Вплив гіпоксії на життєздатність насіння та фізіологічний стан проростків озимої пшениці різних сортів

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ВПЛИВ ГІПОКСІЇ НА ЖИТТЄЗДАТНІСТЬ НАСІННЯ ТА ФІЗІОЛОГІЧНИЙ СТАН ПРОРОСТКІВ ОЗИМОЇ ПШЕНИЦІ РІЗНИХ СОРТІВ

03.00.12 - фізіологія рослин

МАЙОР Павло Степанович

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Силаєва Алла Михайлівна Інститут садівництва УААН завідувач лабораторії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Косаківська Ірина Василівна Інститут ботаніки ім. М.Г.Холодного НАН України,

старший науковий співробітник кандидат біологічних наук Таран Наталія Юріївна Київський національний університет ім.Тараса Шевченка старший науковий співробітник

Провідна установа: Національний ботанічний сад ім. М.М.Гришка НАН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “ 14 ” квітня 2000 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України (03022, м. Київ, вул. Васильківська, 31/17).

З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (03022, м. Київ, вул. Васильківська, 31/17).

Автореферат розіслано “ 10 ” березня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Труханов В.А.

Майор П.С. Вплив гіпоксії на життєздатність насіння та фізіологічний стан проростків озимої пшениці різних сортів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 - фізіологія рослин. - Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 1999.

Дисертацію присвячено дослідженню впливу кисневого дефіциту на проростаюче насіння та проростки озимої пшениці початкових етапів розвитку. Виявлено певні закономірності між стійкістю сорту до гіпоксії та параметрами, що характеризують поглинання кисню при затопленні. Досліджено вплив гіпоксії на процеси росту, дихання та синтезу білків у проростках сортів, що відрізняються за стійкістю до даного фактора. Зроблено висновок про адаптивний характер змін участі альтернативної оксидази на початкових етапах гіпоксичного впливу та захисну роль білків-шаперонів.

Ключові слова: озима пшениця, гіпоксія, кисень, затоплення, дихання, альтернативна оксидаза, білки, шаперони.

Майор П.С. Влияние гипоксии на жизнеспособность семян и физиологическое состояние проростков озимой пшеницы разных сортов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.12 - физиология растений. - Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев, 1999.

Диссертация посвящена исследованию влияния гипоксии на прорастающие семена и проростки озимой пшеницы начальных этапов развития.

Исследована взаимосвязь между скоростью утилизации кислорода при затоплении семян и проростков различных сортов озимой пшеницы и их устойчивостью к гипоксии. По уровню чувствительности к затоплению семян 28 исследованных сортов разделены на две контрастные группы. Показано, что прорастающие семена более устойчивых сортов способны эффективнее поглощать кислород при затоплении. Установлено наличие положительной корреляции между начальной скоростью потребления кислорода проростками различных сортов и продолжительностью затопления, при котором наблюдалась гибель половины растений (полулетальная продолжительность). Предложен безразмерный параметр, связывающий эти показатели, который позволяет установить уровень относительной устойчивости сортов озимой пшеницы к гипоксии.

Достоверный рост-ингибирующий эффект гипоксии фиксируется уже при кратковременном полном затопления проростков. В условиях частичного затопления также наблюдается задержка ростовых процессов, особенно корневой системы растений. Полученные данные свидетельствуют о важности для жизнедеятельности растений в условиях гипоксии кислорода, поглощаемого незатопленной частью листьев и используемого для потребностей всего растения.

При затоплении возрастает удельная интенсивность синтеза ряда полипептидов, в частности, с мол. м. 18, 35, 57, 73 и 82 кД; два последних являются общими для вариантов теплового шока и гипоксического воздействия. Полипептид с мол. м. 35 кД может представлять собой мономер альтернативной оксидазы. В условиях затопления индукция синтеза общих и митохондриальных белков в участках БТШ70 и БТШ90 проявляется сильнее у относительно устойчивых сортов, белоксинтетические процессы в проростках чувствительных к дефициту кислорода сортов существенно замедлены. Указанные белки могут выполнять роль молекулярных шаперонов в клетках, защищая функциональные надмолекулярные структуры в условиях гипоксического воздействия.

Выявлен фазный характер перераспределения электронного транспорта между цитохромным и альтернативным путями как для корней, так и надземной части проростков. В начале затопления имеет место активация альтернативного пути дыхания. В условиях довольно жесткой гипоксии проростки устойчивых сортов демонстрируют более высокую относительную активность цитохромоксидазы, чем растения контрольного варианта, тогда как проростки чувствительных сортов сохраняют повышенную активность альтернативной оксидазы. Сделан вывод об адаптивном характере изменения участия альтернативной оксидазы на начальных этапах гипоксического воздействия.

Ключевые слова: озимая пшеница, гипоксия, кислород, затопление, дыхание, альтернативная оксидаза, белки, шапероны.

Major P.S. The effect of hypoxia on viability of seeds and physiological state of seedlings of various winter wheat cultivars. - Manuscript.

The thesis for Ph.D. degree (Biology) on speciality 03.00.12 - plant physiology. - Institute of Plant Physiology and Genetics of National Academy of Siences of Ukraine, Kyiv, 1999.

