Біотехнологія одержання і застосування екзогенної іммобілізованої глюкоамілази у годівлі молодняку великої рогатої худоби

Білоцерківський державний аграрний університет

УДК 636.2.035/.087.7]:573.6

03.00.20 - біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

Біотехнологія одержання і застосування екзогенної іммобілізованої глюкоамілази у годівлі молодняку великої рогатої худоби

Науковий керівник:

- доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент УААН, заслужений діяч науки і техніки України Герасименко Віктор Григорович, Білоцерківський державний аграрний університет, проректор з навчальної роботи

Офіційні опоненти:

- доктор ветеринарних наук, професор Нікітенко Анатолій Мефодійович, Білоцерківський державний аграрний університет, завідувач кафедри зоогігієни та основ ветеринарії

- доктор сільськогосподарських наук, професор Мазуренко Микола Олександрович, Вінницький державний сільськогосподарський інститут, завідувач кафедри технології виробництва продуктів тваринництва

Провідна установа: Державний науково-дослідний інститут ветеринарних препаратів і кормових добавок, м. Львів

Захист дисертації відбудеться " 27 " квітня 1999 року о 14-00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 27.821.01 в Білоцерківському державному аграрному університеті за адресою: 256400, м. Біла Церква, Соборна площа 8/1, в ауд. 11.

Автореферат розісланий " 26 " березня 1999 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,кандидат біологічних наук Розпутній О.І.

Ключові слова: ферменти, носії, іммобілізація, модельні досліди, велика рогата худоба, продуктивність, науково-господарські досліди, біохімічні показники, мікроелементи, ефективність.

Злочевский М.В. Биотехнология получения и использования экзогенной иммобилизованной глюкоамилазы в кормлении молодняка крупного рогатого скота. - Рукопись.

Ключевые слова: ферменты, носители, иммобилизация, модельные опыты, крупный рогатый скот, продуктивность, научно-хозяйственные опыты, биохимические показатели, микроэлементы, эффективность.

Zlochevski M.V. Biotechnology of obtaining and use of exogene immobilized glucoamylase for feeding young cattle. Handwriting.

Optimal parameters of the glucoamylase immobilization process, which were defined in the model experiments in vitro, are - the enzyme concentration 2 mg/ml (bearer - zeolite) and 1mg/ml (bearer- airpower); correlation: enzyme-bearer-liquid phase constitutes accordingly 20mg:1g:10ml (bearer - zeolite) and 10mg:0,5g:10mg (bearer - airpower); liquid phase content - acetate buffer or distilled water.

It is established that glucoamylase immobilization on such bearers as zeolite and airpower ensures exit of enzyme catalytic activity at the level of 64-65,9 and 67,7-68,2% accordingly.

Maximal output of enzyme activity was reached during glucoamylaze immobilization both on zeolite and airpower in the acetate buffer with pH 5,0.

Substitution of acetate buffer solution by distilled water during immobilization is not significantly decreasing the catalytic activity of enzyme preparation, but makes it more simple and cheap.

It is known that important denaturative factor influencing albumen, is pH of the alimentary tract content. That's why the resistance of immobilized and native glycoamylase against the influence of environments ranged from 1,5 to 8,0 pH was studied in the model experiments.

It is established that glycoamylase, immobilized on zeolite and airpower, both: in acetate buffer with pH 5,0 and distilled water - resistant in a wide range of pH environment and keeps its catalytic power under the pH figures, critical for the native form - in a very acid (pH 1,5) and alkaline (pH 8,0) environments. Native enzyme during such environment reaction is completely inactivated. It proves high stability of obtained bio-catalysts, which ensures their hydrolytic ability along all alimentary tract of an animal.

Comparison of glucoamylase stability data, immobilized on zeolite and airpower, testifies that zeolite as a matrix has advantages over the airpower when used as acetate buffer and over distilled water under the pH environment 2,0 and 6,5- 7,5, while airpower has advantages in the pH range 3,6-6,0. Thus the use of zeolite as a bearer for glucoamylase immobilization gives possibility to obtain a more universal bio-catalyst. Taking this in to account, the zeolite is used as bearer under the glucoamylase immobilization for creation of modified enzyme preparation for young cattle.

Evaluation of the obtained prolonged action bio-catalyst was done on the organism and tissue levels on the base of animal productivity indicators according to the state of biochemical parameters of blood, where the level of albumen, content of nucleic acids (DNA and RNA) aspartat activity and alanin-amino-transpherase, alkaline phosphatase and concentration of microelements in blood and hair cover of calves. It is established that young cattle diet enrichment with zeolite immobilized glucoamylase, activates bio-synthetic processes in the organism of calves, which is testified by the blood RNA concentration increase by 13,4% and 44,3%, increase of aspartat-amino-transpherase catalytic activity by 32,5% and 29,2% and catalase by 21,2% and 57%.

