Об'єкт дослідження: яєчники, ооцит-кумулюсні комплекси і яйцеклітини свиноматок, ембріони свиней, що були отримані in vitro.

Предмет дослідження: ядерне і цитоплазматичне дозрівання ооцит-кумулюсних компплексів свиноматок у різних культуральних середовищах, розвиток зигот свиней після запліднення in vitro.

При виконанні роботи використовували біотехнологічні (дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів, запліднення in vitro яйцеклітин, культивування зигот і зародків), морфологічні (оцінка яєчників, ооцитів, яйцеклітин, сперматозоїдів та ембріонів за морфологічними показниками) і цитогенетичні (аналіз мейотичного дозрівання гамет самиць та дроблення зародків) методи досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Проведений порівняльний аналіз використання різних поживних середовищ при дозріванні і заплідненні in vitro яйцеклітин свиноматок. Визначені терміни культивування, що необхідні ооцит-кумулюсним комплексам свиноматок для дозрівання поза організмом до різних стадій мейозу. Встановлені особливості мейотичного дозрівання гамет свиноматок у культуральному середовищі поповненому клітинами гранульози. Виявлена залежність кількості і якості ооцитів свиноматок від способу отримання їх з яєчників забитих тварин. Встановлений позитивний вплив використання змішаної сперми від різних кнурів при заплідненні in vitro яйцеклітин свиноматок.

Практичне значення одержаних результатів. Дослідження виявили можливість дозрівання поза організмом в різних поживних середовищах ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок з наступним їх заплідненням in vitro і отриманням ембріонів. Результати динаміки дозрівання гамет свиноматок дозволяють визначати стан хромосомного апарату клітин в любий проміжок часу культивування. Одержані результати мають цінність для поглиблення знання механізму і строків дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок і можуть бути використані в роботі біотехнологічних центрів і лабораторій, що займаються питаннями культивування і запліднення in vitro ооцитів ссавців.

Особистий внесок здобувача. Експериментальна робота, аналіз літератури, інтерпритація одержаних результатів, їх статистична обробка виконані автором особисто. Вибір напрямку та опрацювання методики досліджень проведені разом з науковим керівником. Із спільних досліджень використано свою частину роботи.

Апробація результатів дисертації. Одержані в експериментах наукові матеріали доповідалися і обговорювалися на щорічних засіданнях лабораторії генофонду порід сільськогосподарських тварин і аспірантських сесіях Інституту розведення і генетики тварин УААН (1995-1998 рр.), на конференціях: "Региональная конференция молодых ученых и специалистов".- Оренбург, 1997; "Интенсификация производства продукции животноводства в Республике Беларусь".-Жодино, 1998; Международной конференции молодых ученых "Творческое развитие научного наследия академика М.Ф.Иванова".- Аскания Нова, 1998; Третьей международной конференции “Актуальные проблемы биологии в животноводстве”.- Боровск, 2000.

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані у 9 друкованих працях.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 139 сторінках машинописного тексту, включає 16 таблиць та 17 рисунків. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалу і методики досліджень, результатів досліджень і їх обговорення, висновків і практичних пропозицій. Список літературних джерел включає 307 найменувань, в тому числі 161 іноземних авторів.

МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Досліди проводили на фолікулярних ооцитах, одержаних з яєчників свиноматок порід велика біла, українська степова біла і ландрас. Загальна схема досліджень наведена на рис.1. Яєчники в лабораторію привозили не пізніше1,5-2,5 годин після забою тварин у термосі з фізіологічним розчином (0,9% NaCl) та антибіотиками (100 од/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину) при температурі 32-38⁰С. В лабораторії яєчники двічі промивали свіжоприготовленим фізіологічним розчином. Ооцити отримували з яєчників двома шляхами: пункцією антральних фолікулів або надрізаючи лезом видимі антральні фолікули. Вимивали середовищем Дюльбекко з 1 од/мл гепарину ("Biochemi") і антибіотиками, виловлювали пастерівською пипеткою та оцінювали за морфологічними ознаками під контролем мікроскопу МБС-9. Для культивування використовували ооцити з щільним або частково розпушеним кумулюсом, гомогенною та тонкозернистою ооплазмою.

