Створення вихідного матеріалу для селекції ярого ячменю з роздільним і комплексним застосуванням гамма-променів і хімічних мутагенів

Розглядаються викладені різними дослідниками особливості та методи індукованого мутагенезу: радіаційний і хімічний мутагенез, модифікування індукованого мутагенезу, генетичні ефекти спільного застосування радіації та хімічних мутагенів при створенні вихідного матеріалу в селекції.

Умови, матеріал і методика досліджень

Експерименти проводилися в 1996-1999 рр. на дослідному полі Харківського ДАУ. Грунтовий покрив представлений міцним структурним чорноземом на глинистому карбонатному лесі.

Метеорологічні умови в роки проведення дослідів відрізнялися за температурним режимом і зволоженням. Коливання температурного режиму та кількості опадів вище і нижче середньої норми негативно вплинули на ріст і розвиток рослин ячменю. В квітні 1996 р. кількість опадів була на рівні середньої багатомісячної. Це сприяло появі сходів. Однак у травні, червні та липні було сухо і середньомісячна температура перевищувала середню багатолітню. Це вплинуло на ріст і розвиток рослин, знижуючи їх життєздатність і фертильність в М₁. В 1997 р. достатня кількість вологи та невисока температура сприяли росту і розвитку рослин в М₂. В 1998 р. комбінована посуха (незначна кількість води в грунті, сухе, спекотливе повітря протягом всього вегетаційного періоду) мала негативний вплив на ріст і розвиток рослин ячменю.

Дослідження проводились на сортах ярого ячменю різних еколого-географічних груп: Старт, Звершення, Спомин. Насіннєвий матеріал сортів Звершення та Спомин представлений Інститутом рослинництва ім. В.Я.Юр'єва, насіння сорту Старт - кафедрою генетики, селекції та насінництва ХДАУ.

Як хімічні мутагени для обробки насіння використовували діетілсульфат (ДЕС) в концентраціях 0,05; 0,1; 0,2% та етиленімін (ЕІ) в концентраціях 0,0001; 0,006; 0,012; 0,025%. Експозиція обробки складала 12 годин. Потім насіння промивали в проточній воді протягом однієї години і підсушували. Контролем було насіння, намочене у воді. опромінювали насіння в лабораторії кафедри молекулярної та прикладної біофізики ХНУ -променями ⁶⁰Со у дозах 500, 5000, 10000 та 15000Р з інтенсивністю 800 Р/хв та енергією випромінювання 1 МеВ. Контролем було неопромінене насіння.

При спільному застосуванні мутагенів і модифікатора (малої дози мутагена) обробку насіння проводили різними способами. В одному випадку насіння ячменю сорту Спомин у повітряносухому стані спочатку опромінювали -променями в дозі 500Р, а потім намочували в розчинах ДЕС (0,05; 0,1; 0,2%) і ЕІ (0,006; 0,012; 0,025%) протягом 12 годин. У другому випадку насіння спочатку намочували в розчинах ДЕС (0,05; 0,1; 0,2%) і ЕІ (0,006; 0,012; 0,025%) при тій же експозиції, потім підсушували до повітряносухого стану й опромінювали дозою (г500Р).

Для вивчення взаємодії різних концентрацій хімічних мутагенів насіння спочатку обробляли мутагенами ДЕС і ЕІ вказаних концентрацій, а потім замочували на протязі 12 годин у розчині ЕІ низької концентрації (0,0001%).

В одному з варіантів насіння ячменю піддавали дії -променів (5000; 10000; 15000Р) після попереднього опромінення малою дозою (500Р). При зворотній послідовності повітряносухе насіння піддавали впливу малої дози (500Р) після попереднього опромінення їх дозами 5000, 10000 та 15000Р.

Для визначення модифікуючого впливу низької концентрації ЕІ (0,0001%) на опромінене насіння ячменю спочатку діяли вказаними вище дозами, а потім намочували його протягом 12 годин у розчині ЕІ 0,0001% концентрації. У всіх дослідах паралельно проводили обробку насіння у воді.

