Суспензійна культура пшениці Triticum aestivum L. та її використання в генетико-селекційних дослідженнях

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут фізіології рослин і генетики

УДК: 633.11:581.143.6:631.52+57.083

СУСПЕНЗіЙНА КУЛЬТУРА ПШЕНИЦІ TRITICUM AESTIVUM L. ТА ЇЇ ВИКОРИСТАННЯ В ГЕНЕТИКО-СЕЛЕКЦІЙНИХ ДОСЛІДЖЕННЯХ

03.00.12 - фізіологія рослин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Волощук Ганна Дмитрівна

Київ-2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Миронівському інституті пшениці ім. В.М. Ремесла УААН.

Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук Гірко Володимир Сергійович, Миронівський інститут пшениці ім. В.М. Ремесла завідувач відділу біотехнології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Сарнацька Вереса Василівна, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, провідний науковий співробітник

кандидат біологічних наук Панюта Ольга Олександрівна Київський Національний університет ім. Тараса Шевченка, доцент

Провідна установа: Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “21” грудня2000 р. о 10годиніна засіданні спеціалізованої ради Д 26.212.01 при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (03022, Київ-22, вул. Васильківська, 31/17).

Автореферат розісланий “14”11 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Мордерер Є.Ю.

АНОТАЦІЯ

Волощук Г.Д. Суспензійна культура пшениці Triticum aestivum L. та її використання в генетико-селекційних дослідженнях.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 -- фізіологія рослин. Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 2000.

Дисертацію присвячено застосуванню методів біотехнології (культури in vitro) в фундаментальних і прикладних дослідженнях. Розроблено методи ініціації та підтримки довгоживучої гетерогенної суспензійної культури пшениці з високою швидкістю росту, яка може служити модельною системою для вивчення фізіолого-біохімічних механізмів стійкості до стресових факторів, а також для оцінки стійкості генотипів. Наведено результати індукції морфогенетичних процесів в гетерогенній суспензійній культурі. Вивчено ростовi реакції суспензійної культури на додавання хлориду натрію, поліетиленгліколю, іонів алюмінію, а також культуральних фільтратів грибних патогенів Pseudocercosporella herpotrichoides, Septoria tritici та Fusarium graminearum. Встановлено сортоспецифічність таких реакцій, визначено умови адекватності та критерії оцінки стійкості до ряду біотичних та абіотичних стресових чинників у клiтинних культурах. Оптимальним кількісним показником стійкості генотипу до таких факторів є кількість життєздатних клітин у дисоційованій фракції гетерогенної суспензійної культури. гетерогенний суспензійний пшениця генотип

Ключові слова: Тriticum aestivum L., суспензійна культура, біотичні та абіотичні фактори, стійкість.

АННОТАЦИЯ

Волощук А.Д. Суспензионная культура пшеницы (Triticum aestivum L.) и ее использование в генетико-селекционных исследованиях.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.12 -- физиология растений. Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев, 2000.

Диссертация посвящена применению методов биотехнологии (культуры in vitro) в фундаментальных и прикладных исследованиях. В результате проведенной работы были разработаны методы инициации и поддержания долгоживущей гетерогенной суспензионной культуры пшеницы с высокой скоростью роста, которая может служить модельной системой для изучения физиолого-биохимических механизмов устойчивости к стрессовым факторам.

Для инициации суспензионной культуры использовали каллусы, полученные из незрелых зародышей, которые переносили в жидкую перемешиваемую среду. При этом образовывалась гетерогенная суспензия, содержащая одиночные клетки и рыхлые группы из 5-20 клеток (диссоциированная фракция), а также мелкие и крупные (до 2 мм) плотные глобулы (агрегированная фракция). Поскольку культивирование диссоциированной фракции, которую отделяли путем фильтрования через ткань, показало ограниченные способности к росту в жидкой среде и проявлению морфогенного потенциала после плейтинга на агаризованные среды, был предложен альтернативный способ: культивирование агрегированной фракции. Замена диссоциированной фракции свежей средой вызывала рост агрегированной фракции и отслоение клеток в среду, так снова образовывалась гетерогенная суспензионная культура (ГСК). Субкультивирование ГСК производилось каждые 7-14 суток (цикл субкультивирования) путем замены диссоциированной фракции свежей питательной средой. Плотность клеток в диссоциированной фракции в течение одного цикла быстро возрастала по S-образной кривой, в каждом последующем цикле плотность также превышала достигнутую ранее.

Среди всех испытанных источников для инициации ГСК (каллусные ткани, индуцированные из незрелых зародышей, непосредственно незрелые зародыши и незрелые соцветия, а также основания листа и кончики корешков асептически выращенных 7-суточных проростков) оптимальным типом экспланта являются основания листа проростков, которые сочетают способность индуцировать суспензию с достаточно высокой скоростью роста и возможность использования независимо от сезона. Среди испытанных 6 сред для поддержания ГСК: Мурасиге и Скуга, Шенка и Хильдебрандта, Гамборга В5, Дьюдитса (Т), Масуда, Торияма и Хината (АА) -- все, кроме последней, оказались пригодными, оптимальной была среда Мурасиге и Скуга, дополненная 2-5 мг/л 2,4-Д. Такие условия культивирования обеспечивали для всех изучаемых генотипов способность к росту в течение более года при высокой плотности клеток в конце цикла (106 кл./мл).

При периодическом чередовании сред, содержащих и не содержащих 2,4-Д, обнаружено, что в безгормональной среде диссоциированная фракция отличается меньшей плотностью клеток, но увеличением доли клеток меристематического типа, для агрегированной фракции характерна индукция ризогенеза. Глобулы агрегированной фракции после высева на агаризованные среды различного состава демонстрировали рост, индукцию ризогенеза и появление на свету зеленых точек. Наиболее интенсивно морфогенетические реакции отмечались на средах, дополненных гомогенатом незрелых зерновок.

