Поліморфізм гетерохроматинових районів акроцентричних хромосом свиней

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА

УДК 636.4.082

Автореферат

Дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Поліморфізм гетерохроматинових районів акроцентричних хромосом свиней

Івашура Марина Миколаївна

03.00.15 - генетика

Харків - 1998

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії генетики Інституту тваринництва УААН

Науковий керівник: кандидат сільськогосподарських наук,

старший науковий співробітник,

Розсоха Володимир Іванович,

Інститут тваринництва УААН, завідувач лабораторією генетики

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Шахбазов Валерій Гайович,

Харківського державного університет,

Завідувач кафедрою генетики та цітології

кандидат біологічних наук,

Багацька Наталія Василівна

УНДІ охорони здоров'я дітей та підлітків,

старший науковий співробітник лабораторії медичної генетики

Провідна установа: Інститут свинарства УААН, м. Полтава

Захист відбудеться ” 22 ”_грудня 1998 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої Ради 65.356.01 при Інституті тваринництва УААН, 312120, м. Харків, п/в Кулиничі.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці інституту тваринництва УААН, 312120, м. Харків, п/в Кулиничі

Автореферат розісланий “ 20 “_листопада 1998 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Хватов А.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ефективність селекційної роботи у твариництві певною мірою обумовлюється генетичним потенціалом тварин, які використовуються для відтворення стада. Контроль відтворювальної здатності традиційними методами не дозволяє отримувати вичерпну інформацію про фактори, які впливають на запліднюваність та ембріональну життєздатність. Інтенсивні цитогенетичні дослідження виявили ряд показників, пов'язаних з проявленнями репродуктивної функції у тварин. Використання методів диференційного забарвлення хромосом обумовили важливі напрямки цитогенетичних досліджень. Специфічність неоднорідного забарвлення хромосомного матеріалу не тільки стала засобом надійної ідентифікації хромосомних пар, але й дозволила виявляти певні типи хромосомної організації: еухроматин та гетерохроматин. Особливості молекулярного складу та структури цих районів хромосом, а також їх взаємодія на різних етапах клітинних процесів є основою реалізації генетичної інформації. Райони структурного гетерохроматину характеризуються високою варіабельністю як в межах виду, так і в межах одного геному У структурі гетерохроматинових районів фрагменти багатоповторюваних послідовностей ДНК тісно пов'язані з матрицями деяких життєво важливих генів. За літературними даними, варіабельність гетерохроматинових районів може впливати на експресію генів, зокрема, в ембріогенезі.

Тому дослідження поліморфних варіантів хромосом та пошук зв'язків між цитогенетичними показниками та репродуктивними якостями свиней має значення як для теорії, так і для практики свинарства. Стабільність морфологічних типів хромосом викликає інтерес з точки зору існування природних хромосомних маркерів. В зв'язку з цим, удосконалення існуючих методів досліджень та розробка нових підходів до циитогенетичного аналізу є важливим та необхідним етапом у вивченні поліморфізму хромосом.

Дослідження хромосом свиней, забарвлених як рутинним, так і диференційним С-методом, надають важливу інформацію про стан геному, яка може використовуватись при вирішенні проблем практичної селекції.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є складовою частиною науково-технічної комплексної програми “Продовольство-95” завдання П.04.02 “Розробити ефективну систему контролю, оцінки, спрямованої зміни та збереження генетичної структури та потенціалу популяцій свиней на основі використання імуногенетичних та цитогенетичних методів” на 1991-1995 рр. (№ держ. реєстрації 0196U01390 ).

Мета та задачі досліджень. Дослідження С-поліморфізму хромосом свиней проводилось з метою визначення взаємозв'язку між варіабельністю гетерохроматинових районів та репродуктивною функцією тварин та вивчення можливостей використання цитогенетичних показників у практичній селекції. Для досягнення поставленої мети вирішувались такі завдання:

Розробити модифікацію диференційного С-методу забарвлення хромосом свиней.

Розробити критерії візуальної оцінки гетерохроматинових районів на акроцентричних хромосомах свиней.

Вивчити можливість дослідження диференційно забарвлених хромосом з використанням комп'ютерної техніки.

Вивчити локалізацію та межі варіабельності гетерохроматинових районів на хромосомах свиней порід велика біла та ландрас.

Вивчити взаємозв'язок С-поліморфізму хромосом з репродуктивною функцією свиней.

Порівняти частоту та спектр спонтанних мутацій у носіїв поліморфних варіантів хромосом.

Вивчити вплив варіабельності прицентромірного гетерохроматину на реалізацію асоціацій акроцентричних хромосом.

Провести пошук маркерних хромосом та вивчити їх успадкування.

Наукова новизна одержаних результатів. Визначено оптимальні умови С-сегментації на хромосомах свиней. Розроблено критерії напівкількісної оцінки розмірів С-блоків на акроцентричних хромосомах за 5-бальною шкалою. На основі розробленого методу досліджено межі варіабельності районів прицентромірного С-гетерохроматину та визначено частоту поліморфних варіантів хромосом 13-18 у свиней порід велика біла та ландрас. Розроблено спосіб та обладнання для візуалізації та комп'ютерної обробки мікрозображень хромосом. Використання програмно-апаратного комплексу дозволяє каріотипувати хромосоми, забарвлені як рутинним, так і диференційними методами. Досліджено зв'язок між С-поліморфізмом хромосом та відтворювальними якостями свиней, а також вплив різних комбінацій поліморфних гомологів на хромосомну нестабільність у лейкоцитах крові.