Для лабораторних цитологічних досліджень використовували 100 насінин кожного варіанта. Насіння пророщували в чашках Петрі. Пророслі корінці довжиною 3-5 мм фіксували в суміші етилового спирту й оцтової кислоти (3:1) при експозиції 12 годин. Зберігали корінці в 70% спирті. Готували тимчасові ацетокармінові препарати. Розглядали їх під світловим мікроскопом типу МБІ-3. Враховували хромосомні порушення в анафазах мітозу, розглядаючи по 700-1050 анафаз в кожному варіанті за методикою Абрамова З.В. (1992р.).

В М₁ проводили фенологічні спостереження, визначали польову схожість і життєстійкість рослин, враховували морфологічні аномалії та стерильність рослин.

Для одержання другого мутантного покоління (М₂) посів проводили цілим колоссям з розрахунку 24 колоси на 1 м². Протягом усього періоду вегетації облічували хлорофільні, стерильні і морфофізіологічні мутації. Рослини зі зміненими ознаками описували, етикетували та прибирали окремо. Проводили підрахунки випадків мутацій на 100 сімей. Всі відібрані в М₂ рослини висівали посімейно окремо рядками для вивчення характеру спадковості та подальшої мінливості в М₃.

Біохімічний аналіз зерна ячменю на вміст білка та лізину проводили в технологічній лабораторії Інституту рослинництва ім. В.Я.Юр'єва УААН і в лабораторії масових аналізів ХДАУ. Для цієї мети аналізували індуковані мутанти М₃, а також нативні лінії сортів Старт і Звершення, відібрані підряд в М₂ з варіантів ДЕС (0,05; 0,1; 0,2%), ЕІ (0,006; 0,012%) і -опромінювання (5000; 10000; 15000Р). У сорту Спомин були відібрані нативні лінії серед нащадків немутованого насіння М₂ і серед фенотипів змінених нащадків М₂.

Статистичну обробку даних проводили визначенням процентної величини та методом обчислення дисперсійних аналізів і коефіцієнтів кореляції (r) та варіації (V). Різницю між окремими варіантами дослідів визначали показником НІР.

Математичну обробку даних було здійснено на ПЕОМ за допомогою пакета прикладних програм обробки результатів селекційних і генетичних експериментів (ППП “ОСГЕ”), створеного у відділі генетичних основ селекції інституту рослинництва ім. В.Я.Юр'єва УААН за методиками Літуна П.П., Бєлкіна О.О., Белянського О.І. (1992-1994 рр).

Дія радіації та хімічних мутагенів при роздільному і спільному застосуванні на хромосоми, ріст і розвиток ярого ячменю в М₁

Цитогенетичний аналіз. Аналіз частоти хромосомних перебудов показав, що хімічні мутагени і -промені вплинули на структуру хромосом, порушивши хід мітозу в клітинах проростків. Спостерігалася пряма залежність виходу хромосомних перебудов від доз мутагену.

При спільному застосуванні хімічних мутагенів і малої дози -променів майже у всіх випадках спостерігалося зниження частоти хромосомних порушень в порівнянні з роздільним застосуванням на сорті Спомин. Більш істотним це зниження було у варіанті з високою концентрацією хімічного мутагена ДЕС - 0,2%, який при роздільному застосуванні саме в цій концентрації викликав стовідсоткову летальну дію (ЛД₁₀₀). Менш істотним вплив мутагена був на фоні -опромінення насіння. Додаткова ж обробка -опроміненого насіння мутагеном ЕІ 0,0001% істотно знижувала частоту хромосомних порушень (рис. 1,2).

Цитогенетичний ефект залежав від сполучення мутагенних факторів та їх послідовності: був синергичним, тобто перевищував суму ефектів, викликаних кожним мутагеном у окремому випадку (варіанти 500Р+ДЕС 0,2% в прямій і зворотній послідовності; 5000 Р + 500 Р? 15000Р+500Р; ДЕС 0,2%+ЕІ 0,0001%); адитивним, тобто дорівнював сумі ефектів кожного сполучення в цьому ж дозуванні (варіант 10000Р+500Р); антагоністичним, тобто знаходився на більш низькому рівні, ніж у випадку дії одного мутагенного фактора (варіанти 500Р+ДЕС 0,1%; 500Р+ 5000Р; 500Р + 10000Р; 5000Р+ЕІ 0,0001%; 10000Р+ЕІ 0,0001%; 15000+ЕІ 0,0001%).