The Ph.D. degree thesis is devoted to the investigation of oxygen deficiency influence on germinated seeds and seedlings at early stages of development of winter wheat. Certain interrelations between hypoxia tolerance of cultivars and parameters of oxygen consumption during flooding were found. Effect of hypoxia on growth, respiration and protein synthesis in seedlings of cultivars differ in their resistance to this factor were studied. Conclusion about adaptive character of involvement of alternative oxidase at the initial steps of hypoxic state and a protective role of chaperones was made.

Key words: winter wheat, hypoxia, oxygen, flooding, respiration, alternative oxidase, proteins, chaperones.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

озима пшениця гіпоксія кисень

Актуальність проблеми. Рослини або їх частини чи органи часто знаходяться в умовах короткочасного або тривалого кисневого голоду. Нестача O₂ виникає внаслідок переущільнення, підтоплення або затоплення грунтів, утворення льодової кірки тощо [Белецкая, 1979; Вартапетян, 1970, 1985; Гринева, 1975; Остаплюк, 1977, 1984; Чиркова, 1984; Crawford, Braendle, 1998; Kennedy et al., 1992; Perata, Alpi, 1993; Vartapetian, Jackson, 1997]. За державним земельним кадастром України обліковано 2,2 млн. га перезволожених і 2,0 млн. га заболочених угідь. Площа орних та зрошуваних земель в Україні, на яких виникає гіпоксія, складає більше 440 тис. га [Витриховський, 1988], тому проблема порушення кисневого режиму культурних рослин стає глобальною, особливо для районів інтенсивного землеробства.

Озима пшениця (Triticum aestivum L.) належить до видів, чутливих до нестачі кисню [Белецкая, 1979; Остаплюк, 1984; Третьяков и др., 1996; Чиркова и др., 1991, 1992, 1993; Biemelt et al., 1998; Greenway et al., 1992; Ikeda, Nakamura, 1996; Thomson et al., 1990]. Встановлено, що сорти відрізняються між собою за стійкістю до гіпоксії [Власюк и др., 1973; Колбасина, Жильцова, 1978], однак природу цього явища до кінця не розкрито. Вважають, що різна толерантність рослин споріднених видів пов'язана з певними біохімічними відмінностями між ними [Блохина, Чиркова, 1999; Гринева, 1975; Остаплюк, 1977; Banga et al., 1997; Fan et al., 1997; Fox et al., 1995, 1998; James, Crawford, 1998; Kennedy et al., 1992; Menegus et al., 1989; Perata, Alpi, 1993; Ricard et al., 1994; Roberts et al., 1984; Sylayeva, 1998], але залишається малодослідженими ряд питань стосовно особливостей генотипу, які визначають той чи інший ступінь стійкості рослин до кисневого дефіциту всередині одного виду, зокрема, специфіки білкового обміну, процесів генерації і утилізації енергії, механізмів регуляції метаболізму тощо.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась в рамках бюджетних тем лабораторії фізіологічної адаптації рослин - “Дослідити фізіологічні аспекти дії метаболітів трикарбонового циклу та їх похідних при адаптації пшениці до гіпоксії” та відділу фізіології стійкості рослин ІФРГ НАН України - “Вивчення ролі білків-шаперонів та фосфатидилінозитолу у стійкості злаків до екстремальних температур” (0198U009039) і “Регуляція дихання теплолюбних рослин в процесі проростання при низьких температурах” (0199U000020).

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було комплексне дослідження впливу гіпоксії на життєздатність насіння та фізіологічні процеси в проростках різних сортів озимої пшениці у модельних умовах.

Для досягнення цієї мети було поставлено такі завдання:

1) дослідити в лабораторних умовах взаємозв'язок між швидкістю утилізації кисню при затопленні насіння і проростків та їх стійкістю до гіпоксичних умов для різних сортів озимої пшениці;

2) дослідити розвиток гіпоксії при частковому затопленні етіольованих проростків озимої пшениці та з'ясувати можливу компенсаційну роль внутрішнього транспорту кисню з їх надземної частини;

3) вивчити склад та синтез загальних і мітохондріальних поліпептидів проростків озимої пшениці за умов впливу гіпоксії та провести порівняльний аналіз ефектів температурного фактора та кисневого дефіциту;

4) визначити перебудови дихального метаболізму та встановити вклад альтернативного і цитохромного шляхів переносу електронів у мітохондріях за умов недостатнього забезпечення киснем.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що між початковою швидкістю поглинання кисню проростками 20 різних за походженням сортів озимої пшениці та тривалістю затоплення, при якій спостерігається загибель половини рослин, існує позитивна кореляція. За рівнем стійкості до затоплення проростаючого насіння 28 досліджених сортів можна поділити на дві контрастні групи. Вперше встановлено посилення синтезу в умовах кисневого дефіциту стресових білків з родин БТШ70, БТШ90, а також низькомолекулярних БТШ, які, вірогідно, відіграють роль молекулярних шаперонів, захищаючи клітину від пошкодження. Виявлено посилений синтез мітохондріального поліпептиду з мол. м. 35 кД, що може являти собою мономер альтернативної оксидази, функціонування якої дозволяє захистити клітину від вільнорадикального пошкодження, а також підтримувати мітохондрії у функціональному стані в умовах кисневого дефіциту.