Добавление в питательную среду хлорида натрия (солевой стресс), полиэтиленгликоля (осмотический стресс), ионов алюминия (ионный стресс) вызывало угнетение роста ГСК пшеницы. Адекватную реакцию контрастных по устойчивости к данным стрессам сортов наблюдали после 2-4 недель культивирования вприсутствии 0,1-0,4 М NaCl, 10-20 % ПЭГ-6000 и 1-2 мМ Al-ЭДТА, соответственно.

В средах, дополненных культуральными фильтратами (КФ) грибных патогенов Pseudocercosporella herpotrichoides, Septoria tritici и Fusarium graminearum (биотический стресс при поражении церкоспореллезной корневой гнилью, септориозом листья и фузариозом колоса, соответственно) наблюдали ризогенез и геммогенез агрегированной фракции (морфорегуляторный эффект), снижение плотности клеток в диссоциированной фракции (цитостатический эффект), некроз агрегированной фракции и снижение показателя относительной жизнеспособности клеток диссоциированной фракции (цитотоксический эффект). Реакция неустойчивого к данным патогенам генотипа во всех случаях была более выраженной. Показатель количества жизнеспособных клеток объединяет цитостатический и цитотоксический эффекты, а косвенно отражает и морфорегулятрный эффект, поэтому является наиболее адекватным.

Таким образом, ГСК пшеницы представляет теоретический интерес как модель для изучения физиолого-биохимических процессов и практическую ценность как система для оценки устойчивости генотипов.

Ключевые слова: Тriticum aestivum L., суспензионнная культура, биотические и абиотические факторы, устойчивость.

АBSTRACT

Voloshchuk H.D. Wheat (Triticum aestivum L.) suspension culture and its application in genetics and breeding.- Manuscript.

The thesis for Ph.D. degree on speciality 03.00.12 -- plant physiology. Institute of Plant Physiology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

The Ph.D. thesis is devoted to the employment of biotechnology viz. in vitro culture methods in theoretical and applied researches. The methods of induction and maintenance of long-termed heterogenous wheat suspension culture with high growth rate have been developed. It can be used as model system for studing of physiological and biochemical mechanisms of stress-resistance as well as for screening of resistant genotypes. The results of morphogenetic process induction in the suspension culture are presented. The suspension culture's growth responses to addition of sodium chloride, polyethylene glycol, ions of aluminium, and cultural filtrates of fungal pathogenes Pseudocercosporella herpotrichoides, Septoria tritici and Fusarium graminearum are studied. Variety-specificity of these responses is ascertained, the condition of adequacy and evaluation criteria of a number of abiotic stress factor-tolerance and disease-resistance at cell culture level are revealed.The optimal quantitative index of resistance to abiotic and biotic factors is viable cell number in dissociated fraction of geterogenous suspension culture.

Key words: Тriticum aestivum L., suspension culture, biotic and abiotic factors, tolerance.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнiсть теми. Пшениця (Triticum aestivum L.) -- найважливiша продовольча культура для економiки України -- як об'єкт бiотехнологiчних манiпуляцiй вивчена недостатньо. Основна увага як вiтчизняних, так i зарубiжних дослiдникiв була придiлена калусним культурам. Займаючи промiжне мiсце мiж калусними i протопластними культурами in vitro, суспензiйна культура, з одного боку, має ряд переваг над калусними культурами, а з iншого -- є джерелом протопластiв. Роботи, що стосуються суспензiйної культури пшеницi, носять переважно фрагментарний чи феноменологiчний характер. Тому детальне вивчення умов iндукцiї i культивування суспензiї пшеницi як модельної системи, зокрема, придатної для оцiнки впливу рiзних стресових факторiв, є актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках Державних комплексних науково-технiчних програм: 1986-1990 рр. -- О.СХ.01"Сельскохозяйственная биотехнология" (№ держреєстрації 0187.0028535); 1991-1995 рр. -- "Фундаментальні дослідження" (№ держреєстрації UA 01009537P); 1996-2000 рр. -- "Теоретичні основи селекції і насінництва сільськогосподарських культур" (№ держреєстрації 0197U019452).

Мета роботи -- визначити i оптимiзувати умови отримання суспензiйної культури пшеницi, а також розробити методи оцiнки селекцiйного матерiалу по ряду господарсько-корисних ознак з використанням суспензiйної культури. Для досягнення цiєї мети необхiдно було вирiшити такi задачі:

1. Випробувати рiзнi способи iндукцiї та пiдтримки суспензiйної культури пшеницi.

2. Оптимiзувати умови культивування гетерогенної суспензiйної культури пшеницi.

3. Провести дослiдження реалiзацiї морфогенного потенцiалу в гетерогеннiй суспензiйнiй культурi.

4. Розробити критерiї i методи оцiнки генотипiв на стiйкiсть до сольового, iонного, осмотичного стресiв та стiйкiсть до грибних патогенiв в модельних умовах.

Об'єкт дослідження -- культура in vitro пшениці.

Предмет дослідження -- показники росту та розвитку суспензійної культури різних генотипів пшениці при різних умовах культивування.

Методи дослідження -- методи культури in vitro, світлової мікроскопії, варіаційної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Удосконалено методи отримання довгоживучих гетерогенних суспензiйних культур пшеницi з високою швидкiстю росту: оптимізовано умови ініціації та підтримки суспезійної культури за типом експланта, складом поживного середовища, періодом субкультивування, придатні для різних генотипів. Вперше показана адекватнiсть реакцiї гетерогенної суспензiйної культури пшеницi як модельної системи на ряд бiотичних (культуральні фільтрати грибних патогенiв Fusarium graminеаrum, Pseudocercosporella herpotrichoides, Septoria tritici) та абiотичних (сольовий, осмотичний та іонний стрес) факторiв. Встановлено, що найбiльш придатним критерiєм оцiнки реакцiї клiтинних культур є кiлькiсть життєздатних клiтин в дисоцiйованiй фракцiї гетерогенної суспензiйної культури.