Рис. 1 Частота хромосомних аберацій в залежності від концентрації хімічних мутагенів і способу обробки модифікаторами (500Р и ЕІ 0,0001%) в клітинах кореневої меристеми проростків ячменю сорта Спомин

Рис. 2 Частота хромосомних аберацій в залежності від дози -променів і способу обробки модифікаторами (500Р и ЕІ 0,0001%) в клітинах кореневої меристеми проростків ячменю сорту Спомин

Аналізуючи одержані дані, можна припустити, що 500Р у попередній обробці та ЕІ 0,0001% у післямутагенній обробці справляли репарагенну дію, знижуючи рівень пошкоджень хромосом, викликаних хімічними мутагенами та -променями. Захисний ефект малої дози -променів (500Р) пояснюється, певно, безпосередньою реакцією цієї дози мутагена з ДНК і білками хромосом у клітині, що активізує синтез ДНК та РНК і призводить до репарації пошкоджень хромосом, індукованих мутагенами. Генозахисні дії ЕІ 0,0001% є, певно, ефектом комбінованої дії фізичних і хімічних мутагенних факторів, тобто толерантності.

Роздільна дія радіації та хімічних мутагенів на ріст і розвиток рослин ячменю в М₁. Польова схожість насіння ячменю змінювалася під впливом хімічних мутагенів і -променів у більшості варіантів обробки. При цьому позначився вплив як мутагенів та їх доз, так і сортових особливостей. ЕІ у всіх концентраціях знижував польову схожість насіння, в концентрації 0,025% виявився летальний ефект у всіх сортів. Навіть в концентрації 0,012% цей мутаген виявився дуже токсичним для сорту Спомин. ДЕС в концентрації 0,2% також справив летальну дію на цей сорт. При застосуванні 0,05 і 0,1% концентрацій ДЕС виявилися стимулюючі реакції у сортів Старт і Звершення (табл. 1,1).

При застосуванні -променів у високих дозах спостерігалася пригнічуюча дія для насіння сорту Спомин (майже на 50%). У випадку застосування дози 5000Р підвищувалася польова схожість насіння сорту Старт. Цей показник збільшився в порівнянні з контролем при опромінюванні насіння сортів Звершення та Спомин середньою дозою ( 10000Р).

Таблиця 1

Вплив хімічних мутагенів і -променів на польову схожість (1) і виживання (2) рослин ярого ячменю в М₁, %

Важливим показником чутливості рослин до мутагенної дії є їх виживаємість. В наших дослідженнях відмічено зниження виживаємості рослин із збільшенням концентрації мутагена (табл. 1,2). Найбільш сильний вплив на виживаємість рослин сорту Старт мав ЕІ в концентрації 0,025%: вижило лише 10,8% рослин. У сортів Звершення та Спомин ЕІ в цій концентрації викликав ЛД₁₀₀. У сорту Спомин повністю загинули рослини при застосуванні ЕІ в концентрації 0,012%. В свою чергу ДЕС при високій концентрації (0,2%) справив сильну негативну дію на виживаємість рослин сорту Спомин (вижило лише 5,9% рослин) і не вплинув на цю ознаку у сорту Звершення. Але при цьому ДЕС в низьких концентраціях виявив стимулюючу дію у сортів Старт і Звершення. Це можна пояснити різною сортовою реакцією на дію мутагенів.

Застосування гамма-променів у всіх дозах не викликало зниження виживаємості рослин у сортів Старт і Звершення, а у сорту Спомин вплив був дуже сильним: у варіанті 15000Р вижило лише 1,3% рослин. Отже, дія кожного мутагена відрізнялася специфічністю і залежала від сорту. Якщо для одного сорту одна й та ж доза, або концентрація мутагена мала напівлетальний або летальний ефект, то для інших сортів виживаємість досягала досить високого рівня.

Ефект спільної дії радіації та хімічних мутагенів. Комбіноване застосування радіації та хімічних мутагенів у ряді випадків мало позитивний вплив на ріст і розвиток рослин ячменю сорту Спомин. Дія на насіння цього сорту малої дози радіації та високої концентрації мутагена ДЕС (0,2%) справила стимулюючий ефект за ознакою польової схожості: 76,4% проти 3,4% у варіанті без додаткової обробки. При зворотній послідовності обробки насіння тими ж дозами мутагенів також спостерігалося підвищення польової схожості, але тільки до 28,4% в порівнянні з роздільною дією.