Практичне значення одержаних результатів. Робота розширює уявлення про пластичність озимої пшениці та доповнює характеристики стійкості культури до кисневого дефіциту. Запропоновано критерії, придатні для оцінки ступеня чутливості сортів озимої пшениці до затоплення проростаючого насіння та проростків початкових стадій розвитку, які можуть використовуватися також у селекційній роботі. На підставі отриманих даних розроблено спосіб попередження та корекції гіпоксичного стану рослин на основі використання киснегенеруючого препарату [Майор П.С., Половинкин И.Г., Малюк В.И. “Средство для борьбы с гипоксией растений”, А.с. СССР №1533039, 1987].

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача у виконанні поданої роботи полягав у підготовці і проведенні експериментальних досліджень, інтерпретації одержаних результатів. Усі експериментальні матеріали, які використані у дисертації, отримані при безпосередній участі автора.

Апробація роботи. Матеріали, викладені у дисертаційній роботі, було представлено на VIII з'їзді Українського ботанічного товариства (Київ, 1987), науковій конференції “Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов” (Уфа, 1989), 8-й конференції молодих вчених-біологів “Экологические вопросы рационального природопользования” (Рига, 1989), конференціях молодих вчених Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (Київ, 1992, 1996), II З'їзді Українського товариства фізіологів рослин (Київ, 1993 р.), науково-практичній конференції молодих вчених “Інтегративність функцій рослинного організму” (Київ, 1998), 11 конгресі Європейського товариства фізіологів рослин (Болгарія, 1998).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 робіт, у т.ч. чотири статті у провідних фахових виданнях.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається з вступу, трьох розділів основної частини, заключення, висновків, списку цитованої літератури (345 найменувань, з них 213 джерел англійською мовою) та додатків. Дисертацію викладено на 162 сторінках друкарського тексту, з яких 11 сторінок займають 14 таблиць, 17 сторінок - 21 ілюстрація, 34 сторінки - список літературних джерел, 8 сторінок - додаток.

основний змІст роботи

Огляд літератури

Огляд літератури складається з чотирьох підрозділів, у яких розглядається сучасний стан досліджень фізіологічних реакцій та адаптації рослин до умов нестачі кисню, синтез білків в умовах гіпо- та аноксії, функціонування мітохондрій та альтернативний шлях дихання.

Об'єкти та методи досліджень

Об'єктами вегетаційних та лабораторних дослідів були насіння та проростки різних за походженням сортів озимої пшениці Triticum aestivum L. Загалом при дослідженні стійкості насіння до затоплення випробувано 28, у дослідах з проростками - 20 сортів кількох селекційних центрів, переважно вітчизняної селекції. Застосовували різні схеми дослідів, у яких створювалися умови гіпоксії. У вегетаційних дослідах вивчали вплив переущільнення, підтоплення та затоплення грунту на ріст, розвиток та виживання рослин. У лабораторних експериментах досліджували реакцію проростків на кисневий дефіцит, що виникав внаслідок поглинання ними кисню в умовах часткового та повного затоплення водою; гіпоксичний вплив на проростаюче насіння створювався внаслідок обмеженого доступу кисню при затопленні. Динаміку зміни вмісту кисню у воді реєстрували за допомогою відкритого платинового електрода методом вольт-амперної полярографії, записуючи в автоматичному режимі повну полярографічну криву з інтервалом 10-15 хв. протягом усього часу проведення дослідів. У лабораторних дослідах використовували етіольовані проростки, які вирощували у скляних циліндричних посудинах типу СЦ-5 (об'єм 5 л, площа 210 см²) протягом 3-8 діб. Усі експерименти проводили у термостатованих умовах.

Для дослідження складу новосинтезованих поліпептидів контрольні та дослідні проростки інкубували з радіоактивно міченими сполуками протягом 3-5 год. Використовували розчини ³⁵S-метіоніну (об'ємна активність 80-100 мкКі/мл) або суміш ¹⁴C-мічених амінокислот (об'ємна активність 30-70 мкКі/мл). Вилучення мітохондрій (Мх) проводили за модифікованим методом [Day, Hanson, 1977; Честухин и др., 1985] при 4°C. Зразки загального білка отримували при розтиранні рослинного матеріалу у подвійному буфері Леммлі, мітохондріальний - при розчиненні у ньому осаду Мх. Радіоактивність зразків визначали за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника Бета-2 (Україна) або LKB-1211 Rackbeta (Швеція).

Поліпептидний склад досліджували методом диск-електрофорезу у плоских поліакриламідних гелях при використанні трис-аспарагінового електродного буфера (pH 8,3) у присутності 1% ДСН [Половинкін та інш., 1999]. Радіоавтографи отримували після експозиції висушених гелів із рентгенівською плівкою РМ-В. Аналіз відсканованих гелів і радіоавтографів (денситометрію) здійснювали на персональному IBM-сумісному комп'ютері за допомогою безкоштовної програми ImageTool (адреса сайту в Інтернеті ftp://maxrad6.uthscsa.edu, університет Техаського наукового центру США). Концентрацію неспарених електронів досліджували методом низькотемпературного (-196°С) ЕПР. Дихальний метаболізм тканин досліджували за допомогою закритого електроду Кларка. Для блокування альтернативної чи цитохром-оксидази застосовували інгібітори - бензгідроксамову кислоту (БГК, 10 мМ) та азид натрію (5 мМ), відповідно.