Практичне значення отриманих результатів. Результати вивчення зв'язку С-поліморфізму хромосом з проявами репродуктивної функції свиней, а також з нестабільністю геному на клітинному рівні, є важливою частиною загального цитогенетичного тестування сільськогосподарських тварин, і можуть використовуватись при вирішенні певних селекційних задач. Розроблені критерії візуального аналізу дозволяють проводити експрес-оцінку поліморфних С-вариантів хромосом. Використання напівавтоматичної системи для обробки мікрозображень хромосом та каріотипувння є ефективним методом при проведенні масштабних досліджень стану геному сільськогосподарських тварин, а також є необхідною умовою створення банку даних племінних тварин. Розроблена модифікація С-методу дозволяє отримувати якісне С-забарвлення на хромосомах свиней без порушення морфології хромосом.

Особистий внесок здобувача. Дисертант переважну частину робіт виконав самостійно. Методологія та схема досліджень розроблені разом з науковим керівником. Із загальних наукових експериментів та публікацій дисертант використав за згодою співавторів тільки свою частину результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на Вченій раді інституту тваринництва УААН, науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Наукові розробки агропромислового комплексу” Нижні Ворота, 1993; першій науковій конференції молодих вчених та спеціалістів “Селекційно-біотехнологічні методи використання генетичного потенціалу сільськогосподарських тварин”, Київ, 1994р.; другій міжнародній конференції “Молекулярно-генетичні маркери”, Київ, 1996р.; конференціях молодих вчених та спеціалістів ( Харків, 1996р., Харків, 1998р).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладено у 11 друкованих працях. у тому числі 3 статтях у фахових виданнях, затверджених ВАК України, та 8 тезах доповідей науково-практичних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 150 сторінках машинописного тексту, вміщує 18 таблиць та 18 рисунків. Список літератури складається з 243 джерел, у тому числі 162 на іноземних мовах.

МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проводились у лабораторії генетики Інституту тваринництва УААН на племінному поголів'ї свиней д/г “Українка”, Будьонівського племзаводу та Дніпропетровського СГЦ у період з 1991 по 1995 р. Локалізацію С-блоків гетерохроматину проводили на хромосомах 25 кнурів, 27 свиноматок та 33 поросят (віком до 2 місяців) порід велика біла та ландрас. Забір крові, культивування лейкоцитів та виготовлення препаратів хромосом проводили за загальноприйнятими методиками. Для виявлення районів структурного гетерохроматину на хромосомах свиней використовували С-метод забарвлення у модифікації . Оцінку поліморфних С-варіантів акроцентричних, хромосом проводили за результатами візуального каріотипування з використанням напівкількісного методу.

Облік спонтанних хромосомних аберацій проводили на препаратах хромосом, забарвлених рутинним способом барвником Гімза, згідно методичних рекомендацій, розроблених у лабораторії генетики (Мет. рек., Харків, 1990). Від кожної тварини аналізували по 50 метафаз. Анеуплоїдія (N2) та поліплоїдія складали рівень геномних мутацій. Структурні аберації були представлені порушеннями хромосомного та хроматидного типу, а також чисельною фрагментацією хромосом. Для вивчення взаємозв'язку С-поліморфізму хромосом з їх асоціативною здатністю проводили аналіз частоти та спектру асоціацій акроцентричних хромосом (ААХ) у зв'язку з наявністю поліморфних хромосомних варіантів, а також їх комбінаціями. Аналіз препаратів хромосом проводили у системі світового мікроскопу ”Jenaval” (Zeiss, Німеччина) з масляною імерсією при збільшуванні 10х100. Мікрозйомка окремих метафазних платівок проводилась на мікроплівку “Мікрат-200”. Для візуалізації та комп'ютерної обробки мікрозображень хромосом використовували розроблений у лабораторії генетики програмно-апаратний комплекс для каріотипування хромосом сільськогосподарських тварин.Цифровий матеріал обробляли методами варіаційної статистики при використанні пакету програм аналізу даних STADIA.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Дослідження етапів диференційного С-барвлення хромосом свиней. Дослідження хромосом з використанням методів диференційного забарвлення є важливою частиною цитогенетичного тестування. Вивчення взаємозв'язку С-поліморфізму хромосом з продуктивними якостями тварин, а також можливість використання природних хромосомних маркерів, представляється актуальним напрямком дослідницької роботи. Проте, в зв'язку з складністю та низькою відтворюваністю результатів С-забарвлення, цей метод не отримав поширення у цитогенетичних дослідженнях сільськогосподарських тварин. Недоліком С-методики вважається значна денатурація хромосомного матеріалу в результаті дії лужних та сольових розчинів. Для отримання якісного С-забарвлення та збереження морфології хромосом доводиться ємпірично підбирати умови, змінюючи як хімічні, так і фізичні показники діючих агентів. Тому виникла необхідність проаналізувати основні етапи С-методу та визначити оптимальні умови С-забарвлення хромосом свиней.