Процедуру дозрівання проводили в чотирьохлункових планшетах ("Costor") протягом 45 годин у накритих вазеліновим маслом краплях поживного середовища з 10% попередньо інактивованої (56⁰С, 30 хв.) фетальної сироватки корів ("Sera Lab."), 50 мкг/мл гентаміцину ("Reanal") з додатками гормональних [2,5 мкг/мл фолікулостимулюючого гормону ("Schering corporation"), 1,0 мкг/мл естрадіолу ("Serva"), 2,5 МОд/мл лютеінизуючого гормону ("Serva")] та енергетичних [2,0 мМ пірувату натрію ("Sigma") і 2,92 мМ лактату кальцію ("Sigma")] компонентів об'ємом 200 мкл на 20 клітин при температурі 38,5⁰С та 5% CO₂ у повітрі. В експериментах використовували 4 типи поживних середовищ: DMEM ("Sigma", кат. N D5648), M-199 ("Sigma", кат. N M2520), DME/Ham-F-12 ("Sigma", кат. N D8900), Ham-F-10 ("Sigma", кат. N N1387).

Гранульозу отримували з рідини фолікулів діаметром 2-5 мм. Фолікулярну рідину уміщували в центрифужні пробірки з культуральним середовищем, двічі центрифугували (3000 об/хв, 10 хв), кількість клітин гранульози визначали шляхом підрахування їх в гематоцитометрі, оцінку життєздатності перед постановкою на культивування проводили за допомогою вітального барвника - 0,4% трипанового синього ("Serva").

Для запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок використовували свіжоотриману сперму кнурів породи велика біла. Підготовку сперми до запліднення проводили за схемою, що запропонували Nagai T. et al. (1988).

Капацитацію сперматозоїдів здійснювали гепарином (100 од/мл) за методикою Parrish J.J. et al. (1988). Спільне інкубування яйцеклітин і сперматозоїдів проводили в термостаті при температурі 38,5⁰С, 5% СО₂ у повітрі, в краплях середовища Fert.-TALP. Після 10-18 годин спільного інкубування яйцеклітини і зиготи відмивали від прилиплої сперми і переносили в краплі середовища СDM для подальшого культивування протягом 72 годин.

На різних етапах культивування проводили цитогенетичний аналіз ооцитів і ембріонів. Цитогенетичні препарати готували за методом Tarkowski A.K. (1966) або Ushijima M. et al. (1988), забарвлювали 10% розчином Гімза ("Fluka") і досліджували під мікроскопом.

Вірогідність результатів досліджень обраховували за допомогою використання критеріїв Ст'юдента та Пірсона - “Хі-квадрат” (Плохінський М.О., 1969; Лакін Г.Ф., 1990)

Результати досліджень та їх аналіз

Дослідження деяких морфологічних параметрів яєчників свиноматок, різних способів отримання з них ооцитів. Сучасні методи біотехнології, такі, як трансплантація ембріонів, їх клонування та кріоконсервація, визначення статі зародків, отримання трансгенних ембріонів, дають змогу значно прискорити процес відтворення і зберегти цінний генетичний матеріал сільськогосподарських тварин, у тому числі й свиней. З'ясування певних закономірностей й розробка надійних методів прижиттєвої оцінки яєчників, фолікулів та ооцитів дозволить підвищити ефективність робіт з одержання ембріонів в умовах in vitro.

Проведеним аналізом п'яти морфологічних параметрів яєчників свиноматок (табл.1) та кількісного і якісного складу ооцитів, отриманих з яєчників свиноматок різними методами (табл.2) встановлено, що немає статистично вірогідної різниці (Р>0,05) між лівими і правими яєчниками свиноматок за такими показниками: довжина (32,8±5,3 проти 32,1±5,2 мм), ширина (23,6±4,5 проти 22,8±4,5 мм), товщина (16,6±3,6 проти 15,4±3,8 мм), об'єм (5,9±2,5 проти 6,3±2,8 мл), маса (6,5±2,8 проти 6,5±2,9 г). Також виявлено, що немає статистично вірогідної різниці за загальною кількістю ооцитів та за кількістю морфологічно нормальних клітин придатних для культивування (68,4% і 45,4% від загальної кількості, отриманих з лівих яєчників відповідно пункцією та надрізом антральних фолікулів проти 67,7% і 48,3% - з правих). Однак, незважаючи на те, що метод пункції антральних фолікулів дозволяє отримувати вірогідно більше (Р<0,01) в процентному відношенні морфологічно якісних, придатних для культивування ооцит-кумулюсних комплексів (67,7-68,4%) порівняно з іншим методом отримання (45,4-48,3%), все ж таки метод

Таблиця 5. Вплив клітин гранульози на мейотичне дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок

a:b, c:d- P<0,001

Таким чином, результати експериментів свідчать, що культивування ооцит-кумулюсних комплексів в середовищі М-199, поповненому клітинами гранульози, забезпечує більш оптимальні умови для дозрівання гамет свиноматок. В наступних наших дослідах використовували різні концентрації клітин гранульози в культуральному середовищі для вивчення характеру їх впливу на мейотичне дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок. Дані наведені в таблиці 6. При культивуванні ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок в середовищі М-199 поповненому клітинами гранульози в концентрації 1х10⁶ клітин/мл і 3х10⁶ клітин/мл (групи А і Б) протягом 48 годин стадії метафази-2 мейозу досягали відповідно 25/37, 67,6% і 47/62, 75,8% клітин. Кількість клітин з дегенерацією хромосомного матеріалу в цих експериментальних групах становила відповідно 4/37, 10,8% і 7/62, 11,3%.