Use of stabilized glucoamylase in summer diets is positively influencing metabolism and copper\zinc deponing, which depicted by their quantity increase in calves' hair accordingly by 40,4 and 32%.

There was no significant influence established on concentration of magnesium, iron, copper and zinc in blood. Absence of changes in the activity of alkaline phosphatase is the evidence of normal run of bone tissue mineralization processes in young cattle.

Feeding young cattle with modified enzyme preparation of amylolythic action promotes the average day weight gain by 10-22,1% with the most efficient preparation in-mix with summer diet.

Key words: enzymes, bearers, zeolite, airpower, immobilization, model experiments, cattle, productivity, scientific-managerial experiments, biochemical indicators, microelements, efficiency.

Загальна характеристика роботи

висвітлити теоретичні принципи одержання біокаталізаторів пролонгованої дії шляхом іммобілізації і модифікації біологічно активних речовин;

виявити вплив різних факторів (природи носія, рН і іонної сили розчину, концентрації ферменту, складу рідкої фази) на процес іммобілізації;

визначити оптимальні параметри іммобілізації глюкоамілази Г 20х на різних носіях (цеоліті, аеросилі);

вивчити стійкість іммобілізованого на цих носіях ферменту in vitro при різних значеннях рН середовища, порівняно з його нативною формою;

зробити порівняльну характеристику властивостей нативного та іммобілізованого на різних носіях ферменту в умовах in vitro;

дослідити інтенсивність і спрямованість біосинтетичних процесів у організмі телят під впливом іммобілізованої глюкоамілази;

вивчити вплив одержаного модифікованого препарату амілолітичної дії на продуктивність молодняку великої рогатої худоби;

на основі одержаних результатів зробити висновки і дати пропозиції виробництву.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше шляхом іммобілізації глюкоамілази Г 20х на носії аеросилі одержано модифікований екзогенний ферментний препарат пролонгованої дії та визначено оптимальні умови для адсорбції ферменту на матриці.

Проведено вдосконалення технології іммобілізації глюкоамілази Г 20х на носії цеоліті шляхом заміни в рідкій фазі ацетатного буферного розчину з рН 5,0 на дистильовану воду, що підвищує технологічність і здешевлює процес одержання біокаталізатора без суттєвого зниження його стабільності і каталітичної активності.

Доведено, що іммобілізована форма ферменту зберігає досить високу ферментативну активність і є більш стійкою до денатуруючого впливу рН середовища. Це забезпечує гідролітичну здатність біокаталізатора на протязі усього шлунково-кишкового тракту тварин.

Вперше проведено вивчення ефективності використання іммобілізованої глюкоамілази на молодняку великої рогатої худоби. Виявлено, що застосування модифікованого ферменту сприяє інтенсифікації обмінних процесів в організмі тварин і підвищує їхню продуктивність.

Практичне значення одержаних результатів. Проведеними дослідженнями доведена можливість і доцільність використання біотехнологічних прийомів у вирішенні практичних завдань тваринництва.

Розроблено простий, доступний і дешевий спосіб модифікації екзогенного ферментного препарату амілолітичного спектру дії, який застосовується у тваринництві.

Заміна ацетатного буферного розчину з рН 5,0 на дистильовану воду у рідкій фазі при проведенні іммобілізації покращує технологічність і здешевлює процес одержання біокаталізатора.

Оцінка продуктивної дії одержаного препарату в науково-господарських дослідах дозволила рекомендувати модифіковану глюкоамілазу Г 20х як ефективну домішку до раціонів молодняку великої рогатої худоби з метою підвищення продуктивності тварин.

На основі одержаних результатів розроблено рекомендації щодо одержання та використання екзогенної глюкоамілази у годівлі молодняку великої рогатої худоби та методичні вказівки для проведення лабораторно-практичних занять з біотехнології іммобілізації ферментів для студентів зооінженерного факультету і факультету ветеринарної медицини.