Вплив кисневого дефіциту на рослини у вегетаційних дослідах

Результати аналізу вегетаційних дослідів свідчать, що кисневий дефіцит, який виникає внаслідок переущільнення грунту, є невеликим і його вплив проявляється у деякому сповільненні росту рослин. Негативний ефект гіпоксії, що є результатом надмірного зволоження грунту (підтоплення або затоплення), на життєдіяльність рослин носить більш виражений характер і може виявитися для рослин летальним.

Початкові етапи розвитку рослин (стадія проростання та формування проростків), коли вони ще не мають розгалуженої кореневої системи та розвинутого листового апарату, виявились найбільш вразливими до дії гіпоксичного стресу.

Виявлений більший ефект гіпоксії, що виникає в результаті затоплення чи підтоплення грунтів, зумовлює більший теоретичний та практичний інтерес саме до цього варіанту впливу, який моделювали у лабораторних умовах при різних варіантах затоплення.

Вплив гіпоксичних умов на рослини у лабораторних дослідах

При затопленні рослин в результаті поглинання ними кисню відбувається зменшення його концентрації у воді, і умови аерації визначається як швидкістю утилізації кисню рослинами, так і його дифузії з повітря. Фактори, що впливають на швидкість зменшення вмісту кисню у водному середовищі, визначають час настання та напруженість гіпоксичного стресу для рослин.

Результати багатофакторного експерименту, спланованого за методом латинських квадратів, дозволили встановити функціональні залежності швидкості зменшення концентрації кисню у воді від температури, глибини затоплення, густини посіву та віку проростків у широкому діапазоні варіювання значень факторів.

Встановлено, що виходячи із поведінки кривих зменшення схожості насіння в умовах кисневого дефіциту (який створювався при затопленні) досліджені сорти можуть бути розділені на дві групи (табл. 1).

Тривалість затоплення, що викликає зменшення частки життєздатного насіння на 50% (напівлетальна доза LD_50зат) у першій групі сортів (№ 1-13) складає 81,0±2,5 год., для сортів другої групи - 103,5±2,0 год.

Різниця між групами достовірно (p>0,95) зберігається протягом усього часу у межах дослідженого відрізка тривалостей гіпоксичного впливу, а розходження всередині однієї групи статистично незначущі (p<0,90).

Насіння сортів озимої пшениці різних груп стійкості відрізняються також і за кінетичними параметрами: точки у координатах швидкість поглинання кисню - величина квазістаціонарної концентрації кисню (яка встановлюється при досягненні рівноваги між процесами поглинанням кисню та його розчиненням внаслідок дифузії), розташовані у різних ділянках, тобто, насіння толерантних сортів здатні утилізувати кисень при більш низькому вмісту його в оточуючому водному середовищі, ніж насіння сортів чутливої групи (рис. 1).

Діапазон значень швидкості поглинання кисню при цьому є приблизно однаковим для обох груп сортів.

Таблиця 1 Групи стійкості до гіпоксії різних сортів озимої пшениці на етапі проростання насіння

Рис. 1. Взаємозв'язок між значеннями початкової швидкості поглинання кисню та квазістаціонарної його концентрації при затопленні насіння різних сортів озимої пшениці: малостійкі сорти, % відносно стійкі сорти.

Оскільки зменшення концентрації кисню у воді має лінійний характер до значень 30-40% від насичення, умови гіпоксії створюються приблизно через проміжок часу T₀, за який відбулось би повне (100%) поглинання кисню з початковою швидкістю V₀: T₀=100%/V₀. Тоді значення напівлетальної дози затоплення з урахуванням часу затримки досягнення гіпоксичних умов можна отримати за формулою: LD₅₀=LD_50зат-T₀, де LD_50зат - експериментально визначене значення. Якщо провести нормування на величину LD_50зат, можна отримати безрозмірний параметр, придатний для порівняння ступеню стійкості до гіпоксії при різних значеннях швидкостей основних процесів (поглинання кисню та загибелі рослин) для різних сортів або при відмінності експериментальних умов: W = LD₅₀ /LD_50зат = 1-T₀/LD_50зат.

Від'ємні значення параметра W будуть свідчити про сильну залежність рослин від умов аерації, оскільки масова їх загибель у цьому випадку буде спостерігатися при ще досить значній концентрації кисню в оточуючому середовищі, тоді як позитивні значення вказуватимуть на більш високу ступінь стійкості до гіпоксії.

Експериментальну перевірку залежності запропонованого параметра від умов середовища провели при різних рівнях основних факторів, що визначають швидкості поглинання кисню (V₀) та втрати життєздатності рослин (LD_50зат) - температури, висоти водного стовпа, віку рослин та їх кількості на одиницю площі. Якщо зміна експериментальних умов викликала помітне збільшення (або зменшення) величини LD_50зат, то значення параметра W при цьому змінювалося у тому ж напрямку, але в меншій мірі. Отже, можна зробити висновок про більшу придатність запропонованого параметра W для оцінки резистентності проростків до гіпоксії, ніж характеристики за величиною LD_50зат, оскільки він враховує вплив умов затоплення як на ступінь та напруженість стресового фактора, так і на загибель рослин внаслідок нестачі кисню. Це дозволяє використовувати даний параметр також для порівняння різних сортів з метою визначення їх рівня чутливості до гіпоксії, що створюється у результаті затоплення рослин.

Рис. 2. Залежність початкової швидкості поглинання кисню (А) та параметра W (Б) від напівлетальної тривалості затоплення для проростків різних сортів.