Практичне значення одержаних результатiв. Розробленi методи оцiнки генотипiв пшеницi на стiйкiсть до фузарiозу колоса, септорiозу листя, церкоспорельозної кореневої гнилi, засолення, закислення та засухи в клiтинних культурах можуть бути елементом як бiотехнологiчних, так i традицiйних селекцiйних програм. Отриманi результати оформленi у виглядi брошури “Методические рекомендации по получению суспензионной культуры мягкой пшеницы и ее применению в селекционно-генетических исследованиях in vitro” i можуть бути застосованi в роботi наукових та селекцiйних установ. За матерiалами роботи подані 2 заявки на винаходи.

Особистий внесок здобувача полягає в тому, що ним безпосередньо здійснено планування, підготовка та проведення лабораторних досліджень, проведено аналіз експериментальних даних, зроблено висновки. Персональний внесок здобувача у проведенні дослідів та отриманні експериментального матеріалу складає не менше 80 %, а у наукових працях, що опубліковані в співавторстві -- 40-70%.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на Міжнародній конференції "Агробиотехнологии растений и животных" (29-30 мая, 1997, Киев); ІХ International Congress on Plant Tissue and Cell Culture "Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century" (Jerusalem, Israel, June 14-19, 1998); II International Symposium on Plant Biotechnology (4-8 October 1998, Kyiv); II Міжнародній конференції "Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок в генетико-селекційних дослідженнях" (м. Одеса,1998), Міжнародній конференції "Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва" (м. Харків, 1999).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 наукових праць. З них 6 статей у провідних фахових виданнях.

Структура роботи. Дисертація містить список умовних скорочень, вступ, загальну характеристику роботи, огляд літератури за останні 40 років, опис матеріалів та методів дослідження, виклад результатів та їх обговорення (4 розділи), висновки, перелік посилань і 2 додатки. Робота викладена на 160 сторінках машинопису, містить 25 рисунків і 16 таблиць в основній частині та 12 у додатках. Список літератури налічує 295 посилань, в т.ч. 199 публікацій іноземними мовами.

В роботу включали 10 сортів озимої пшеницi Triticum aestivum L. та гiбриди F1і F2. Суспензiйну культуру ініціювали з калусів, одержаних з незрiлих зародкiв (10-13 дiб пiсля цвiтiння), а також з основ листкiв і кiнчиків корiнцiв асептично вирощених проросткiв та безпосередньо з незрiлих зародків (1-2 мм) і незрiлих суцвiть (5-30 мм) у середовищі MS (Murashige, Skoog, 1962) і SD (Sears, Deckard, 1982) з 2-5 мг/л 2,4-Д та 500 мг/л гiдролiзату казеїну, при ініціації з основ листків модифiкованому по Fe-EДTA згідно з Мезенцевим і Костенком (1987), і культивували на качалці шейкерного типу (180 rpm) в темряві при 26оС.

Подальше культивування утвореної гетерогенної суспензiйної культури (ГСК), що мiстила поодинокi клiтини i рихлi групи з 5-20 клiтин (дисоцiйована фракцiя), а також дрiбнi i великi (до 2 мм) глобули (агрегована фракцiя), здiйснювали двома способами. При першому -- через 3 тижнi пiсля iнiцiацiї її фiльтрували через тканиннi фiльтри. Агреговану фракцiю вiдкидали, а дисоцiйовану культивували далi, додавши поживне середовище (1:1). Другий спосiб, описаний Negrutiu i Jacobs (1977) для Arabidopsis thaliana, протилежний першому: дисоцiйовану фракцiю максимально декантували, а до агрегованого осаду додавали свiже поживне середовище i продовжували культивування. Першу замiну середовища проводили через 2-3 тижнi пiсля iнiцiацiї суспензiї, потiм -- кожні 7-14 дiб. Крiм середовища MS, при цьому використовували середовища В5 (Gamborg et al., 1968), Masuda (Masuda et al., 1981), T (Dudits et al., 1975), SH (Schenk, Hildebrandt, 1972), AA (Toriyama, Hinata, 1985) з 5 мг/л 2,4-Д.

Пiд мiкроскопом спостерігали морфологiю клiтин та клiтинних агрегатiв і визначали кількісні показники росту. Густину клiтин в дисоцiйованiй фракцiї визначали без мацерацiї з допомогою скляної камери (King, 1984). Загальну кiлькiсть клiтин (N) обчислювали як добуток густини на об'єм дисоцiйованої фракцiї. Вмiст бiлку в фiльтрованiй суспензiйнiй культурi визначали методом Лоурi в модифiкацiї Hartree (1972). Вiдносну життєздатнiсть клiтин (v) оцiнювали по плазмолiзу в гiперосмотичному розчинi сахарози за Widholm (1972) і виражали як вiдношення кiлькостi плазмолiзованих клiтин до загальної кiлькостi клiтин у полi зору. Кiлькiсть життєздатних клiтин (Nv) обчислювали як добуток загальної кiлькостi клiтин на вiдносну життєздатнiсть. Проводили також вiзуальний контроль росту i морфогенетичних реакцiй в агрегованiй фракцiї в рідкому середовищі і після висіву на агаризоване середовище MS в рiзних модифiкацiях. Першi 7 дiб пiсля висiвання чашки тримали в темрявi, потiм -- в умовах 16-годинного фотоперiоду.