Особистий внесок здобувача. Участь здобувача в отриманні наукових результатів, які покладено в основу дисертації, становить 80%. Автором особисто виконані експериментальні дослідження in vitro по одержанню біокаталізатора пролонгованої дії з використанням екзогенного ферментного препарату глюкоамілази Г 20х, а також здійснено організацію і проведення науково-господарських дослідів на молодняку великої рогатої худоби, біохімічні дослідження крові, статистичну обробку та аналіз одержаних результатів, обгрунтування і висновки. Наукова гіпотеза про підвищення стабільності екзогенних ферментних препаратів шляхом їх іммобілізації і можливість використання отриманих біокаталізаторів при інтенсивному вирощуванні молодняку великої рогатої худоби з метою повнішої реалізації генетичного потенціалу порід належить науковому керівнику член-кор. УААН Герасименку В.Г.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на засіданнях вченої ради зооінженерного факультету і факультету ветеринарної медицини Білоцерківського державного аграрного університету (1992-1997) та Інституту розведення і генетики тварин УААН (1993-1995), секції ветеринарної медицини Науково-технічної ради Мінагропрому України (1994-1997), республіканській науково-практичній конференції "Проблеми підвищення продуктивності тварин та ефективності їх лікування" (м. Дніпропетровськ, 1994), науково-практичній конференції "Вчені державного сільськогосподарського інституту - виробництву" (м. Біла Церква, 1994), Всеукраїнській конференції з фізіології і біохімії тварин (м. Львів, 1994), а також на спільному розширеному засіданні кафедр годівлі сільськогосподарських тварин і біотехнології, анатомії і гістології, зоогігієни та основ ветеринарії, мікробіології і вірусології, фізіології і патфізіології, органічної і біологічної хімії, хірургії, розведення і генетики тварин Білоцерківського державного аграрного університету 3 червня 1998 року.

Одержані результати використовуються у навчальному процесі при вивченні біотехнології на зооінженерному і факультеті ветеринарної медицини Білоцерківського державного аграрного університету.

Публікації. Основні положення і результати досліджень опубліковані у п'яти друкованих працях у вигляді наукових статей та рекомендаціях виробництву. глюкоамілаза ферментний раціон молодняк

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, експериментальної частини з результатами роботи, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків та пропозицій виробництву, списку використаної літератури. Текст викладений на 125 сторінках машинопису, містить 14 таблиць, 5 рисунків. Список літератури включає 312 джерел, у тому числі 71 - іноземних авторів.

Матеріали і методи досліджень. Робота виконувалась упродовж 1990-1998 рр. у проблемній науково-дослідній еколого-біотехнологічній лабораторії Білоцерківського державного аграрного університету і у лабораторії систем ведення тваринництва в Київській області Інституту розведення і генетики тварин УААН, а також у племзаводі "Терезине".

З теми дисертації проведено модельні експерименти і три науково-господарські досліди на молодняку великої рогатої худоби.

Для іммобілізації використовували глюкоамілазу Г 20х з активністю 1000 од/ г, що виробляється у промисловому масштабі на Україні Ладижинським заводом "Ензим". Як носії використовували цеоліт тонкого подрібнення сортів А Сокирницького родовища Закарпатської області та аеросил (пірогенний кремнезем).

Іммобілізацію глюкоамілази проводили методом адсорбції на цеоліті і аеросилі у ацетатному буфері з рН 5,0 та дистильованій воді при постійному перемішуванні упродовж 2 год. з послідучим відмиванням неадсорбованого ферменту шляхом центрифугування.

У науково-господарських дослідах в умовах виробництва іммобілізували глюкоамілазу на цеоліті, суспензованому у водному розчині ферменту із розрахунку на групу тварин, шляхом періодичного перемішування упродовж 4 год.

У модельних дослідах in vitro визначали оптимальні параметри іммобілізації глюкоамілази на цеоліті та аеросилі, а також вплив денатуруючих факторів на іммобілізований фермент. Оптимальне співвідношення фермент: носій: рідина встановлювали експериментально шляхом підбору різних концентрацій компонентів, при яких зберігалась найвища активність ферменту.

Залежність каталітичної активності глюкоамілази від рН середовища визначали після інкубації наважки ферменту упродовж 20 хв. при 370 у солянокислому розчині, ацетатному та фосфатному буферах у діапазоні рН 1,5 - 8,0. Величину рН використовуваних розчинів вимірювали на потенціометрі рН - 340.

Каталітичну активність глюкоамілази вивчали за її амілолітичною активністю, яку визначали за кількістю розщепленого крохмалю згідно ГОСТу 20264.- 4-89.

Властивості іммобілізованого ферменту оцінювали шляхом порівняння його активності з активністю нативної глюкоамілази.

У науково-господарських дослідах вивчали вплив іммобілізованої глюкоамілази на біохімічні показники та продуктивність молодняку великої рогатої худоби.