Таблиця 2 Групи стійкості сортів до гіпоксії на стадії проростків 5-денного віку

Рис.2, А ілюструє взаємозв'язок величин V₀ і LD_50зат для 20 сортів озимої пшениці (нумерація згідно табл.2). Спостерігається парадоксальна, на перший погляд, закономірність: чим із більшою швидкістю проростки здатні поглинати кисень при затопленні, тим більш тривалий час вони зберігають життєздатність в умовах впливу гіпоксичного стресу (коефіцієнт кореляції r=0,813±0,137). На рис.2, Б представлено залежність між значеннями параметра W та LD_50зат для того ж набору сортів озимої пшениці (коефіцієнт кореляції r=0,962±0,064). Отримані результати дозволяють розділити дані сорти на три групи стійкості до гіпоксії в залежності від значення параметра W. Важливо відзначити, що неперервний характер зміни показників LD_50зат та W для проростків та відсутність між групами чітких границь робить таке рознесення сортів до деякої міри умовним, на відміну від ситуації, що спостерігається у дослідах з насінням. Виявлена залежність дає можливість у фіксованих умовах проведення дослідів за кілька годин визначати рівень стійкості сорту озимої пшениці до гіпоксії лише за початковою швидкістю поглинання кисню проростками при збереженні їх повної життєздатності, що може бути важливим для селекційної роботи.

Отже, рівень толерантності до кисневого дефіциту відрізняється в залежності від стадії (проростання насіння чи розвиток проростка).

Ступінь впливу затоплення на рослини та рівень пошкодження визначаються не лише початковою швидкістю зменшення вмісту кисню у воді, але й подальшими умовами забезпечення киснем, що залежить від умов його надходження. Детальний розгляд кінетичних кривих показав, що тут існують певні закономірності, пов'язані з рівнем чутливості проростків до гіпоксії. Виявлено існування плато на кривих, які описують зменшення з часом вмісту кисню у воді при затопленні проростків відносно стійких сортів. Це явище пов'язане із залученням у дихальний метаболізм кисню, який міститься у міжклітинних просторах у газоподібному стані при досягненні певних порогових рівнів, та зменшенням внеску у процес дихання кисню, розчиненого в оточуючій воді.

Вивчали кінетику зменшення концентрації кисню у воді та реакцію проростків на гіпоксичні умови при їх частковому затопленні. Рис.3 ілюструє різний характер змін концентрації кисню у воді при частковому (криві 1) та повному затопленні (криві 2) проростків середньовитривалого сорту Одеська 51 (Од51) - А та більш стійкого сорту Миронівська 808 (М808) - Б. У випадку повного затоплення вміст розчиненого у воді кисню монотонно зменшується і врешті-решт досягає нульових значень. Якщо ж надземна частина проростків контактує з атмосферою, аноксичні умови не створюються, а концентрація кисню у воді встановлюється на сталому рівні. Виявилось, що для проростків сорту М808 стаціонарне значення, що досягається при експоненційному зменшенні вмісту кисню у воді, практично не залежить від глибини затоплення у широкому діапазоні значень. Для проростків сорту Од51 характер виходу на плато та його рівень визначаються товщиною водного шару. При малих глибинах затоплення (до 6-8 см) концентрація кисню спершу зменшується до більш низьких значень, а потім спостерігається поступове наближення до стаціонарного рівня внаслідок переорієнтації дифузійних потоків, коли зростає роль транспорту кисню у корінь із надземної частини. Надходження кисню у корені з надземної частини, що має місце при частковому затопленні проростків, для сорту Од51 є недостатнім, щоб компенсувати кисневий дефіцит для коренів, принаймні у перші години затоплення. Посилення внутрішнього транспорту кисню із листків у затоплену частину проростків відбувається лише через деякий час затоплення, коли градієнт концентрації кисню у системі надземна частина - корінь - вода уможливлює цей процес. Для проростків сорту М808 базипетальний транспорт кисню з листків до затоплених органів з самого початку є досить ефективним, тому частка цього кисню у підтримці дихання залитих водою тканин також є досить високою.

Рис. 3. Зміни концентрації кисню у воді при частковому (1) та повному (2) затопленні проростків озимої пшениці сорту Одеська 51 (А) і Миронівська 808 (Б).

Швидкість дифузії газів у рослинних тканинах визначається їх морфологією і залежить, зокрема, від пористості [Вартапетян, 1982; Armstrong, Beckert, 1987]. При порівнянні проростків чотирьох сортів, у т.ч. Од51 і М808, було встановлено, що пористість як надземної частини проростків, так і їх кореневої системи вища для рослин більш стійких сортів.

Оцінювали ступінь впливу на ріст умов затоплення та залежність ефекту від концентрації кисню у навколишньому середовищі. Достовірне зменшення відносної швидкості росту спостерігали вже через 5 год. затоплення. При цьому визначена полярографічно концентрація кисню у воді, що затоплює рослини, складає близько 75-85% від початкової, тобто, вже незначне погіршення ситуації із забезпеченням киснем справляє на проростки відчутний негативний вплив. Збільшення тривалості затоплення веде до подальшого падіння вмісту кисню у воді та зростання викликаного цією обставиною ріст-інгібуючого ефекту. При збільшенні глибини затоплення відбувається зменшення приросту довжини рослин, зафіксоване після впливу гіпоксії. Гальмування їх росту при малій товщині водного шару (часткове затоплення, глибини 4 та 8 см) є не дуже великим порівняно до повного затоплення проростків (18,5 см). Особливо чітко негативний ефект гіпоксії проявляється для коренів проростків сорту Од51, для проростків сорту М808 навіть у варіанті повного затоплення спостерігається менший вплив гіпоксії на ріст кореневої системи, що вказує на кращий кисневий режим її апікальної ділянки, який підтримується за рахунок внутрірослинного надходження кисню.