В дослiдах, якi моделюють вплив несприятливих абiотичних та бiотичних факторiв зовнiшнього середовища, до основного середовища MS додавали 0,01-0,4 М NaCl (сольовий стрес); 5, 10 і 20 % ПЕГ-6000 (осмотичний стрес); 0,4, 1,2 і 2 мМ Al-ЕДТА (iонний стрес), а також 2-50 % (об/об) культуральних фiльтратів грибних патогенiв Fusarium graminеаrum Schwabe, Pseudocercosporella herpotrichoides Fron та Septoria tritici Rob ex Desm (вплив токсичних метаболiтiв при фузарiозі колоса, церкоспорельозній кореневій гнилі та септорiозі листя, вiдповiдно). Як контроль брали середовище MS без селективних агентiв з вiдповiдним рiвнем 2,4-Д.

Після перенесення калусів у рідке рухоме середовище утворювалась гетерогенна суспензiя, яка мiстила великi (до 2 мм) i дрiбнi (5-50 клiтин) агрегати клiтин та одиничнi клiтини паренхiмного i меристематичного типу. Після перших 18 дiб культивування суха маса гетерогенної суспензiї зростала майже в 4 рази, густина клiтин складала бiля 100 тис. кл./мл. Це свідчить про задовільні умови культивування. Після фільтрації вихідної гетерогенної культури вмiст бiлку через 6 дiб зростав у 1,7 раза, через 10 дiб -- майже в 3 рази, надалi стабiлiзувався. Густина клiтин в суспензiї пiсля фiльтрування через 1 шар тканини зростала в 2,5 рази за 28 діб, а потiм пiсля розбавлення в 1,5 раза не змiнювалась. Пiсля фiльтрування суспензiї через 4 шари тканини спостерiгали значне уповiльнення росту густини клiтин порівняно з суспензією, профiльтрованою через один шар. При плейтiнгу фiльтрованої суспензiї в таке ж по складу, як i рiдке, агаризоване середовище через 1,5 мiсяці спостерiгали появу невеликої кiлькостi дрiбних (до 2 мм в дiаметрi) колонiй, частина з них утворили калуси, якi на середовищi для регенерацiї не проявляли жодних морфогенетичних реакцiй. Отже, одержана фiльтрована суспензiйна культура пiдтримувала здатнiсть до росту протягом обмеженого промiжку часу (до 30 дiб), досягала недостатньо високої густини (менше 100 тис. кл./мл), не зберiгала морфогенного потенцiалу. Модифiкацiї базового середовища MS за вмістом гормонів (НОК, IОК, БАП, зеатин), амiнокислот (L-глутамiн, L-аспарагiн, L-пролiн), спiввiдношенням нiтратних та амонiйних iонiв не приводили до покращення параметрiв суспензiйної культури. Така суспензiйна культура має обмежене використання в бiохiмiчних та фiзiологiчних дослiдженнях, але малопридатна для генетичних та селекцiйних дослiджень в клiтиннiй культурi.

Оскільки культивування дисоційованої фракції, отриманої після фільтрації, не давало бажаних результатів, було випробувано альтернативний спосiб: культивування агрегованої фракцiї. Заміна дисоційованої фракції свiжим середовищем викликала рiст агрегованої фракцiї i відновлення або навіть наростання густини в дисоцiйованiй фракцiї -- знову утворювалась гетерогенна культура. Густина одиничних клiтин в дисоцiйованiй фракцiї ГСК протягом циклу субкультивування зростає по S-подiбнiй кривiй (рис. 1.А), яку найбiльш адекватно описує модель Рiчардса (R2 = 0,96-0,98 при p<0,001), але залежно вiд генотипу коефiцiєнти моделi вiдрiзняються. В кожному наступному циклі густина клітин зростає (рис. 1.Б), пiсля 6-9 циклiв (в залежностi вiд сорту) спостерiгається насичення. Всі досліджувані генотипи хоч і відрізняються між собою, мають досить високі показникиросту.

Отже, гетерогенна суспензiйна культура, на вiдмiну вiд фiльтрованої, забезпечує швидке наростання бiомаси, в тому числi високу густину одиничних клiтин протягом багатьох циклiв.

З метою вибору оптимального експланту для ініціації суспензійної культури пшеницi, крім калусів, використовували незрiлі суцвiття, незрiлі зародки і фрагменти асептично вирощених проросткiв. Всi цi експланти мiстять меристематичнi клiтини i iндукують суспензiйну культуру з достатньо високою швидкiстю росту. Найменші економічні затрати дає використання в якості експланта основ листків (leaf base) асептично вирощених проростків, які можна отримувати з сухого насіння незалежно від сезону на відміну від різного типу незрілих експлантів, які придатні тільки на певних стадіях розвитку донорної рослини. Використання калусів різного походження пов'язано з додатковими затратами.

З метою вибору оптимального середовища було випробувано 5 середовищ: Гамборга В5, Masuda, T, SH, AA, які iншi автори рекомендували для культивування саме суспензiй. Агреговану фракцiю ГСК, iнiцiйованої з основ листків сорту Балкан, роздiляли на 6 рiвних частин i культивували в 6 середовищах: MS та 5 вищевказаних з 5 мг/л 2,4-Д. Через певнi перiоди проводили замiну дисоцiйованої фракцiї свiжим поживним середовищем i аналiзували пiд мiкроскопом як дисоцiйовану, так i агреговану фракцiї (табл. 1). За сумою всiх показникiв данi середовища можна розмiстити в ряд в порядку зниження: MS>SH>Masuda>T>B5 >AA. Середовище MS було найбiльше придатним, але 4 наступних також можуть бути використанi для культивування суспензiї. Виняток становило середовище АА -- в ньому спостерiгали сильний некроз клiтин агрегованої фракцiї, що зумовлювало низьку густину i гiршi показники одиничних клiтин в дисоційованій фракції.

Таким чином, гетерогенна суспензiйна культура пшениці при циклiчнiй замiнi дисоцiйованої фракцiї свiжим поживним середовищем пiдтримує здатнiсть до росту протягом тривалого часу.