Для проведення науково-господарських дослідів були підібрані за принципом зоотехнічних аналогів телята чорно-рябої породи у віці 2-3-х місяців на початок експерименту з урахуванням віку, статі, живої маси та енергії росту. Досліди проводились методом збалансованих груп - аналогів з додержанням усіх методичних вимог постановки зоотехнічних експериментів (Овсянніков А.І., 1976) згідно схем (таблиця 1).

Кожному досліду передував підготовчий період тривалістю 20-30 днів, під час якого перевірялась однорідність підібраних тварин. Тривалість основного періоду складала відповідно для І досліду - 88 днів, ІІ - 102 і ІІІ - 93 дні.

Годівлю тварин здійснювали згідно норм ВАСГНІЛ (1985). При балансуванні раціонів за вмістом мікроелементів, використовувались дані власних досліджень кормів господарства.

Таблиця 1. Схема дослідів

Домішки нативної та іммобілізованої глюкоамілази, солей мікроелементів, яких не вистачало до норми, попередньо розчинені у воді, а цеоліт у сипучому вигляді вводили одноразово у концентровані корми при їх перемішуванні безпосередньо перед згодовуванням. Глюкоамілазу додавали в дозах, рекомендованих заводом-виробником із врахуванням її фактичної активності. Каталітичні активності нативного та іммобілізованого ферменту при додаванні їх до раціону були однаковими.

У основний період дослідів визначали динаміку живої маси тварин шляхом їх індивідуального зважування один раз на місяць.

З метою визначення спрямованості метаболічних процесів у організмі телят під дією домішок у кінці другого і третього дослідів було взято кров від шести голів з кожної групи і визначено деякі біохімічні показники.

Сироватку крові одержували центрифугуванням при 2000 об/ хв., а цільну кров стабілізували гепарином.

У сироватці крові визначали вміст загального білка за Lowry O.H. et al. (1951), активність амінотрансфераз за Пасхіною Т.С. (Покровський О.О., 1969), лужної фосфатази - методом Bodansky A. (Покровський О.О., 1969), каталази - методом Баха і Зубкової (Збарський Б.І. та ін., 1954).

У цільній крові знаходили концентрацію нуклеїнових кислот (ДНК і РНК) - за Цаневим Р.Г. та Марковим Г.Г. у модифікації Климова Н.М., Коромислова Г.Ф. (1970).

У крові, волосяному покриві і кормах досліджували вміст макро- та мікроелементів методом атомно-адсорбційної спектрофотометрії на спектрофотометрі С-302. Зразки попередньо висушували, потім озолювали у муфельній печі, поступово доводячи температуру до 4500 С (Хавезов І., Цалев Д., 1983).

Одержаний цифровий матеріал піддавали біометричній обробці методом Монцевічюте-Ерингене В.М. (1964).

Результати досліджень

Вивчення параметрів іммобілізації глюкоамілази Г 20х

У модельних дослідах in vitro визначені оптимальні умови іммобілізації екзогенного ферментного препарату амілолітичного спектру дії - глюкоамілази Г 20х. Обрані для цієї мети носії цеоліт і аеросил відповідають усім вимогам, які висуваються до цієї групи речовин, та що особливо важливо, вже знайшли застосування у годівлі сільськогосподарських тварин і виготовленні лікарських засобів.

При проведенні іммобілізації глюкоамілази на цеоліті було встановлено оптимальну кількість ферменту, здатного адсорбуватись на поверхні носія - 2 мг/мл розчину. При зменшенні концентрації спостерігали зниження активності іммобілізованої глюкоамілази; збільшення кількості ферменту призводить до того, що значна його кількість залишається у розчині і не використовується за призначенням.

Найвищу ємкість носія (цеоліту) було досягнуто, коли співвідношення фермент: носій (цеоліт) : рідка фаза складало відповідно 20 мг: 1 г: 10 мл при перемішуванні упродовж 2 годин.

Герасименком В.Г. і Бітюцьким В.С. (1991) було встановлено, що оптимальним для проведення іммобілізації глюкоамілази Г 20х на цеоліті є ацетатний буфер з рН 5,0. З метою спрощення і здешевлення технології одержання іммобілізованого препарату нами було проведено порівняльне вивчення ефективності процесу іммобілізації на ацетатному буфері з рН 5,0 і дистильованій воді.

Дослідами доведено збереження високої каталітичної активності ферменту при іммобілізації його у воді (64%); при застосуванні буферного розчину вихід каталітичної активності досягає 65,9%.