Найбільш ефективними виявилися послідовності обробок, які включали лужну передобробку препаратів. Проведення м'якої денатурації з використанням гідроксида барію дозволяло досягнути С-сегментації, уникаючи сильного порушення хромосом у порівнянні з результатами обробки гідроксидом натрію. При інкубації препаратів у стандартному сольовому розчині (SSC) переважне значення мав показник pH. Визначено, що зміна цього показника у лужну сторону (рH 8,5) виявилася оптимальною для отримання якісного С-забарвлення на хромосомах свиней. Для найкращої стабілізації хромосомного матеріалу запропоновано використання буферно-спиртової суміші. Інкубація препаратів у сольовому розчині з додаванням 5 мл 96%-ного етанолу на 100 мл 2хSSC при pH 8,5 дозволяє значно краще зберегти морфологію хромосом, навіть при необхідності збільшити час дії або температуру буферного розчину.

В результаті дослідження основних етапів С-методики визначено найбільш важливі фактори, які впливають на стан хроматину у період передобробки препаратів, та розроблено модифікацію цього метода для отримання якісного С-забарвлення на хромосомах свиней. Основними моментами запропонованої послідовності обробок є м'яка денатурація гідроксидом барію (5%-ний Ba(OH)2, 500С) та інкубація у буферно-спиртовому розчині 2хSSC при pH 8,5 (2-4 г., 650С).

2. Аналіз С-поліморфізму хромосом свиней візуальним та комп'ютерним способом. У дослідженнях С-поліморфізму хромосом важливою проблемою залишається об'єктивна оцінка розмірів С-блоків гетерохроматину на хромосомах свиней. У практиці медичної генетики для аналізу варіабельних С-блоків гетерохроматину використовують напівкількісні методи оцінки, які дозволяють визначати відносні розміри С-блоків візуальним способом. На основі аналогічних методичних підходів були розроблені критерії напівкількісної оцінки С-блоків на акроцентричних хромосомах свиней., розміри С-блоку визначали візуально як відношення його довжини до довжини плеча і оцінювали за 5-бальною шкалою. Межі відносної довжини поліморфних С-блоків наведені у табл.1. Згідно з критеріями напівкількісного методу абсолютна довжина сегменту хромосоми, який відповідає одній умовній одиниці розміру (1 бал), становить 0,4-0,5 мкм при спіралізації хромосом середнього ступеня. Від кожної тварини аналізували по 11 метафаз, для оцінки розміру С-блоків у ряді спостережень визначали значення медіани (Ме). Така система аналізу дозволяє урахувати ступінь спіралізації хромосом та провести корекцію результатів візуальної оцінки.

Вимірювання морфометричних параметрів варіабельних районів С-гетерохроматину на хромосомах свиней проводилось комп'ютерним способом. Мікрофотографії хромосом, забарвлених по С-методу, оброблювали з допомогою планшетного сканера SCAN JET програмою DESK SCANER. Розміри С-блоків визначали у вигляді коефіцієнтів, які показували відношення середнього діаметру С-блока до довжини реперної хромосоми 18. Порівняння результатів оцінки розмірів С-блоків у балах з розрахованими коефіцієнтами не визначило статистично вірогідної різниці (Р<0,05) між результатами двох методів, що свідчить про відносну адекватність оцінки поліморфних С-блоків як комп'ютерним, так і візуальним способом. Проте, певну різницю величини коефіцієнтів можна використовувати при детальному аналізі структурно-морфологічних параметрів гетерохроматинових районів.

Таблиця 1

Критерії напівкількісної оцінки розмірів С-блоків на акроцентричних хромосомах свиней

Експериментальні дослідження показали, що ефективність комп'ютерної обробки мікрозображень хромосом, отриманих за допомогою планшетного сканеру, обмежена якістю мікрофотографій. В зв'язку з трудомісткістю та складністю обробки фотографічного матеріалу актуальною є розробка методів, які дозволяють проводити візуалізацію зображень хромосом без фотографування мікрооб'єктів.

Для реалізації такого методу нами спільно з фірмою “Оптрон”(м. Київ) було розроблено та виготовлено програмно-апаратний комплекс для каріотипування хромосом сільськогосподарських тварин. Схема напіватоматичної системи візуалізації мікрооб'єктів наведена на рис. 1.

Мал.1. Блок-схема установки для напівавтоматичного каріотиаування. 1- конденсор з освітлювачем, 2 - координатний столик мікроскопу, 3- препарат, 4- мікроскоп, 5 - відеокамера, 6- відеопорт, 7- персональний комп'ютер

Система змонтована на базі мікроскопу “Люмам-И2”. Основною складовою частиною є відеокамера 5, яка за допомогою відеопорту 6 підключається до ПЕОМ 7. Використання цього обладнання дозволяє досліджувати хромосоми, забарвлені як рутинним, так і диференційним способом. Зображення хромосом за допомогою відеокамери транслюється з мікропрепарату до ПЕОМ та виводиться на екран монітору. Після обробки зображень формується файл початкових даних, в якому знаходяться графічні параметри мікрооб'єктів.

