующих вариантах: без коллагеназы и с добавлением коллагеназы, полученной из гепатопанкреаса краба («Биолот», Россия, арт. 1.4.8.1), до конечной концентрации 150, 300 и 450 ед./мл.

Далее образцы культивировали 48 часов при 37°С и 5,5% СО2. Визуализацию и фотофиксацию образцов осуществляли через 24 и 48 часов. На вторые сутки производили выделение клеток из образцов опухоли с добавлением коллагеназы в соответствии со следующим протоколом.

1. К образцу добавляли 5 мл DMEM и производили энергичное пропускание размягченных фрагментов ткани через 10-мл наконечник (10 раз) и далее через 5-мл наконечник (10 раз).

2. Полученную суспензию, включая неразложившиеся остатки ткани опухоли, пропускали через нейлоновые фильтры с диаметром ячейки 70 мкм.

3. Трижды производили отмывку полученной клеточной суспензии в 5-кратном объеме буфера для сепарации клеток (MACS separation buffer, Miltenyi Biotech, Германия).

4. Подсчет клеток осуществляли в камере Горяева с 0,1% раствором трипанового синего под микроскопом инвертированным биологическим Leica DM IL LED.

Образец сравнения, который культивировали в отсутствие коллагеназы, измельчали в Medimachine (BD, США), и далее, начиная с п. 2, протокол выделения клеток не отличался от такового для образцов с коллагеназой.

Оценку влияния процесса ферментативной дезагрегации ткани на сохранность иммунофенотипа ОСК рака молочной железы (CD24low/"CD44+) производили на проточном цитометре BD FacsCanto II (BD, США) с антителами PE Mouse Anti-Human CD24 (клон ML5; BD, США) и FITC Mouse Anti-Human CD44 (клон G44-26; BD, США).

опухолевый стволовой клетка коллагеназа гепатопанкреас

Результаты исследования и их обсуждение

Рис. 1. Вид фрагментов ткани опухоли молочной железы в контроле и после инкубации с раствором коллагеназы в среде DMEM в трех концентрациях:

а - контроль без коллагеназы, культивирование 24 часа;

г - концентрация коллагеназы 150 ед./мл, культивирование 48 часов;

д - концентрация коллагеназы 300 ед./мл, инкубация 24 часа;

з - концентрация коллагеназы 450 ед./мл, культивирование 48 часов.

Чёрными стрелками обозначены единичные клетки, белыми стрелками обозначены фрагменты ткани. Увеличение х100

По мере увеличения срока культивирования отмечалось постепенное размягчение образцов ткани опухоли молочной железы, находившихся в среде с добавлением коллагеназы, при этом увеличивалось количество переходящих в среду клеток, росла вязкость раствора и уменьшалась его прозрачность. На фотографиях образцов видно, что увеличение концентрации коллагеназы ведет к резкому росту количества перешедших в раствор клеток (рис. 1).

Тем не менее полного разложения волокон коллагена на вторые сутки все же не произошло, и большая часть материала не поддалась дезагрегации даже при высоких концентрациях коллагеназы.

Подсчет клеток в камере Горяева показал, что общее количество выделенных клеток увеличивается с ростом концентрации коллагеназы почти экспоненциально. При этом по данным теста с трипановым синим жизнеспособность клеток с ростом концентрации коллагеназы существенно не меняется и составляет в среднем примерно 50%, что на порядок выше по сравнению с механической диссоциацией (4%) (табл.).

Таблица

Результаты подсчета клеток в камере Горяева с применением 0,1% раствора трипанового синего через 48 часов культивирования с коллагеназой и без нее

Увеличение количества выделяемых живых клеток тем не менее сопровождалось существенным уменьшением экспрессии маркеров ОСК рака молочной железы - трансмембранных гликопротеинов CD44 и CD24. По данным проточной цитометрии, спустя 48 часов после культивирования образцов ткани в растворе коллагеназы количество клеток, экспрессирующих CD44, уменьшается пропорционально концентрации фермента и в сравнении с контролем составляет от 3- до 10-кратного уменьшения в образцах с концентрацией коллагеназы 150 и 450 ед./мл соответственно (рис. 2а).

Рис. 2. Доля клеток опухоли, экспрессирующих поверхностные белки-маркеры ОСК после инкубации в течение 48 часов в растворах коллагеназы в сравнении с контролем.