Нами в модельних дослідах також вивчалась можливість використання для іммобілізації глюкоамілизи аеросилу. Іммобілізацію проводили адсорбційним методом за схемою, яку було використано в експериментах з цеолітом.

Установлено, що оптимальною є концентрація ферменту 1 мг / мл розчину, яка при співвідношенні фермент: носій: розчин відповідно 10 мг: 0,5 г: 10 мл забезпечує найвищий вихід ферментативної активності у дистильованій воді і ацетатному буфері з рН 5,0 відповідно 67,7 та 68,2% у порівнянні з активністю нативної глюкоамілази. Істотної різниці у каталітичній активності іммобілізованого препарату при заміні буферного розчину на дистильовану воду не виявлено (68,2 проти 67,7%).

Час контакту ферменту з носієм при перемішуванні становить 2 години.

Вивчення стабільності іммобілізованої глюкоамілази in vitro

Експериментально підтверджено, що головною перевагою іммобілізованих ферментів над нативними формами є їх висока технологічність, яка проявляється більш високою стабільністю до денатуруючих чинників. При одержанні модифікованих ферментів, адаптованих до потреб тваринництва, важливим денатуруючим фактором є рН вмістимого шлунково-кишкового тракту.

У модельних дослідах вивчали стійкість іммобілізованої і нативної глюкоамілази до дії реакції середовища в діапазоні рН від 1,5 до 8,0.

Установлено, що глюкоамілаза, яка іммобілізована на цеоліті в ацетатному буфері з рН 5,0 і дистильованій воді, зберігає свою каталітичну активність при значеннях рН, критичних для нативної форми - у сильно кислому (рН 1,5) і лужному (рН 8,0) середовищах активність знаходиться відповідно на рівні 45 і 40% та 41,1 і 30%. Нативний фермент при такій реакції середовища повністю інактивується (рис. 1).

Аналогічні результати було одержано і при випробуванні стабільності глюкоамілази, іммобілізованої на аеросилі у буферному розчині з рН 5,0 і дистильованій воді (рис. 2). Іммобілізований фермент зберігає каталітичну активність відповідно на рівні 43,9 і 27,8% та 22,0 і 6,7%, тоді як нативна глюкоамілаза у цих умовах повністю втрачає свою активність.

Порівняння показників стабільності іммобілізованої глюкоамілази свідчить про те, що цеоліт в якості матриці має певну перевагу над аеросилом як при використанні ацетатного буферу, так і дистильованої води у сильно кислому (рН 1,5 - 2,0) та лужному (рН 8,0) середовищах, тоді як аеросил у діапазоні рН 3,6 - 6,0 (рис. 3, 4).

Ці властивості одержаних біокаталізаторів на основі екзогенного ферментного препарату глюкоамілази мають значення при вирішенні питання їх подальшого застосування. Взагалі, використання цеоліту у якості носія дає можливість створити більш універсальний препарат, який зберігає каталітичну активність у широкому діапазоні рН.

Отже, до вибору носія слід підходити диференційовано з урахуванням цільового використання препарату. З огляду на те, що метою наших подальших досліджень було одержання біокаталізатора для його використання у годівлі молодняку великої рогатої худоби, вибір зупинили на цеоліті.

Рис. 1. Залежність активності глюкоамілази нативної (1) та іммобілізованої на цеоліті в ацетатному буфері (2) і дистильованій воді (3) від рН середовища

Рис. 2. Залежність активності глюкоамілази нативної (1) та іммобілізованої на аеросилі в ацетатному буфері (2) і дистильованій воді (3) від рН середовища

Рис. 3. Залежність активності глюкоамілази, іммобілізованої на цеоліті (1) і аеросилі (2) в буферному розчині від рН середовища

Рис. 4. Залежність активності глюкоамілази, іммобілізованої на цеоліті (1) і аеросилі (2) у дистильованій воді від рН середовища

Примітка: * різниця вірогідна

Вплив іммобілізованої глюкоамілази на продуктивність телят

Інтегральним тестовим параметром впливу різних факторів на організм тварин є показники продуктивності. У трьох науково-господарських дослідах, які були проведені відповідно у літньо-осінній, зимовий і літній періоди, вивчали ефективність одержаного біотехнологічним шляхом модифікованого ферменту глюкоамілази, а також компонентів, які були вихідними при конструюванні цього біокаталізатора (нативної глюкоамілази і цеоліту) у годівлі молодняку великої рогатої худоби.

Примітка: * різниця вірогідна

Економічна оцінка ефективності використання іммобілізованої глюкоамілази

Размещено на Allbest.ru