Обробка -опроміненого (500Р) насіння розчином ЕІ в середніх і високих концентраціях (і у прямій, і у зворотній послідовності) викликала негативний ефект за ознакою польової схожості. Хоч мала доза радіації як модифікатор справила щось схоже на захисний ефект, викликаючи адаптивну реакцію при цих концентраціях, вона не змогла повністю відновити зруйновані ЕІ системи (табл.2).

Взаємодія низької та середньої доз -променів при постмутагенній обробці малою дозою мутагена 500Р не призвела до істотних змін польової схожості. А при опроміненні дозою 15000Р після попередньої дії малої дози відбулася позитивна реакція (58,6% проти 46,2% на варіанті без додаткової обробки).

Вплив низької концентрації ЕІ (0,0001%) і води на польову схожість при постмутагенній обробці в багатьох варіантах був приблизно однаковим. ДЕС в середній і високій концентраціях, застосований спільно з ЕІ 0,0001% і водою, був менш токсичним. Таку ж реакцію на додаткову обробку виявив мутаген ЕІ. Щодо -променів, то тут додаткова обробка дала позитивний результат тільки при дозі 15000Р (відповідно 69,4 і 71,2% проти 46,2% на варіанті без додаткової обробки).

Вивчався вплив хімічних мутагенів і -променів при спільному застосуванні з малою дозою мутагена 500Р на життєздатність рослин ячменю сорту Спомин. Дослідження показали, що вплив додаткової обробки малою дозою -променів на цей показник залежав від характеру основної обробки. У варіанті з високою концентрацією ДЕС додаткове опромінення малою дозою -променів підвищило у 10 разів виживаємість (табл. 3). У варіанті з постмутагенною обробкою також спостерігалося підвищення виживаємості рослин в середньому в чотири рази. Додаткова обробка на фоні ЕІ (0,025%) була не ефективною.

Взаємодія мутагенних доз -променів і малої дози цих же променів не викликала істотного підвищення виживаємості. При постмутагенній обробці спостерігалося навіть її зниження в порівнянні з контролем.

Врешті-решт мала доза -променів як модифікатор, викликаючи епігенетичну мінливість, показала стимулюючий ефект на фоні хімічного мутагена ДЕС і не була ефективною на фоні ЕІ.

Застосування помірної концентрації ЕІ при постмутагенній обробці було ефективним за даним тестом на фоні хімічного мутагена ДЕС. Схожий результат дала постмутагенна обробка насіння водою. Додаткова обробка не дала позитивного результату у варіантах з мутагеном ЕІ, за винятком варіанта з постмутагенною обробкою ЕІ 0,0001%. На фоні -променів додаткова обробка ЕІ 0,0001% підвищила виживаємість рослин у варіанті з найвищою дозою (15000Р).

Дія радіації та хімічних мутагенів на мінливість ячменю в М₂ при їх роздільному та спільному застосуванні

Загальна частота мутацій, індукована відповідним мутагеном, є одним з найбільш ефективних критеріїв оцінки мутагенної активності в М₂. Частота мутацій при роздільній дії хімічних мутагенів і -променів варіювала в залежності від виду мутагенного фактора, дози дії та сортових особливостей.

Як правило, частота мутацій збільшувалася з підвищенням дози мутагенів. Однак таке підвищення не завжди призводило до значної зміни частоти мутацій. Для сорту Звершення дія ДЕС в концентраціях 0,1 і 0,2% викликала приблизно однаковий вихід мутацій, що свідчить про неефективність застосування високих доз. Тому рекомендуються помірні дози мутагенів. При застосуванні ЕІ у сортів Старт і Звершення частота мутацій була високою при середній концентрації мутагена, а у сорту Спомин - при низькій. Це пояснюється тим, що і висока, і середня концентрації ЕІ у відповідних варіантах викликали ЛД₁₀₀ вже в першому поколінні. При вивченні генетичної активності дії радіації на рослини ячменю найбільш ефективним виявилось опромінення в дозі 10000Р для сорту Спомин і 15000Р для сорту Старт.