Важливим етапом цитогенетичних досліджень є каріотипування хромосомного набору. Для вирішення цієї задачі нами спільно з фірмою “Оптрон”(м.Київ) було розроблено оригінальне програмне забезпечення. Розробка програми KARYOTYPE була принципово спрямована на інтерактивний режим роботи, що дозволяє оператору-досліднику контролювати та швидко проводити корекцію всіх етапів аналізу. Каріотипування хромосом проводиться у напівавтоматичному режимі. Передбачена можливість редагування каріограми: корекція положення центроміри, підбор гомологічних хромосом.

Використання комп'ютерної техніки у цитогенетичних дослідженнях сільськогосподарських тварин не тільки дозволяє значно підвищити ефективність методів мікродосліджень, але і є необхідним при створенні банку даних племінних тварин. Проте, розробка методів візуального аналізу, які можна використовувати не тільки у спеціалізованих лабораторіях з коштовним обладнанням, також представляється доцільною.

3. Варіабельність районів структурного гетерохроматинуна акроцентричних хромосомах свиней.Аналіз літературних даних показав, що поліморфізм С-блоків гетерохроматину на хромосомах свиней виявлено у багатьох дослідженнях. Проте, характеристика параметрів цієї мінливості обмежена, тоді як варіабельність районів С-гетерохроматину обумовлює структурну неоднорідність хромосомного матеріалу, що слід брати до уваги при вирішенні селекційних задач. Дослідження забарвлених по С-методу хромосом свиней показали, що найбільш великими та варіабельними є блоки С-гетерохроматину на акроцентричних хромосомах. икористовуючи критерії напівкількісного методу оцінки провели дослідження варіабельності районів структурного гетерохроматину на акроцентричних хромосомах свиней порід велика біла та ландрас. Частота поліморфних С-варіантів хромосом 13 - 18 наведена у табл. 2.

В результаті аналізу частоти морфологічних С-типів акроцентричних хромосом визначено, що найчастіше поліморфні блоки С-гетерохроматину локалізувалися на хромосомах 13, 15, 16 та 18. Найбільшою варіабельністю С-гетерохроматинового району характеризувалася хромосома 16, частота хромосомних варіантів з великими С-блоками ( 3-5 балів) складала 45,8%.

Таблиця 2.

Частота (%) С-варіантів акроцентричних хромосом у свиней (n=45, велика біла та ландрас)

№	Розміри С-блоку гетерохроматіну
хромосоми	1 бал	2 бали	3 бали	4 бали	5 балів
13	5.56	67.26	25.0	0	0
14	54.44	42.22	3.33	0	0
15	7.78	22.22	31.11	6.67	0
16	13.19	40.28	34.03	10.42	1.39
17	85.56	12.22	2.22	0	0
18	67.78	14.44	7.78	5.56	0

Порівняння частоти поліморфних С-варіантів хромосом 13, 15, 16 та 18 у свиней порід велика біла (n = 36) та ландрас (n = 34) показало, що за варіабельністю С-гетерохроматина представники двох порід практично не відрізняються. Невелика різниця у частоті хромосомних варіантів 16 та 18 з маленькими С-блоками (1 бал ) може свідчити про початок накопичення певних хромосомних С-варіантів у досліджуваних породних групах тварин (Р<0,01). Дослідження розподілу морфологічних С-типів хромосом 13, 15, 16 та 18 у свиноматок та кнурів двох порід також не визначили помітної різниці по частоті поліморфних С-блоків між тваринами різної статі, що дозволяє вважати функціональне значення варіабельних районів С-гетерохроматину акроцентричних хромосом нейтральним у відношенні до статі свиней.

В результаті досліджень визначено, що варіації С-гетерохроматинової частини геному обумовлені переважно поліморфізмом хромосом 13, 15, 16 та 18. Відсутність значної різниці у розподілі поліморфних С-варіантів хромосом між кнурами та свиноматками порід велика біла та ландрас дозволяє вважати варіабельність районів С-гетерохроматину нейтральною характеристикою як у відношенні до статі свиней, так і в породному аспекті.

4.Взаємозв'язок С-поліморфізму акроцентричних хромосом з репродуктивною функцією свиней. Поліморфізм районів структурного гетерохроматину спостерігається не тільки в межах одного виду, але й в межах одного геному. Гомологічні хромосоми, С-блоки яких відрізнялися за розмірами, вважаються гетероморфними, при цьому розрізнювали гетероморфізм слабкого (1 бал) та сильного ступеня (2-3 бали).

Проведено аналіз основних показників відтворювальної здатності свиней (n=48) порід у зв'язку з наявністю у геномі поліморфних С-варіантів хромосом 13, 15, 16 та 18, а також комбінаціями гетероморфних гомологів. Дослідження показало, що носії великого С-блоку (3-5 балів) на хромосомі 16 характеризувались вірогідно вищим (Р<0,05) показником багатопліддя (10,00,23) у порівнянні з носіями маленьких С-блоків (9,00,61). Порівняння відтворювальної здатності свиней, що характеризувались гетероморфізмом гомологічних хромосом, виявило різницю за показниками кількості поросят у 2 місячному віці та збереженістю приплоду, пов'язану з С-гетероморфізмом гомологів 16-ої пари(Р<0,05).

Дослідження репродуктивних якостей кнурів та свиноматок з різними комбінаціями гетероморфних гомологів виявили, що тварини з підвищеною варіабельністю структурного С-гетерохроматину характеризуються більш високою життєздатністю нащадків. Кількість поросят у 2 місяці була вірогідно вищою у свиноматок з вираженим С-гетероморфізмом хромосомних пар (Табл.3), підвищення збереженості приплоду складало 15,8%.