Таким чином, отриані дані свідчать про важливість для життєдіяльності рослин в умовах гіпоксії кисню, який поглинається незатопленою частиною листків та використовується на потреби всієї рослини. Внутрішній газовий об'єм тканин виступає в ролі буфера, мінімізуючи до деякої міри вплив низької зовнішньої концентрації кисню на дихання затопленої частини проростків. Компенсаційне значення аксіального транспорту кисню залежить від частки газових об'ємів в органах рослини - при високій пористості його ефективність вища, при менших значеннях внутрішній транспорт проявляється лише при відносно низькій його концентрації навколо затоплених органів та у них самих. Для виникнення такого транспорту всередині рослини необхідний деякий час та умови достатньої аерації листкового апарату.

Зміни показників дихання рослин при гіпоксії

Було проведено дослідження дихальної активності ізольованих коренів та надземної частини проростків озимої пшениці чотирьох різних за чутливістю до гіпоксії сортів. У порядку збільшення стійкості до кисневого дефіциту їх згідно із запропонованим параметром W можна розташувати у ряд Лютесценс 7 (Л7) - Миронівська 29 (М29) - Миронівська 40 (М40) - М808. Динаміку змін дихальної активності проростків сорту М808 при повному затопленні репрезентують дані табл.3. Швидкість поглинання кисню кореневою системою вже через 5 год. затоплення реєструється на більш низькому рівні, ніж у контрольного варіанта. При збільшенні тривалості гіпоксичного впливу відбувається подальше зменшення цього показника і через добу спостерігається приблизно вдвічі менша порівняно до початкових значень інтенсивність дихання. Іншою є ситуація для надземної частини проростків в цих умовах: спершу відбувається деяке зниження швидкості утилізації кисню, що у подальшому відновлюється фактично до початкового рівня (зміни відносно контролю недостовірні). Як у випадку надземних органів, так і для кореневої системи виявлено зростання відносної активності альтернативного шляху дихання у перші години затоплення, що зберігається при подовженні гіпоксичного впливу до 17 год. Далі відбувається достовірне збільшення інгібуючого впливу азиду та відповідне зменшення дії БГК на загальну швидкість поглинання кисню, що свідчить про підвищення активності цитохромного шляху. Через добу після початку затоплення активність альтернативної оксидази реєструється на значно меншому рівні, ніж у контрольному варіанті. Особливо слід зауважити, що вказані зміни спостерігаються як для надземної частини проростків, так і для їх кореневої системи однаковим чином. Схожі результати було отримано при порівняльному аналізі змін дихальної активності проростків інших сортів - Л7, М29 та М40. Дані дослідів наведено у табл.4. Після тривалого затоплення відбувається зменшення швидкості поглинання кисню кореневою системою проростків, особливо чутливих сортів. Подібні, але менш виражені зміни цього показника відзначено й у випадку надземної частини рослин.

Таблиця 3 Зміни дихальної активності надземної частини та коренів проростків сорту Миронівська 808 при затопленні

Таблиця 4 Зміни дихальної активності надземної частини та коренів проростків різних сортів озимої пшениці при затопленні протягом 21 год.

Таким чином, проростки більш стійких до впливу гіпоксії сортів здатні в умовах затоплення підтримувати дихальну активність на вищому рівні, ніж рослини чутливих сортів. Ще більша різниця між відносно стійкими та чутливими сортами спостерігається у змінах перерозподілу електронного транспорту між альтернативним та цитохромним шляхами: якщо у проростків М808 і М40 відбувається суттєве зменшення частки альтернативної оксидази у сумарному процесі утилізації кисню при тривалому затопленні, то рослини менш стійких сортів Л7 і М29 не здатні обмежити її функціональну активність в умовах значного кисневого дефіциту. Характер таких перебудов термінальної ділянки дихання у надземній частині та кореневій системі проростків є дуже подібним і відбувається паралельно, що може додатково свідчити про їх невипадкове походження.

Питання про участь шляху переносу електронів до кисню через альтернативну оксидазу в умовах гіпоксії у літературі практично не розглядалося з огляду на відсутність спряження електронного транспорту з генерацією макроергів. Функціонування альтернативного шляху транспорту електронів при стресах може послабити процеси деградації за рахунок зменшення концентрації супероксид-радикалів та інших форм активного кисню у Мх і зменшити швидкість перекисних та вільнорадикальних реакцій у клітині до безпечного рівня [Purvis, Shewfelt, 1993; Popov et al., 1997].