Оскiльки основним регулятором росту, який забезпечував дедиференцiйований стан суспензiйної культури, був аналог ауксину -- 2,4-Д, а в калусних культурах для регенерацiї використовують середовища без гормонів або з низьким їх вмiстом, було дослiджено вплив перiодичної змiни вмiсту 2,4-Д в середовищi культивування суспензiйної культури. Середовище MS в двох модифiкацiях: з 5 мг/л 2,4-Д (MS-5) i без 2,4-Д (MS-0) по черзi замiнювали кожнi 3 доби в однiй групi зразкiв i кожнi 7 дiб -- у другiй. Дослiди проводили на сортах з рiзною культурабельнiстю: Балкан i Миронiвська 808.

В середовищi MS-0 в кiнцi кожного перiоду в дисоцiйованiй фракцiї налiчувалось в середньому в 1,5-2 рази менше клiтин, нiж при культивуваннi в середовищi MS-5, при цьому зростала частка клiтин меристематичного типу (табл. 2). Ця залежнiсть була бiльше вираженою в обох сортiв у варiантi дослiду Т = 7 дiб. А ще чiткiше при повторному культивуванні агрегованої фракцiї ГСК сорту Балкан в середовищi MS-0 (позначено Балкан* в табл. 2).

2,4-Д впливала також на стан агрегованої фракцiї. При короткочаснiй вiдсутностi 2,4-Д в середовищi (Т=3 доби) морфологiчних змiн, видимих неозброєним оком i при мiкроскопiї давлених препаратiв, не було виявлено, вiдбувалось тiльки наростання маси агрегованої фракцiї без ознак диференцiювання. Тiльки в кiнцi другого мiсяця при повторному культивуваннi в середовищi MS-0 протягом 3 дiб в агрегованiй фракцiї обох сортів з'являлись одиничнi ознаки ризогенезу. В режимі Т = 7 дiб вже пiсля першого циклу культивування в середовищi MS-0 в агрегованiй фракцiї сорту Балкан з'являлись численнi кореневi примордiї, а у частини зразкiв сорту Миронiвська 808 почався iнтенсивний рiст коренiв, якi досягали 2 см в довжину. В культурi сорту Балкан ризогенез починався тоді, як частину агрегованої фракції було повторно залишено на 7 дiб в середовищi MS-0.

Аналіз росту гетерогенної суспензійної культури пшениці сорту Балкан при культивуванні в різних середовищах

Вивчали також морфогенетичні реакції в глобулах агрегованої фракції ГСК сорту Балкан (культивованої в середовищах MS, SH, Masuda, T, B5) після висіву на агаризовані середовища MS з 5 і 1 мг/л 2,4-Д,MS з вітамінами по Staba, 2 мг/л БАП і 0,5 мг/л ІОК i MS без регуляторів росту з 10 % гомогенату незрілих зернівок. Через 2-3 мiсяцi спостерiгали помiтний рiст, з'являлись коренi i зеленi крапки, траплялись ознаки некрозу. Найбiльш придатним виявилось середовище з гомогенатом незрiлих зернiвок. З 5 рідких середовищ для культивування ГСК кращими виявились SH i Masuda, дещо гiршими -- MS i Т; середовище Гамборга В5 було найменш придатним для збереження морфогенного потенцiалу.

Після висiвання агрегованої фракцiї ГСК сортiв Балкан i Миронiвська 808, якi культивували почергово в середовищах MS-5 i MS-0, на агаризованi середовища MS з підвищеним вмістом сахарози (60 г/л), зниженим вмістом 2,4-Д (0,1 і 0,5 мг/л), 0,5 мг/л зеатину і 1 мг/л АБК спостерiгали ознаки некрозу різного ступеню, ризогенез та появу зелених крапок. Iстотних вiдмiнностей мiж сортами не виявлено. Морфогенний потенцiал краще зберiгався при режимi замiни середовищ з перiодом 3 доби, що узгоджується з результатами спостережень за станом суспензiйної культури в рiдкому середовищi. Зеатин i АБК виявляли позитивний ефект у варіантах Т = 7 діб.

Отже, культивування гетерогенної суспензiйної культури в середовищi без 2,4-Д супроводжується процесами диференцiацiї клітин в поверхневих шарах агрегованої фракцiї і індукцією ризогенезу. Це характеризується уповiльненням процесiв розтягнення клiтин i змiцненням мiжклiтинних зв'язкiв. Тому дисоцiйована фракцiя вiдрiзняється меншою густиною i збiльшенням частки дрiбних клiтин меристематичного типу. Глобули агрегованої фракцiї, висiяні на агаризоване середовище, продовжують рости, в них спостерiгається ризогенез i поява на свiтлi зелених крапок. Морфогенетичнi реакцiї посилюються на середовищах з додаванням абсцизової кислоти, зеатину i природних фiзiологiчно активних речовин у виглядi гомогенату незрiлих зернiвок.

Дiя абiотичних факторiв на суспензiйну культуру пшеницi.

Введення в поживне середовище рiзних селективних агентiв дає змогу вивчати їх дiю на культуру на клiтинному рiвнi, а при адекватності реакції з'являється можливiсть використовувати суспензiйнi культури як тест-систему для оцiнки генотипiв на стiйкiсть до несприятливих умов. Рiст гетерогенної суспензiї можна характеризувати рiзними параметрами, що стосуються як агрегованої, так i дисоцiйованої фракцiї. Для агрегованої фракцiї визначали сиру масу i проводили вiзуальну оцiнку стану (некроз i ризогенез). Для дисоцiйованої фракцiї визначали кiлькiсть клiтин (N) та кiлькiсть життєздатних клiтин (Nv) на одну клiтинну популяцiю в кiнцi перiоду субкультивування. Показник сирої маси агрегованої фракцiї вiдзначався значною варiабельнiстю, тому його не використовували. Показники N і Nv вірогідно залежали від генотипу, тому в селективних середовищах їх виражали в процентах до контролю (pN та pNv).