Таблиця 3

Основні показники репродуктивної функції свиноматок у зв'язку з С-гетероморфізмом акроцентричних хромосом

№ Групи	n, голів	Ступінь гетеро морфізму, бал.	Багатопліддя, голів	У 2 місяці
				кількість поросят, голів	збереженість приплоду, %
1	18	0-1	9,40,54	7,20,40*	71,83,80**
2	9	2-3	10,40,41	8,80,47*	84,13,40**

*- в цій та наступних таблицях однакові суперскрипнти мають значення, що відрізняються з вірогідністю не менш 95%.

Кнури, в геномі яких виявлені структурно неоднорідні гомологи, також характеризувались підвищенням збереженості приплоду (Табл. 4), при цьому фертильність досягала рівня 82,4%.

Таблиця 4

Основні показники репродуктивної функції кнурів у зв'язку з С-гетероморфізмом акроцентричних хромосом

№ групи	n, голів	Ступінь гетеро морфізму, бал.	Багатопліддя, голів	У 2 місяці
				Кількісні поросят, голів	збереженість приплоду, %
1	10	0-1	9,90,29	7,80,40	78,62,88*
2	11	2-3	9,60,41	8,40,28	86,51,84*

В результаті аналізу рівня хромосомної нестабільності у зв'язку з С-гетероморфізмом гомологів виявлено зміну співвідношення структурних та геномних аберацій як у кнурів, так і у свиноматок. (табл. 5, 6)Наявність у геномі хромосомних пар з вираженим структурним С-гетероморфізмом супроводжувалась зниженням частоти геномних мутацій (Р<0,05).

Таблиця 5

Цитогенетична характеристика свиноматок у зв'язку з С-гетероморфізмом акроцентричних хромосом

№ групи	n, голів	Ступінь гетероморфізму, бал.	РХН, %	Частота структурних аберацій, %	Частота геномних мутацій, %	Загальний бал С-гетеро-морфізму
1	18	0-1	17,60,91	12,12,46	6,50,83*	2,20,20**
2	9	2-3	17,23,57	13,74,15	4,00,93*	4,10,53**

Таблиця 6

Цитогенетична характеристика кнурів у зв'язку з С-гетероморфізмом акроцентричних хромосом

№ групи	n, голів	Ступінь гетероморфізму, бал.	РХН, %	Частота структурних аберацій, %	Частота геном них мутацій, %	Загальний бал С-гетеро-морфізму
1	10	0-1	16,02,56	4,30,88*	11,82,19*	1,90,32**
2	11	2-3	16,23,19	11,82,90	5,41,08*	3,50,35**

Аналіз спектру спонтанних мутацій показав пропорційне змінювання всіх типів хромосомних порушень, за винятком аберацій хроматидного типу, частота яких помітно не відрізнялася .

В результаті досліджень визначено, що кнури та свиноматки з С-гетероморфізмом гомологічних хромосом вище 2-ох балів харктеризувались підвищенням збереженості приплоду. У свиней, які мали структурно неоднорідні гомологи акроцентричних пар, виявлено зниження рівня геномних мутацій, які негативно впливають на відтворювальні якості свиней. Отримані результати свідчать, що структурний поліморфізм по С-блоків гетерохроматину може бути одним з факторів, які обумовлюють високу життєздатність нащадків. Характеристика С-поліморфізму хромосом як складова частина цитогенетичного тестування свиней може використовуватись при розробці цитогенетичних критеріїв репродуктивної здатності свиней.

5. Варіабельність С-гетерохроматинових районів хромосом та нестабільність геному в лейкоцитах крові свиней. Для вивчення зв'язку С-поліморфізму хромосом з нестабільністю геному свиней проведено аналіз частоти та спектру спонтанних мутацій носіїв поліморфних С-варіантів хромосом 13, 15, 16 та 18. Розподіл типів хромосомних порушень представлений на мал. 3 та 4.

При наявності у геномі варіанту хромосом 13 з великим С-блоком спостерігали зниження рівня геномних мутацій, яке відбувалося за рахунок зменшення числа поліплоїдних клітин. Підвищення кількості С-гетерохроматину на хромосомі 18 супроводжувалось підвищенням частоти структурних аберацій, що може бути пов'язано з невипадковістю хромосомних порушень у С-гетерохроматині (Р<0,05). При структурній гетерогенності гомологічних хромосом також виявили певні зміни спектру мутацій. Виражений С-гетероморфізм гомологів 15-ої пари супроводжувався як зниженням рівня геномних мутацій, так і підвищенням рівня структурних аберацій, обумовленого фрагментацією хромосом (Р<0,05). Зниженою частотою геномних мутацій характеризувалися носії гетероморфних гомологів 16-ої пари, тоді як структурна неоднорідність гомологів 18-ої пари підвищувала частоту порушень хромосомного матеріалу. Виявлені зміни співвідношення та спектру мутацій були вірогідними на рівні Р<0,05.

