При встановленні класу токсичності також спостерігали прямий зв'язок між токсичністю препаратів на тваринах (щурах) та інфузоріях. Важливим є вивчення окремих функціональних і морфологічних змін у процесі виживання інфузорій під впливом препаратів з метою їх використання для експрес-визначення токсичності ветеринарних препаратів.

У гострому і хронічному дослідах, в основному, спостерігалася пряма залежність між токсичністю препарату та відхиленням основних функцій інфузорій (табл. 3).

Таблиця 3

Відхилення функцій інфузорій під впливом різних концентрацій препаратів (в %)

Концен-трація, %	Розмноження	Травлення	Осморегуляція
	Дослід
	гострий	хронічний	гострий	хронічний	гострий	хронічний
Аверсект
1	-	-	-	-	-	-
0,1	44,7	-	30,8	-	100,0	-
0,01	3,6	51,4	20,1	66,0	62,4	6,8
0,001	0	56,1	11,1	45,8	34,7	3,3
Бутокс
0,01	-	-	-	-	-	-
0,001	54,0	87,9	68,1	38,8	57,7	30,6
0,0001	17,1	73,0	50,1	37,6	51,4	11,1
0,00001	24,9	68,0	43,1	18,0	50,4	5,4
Дексатоманол
1	-	-	-	-	-	-
0,1	36,7	-	67,8	-	51,4	-
0,01	30,7	49,0	51,1	48,5	24,8	40,2
0,001	21,9	41,2	46,8	47,7	9,0	34,5
Лінкоміцин
10	34,3	87,6	52,6	62,3	65,4	44,1
1	37,3	70,2	47,6	47,3	29,4	10,6
0,1	36,0	64,6	35,1	41,5	2,5	10,5
Томанол
1	-	-	-	-	-	-
0,1	25,0	60,3	37,5	59,1	9,1	29,5
0,01	6,9	33,9	24,7	46,3	9,9	15,6

“-“ - загибель інфузорій.

У гострому досліді зміни будь-якої, окремо взятої функції інфузорії за різних концентрацій препаратів були, в більшості випадків, одночасними та однонаправленими. Про це свідчить висока частка коефіцієнтів кореляції з середньою та високою силою зв'язку, що становить 69%. З часом в різних концентраціях препаратів зміни кожної фізіологічної функції ставали менш впорядкованими, оскільки частка коефіцієнтів з відносно високою силою зв'язку знижувалась до 52%.

Установлено, що зв'язок між змінами тієї чи іншої функції в різних розчинах одного препарату був досить сильним. Ця закономірність разом із пропорційним характером залежності розладу фізіологічних функцій від концентрації зумовлювали можливість застосування лише однієї-двох концентрацій для оцінки токсичності препаратів. До того ж, у гострому досліді зв'язок між змінами певної функції за різних концентрацій розчину був значно вищим, ніж у хронічному.

Отримані результати за умов вивчення токсичності ветеринарних препаратів у гострих дослідах на інфузоріях вказують на певний зв'язок між установленням класу токсичності ветеринарних препаратів на інфузоріях та лабораторних тваринах, зокрема щурах.

На основі проведених досліджень була розроблена класифікація, яка дала змогу прогнозувати токсичність ветеринарних препаратів за результатами гострих (тривалістю 48 год.) дослідів на інфузоріях за допомогою такого тест-критерію як ЛК100 - концентрація препарату, за якої гинули 100% особин (табл.4).

Таблиця 4

Оцінка ступеня токсичності ветеринарних препаратів за допомогою інфузорій на основі ЛК100 через 48 год. досліду

ЛК100	Клас токсичності на
	інфузоріях	тваринах
0,001% і вище	1	1
0,1% і вище	2	2 (ЛД50<800 мг/кг)
1% і вище	3	3 (ЛД50>800 мг/кг)
повної загибелі немає в жодній концентрації	4	4

Отже, найнебезпечніші для парамецій препарати повністю знищували їх протягом 48 год. досліду в концентрації 0,001% і вище (1 клас токсичності на інфузоріях), менш небезпечні - 0,1% і вище (2 клас), помірно токсичні - 1% і вище (3 клас), відносно безпечні - не викликали загибелі найпростіших у жодній з щойно вказаних концентрацій (4 клас). Додаткову інформацію з оцінки ступеня токсичності препаратів, що досліджувались, одержували на основі розладу травної та осморегуляторної функцій інфузорій. Критерієм токсичності препарату служив ступінь середнього відхилення цих функцій від норми (в %), вирахуваний за 48 год. експерименту. Порушення травної та осморегуляторної функцій прямо пропорційно залежало від класу токсичності препарату.

Визначення токсичності кормів та кормових добавок

Одним із важливих показників, який характеризує якість кормів і кормових добавок, є загальна токсичність. Під загальною токсичністю розуміють дію, яка може бути зумовлена одночасно і мікотоксинами, і токсинами життєдіяльності зернових шкідників, і підвищеною концентрацією пестицидів. Їх сумісну дію важко передбачити, оскільки вона часто залежить не тільки від виду бактерій, який притаманний даному токсину, а й від його концентрації. Різні методи хімічної токсикології дозволяють виділити окремі види токсинів і визначити їх кількісно інструментальними методами: спектрофотометрично, хроматографічно тощо. Ці методи дають можливість визначити лише концентрації окремих видів токсинів.

На сумісну дію токсинів можуть вказувати лише методи біологічної токсикології. Вони основані на біологічному аналізі (біотестуванні), при якому присутні в кормах та кормових добавках різні види токсинів екстрагуються певним розчинником і діють на біологічні об'єкти (тест-організм). Ними можуть бути кролі, білі миші, риби гуппі й інфузорії.