Данные приведены для клеточной субпопуляции отрицательной по CD45 (общий лейкоцитарный антиген):

а - данные проточной цитометрии для CD44;

б - данные проточной цитометрии для CD24

Полученные данные говорят о том, что длительное культивирование с исследуемой коллагеназой оказывает негативное влияние на полноту выделения из ткани рака молочной железы клеток, обладающих фенотипом CD44+. Учитывая, что уровень экспрессии этого маркера в ткани опухоли изначально довольно низкий, таргетная популяция клеток может быть полностью потеряна при слишком жестких режимах ферментативной диссоциации. Кроме того, в исследуемых образцах наблюдается угнетение экспрессии CD24 по сравнению с контролем, что неизбежно приведет к снижению чистоты выделения субпопуляции с фенотипом CD24low/-CD44+. На гистограмме видно, что после культивирования с коллагеназой единый пик в области положительной экспрессии данного маркера разбивается на два и появляется выраженный пик, соответствующий отрицательной по данному маркеру популяции клеток (рис. 2б). Таким образом, длительная обработка ткани исследуемой коллагеназой может привести к контаминации выделенной отрицательной по CD24 фракции клетками, в действительности несущими фенотип CD24⁺.

Заключение

По результатам проведенного исследования можно сделать ряд выводов. Во-первых, культивирование ткани в растворе коллагеназы из гепатопанкреаса краба («Биолот», Россия) является более эффективным методом получения жизнеспособных клеток из ткани рака молочной железы по сравнению с простой механической диссоциацией и может быть применено для решения широкого круга исследовательских задач, где требуется получение большого количества клеток из послеоперационного материала. Во- вторых, так как жизнеспособность получаемых клеток остается постоянной при различных режимах обработки коллагеназой в диапазоне концентрации от 150 до 450 ед./мл и при культивировании от 24 до 48 часов, то итоговый протокол может быть модифицирован в широких пределах для получения наилучшего результата с учетом плотности ткани опухоли и возможности для обработки материала в лаборатории. В-третьих, как оказалось, применение исследуемой коллагеназы при длительной инкубации приводит к изменению иммунофенотипа ОСК рака молочной железы, что может отразиться на чистоте и полноте выделения субпопуляции CD24^low/-CD44⁺ методами иммуномагнитного или флуоресцентно активированного клеточного сортинга, и, как следствие, результаты последующих экспериментов с выделенными клетками опухоли могут быть скомпрометированы. Также мы предполагаем, что подобный тип ферментативной обработки с использованными нами реагентами и концентрациями, скорее всего, будет провоцировать слущивание и других поверхностных антигенов независимо от типа ткани. В качестве решения проблемы повышения клеточного выхода при сохранении поверхностных маркеров ОСК мы предлагаем применять укороченное культивирование ткани (до 12 часов) в растворе исследуемой коллагеназы в сочетании с низкоинтенсивной механической обработкой.

Список литературы

1. Colak S., Medema J.P. Cancer stem cells--important players in tumor therapy resistance. FEBS J. 2014. V.281. no. 21. P. 4779-4791.

2. Златник Е.Ю., Кит О.И., Новикова И.А., Ульянова Е.П., Сагакянц А.Б., Теплякова М.А., Егоров Г.Ю., Чупанов Г.М., Черникова Е.Н. Возможная роль стволовых опухолевых клеток в процессах метастазирования колоректального рака // Современные проблемы науки и образования. 2018. №6.

3. Lapidot T., Sirard C., Vormoor J., Murdoch B., Hoang T., Caceres-Cortes J., Minden M., Paterson B., Caligiuri M.A., Dick J.E. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 1994. V.367. no. 6464. P. 645-648.

4. Al-Hajj M., Wicha M.S., Benito-Hernandez A., Morrison S.J., Clarke M.F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V.100. no. 7. p. 3983-3988.

5. De Angelis M.L., Francescangeli F., Zeuner A. Breast Cancer Stem Cells as Drivers of Tumor Chemoresistance, Dormancy and Relapse: New Challenges and Therapeutic Opportunities. Cancers (Basel). 2019. V.11. no. 10. pII: E1569.

6. DA Cruz Paula A., Lopes C. Implications of Different Cancer Stem Cell Phenotypes in Breast Cancer. Anticancer Res. 2017. V.37 no. 5. P. 2173-2183.

Camerlingo R., Ferraro G.A., De Francesco F., Romano M., Nicoletti G., Di

7. Bonito M., Rinaldo M., D'Andrea F., Pirozzi G. The role of CD44+/CD24-/low biomarker for screening, diagnosis and monitoring of breast cancer. Oncol. Rep. 2014. V.31. no. 3. P. 1127-1132

Размещено на allbest.ru