Вплив засолення (NaCl) і експресія солестійкості. В дослiдження включали сорти з рiзною польовою стiйкiстю до засолення: стiйкий -- Аtlas 66 (США) i слабостiйкi -- Миронiвська 808 i Донська напiвкарликова. Додавання NaCl в середовище викликало помiтне пригнiчення росту суспензiйної культури у всiх сортiв, однак кiлькiсні відмінності свiдчать про адекватнiсть реакцiї сортiв на клiтинному i органiзменному рiвнi (рис. 2А). У дослiдах з висхiдними концентрацiями NaCl: 0,01-- 0,02 -- 0,1 -- 0,4 М найбiльшi вiдмiнностi мiж сортами спостерiгали при дiї високих концентрацiй NaCl, зi збiльшенням експозиції вiдмiнностi посилювались. Так, через 4 тижнi культивування в середовищi з 0,4 М NaCl спiввiдношення Nv0.4/Nvк для сортiв складало: Аtlas 66 -- 0,64; Миронiвська 808 -- 0,25; Донська напiвкарликова -- 0,16, а через 6 тижнiв -- 0,34; 0,15 i 0,08, вiдповiдно.

Експресія посухостійкості. Вивчали високостiйкий до засухи сорт Саратовська 11, середньостiйкий -- Донська напiвкарликова i слабостiйкий сорт Бучани 22. Селективнi середовища мiстили полiетиленглiколь ПЕГ-6000. Спостерiгається вiдповiднiсть мiж стiйкiстю суспензiйної культури до ПЕГ i польовою стiйкiстю сорту до засухи (рис. 2Б). З часом стiйкiсть у культурi знижувалась у всiх сортiв. Дисперсiйний аналiз показав вiрогiдний вплив всiх факторiв на кiлькiсть життєздатних клiтин. При заміні селективного середовища (20 % ПЕГ, експозиція -- 4 тижні) на контрольне (вiдростання), спостерiгали вiдновлення кiлькостi життєздатних клiтин (для сортів Саратовська 11, Донська напівкарликова і Бучани 22, відповідно, 276 %, 205 % і 122 % вiд початкової, тобто яку фіксували до переведення культур на селективнi середовища).

Експресія стійкості до іонів алюмінію (кислотостійкості). Токсичний вплив закислення грунту проявляється через токсичну дiю iонiв алюмiнiю, якi переходять у розчинну форму при низьких рН. Тому цi умови моделювали додаванням Al-ЕДТА при знижених рН середовища (4,5 проти 6,0-6,2 в контролі). Як високостiйкий сорт брали Аtlas 66, як слабостiйкий -- Миронiвську 808. Ефект-дозовi кривi (рис. 2В) вказують на значну диференцiацiю даних сортiв за цiєю ознакою. LD50 для сорту Миронiвська 808 становила бiля 0,4 мМ, тодi як для сорту Аtlas 66 -- бiльша вiд максимальної з використаних концентрацiй (2 мМ).

Отже, створення в середовищi культивування сольового, осмотичного та iонного стресу викликає уповiльнення росту ГСК. Як критерій оцiнки реакцiї генотипiв можна використовувати кiлькiсть життєздатних клiтин у дисоцiйованiй фракцiї. Бiльш чiтку диференцiацiю спостерiгали при високих концентрацiях селективних агентiв (0,1-0,4 М NaCl; 10-20 % ПЕГ-6000; 1-2 мМ Al-ЕДТА) протягом 2-4 тижнів культивування. Використання зростаючих концентрацiй дозволяє зберегти вищi показники росту суспензiйної культур при високих концентрацiях селективного агенту i в той же час ослабити вплив адаптацiйних можливостей генотипiв.

Вивчали дiю культуральних фiльтратiв (КФ) фiтопатогенних грибiв Septoria tritici, Pseudocercosporella herpotrichoides та Fusarium graminearum на ГСК пшеницi. Використовували сорти з контрастною стiйкiстю до септорiозу листя, церкоспорельозної кореневої гнилi та фузарiозу колоса. В кiнцi перiоду субкультивування (Т = 2 тижнi) визначали кiлькiсть клiтин в дисоцiйованiй фракцiї (N), вiдносну життєздатнiсть (v) i кiлькiсть життєздатних клiтин як добуток Nv. Для проведення дисперсiйного аналiзу данi були перетворенi в log10N, log10Nv i arcsin(v1/2).

Дія КФ Septoria tritici. Як стiйкий брали сорт Fakta (Нiмеччина), нестiйкий -- Донську напiвкарликову. В присутностi КФ (5, 10 i 25 % (V/V)) спостерiгали зниження показникiв росту: кiлькості клiтин (N) i кiлькості життєздатних клiтин (Nv). Показник вiдносної життєздатностi (v) майже не змiнювався. Тому зменшення Nv вiдбувалось за рахунок зменшення N. Такий вплив можна вважати скорiше цитостатичним, нiж цитотоксичним. Ефект-експозицiйнi кривi вказують на сортоспецифiчнiсть реакцiї суспензiйної культури на присутнiсть КФ. Вiдмiнностi проявляються при всiх концентрацiях i з часом посилюються. Змiна показникiв росту для дисоцiйованої фракцiї в присутності КФ значною мiрою пояснюється ризогенезом агрегованої фракцiї, тодi як у контролi він був вiдсутнiй. Вiзуальна оцiнка ризогенезу в балах показала його зростання зi збiльшенням як концентрацiї, так i експозицiї, причому в присутностi 5-10 % КФ реакцiя нестiйкого сорту була бiльш вираженою (рис. 3Б), що також може бути адекватним показником для оцiнки стiйкостi генотипу. Пiсля вилучення КФ з середовища показники росту стають вищими. Диференцiацiя по сортах зберiгається протягом перших двох тижнiв.