Підвищена варіабельність С-гетерохромтаинових районів хромосом 13, 15 та 16 супроводжувалось зниженням рівня геномних мутацій, тоді як при структурній гетерогенності хромосомних пар 15 та 18 підвищувалась частота структурних аберацій. Визначені зміни спектру мутацій свідчать, що поліморфізм районів структурного гетерохроматину може, у певній мірі, впливати на прояви спонтанних мутацій на клітинному рівні, при цьому певні типи аберацій можуть як підвищуватись, так і знижуватись.

Взаємозв'язок поліморфізму районів прицентромірного С-гетерохроматину з асоціаціями акроцентричних хромосом у свиней.

Для вивчення ролі варіабельного С-гетерохроматину у формуванні асоціацій провели дослідження асоцативної здатності акроцентричних хромосом у зв'язку з локалізацією поліморфних С-блоків гетерохроматину. В результаті аналізу визначено, що кількість прицентромірного С-гетерохроматину практично не впливала на асоціативну поведінку хромосом, про що свідчить відсутність вірогідної різниці між носіями поліморфних С-варіантів хромосом за показниками частоти клітин з асоціаціями акроцентричних хромосом (ААХ), а також участі хромосомних пар у ААХ.

Виявлено підвищення частоти ААХ при наявності у геномі структурно гетерогенних гомологів. Виражений С-гетероморфізм гомологів 16-ої пари супроводжувався значним підвищенням показника частоти ААХ з 35,5% до 53,1% (Р<0,05), проте не виявлено переважної участі 16-ої хромосоми у ААХ. У носіїв гетероморфної пари 15 визначено позитивні кореляції між загальним балом С-гетероморфізму та частотою ААХ (r1 =0,37; P<0,01), а також кількістю ААХ на клітину (r2=0,30; Р<0,05). Виявилося, що позитивний корелятивний зв'язок між загальним балом С-гетероморфізму гомологів та частотою ААХ є характерним також для всіх досліджених тварин (r=0,29; Р<0,01).

В результаті досліджень визначено, що структурна гетерогенність гомологічних хромосом супроводжується підвищенням рівня ААХ, тоді як кількість С-гетерохроматину не має прямого впливу на асоціативну здатність акроцентричних хромосом. Отримані дані свідчать про те, що варіабельність районів прицентромірного гетерохроматину пов'язана з формуванням ААХ, але вплив поліморфних С-блоків гетерохроматину відбувається на рівні тонких взаємодій компонентів геному. Вивчення структурно-функціональних зв'язків на клітинному рівні надає інформацію про діяльність геному, а також створює основу для визначення ознак, які у подальшому можуть бути включені у процес спрямованої селекції.

7. Маркерні хромосоми та їх успадкування Вивчення поліморфізму гетерохроматинових районів представляє інтерес з точки зору існування природних хромосомних маркерів. Присутність у геномі хромосом, маркіруваних поліморфними С-блоками дозволяють контролювати походження хромосом. Маркерні С-блоки (4-5 балів) визначено у свиней порід велика біла та ландрас на хромосомах 15, 16 та 18. Аналіз основних показників репродуктивної здатності носіїв маркерних С-варіантів хромосом не виявив патогенетичного зв'язку між підвищенням кількості С-гетерохроматину та репродуктивною функцією свиней.

Для вивчення характеру успадкування маркерних хромосом проведено аналіз поліморфних С-варіантів хромосом у нащадків (n=22) кнурів та свиноматок, в геномі яких виявлено маркерні С-блоки гетерохроматину. Виявлено, що розподіл маркерних С-варіантів хромосом не відхилявся від свіввідношення 1:1. Таким чином, успадкування маркерних хромосом з великими С-блоками гетерохроматину відбувалося згідно загальногенетичному принципу. У одного з нащадків виявили великі С-блоки на обох гомологах 16-ої пари, тоді як тільки кнур був носієм маркерного варіанту хромосоми 16. Припущення про походження цього нащадка від інших батьків підтвердив імуногенетичний аналіз.

В результаті досліджень встановлено високу стабільність морфологічних типів хромосом з маркерними С-блоками, а також можливість їх ідентифікації при візуальному каріотипуванні. Маркерні хромосоми можуть використовуватись як додатковий критерій при визначенні походження тварин.

ВИСНОВКИ

Акроцентричні хромосоми свиней характеризуються високою варіабельністю районів структурного гетерохроматину. Поліморфізм районів прицентромірного С-гетерохроматину хромосом 13, 15, 16 та 18 обумовлює структурну гетерогенність гомологічних хромосом.

Поліморфізм С-гетерохроматинових районів пов'язаний з функціями геному свиней як на клітинному рівні, так і на рівні діяльності організму. На клітинному рівні підвищена варіабельність С-гетерохроматина гомологічних хромосом характеризується зміною співвідношення структурних та геномних мутацій у лейкоцитах крові, тоді як зв'язок з функціями організму проявляється у рівні репродуктивної функції свиней. Структурна гетерогенність гомологів акроцентричних хромосом по С-гетерохроматину у кнурів та свиноматок пов'язана з підвищенням збереженості приплоду на 10-15%.

Поліморфізм районів структурного гетерохроматину взаємопов'язаний з проявами спонтанних хромосомних мутацій у лейкоцитах крові свиней. Підвищена варіабельність С-гетерохроматину на хромосомах 13, 15 та 16 супроводжується зниженням рівня геномних мутацій, тоді як структурний поліморфізм хромосомних пар 15 та 18 пов'язаний з підвищенням частоти структурних аберацій.