Порівнюючи мінливість сортів ячменю при обробці насіння рослин хімічними мутагенами та -променями, слід зазначити, що сорти проявили ранню мутабельність, що свідчить про велике значення особливостей генотипу сорту в мутаційному процесі. Величина загальної частоти мутацій у сорту Спомин була вищою майже у 2,5 рази, ніж у сорту Звершення, і майже у 1,5 рази вище, ніж у сорту Старт.

Досліди на сорті Спомин показали, що генетичні ефекти від дії мутагенів змінювалися під впливом малої дози радіації та хімічного мутагена. Загальна частота мутацій в М₂ збільшилася в порівнянні з роздільною обробкою (табл. 5). При застосуванні 500Р у передмутагенній обробці відмічено збільшення частоти мутацій. Особливо висока загальна частота мутацій спостерігалась у варіанті з опроміненням дозою 10000Р і у варіанті з етиленіміном у концентрації 0,006% - відповідно: 23,4 і 26,7% проти 17,2 і 20,7% у варіанті без додаткової обробки.

Таблиця 5

Загальна частота мутацій у рослин ячменю сорту Спомин в М₂ під дією мутагенів з перед- і постмутагенною обробкою малими дозами радіації та хімічного мутагена, а також водою, %

Мала доза радіації в постмутагенній обробці підсилювала мутагенну ефективність у варіантах з попередньою обробкою низькими та середніми дозами мутагенів. При застосуванні дози 500Р вихід мутацій в цілому не дуже відрізнявся в залежності від послідовності обробки. Додатково опромінені 500Р варіанти мали більшу частоту мутацій на фоні хімічних мутагенів, але не так чітко виражену на фоні -променів. Варіанти з ЕІ 0,0001% мали зворотний характер. Саме у варіанті з 15000Р + ЕІ 0,0001% вихід мутацій був найбільшим - 32,6% проти 22,7% на контролі з водою. Слід зазначити, що дія -опромінення в дозі 15000Р як при самостійній обробці, так і у сполученні з 500Р в будь-якій послідовності викликала ЛД₁₀₀ вже в першому поколінні. Аналогічна закономірність спостерігалася на фоні ДЕС 0,2% при самостійній дії мутагена. Однак при сполученні ДЕС 0,2% як з ЕІ 0,0001%, так і з опроміненням 500Р вдалося одержати нададитивний ефект в М₂. Роздільна дія цих мутагенів викликала повну загибель рослин в М₁. При додатковій обробці збереглася частина рослин М₁ і підвищилася загальна частота мутацій в М₂.

В наших дослідах в М₂ виявлено хлорофільні, стерильні та морфофізіологічні мутації, в тому числі селекційно цінні. При роздільній, а також при спільній дії мутагенів із збільшенням їх доз зменшувалося число морфофізіологічних мутацій, особливо селекційно цінних, одночасно збільшувалася кількість летальних і стерильних форм. Спільна дія радіації та хімічних мутагенів давала в середньому у варіантах більший вихід морфофізіологічних мутацій порівняно з варіантами без додаткової обробки та варіантами з використанням води як додаткового фактора.

Спектр морфофізологічних мутацій при спільній обробці мутагенами був різним у різних випадках: в одних варіантах розширювався, в інших вужчав. При роздільній і спільній обробці у всіх варіантах з різною частотою виявлено мутації за ознакою, яка стосується ширини листової пластинки, висоти рослини, будови колоса, вищербленості остей, довжини вегетаційного періоду та багатьох інших ознак і властивостей.

Характер мінливості та рівень успадкування морфофізіологічних змін в М₃

Аналіз відібраного матеріалу показав різну мутабельність сортів ячменю, які вивчалися, при врахуванні нових змін в М₃. Загальна частота мутацій варіювала від 0,0 до 10,3% у сорту Старт, від 1,6 до 14,0% у сорту Звершення, від 3,8 до 17,0% у сорту Спомин, в залежності від виду мутагенів, їх доз і особливостей сорту. В М₃ сорт Звершення виявився більш мутабельним порівняно із сортом Старт.

При спільній обробці у випадку дії 500Р та ЕІ 0,0001% на фоні хімічних мутагенів і -променів у більшості варіантів вихід мутацій зменшувався порівняно з незалежною дією фонового мутагена на сорті Спомин. Загальна частота мутацій була високою у випадках поєднання 500Р з ДЕС 0,2%. Застосування опромінення 500Р на фоні ЕІ 0,006% не викликало перевищуючий ефект по відношенню до контролю. Однак дія 500Р на фоні -променів виявилась ефективною при опроміненні у дозі 5000Р. В М₃ постмутагенна обробка малою дозою -променів порівняно з передмутагенною була більш ефективною. Можливо, це пов'язано з різним ефектом радіобіологічної толерантності.