Дія КФ Pseudocercosporella herpotrichoides. Як стiйкий брали сорт Roazon (Францiя), нестiйкий -- Донську напiвкарликову. Додавання КФ P. herpotrichoides (5, 10 i 25 % (V/V)) викликало різке пригнiчення росту. В агрегованiй фракцiї було вiдмiчено сильний некроз і ризогенез з частотою на рiвнi зразкiв з КФ S. tritici, але меншою iнтенсивнiстю росту коренiв. При 25 % КФ ризогенез був слабшим, переважав некроз. Зменшення показника Nv вiдбувалось за рахунок зменшення як кiлькостi клiтин (N), так i вiдносної життєздатностi (v), причому бiльше в останньому випадку. Такий вплив можна вважати скорiше цитотоксичним. Ефект-експозицiйна залежність (рис. 4А) вказує на сортоспецифiчнiсть реакцiї ГСК на присутнiсть КФ. Чіткіше вiдмiнностi проявляються при високiй концентрацiї, але при збільшенні експозицiї дещо зменшуються. Вiзуальна оцiнка некрозу агрегованої фракції свiдчить про його зростання при збiльшеннi концентрацiї КФ i експозицiї, а також сортоспецифiчнiсть при низьких i середнiх концентрацiях. Рівень ризогенезу агрегованої фракцiї нестiйкого сорту Донська напiвкарликова був вищим при всiх концентрацiях i експозицiях (рис. 4Б). Пiсля вилучення КФ з середовища показник вiдносної життєздатностi клiтин досягає i навiть перевищує рівень контролю, що пiдтверджує переважно цитотоксичну дiю КФ Р. hеrpotrichoides. Диференцiацiя по сортах (за показником Nv) зберiгалась протягом всього часу спостережень.

Дія КФ Fusarium graminearum. Використовували вiдносно стiйкі до фузарiозу колоса сорти 80117 i Са 8055 (Китай) і нестiйкий -- Донську напiвкарликову. При додаваннi КФ F. graminearum (2, 10 i 50 % (V/V)) спостерiгали змiну всiх дослiджуваних параметрiв: N, v і Nv. На рис. 5.А показано сортоспецифічність впливу КФ F. graminearum на показник Nv.

Зниження показника Nv вiдбувалось одночасно як за рахунок зниження кiлькостi клiтин (N), так i вiдносної життєздатностi (v), тобто КФ F. graminearum має як цитостатичний, так i цитотоксичний вплив, причому останнє бiльш характерне для сприйнятливого сорту Донська напiвкарликова. Цитотоксична дiя КФ проявлялась також в некрозi агрегованої фракцiї, ця реакція теж є сортоспецифiчною. Для КФ F. graminearum була характерна індукція ризогенезу, при низьких концентраціях його рівень є адекватним показником стійкості генотипу (рис. 5Б). Слід зазначити, що істотним заходом при використаннi КФ F. graminearum для оцiнки генотипiв на стiйкiсть до цього патогена є підвищення рівня 2,4-Д до 5 мг/л - при нижчих концентраціях спостерігається бурхливий ризогенез, який маскує токсичний ефект. Це свідчить про те, що одним з механiзмiв взаємодiї хазяїн-патоген в системi з F. graminearum є порушення гормонального балансу.

Таким чином, в ГСК пшеницi при додаваннi до середовища КФ S. tritici, P. herpotrichoides i F. graminearum спостерiгаються морфорегуляторний, цитостатичний та цитотоксичний ефекти. Про це свiдчать ризогенез та гемогенез агрегованої фракцiї (морфорегуляторний ефект); зменшення загальної кiлькостi клiтин у дисоцiйованiй фракцiї (цитостатичний ефект), некроз агрегованої фракцiї та зниження показника вiдносної життєздатностi клiтин дисоцiйованої фракцiї (цитотоксичний ефект). Бiльш вираженою в усiх вiдношеннях була реакцiя нестiйкого сорту. Отже, ознака стiйкостi до септорiозу, церкоспорельозу та фузарiозу колоса на рiвнi цiлої рослини може експресуватись в культурi in vitro на селективному фонi -- в присутностi токсичних метаболiтiв даних патогенiв. Отриманi результати свiдчать про можливiсть використання токсичних метаболiтiв патогенiв S. tritici, P. herpotrichoides та F. graminearum в культурах клiтин i тканин для вивчення механiзмiв взаємодiї хазяїн-патоген та розробки систем скрiнiнгу та вiдбору стiйких варiантiв.

ВИСНОВКИ

1. Гетерогенна суспензiйна культура пшеницi становить теоретичний iнтерес як адекватна модельна система для вивчення фiзiолого-бiохiмiчних механiзмiв стiйкостi до стресових факторiв та практичну цiннiсть як система оцiнки та вiдбору стiйких варiантiв.

2. Гетерогенна суспензiйна культура пшеницi при циклiчнiй замiнi дисоцiйованої фракцiї свiжим поживним середовищем пiдтримує здатнiсть до росту протягом тривалого часу (бiльше року), досягає високої густини одиничних клiтин (106 кл./мл).

3. Оптимальними умовами для одержання i пiдтримки гетерогенної суспензiйної культури є такi: експлант для iнiцiацiї -- основи листкiв асептично вирощених проросткiв та калуси з незрiлих зародкiв; середовище для пiдтримки i росту -- Мурасiге i Скуга, Шенка і Хільдебрандта; перiод замiни середовища (субкультивування) -- 7-14 дiб. Такi умови культивування придатнi для рiзних генотипiв пшеницi, однак iнтенсивнiсть росту залежить вiд генотипу.

4. Для активного вiдокремлення клiтин агрегованої фракцiї в рiдке середовище необхiдна присутнiсть 2,4-Д, в цих умовах вiдбувається також розтягнення клiтин та їх вакуолiзацiя. В безгормональному середовищi вiдшаровується менше клiтин, але з переважанням клiтин меристематичного типу, а також вiдбувається диференцiацiя клiтин в поверхневих шарах агрегованої фракцiї, що приводить до ризогенезу. Глобули агрегованої фракцiї після висiву на агаризоване або рiдке середовище з низьким вмiстом 2,4-Д продовжують рости, для них характерний ризогенез i поява на свiтлi зелених крапок.