Структурна гетерогенність гомологів акроцентричних хромосом по С-блоках гетерохроматину сприяє формуванню асоціацій ААХ (r=0,29; P<0,01). Виявлено зв'язок С-гетероморфізму 16-ої пари з підвищенням частоти ААХ (P<0,05), а також позитивну кореляцію загального бала С-гетероморфізма з показниками асоціативної здатності хромосом (r1=0,37; P<0,01; r2=0,30; P<0,05) у носіїв гетероморфних гомологів 15-ої пари.

Свині порід велика біла та ландрас практично не відрізняються за частотою поліморфних варіантів хромосом 13, 15, 16 та 18, незначна різниця у частоті окремих С-типів хромосом 16 та 18 можуть свідчити про накопичення певних хромосомних варіантів у селекціонованих групах тварин. Відсутність значної різниці у варіабельності районів структурного гетерохроматину між кнурами та свиноматками двох порід дозволяють вважати С-поліморфізм акроцентричних хромосом нейтральною характеристикою як у відношенні до статі свиней, так і в породному аспекті.

Маркерні С-блоки гетерохроматину є стабільним структурно-морфологічним компонентом хромосоми, характер успадкування маркерних хромосом у свиней характеризується співвідношенням 1:1, що відповідає загальногенетичному принципу.

Візуальний аналіз С-поліморфізму хромосом свиней з використанням критеріїв напівкількісної оцінки дозволяє за 5-бальною шкалою визначати відносні розміри С-блоків гетерохроматину на акроцентричних хромосомах 13-18.

Удосконалено метод диференційного С-забарвлення хромосом свиней. Використання модифікації С-методу, основними етапами якої є обробка гідроксидом барію (500С) та інкубація у буферно-спиртовому розчині SSC при pH=8,5, доволяє отримувати С-забарвлення на хромосомах свиней без значних порушень хромосомного матеріалу

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

При візуальному аналізі С-поліморфізму хромосом свиней доцільно використовувати критерії напівкількісної оцінки поліморфних С-блоків гетерохроматину на акроцентричних хромосомах 13-18.

Ураховуючи високу ефективність та можливість автоматизації, при проведенні цитогенетичного аналізу хромосом сільськогосподарських тварин пропонується використовувати програмно-апаратний комплекс для каріотипування.

Для отримання якісного С-забарвлення на хромосомах свиней доцільно використовувати модифікацію С-методу, яка включає обробку препаратів гідроксидом барію та буферно-спиртовим розчином SSC при pH=8,5, що забезпечує можливість проведення цитогенетичного аналізу у свинарстві.

Характеристика С-поліморфізму хромосом як складова частина цитогенетичного тестування свиней слід використовувати у контексті програм по удосконаленню відтворювальної здатності ліній та родин свиней.

СПИСОК НАУКОВИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Россоха В.И., Ивашура М.Н. Взаимосвязь С-полиморфизма хромосом с воспроизводительными качествами свиней //Научно-тех. бюл.. Институт животноводства УААН. - Харьков, 1996. - Nо 72. - С. 39-43.

2. Івашура М.М. Варіабельність районів прицентромірного гетерохроматину та спонтанні хромосомні мутації у лейкоцитах крові свиней//Научно-тех. бюл.. Институт животноводства УААН. - Харьков, 1998. - Nо 73. - С. 27-30.

3. Івашура М.М. Вивчення взаємозв'язку структурного поліморфізму хромосом з репродуктивною функцією свиней// Вісник: Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини. Науково-теор. журнал ХЗВИ - Харьков, 1998. - Вип.3(27).-С.50-52.

4. Воробйова М.М., Єфіменко Л.Й., Розсоха В.І. Вивчення хромосомного поліморфізму у свиней//Тези допов. -ої Міжнар. науково-практ. конф. “Селекційно-біотехнологічні методи використання генетичного потенціалу с.-г. тварин”.- Київ: Інститут розведення та генетики тварин УААН. - 1994.- С. 20.

5. Воробьева М.Н., Россоха В.И., Ефименко Л.Й. Полиморфизм С-блоков хромосом свиней// Тези допов. Міжнар. конф. ”Шляхи підвищення виробництва та поліпшення якості свинини”. - Харків: ІТ УААН. - 1995. - С. 33.

6. Воробьева М.Н., Россоха В.И., Шигимага В.А. Применение телевизионного комплекса при анализе изображений с препаратов хромосом // Тези допов. Міжнар. конф.”Шляхи підвищення виробництва та поліпшення якості свинини”. - Харків: ІТ УААН. - 1995. - С. 32.

7.Хватов А.И., Россоха В.И., Ефименко Л.Й. Воробьева М.Н., Россоха Л.В. Возможности использования цитогенетических методов в селекции свиней при раннем выборе родоначальников заводских линий// Тези допов. Міжнар. конф.”Шляхи підвищення виробництва та поліпшення якості свинини”. - Харків: ІТ УААН. - 1995. - С. 17.

8. Івашура М.М.,Розсоха В.І. Використання диференційного С-методу для пофарбування хромосом свиней// Тезисы докл. ІІ Междунар. конф. по молекулярно-генетическим маркерам животных. Киев: Институт агроэкологии и биотехнологии УААН. - 1996. - С 82.