Відомо, що окисно-відновний баланс Мх є фактором, що контролює активність альтернативної оксидази. Добре встановленим фактом є залежність ступеня залучення альтернативного шляху від рівня відновленості убіхінону, на ділянці якого відбувається розгалуження двох ланцюгів електронного транспорту. Було встановлено, що в зразках, отриманих з етіольованих проростків пшениці, при температурі рідкого азоту спостерігається характерний спектр ЕПР марганцю і синглетний сигнал з g-фактором вільного електрону. Збільшення концентрації парамагнітних центрів в органах проростків при збільшенні тривалості затоплення відбувається у тому ж часовому інтервалі, що і перебудови термінальних шляхів. Досить повільне монотонне збільшення сигналу ЕПР спостерігається на початку затоплення, і через 10 год. концентрація парамагнітних центрів в коренях проростків сорту М808 перевищує рівень контролю на 34±11%, а через 14 год. - на 68±15%. Далі цей показник зростає швидше, і через 17 год. реєструється перевищення початкового рівня на 122±16%, а через 22 год. затоплення- на 201±51%. Таким чином, у той час, коли відбувається зменшення активності альтернативного шляху електронного транспорту, реєструється більш швидке збільшення сигналу ЕПР. Подібні зміни спостерігаються у надземній частині, але з деяким відставанням порівняно до того, які відбувається у їх коренях. Це свідчить про підвищення ступеню відновленості переносників і, відповідно, пулу убіхінону у електрон-транспортному ланцюзі Мх. Інтенсифікація у гіпоксичних умовах електронного транспорту через альтернативний шлях за рахунок збільшення його частки може знизити кількість недоокислених інтермедіатів гліколізу [Kennedy et al., 1992] та активних форм кисню [Wagner, Moore, 1997], високий вміст яких негативно впливає на життєдіяльність клітини. Тому можна говорити про адаптивний характер таких перебудов дихального метаболізму в умовах помірної гіпоксії. При зростанні напруженості кисневого дефіциту енергетичні втрати вже є критичними, тому зменшення зайнятості альтернативного шляху електронного транспорту, що спостерігається при великих тривалостях затоплення, є цілком закономірним.

Вплив затоплення на синтез білків проростків озимої пшениці

Оскільки існують відмінності у реакції різних сортів озимої пшениці на затоплення, є підстави думати, що ця ознака генетично детермінована і її реалізація має бути пов'язана з процесами білкового синтезу. Враховуючи отримані дані, що свідчать про інтенсифікацію альтернативного шляху транспорту електронів, особливу увагу було приділено пошуку відповіді на питання, чи пов'язані згадані зміни також і з посиленням синтезу білка альтернативної оксидази.

Було проведено дослідження впливу затоплення на склад та синтез загальних та мітохондріальних поліпептидів проростків озимої пшениці різних сортів. Додаткову інформацію про характер змін складу новосинтезованих білків отримали при порівнянні ефекту гіпоксії та температурного (тепловий шок та дія холоду) фактора. Вплив затоплення на синтез білків озимої пшениці залежно від сорту відзначено після зниження концентрації кисню у воді до рівня 20-70%. Якщо внаслідок поглинання рослинами кисню його концентрація у воді спадає швидше, ніж 20-25 %/год, то навіть у проростках найвитриваліших із досліджених сортів - Киянки і М808 - відбувається значне сповільнення білоксинтетичних процесів і зміни інтенсивності окремих смуг на автографах не детектуються. Загалом, більш стійкі до затоплення сорти здатні довше підтримувати синтез нових білків на достатньо високому рівні, ніж чутливі, у яких зміни мають скоріше кількісний, ніж якісний характер. Відмінності в складі новосинтезованих поліпептидів для контрольних і дослідних рослин спостерігаються для зразків як сумарного білка, так і білка Мх (рис. 4).

Рис. 4. Cпектр новосинтезованих сумарних (ліворуч) і мітохондріальних (праворуч) білків проростків озимої пшениці сортів Миронівська 40 (М40) і Миронівська 808 (М808): ТШ - тепловий шок (+41°C, 2 год); Х - дія холоду (+4°C, 7 діб); К - контроль; З - вплив гіпоксії (затоплення 26 год). Стрілками позначено спільні зони мінливості.

В умовах затоплення посилюється питома інтенсивність синтезу поліпептидів з мол. м. 18, 23, 25, 32, 35, 48, 57 кД та БТШ70 і БТШ90. Для білка Мх основні зміни інтенсивності смуг новосинтезованих поліпептидів для усіх трьох чинників детектуються у ділянці 70, а для впливу холоду і затоплення також 35 кД. Останній може бути приналежним до альтернативної оксидази. Таким чином, при експериментальному моделюванні гіпоксії шляхом затоплення може відбуватися зростання транспорту електронів у Мх проростків через альтернативний шлях як внаслідок активації альтернативної оксидази, так і завдяки збільшенню її кількості у цих органелах.

Таблиця 5 Питома інтенсивність синтезу білків проростків пшениці в умовах затоплення у шаперонних ділянках електрофоретичного спектра (за включенням радіоактивної мітки)

Примітка. ^* Кінцева концентрація кисню у воді. “-” - даних немає.

Для досліджуваних факторів виявлено спільні ділянки перебудов білкового синтезу, а саме 16-18, 35, 71-73 і 82 кД. Деякі результати кількісної оцінки змін інтенсивності смуг на радіоавтографах у зазначених ділянках наведено у табл.5. Загальна тенденція, що спостерігається при порівнянні змін у зразках загального і мітохондріального білка, свідчить про більшу чутливість спектра сумарних білків проростків до дії досліджуваних факторів. На підставі аналізу отриманих даних можна також дійти висновку, що у проростках сортів, більш чутливих до дії конкретного чинника, зокрема, кисневого дефіциту, індукція синтезу білків у ділянках БТШ70 і БТШ90 виражена слабкіше, ніж у більш стійких сортів.