Збільшення концентрації гранульозних клітин у середовищі М-199 до 6х10⁶ клітин/мл і 9х10⁶ клітин/мл (групи В і Г) призвело до того, що завершили мейотичне дозрівання відповідно лише 36/69, 52,2% і 27/56, 48,2% клітин, в той час як значно збільшилась кількість клітин (відповідно 19/69, 27,5% і 18/56, 32,1%) з хромосомними порушеннями порівняно з групами А і Б.

Таблиця 6. Використання різних концентрацій клітин гранульози у середовищі М-199 для дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок

a:b, c:d- P< 0,001

Таким чином, нами встановлений позитивний ефект використання клітин гранульози у поживному середовищі на етапі дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок. Найкращі результати за показниками кількості клітин з неушкодженим хромосомним апаратом і дозрілих до метафази-2 мейозу отримані при культивуванні ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок у середовищі 199 з додаванням клітин гранульози в концентрації 1-3х10⁶ клітин/мл.

Запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок, що дозріли поза організмом в різних поживних середовищах. Дослідження з дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок в середовищах DMEM, Ham-F-10, M-199, DME/Ham-F-12 виявили різну ефективність використання цих середовищ. Але найбільш об'єктивним критерієм повноцінного дозрівання ооцитів поза організмом, безумовно, є їх запліднення in vitro. Результати експериментів наведені в таблиці 7.

Таблиця 7. Запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок, що дозріли у різних культуральних середовищах

a:b, a:c, b:c- P< 0,001

Аналіз результатів досліджень виявив різний рівень дроблення гамет свиноматок після їх запліднення in vitro і культивування протягом 72 годин (в 1, 2, 3, 4 варіантах досліду відповідно 2,1;22,2;12,7; 17,2%). Звертає на себе увагу й той факт, що в варіантах досліду 2 і 4 не тільки вищий показник дроблення клітин порівняно з варіантами 1 та 3, але й вищий показник подальшого дроблення ембріонів (від 2-х клітинних), відповідно 58,3 і 42,9% проти 33,3 та 35,3%. Запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок, що дозріли поза організмом змішаною спермою від різних кнурів. Проблема підвищення запліднення in vitro яйцеклітин, що дозріли поза організмом за рахунок використання змішаних еякулятів сперми в біотехнології відтворення сільськогосподарських тварин не нова. Інтерес до цієї проблеми пов'язаний не тільки завдяки підвищенню ефективності запліднення in vitro, а й в першу чергу з питанням презиготичного відбору на рівні гамет. Ряд авторів (Кузьмина Т.И. и др., 1994.; Бабушкина И.А., 1995) спостерігали підвищення ефективності запліднення in vitro яйцеклітин корів.

В наших дослідах з запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок, що дозріли поза організмом використовували свіжі еякуляти трьох кнурів (Кроссі 123/7093, Теккі 13/107, Руссо 299) та змішану сперму, виготовлену перед капацитацією злиттям рівних об'ємів. Дані експериментів наведені в таблиці 8.

Таблиця 8. Використання змішаної сперми від різних кнурів при заплідненні in vitro яйцеклітин свиноматок

a:b, b:c- P< 0,01; a:c- P< 0,001

Аналіз результатів досліджень свідчить, що при використанні змішаної сперми від різних кнурів (групи А+В+С; А+В; А+С; В+С) дроблення яйцеклітин після запліднення in vitro було вірогідно вищим (відповідно 10/32, 31,3%; 8/38, 21,1%; 11/47, 23,4%; 8/41, 19,5%) порівняно з індивідуальним (групи А, В, С) використанням сперми цих кнурів (відповідно 9/52, 17,3%; 5/57,8,8%; 8/54, 14,8%). Привертає увагу й те, що подальший розвиток ембріонів (більше 2-х бластомерів) також був вищим (7,3-21,9%) після 72-х годинного культивування в групах А+В+С; А+В; А+С; В+С ніж у групах А, В, С (0-9,6%).