У досліді із застосуванням ЕІ 0,0001% в постмутагенній обробці відзначалося зменшення виходу мутацій. На фоні ДЕС при концентрації 0,1% та на фоні -променів у дозі 5000Р кращим був варіант з водою.

В цілому в М₃ відмічалося звуження спектра та зниження частоти мутацій порівняно з поколінням М₂. Можливо, це пов'язано із зменшенням гетерозиготності в кожному з наступних поколінь, а також із розвитком реакції адаптивної відповіді, викликаної алкиліюванням і малою дозою радіації у випадку комбінованої дії.

Перевірка мутантів на стабільність при аналізі успадкування змінених в М₂ ознак у варіантах як при роздільній, так і при спільній дії показала, що не всі новоутворення успадковувалися в М₃. Частина з них характеризувалася генетичною нестабільністю, тобто давала неоднорідне потомство. У ряді мутантних сімей спостерігалося розщеплення на вихідну форму, мутант і проміжну форму.

Мінливість якості зерна

Мінливість вмісту білка та лізину в зерні і лізину в білку мала протилежне співвідношення. Високобілкові мутанти (в 50% випадків) відрізнялися підвищеним вмістом лізину в зерні та зниженим вмістом лізину в білку, а низькобілкові - навпаки. Вміст лізину в зерні ячменю був високим у макромутантів із гладенькими остями і у форм без воскового нальоту відібраного з сорту Звершення у варіантах з 10000Р і з ДЕС 0,1%, відповідно 0,575 і 0,588% на суху вагу, проти 0,528% на контролі. Аналогічна тенденція існує у низькорослого хемомутанта, одержаного в результаті дії ЕІ 0,006% на сорті Спомин: 0,550 проти 0,500% на контролі. Такої закономірності не було у аналогічного мутанта сорту Старт. Однак при цьому сполученні підвищена білковість зерна з підвищеним вмістом лізину в білку спостерігалася у -мутанта з гладкоостими колосами, відібраного у сорту Звершення: 3,97 проти 3,69% на контролі. В останніх варіантах виявилася несполучність між вмістом білка в зерні та вмістом лізину в зерні і в білку. Прикладом може бути мутант із багаторядним колосом (10000Р), у якого вміст білка в зерні не перевищував контроль (0,423 проти 0,500%), а кількість лізину в білку збільшилася до 4,73% і перебуває у зворотній залежності від вмісту білка в зерні (8,95% проти 14,04% у материнській формі).

Більшість високобілкових мутантів, а також мутантів, які поєднують підвищений вміст білка та лізину в зерні і лізину в білку, одержано із застосуванням малої дози радіації ( 500Р) та хімічного мутагена (ЕІ 0,0001%) при спільній обробці ними сорту Спомин (табл. 6). Зміни вмісту лізину в зерні та лізину в мутантних формах, одержаних при спільній дії радіації та хімічних мутагенів, відбуваються у бік не тільки збільшення, а й зменшення. У більшості випадків один з цих показників збільшується. При цьому у варіантах 500Р+10000Р та 500Р+ЕІ 0,006% спостерігалося позитивне сполучення вмісту білка і лізину в зерні та вмісту лізину в білку.

Результати досліджень показали, що спільна дія мутагенів дозволяє отримати високолізинові та велокозернисті мікромутанти. Найбільший ефект спостерігався у варіантах 500Р+10000Р; ДЕС 0,1%+ 500Р; 10000Р+ЕІ 0,0001%. Позитивне сполучення білка та лізину в зерні і лізину в білку одержано у варіанті 500Р + 10000Р. В останніх варіантах спостерігалася несполучність між вмістом білка та лізину в зерні або лізину в білку паралельно з величиною зерна.

Таким чином, за допомогою радіації та хімічних мутагенів при роздільному і спільному їх застосуванні вдається значно розширити генетичну мінливість якості зерна ячменю, відібрати поліпшені за даною ознакою форми.

Висновки