9. Івашура М.М.,Розсоха В.І., Безуглий М.Д., Шигимага В.О., Вивчення можливостей нових методичних підходів до оцінки С-поліморфізму хромосом свиней// Тезисы докл. ІІ Междунар. конф. по молекулярно-генетическим маркерам животніх. Киев: Институт агроэкологии и биотехнологии УААН. - 1996. - С 83.

10. Розсоха В.І., Єфіменко Л.Й., Івашура М.М. С-блоки гетерохроматину як природні хромосомні маркери// Тезисы докл. ІІ Междунар. конф. по молекулярно-генетическим маркерам животных. Киев: Институт агроэкологии и биотехнологии УААН. - 1996. - С 86.

Розсоха В.І., Івашура М.М., Єфіменко Л.Й., Біденко М.М. Взаємозв'язок С-гетероморфізму гомологічних хромосом з відтворювальними якостями свиней// Тезисы докл. ІІ Междунар. конф. по молекулярно-генетическим маркерам животніх. Киев: Институт агроэкологии и биотехнологии УААН. - 1996. - С 87.

хромосома свиня акроцентричний репродуктивний

АНОТАЦІЇ

Івашура М.М. Поліморфізм гетерохроматинових районів акроцентричних хромосом свиней. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандитата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.15. - гететика. - Інститут тваринництва УААН, Харків , 1998.

Дисертацію присвячено вивченню поліморфізма районів структурного гетерохроматину на хромосомах свиней, а також зв'язку варіабельності С-гетерохроматину з репродуктивними функціями тварин. Визначено, що носії структурно гетерогенних по С-гетерохроматину гомологічних хромосом, характеризувались підвищеною життєздатністю нащадків. На клітинному рівні виявлено зв'язок структурного С-поліморфізму акроцентричних хромосом з нестабільністю генома в лейкоцитах крові свиней. Підвищена варіабельність С-гетерохроматину пов'язана з реалізацією певних типів хромосомних порушень, а також з формуванням асоціацій хромосом. Розроблено метод та обладнання для дослідження хромосом комп'ютерним способом. Для візуального аналіза С-поліморфізму акроцентричних хромосом свиней запропоновано критерії напівкількісної оцінки поліморфних С-блоків за 5-бальною шкалою. Розроблено модифікацію С-методу, яка забезпечує стабілізацію хромосомного материалу при С-забарвленні.

Ключові слова: структурний гетерохроматин, гетероморфізм гомологічних хромосом, нестабільність геному, аберації, асоціації акроцентричних хромосом, відтворювальна здатність свиней.

Ивашура М.Н. Полиморфизм гетерохроматиновых районов акроцентрических хромосом свиней. - Рукопись.

Дисертация на соискание научной степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.15. - гететика. - Институт животноводства УААН, Харьков , 1998.

Дисертация посвящена изучению полиморфизма районов структурного гетерохроматина на хромосомах свиней, а також взаимосвязи вариабельности С-гетерохроматина с репродуктивными функциями животных. Установлено, что носители структурно гетерогенных по С-гетерохроматину гомологичних хромосом, характеризовались повышенной жизнеспособностью потомков. На клеточном уровне выявлена связь структурного С-полиморфизма акроцентрических хромосом с нестабильностью генома в лейкоцитах крови свиней. Повышенная вариабельность С-гетерохроматина связана с реализацией определенных типов хромосомных нарушений, а также с формированием асоциаций хромосом. Разработан метод и оборудование для исследования хромосом компьютерным способом. Для визуального анализа С-полиморфизма акроцентрических хромосом свиней рекомендуется использовать критерии полуколичественной оценки полиморфных С-блоков по 5-бальной шкале. Разработана модификация С-метода, обеспечивающая стабилизацию хромосомного материала при С-окрашивании.

Ключевые слова: структурный гетерохроматин, гетероморфизм гомологичных хромосом, нестабильность генома, аберрации, ассоциации акроцентрических хромосом, воспроизводительная способность свиней.

Ivashura M.N. Polymorphism of heterochromatin regions of the pig acrocentric chromosomes.- Manuscript.

Dissertation for the degree Candidate Science (Agriculture) in speciality 03.00.15.-The Institute of Animaj Science of UAAS, Kharkov, 1998.

The dissertation deals with studying the polymorphism of structural heterochromatin regions on porcine chromosomes and C-heterochromatin variability relationship with the animal reproductive functions. It was established that carriers of the chromosomes structurally heterogeneous in C-heterochromatin were characterized by the progeny improved viability. The relatioship of the structural C-polymorphism of acrocentric chromosomes with genome instability in porcine blood leucocytes was found at the cell level. The incrized C-heterochromatin variability is connected to realization of certain chromosome aberrations and formation of associations. A method and equipment are developed to investigate chromosomes using a computer. For visual analysis of the C-polymorphism of porcine acrocentric chromosomes, criteria of semiquantitative evaluation of polymorphous C-blocks according to 5-point scoring were proposed. The C-method was modified to provide chromosome stabilization at C-staining.

Key word: constitutive heterochromatin, heteromorphism of gomologous chromosomes, genome instability, aberration, association of acrocentric chromosomes, reproductive ability of pigs.

Размещено на Allbest.ru

...