ВИСНОВКИ

1. Використання поживних середовищ DMEM, Ham-F-10, M-199, DME/Ham-F-12 як базових для приготування культуральних середовищ дозволяє в умовах in vitro у гамет свиноматок відновити і завершити їх мейотичне дозрівання та отримати після запліднення in vitro і подальшого культивування зародки свиней.

2. Культуральні середовища, виготовлені на основі поживних середовищ DMEM, Ham-F-10, M-199, DME/Ham-F-12, зумовлюють різну ефективність дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок. Рівень дозрівання гамет свиноматок до метафази-2 мейозу в середовищах М-199 (66,1%) і Ham-F-10 (60,3%) був вищим (P<0,05), а кількість клітин з хромосомними порушеннями (відповідно 14,3 і 12,1%) нижчою (P<0,001), ніж у середовищах DME/Ham-F-12 (56,2 і 23,3%) і DMEM (43,8 і 29,7%).

3. Культивування гамет свиноматок поза організмом в середовищі М-199, поповненому клітинами гранульози в концентрації 1-3х10⁶ клітин/мл, забезпечує більш оптимальні умови для їх дозрівання.

4. Стадії метафази-2 мейозу через 42-45 годин культивування досягають 58,3-62,1% ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок. Збільшення терміну культивування не призводить до збільшення кількості дозрілих клітин.

5. Метод надрізу видимих антральних фолікулів яєчників свиноматок порівняно з методом аспірації дозволяє отримувати з яєчника більшу (P<0,001) загальну кількість ооцитів (73,1-76,4 проти 17,7-19,8) та кількість ооцит-кумулюсних комплексів придатних для культивування (33,2-36,9 проти 12,1-13,4).

6. Рівень дроблення зародків (22,2%) і їх подальшого розвитку (58,3%) після запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок вищий (P<0,001) при використанні середовища М-199 для дозрівання гамет самиць.

7. Застосування при заплідненні in vitro змішаної сперми від різних кнурів підвищує (P<0,01) дроблення клітин на 3,8-22,5%.

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

1. Для вдосконалення методу дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок рекомендуємо використовувати поживні середовища M-199 і Ham-F-10 як базові культуральні середовища та додавати до них клітини гранульози в концентрації 1-3х10⁶ клітин/мл.

2. Для підвищення запліднення яйцеклітин свиноматок рекомендуємо застосовувати змішану сперму від різних кнурів на товарних фермах та в наукових установах, що займаються питаннями біотехнології відтворення сільськогосподарських тварин.

3. Результати досліджень можуть бути використані при викладанні лекцій з біотехнології, генетики, морфології, біології розвитку та відтворення сільськогосподарських тварин у ВУЗах країни.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ.

1. Гончарук О.П., Собко Ю.М., Гузеватий О.Є. Деякі морфологічні особливості яєчників і ооцитів свиноматок// Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць.- 1997.- Вип.2.-Ч.1.- С.146-149.

2. Гончарук О.П., Гузеватий О.Є. Використання різних поживних середовищ при культивуванні ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок// Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб.наук. праць.-1997.- Вип.3.- Ч.1.- С.228-231.

3. Гузеватий О., Гончарук О., Собко Ю. Динаміка дозрівання in vitro ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок// Тваринництво України.-1998.- N 1.- С.12-13.

4. Гузеватий О.Є., Гончарук О.П. Запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок, що дозріли в різних культуральних середовищах// Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць.-1999.- Вип.8.- Ч.2.- С.53-57.

5. Гузеватий О.Є., Гончарук О.П. Запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок змішаною спермою від різних кнурів //Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць.- 2000.- Вип.14.- С.28-31.

6. Гончарук О.П. Временные параметры мейотического созревания in vitro ооцит-кумулюсных комплексов свиноматок// Тезисы региональной конференции молодых ученых и специалистов.- Оренбург.- 1997.- Ч.2.-С.85-86.

7. Гончарук О.П., Гузеватый О.Е. Некоторые особенности культивирования in vitro ооцит-кумулюсных комплексов свиноматок// Интенсификация производства продукции животноводства в Республике Беларусь.- Жодино, 1998.- С.94.

8. Гончарук О.П. Використання клітин гранульози при культивуванні ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок //Молоді вчені - тваринництву.- К.: Аграрна наука, 2000.- С.95-97.

9. Гузеватый О.Е., Собко Ю.М., Гончарук О.П. Некоторые особености созревания и оплодотворения in vitro ооцит-кумулюсных комплексов свиноматок //Актуальные проблемы биологии в животноводстве.- Боровск, 2000.- С.393-394.

Размещено на Allbest.ru