ВИСНОВКИ

1. В модельних дослідах з озимою пшеницею показано, що найбільшою чутливістю до впливу гіпоксії відзначаються початкові етапи розвитку рослин.

2. Здатність проростаючого насіння та проростків досліджених сортів озимої пшениці з різною ефективністю використовувати кисень з води при затопленні корелює з рівнем стійкості до гіпоксичних умов.

3. Запропоновано безрозмірний параметр W, що пов'язує початкову швидкість поглинання кисню з води V₀ (виражену у %/год.) та напівлетальну тривалість затоплення LD_{50 зат} (виражену у год.): W=1-100%/(V₀·LD_{50 зат}), від'ємні значення якого свідчать про сильну залежність рослин від умов аерації, а додатні - вказують на більш високу ступінь стійкості до гіпоксії.

4. Достовірний ріст-інгiбуючий вплив помірної гіпоксії (при зменшенні концентрації кисню у воді до 75-85% від умов рівноваги) при температурі 22°C фіксується вже після короткочасного (5 год.) повного затоплення рослин. Значна затримка розвитку та сповільнення росту кореневої системи проявляється навіть в умовах часткового затоплення проростків.

5. За умов кореневої гіпоксії листковий апарат частково компенсує кисневий дефіцит кореневої системи рослин за рахунок базипетального транспорту кисню.

6. В умовах повного затоплення відбувається зниження інтенсивності дихального метаболізму, особливо кореневої системи. Спостерігається двофазний характер змін участі альтернативного шляху дихання, що можуть носити адаптивний характер. При затопленні посилюється синтез мітохондріального поліпептиду з мол. м. 35 кД, який вірогідно являє собою мономер альтернативної оксидази.

7. За умов кисневого дефіциту у проростках озимої пшениці відбувається індукція синтезу загальних та мітохондріальних білків у ділянках БТШ70 і БТШ90, причому у більш стійких до гіпоксії сортів цей ефект проявляється сильніше. Вказані білки можуть виконувати роль шаперонів у клітині, захищаючи функціональні надмолекулярні структури від пошкоджень в умовах гіпоксичного впливу.

8. Запропоновані підходи та знайдені в роботі закономірності можуть бути використані у селекційній практиці та для розробки способів боротьби з гіпоксією вищих рослин.

результати дисертацІЇ опублІковано в роботах

1. Майор П.С. Устойчивость к гипоксии озимой пшеницы на ранних стадиях развития // Физиология и биохимия культ. растений. - 1995. - 27, №4. - C. 269-275.

2. Майор П.С. Розвиток гіпоксії при частковому затопленні етіольованих проростків озимої пшениці // Физиология и биохимия культ. растений. - 1998. - 30, №2. - C. 131-137.

3. Майор П.С., Половинкін І.Г., Кравець В.С. Вплив низьких температур та затоплення на синтез білків етіольованих проростків озимої пшениці // Физиология и биохимия культ. растений. - 1999. - 31, №2. - C. 123-128.

4. Майор П.С., Половинкін І.Г., Кравець В.С. Синтез загальних та мітохондріальних білків озимої пшениці при дії низьких температур та за умов гіпоксії // Доповіді НАН України. - 1999. - №8. - C. 152-156.

5. Майор П.С. Кинетика потребления кислорода корнями проростков пшеницы при моделировании гипоксии // Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов: Тез. науч. конф. - Уфа, 1989. - Ч. 2. - С. 4.

6. Майор П.С., Половинкин И.Г. О возможности повышения продуктивности растений в условиях гипоксии // Экологические вопросы рационального природопользования: Тез. докл. 8-й конф. молодых ученых-биологов. - Рига, 1989. - С. 109.

7. Майор П.С. Периодические колебания скорости убыли кислорода в воде, затапливающей проростки // Актуальные проблемы физиологии растений и генетики: Тез. докл. конф. молодых ученых. - Киев, 1992. - С. 86.

8. Майор П.С. Стiйкiсть насiння сортiв озимої пшеницi до гiпоксiї // II З'їзд Укр. т-ва фiзiологiв рослин (Київ, 1993 р.): Тез. доп. - Київ, 1993. - Т. 1. - С. 139-140.

9. Майор П.С. Про можливу роль альтернативної оксидази при адаптації проростків озимої пшениці до гіпоксії // Актуальні проблеми фізіології рослин і генетики: Тези доп. VI конф. молодих вчених, присвяченої 50-й річниці з дня заснування Інституту фізіології рослин і генетики НАН України. - Київ, 1996. - С. 58-60.

10. Major P.S. The effect of flooding on the oxygen consumption and synthesis of mitochondrial proteins by winter wheat seedlings // Bulg. J. Plant Physiol. - 1998. - Spec. issue. - P. 291.

11. Майор П.С. Синтез мітохондріальних білків проростків пшениці в умовах гіпоксичного впливу // Інтегративність функцій рослинного організму: Тези доп. наук.-практичн. конф. молодих вчених. - Київ, 1998. - С. 26-29.

Размещено на Allbest.ru