5. Для оцiнки реакцiї генотипiв на абiотичнi та бiотичнi стресовi умови оптимальним показником є кiлькiсть життєздатних клiтин у дисоцiйованiй фракцiї гетерогенної суспензiйної культури.

6. Створення в середовищi культивування сольового, осмотичного та iонного стресу викликає пригнічення росту гетерогенної суспензiйної культури. Для оцiнки солестiйкостi, посухостiйкостi та стiйкостi до закислення середовище слід доповнити 0,1-0,4 М NaCl, 10- 20 % ПЕГ-6000 i 1-2 мМ Al-ЕДТА, вiдповiдно. Експозицiя -- 2-4 тижнi.

7. В гетерогеннiй суспензiйнiй культурi пшеницi в присутностi культуральних фiльтратiв Septoria tritici, Pseudocercosporella herpotrichoides i Fusarium graminearum спостерiгаються морфорегуляторний, цитостатичний та цитотоксичний ефекти. Про це свiдчать ризогенез та гемогенез агрегованої фракцiї (морфорегуляторний ефект); зменшення загальної кiлькостi клiтин у дисоцiйованiй фракцiї (цитостатичний ефект), некроз агрегованої фракцiї та зменшення показника вiдносної життєздатностi клiтин дисоцiйованої фракцiї (цитотоксичний ефект). Для оцiнки стiйкостi до цих патогенів можна використовувати їх культуральнi фiльтрати в концентрацiї 10-50 %. Оптимальна експозицiя -- 4 тижнi. Додатковим показником стiйкостi генотипiв до вказаних патогенiв може служити рiвень ризогенезу пiсля 4 тижнiв культивування в присутностi 2-5 % КФ.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦIЇ

1.Гирко В.С., Волощук А.Д. Индукция и рост культуры клеток пшеницы в жидкой среде // Докл. ВАСХНИЛ.- 1990.- 9.- С. 4-10.

2.Гирко В.С., Волощук А.Д. Индукция и рост культуры клеток пшеницы в жидкой среде // С.-х. биология.- 1991.- №. 5.- С. 61-66.

3.Волощук А.Д. Влияние генотипа и среды культивирования на параметры суспензионной культуры пшеницы // Селекционные и агротехнические пути повышения урожайности зерновых колосовых культур.- Мироновка, 1992.- С. 79-91.

4.Созинов А.А., Гирко В.С., Волощук А.Д. Действие стрессовых факторов на суспензионную культуру пшеницы // Вiсник аграрної науки.- 1994.- № 2.- С. 65-75.

5.Волощук А.Д. Морфогенетические процессы в суспензионной культуре пшеницы // Сб. науч. трудов Мироновского института пшеницы.- Киев: Урожай, 1995.- С. 58-74.

6.Волощук Г.Д., Волощук С.I., Гiрко В.С. Вплив культуральних фiльтратiв деяких грибних патогенiв на суспензiйну культуру пшеницi // Цитология и генетика.- 1995.- 29, № 4.- С. 70-77.

7.Волощук С.I., Волощук Г.Д., Гiрко В.С. Створення вихiдного матерiалу озимої пшеницi, стiйкого до грибних патогенiв, методами клiтинної селекцiї // Захист рослин.- 1998.- № 8.- С. 4-5.

8.Волощук Г.Д. Оцiнка стiйкостi пшеницi до грибних патогенiв в суспензiйнiй культурi // Захист рослин.- 1998.- № 11.- С. 10.

9. Волощук Г.Д., Волощук С.I., Гiрко В.С. Використання клiтинних культур пшеницi для оцiнки стiйкостi до стресових факторiв // Зб. наукових праць УААН "Науковi розробки i реалiзацiя потенцiалу сiльськогосподарських культур".-К.: Аграрна наука.- 1999.- С. 59-64.

10.Волощук А.Д., Волощук С.И., Гирко В.С. Использование селективных сред как тест-системы для оценки генотипов пшеницы на устойчивость к патогенам // Агробиотехнологии растений и животных. Тез. Докл. Междунар. конф.- Киев, 1997.- С. 86.

11.Волощук А.Д., Волощук С.И., Гирко В.С. Разработка методов оценки генотипов пшеницы на устойчивость к Fusarium graminearum в суспензионной культуре // Там же.- С. 87.

12.Girko V.S.,Voloshchuk A.D., Voloshchuk S.I. Effects of biotic and abiotic factors on wheat suspension culture // Abstr. IX Intern. Congr. Plant Tissue Cell Cult. Israel, June 14-19, 1998.- P. 145.

13.Voloshchuk A.D., Voloshchuk S.I., Girko V.S. Study of effect of Fusariun graminearum cultural filtrate action on wheat suspension culture growth parameters to estimate the resistance to this pathogen // Abstr. II Intern. Symp. Plant Biotechnol., 4-8 October 1998, Kyiv, Ukraine.- Kyiv, 1998.- P. 143.

14.Волощук Г.Д., Волощук С.I., Гiрко В.С. Оцiнка генотипiв пшеницi на стiйкiсть до бiотичних i абiотичних факторiв з використанням суспензiйної культури // Використання сучасних молекулярно-генетичних i бiотехнологiчних розробок у генетико-селекцiйних дослiдженнях. Зб. матер. II Мiжнар. конф. (м. Одеса).- Київ: Аграрна наука, 1998.- С. 21-22.

15. Волощук Г.Д., Волощук С.І., Гірко В.С. Дія культуральних фільтратів факультативних грибних патогенів на клітинні культури пшениці // Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва. Тез. доп. Міжнар. конф. (м. Харків).- Харків, 1999.- С. 239.

Размещено на Allbest.ru