Шкірна проба на кролях протягом тривалого часу була єдиним методом визначення токсичності комбікормів. Незважаючи на ряд недоліків, даний метод визначення токсичності комбікормів та сировини залишається поки що головним у токсико-біологічних дослідженнях. Проте, які б не були великі переваги цього методу, потрібно ще раз нагадати, що це розробка піввікової давнини, і сьогодні є більш економічні, експресні та вірогідні методи.

Так, для визначення токсичності рибного борошна успішно зарекомендував себе метод на рибах гуппі. За умов біотестування на гуппі статистика вже наближається до припустимих меж, бо в дослід беруться не один, а п'ять організмів. Вирощування риб гуппі (вони живородні) значно простіше, ніж кролів (не потрібний віварій, достатньо декілька акваріумів) (Богомолов В., Головня Е., 2000).

Переваги методу на рибах гуппі полягає ще й у тому, що крім загальної можна визначити токсичність, що викликається мікотоксинами. При підготуванні проби після екстракції ацетоном екстракт частково очищають гексаном від ліпідів і деяких неполярних хлор- і фосфорорганічних сполук. Далі проводять переекстракцію мікотоксинів хлороформом.

Важливо також відзначити, що спрощення методу на рибах гуппі шляхом заміни його безпосереднім згодовуванням неприпустимо. Досліди, проведені з акваріумними рибами різних видів, показали, що за таких умов згодовування токсичних кормів риби усіх видів загинули, крім гуппі. У гуппі існують, поки ще не досліджені, добре розвинуті механізми кормової дезінтоксикації.

З усього сказаного вище видно, що метод на рибах гуппі за багатьма параметрами значно перевершує метод на кролях. Однак він досі не впроваджений як арбітражний для визначення токсичності комбікормів і сировини.

Установлення токсичності на білих мишах базується на екстракції токсичних речовин із кормів та кормових добавок ацетоном та подальшому концентрованому випарюванні з додаванням рослинної олії. Екстракт уводять у шлунок білим мишам за допомогою шприца з тупою голкою. За умови наявності в кормах токсинів відбувається геморагічне запалення шлунково-кишкового тракту, а також загибель мишей. Хоча ця методика затверджена для визначення токсичності шротів, макух і кормових дріжджів, вона успішно використовується також для визначення токсичності в комбікормах.

Однак, незважаючи на окремі незначні недоліки методу, а саме: метод вимагає дуже обережного виконання, за незначного ушкодження стравоходу під час введення екстракту тупою голкою можна одержати неадекватну токсичну реакцію в досліді і навіть загибель мишей у контролі за введення рослинної олії, великої витрати реактиву (на один аналіз використовують 300 мл ацетону), відносно довга тривалість аналізу (підготування проби займає одну добу, а проведення біоаналізу - три доби), вважаємо, що у ДСТУ 3570-97 “Зерно фуражне, продукти його переробки, комбікорми, методи визначення токсичності” як арбітражний метод потрібно додати метод тестування на білих мишах у “гострому досліді”. Шкірна проба визначає в основному мікологічну токсичність, а проба на мишах дозволяє ввести строго визначену кількість корму через зонд у шлунок і простежити його вплив на весь організм у процесі травлення. Приготування проб в обох методах ідентичні, що дає змогу ставити експерименти паралельно, не продовжуючи час на проведення досліджень. У цьому випадку, варто вважати нетоксичним комбікорм, кормову добавку тощо, в яких не виявлено токсичності в обох тестах.

Важливою є розробка вітчизняного Державного стандарту із визначення токсичності рибного, м'ясного та м'ясо-кісткового борошна і уведення встановлення токсичності на білих мишах, як арбітражного методу. До складу борошна, особливо імпортного, дуже часто вносять антибіотики, бактерицидні, мікоцидні препарати різної хімічної природи, що згубно впливають на одноклітинні організми, які не володіють подібно до вищих тварин потужними захисними буферними системами. Саме тому в даному випадку вони не можуть служити адекватно біомоделлю, тим паче, як арбітражний метод, про що відзначає ряд авторів (Виноходов Д.О., 1995; Коцюмбас І.Я., 1999).

Діагностика токсикозів складна і трудомістка, займає багато часу і часто буває вже непотрібною через швидку зміну кормів у господарстві. У зв'язку з цим профілактика токсикозів є значно ефективнішим заходом і тому повинна бути 100% перевірка комбікормів і сировини для їх виготовлення на загальну токсичність.

Для таких методів вимагаються чутливі тест-організми, що не мають складних захисних буферних систем, як у теплокровних тварин або риб.

За умови визначення токсичності кормів та кормових добавок при використанні інфузорії названих проблем вдається повністю або частково уникнути. Оскільки потреби “насильного введення” дослідного корму, або його екстракцій в організм інфузорій не існує: з одного боку, вони не розрізняють кормові і некормові частинки, а з іншого, їх оболонка, на відміну від шкірних покривів лабораторних тварин, не лише чутлива, але й дуже прониклива для багатьох токсикантів. Крім того, якщо врахувати, що дослід на інфузоріях триває лише декілька годин; кількість ацетону, необхідного для екстракції - всього 14-20 мл, то можливість використання інфузорій для визначення токсичності кормів стає ще більш переконливою.

Методика визначення токсичності кормів рослинного та тваринного походження і кормових добавок ґрунтується на екстракції ацетоном токсичних речовин і подальшій дії їх водних розчинів на інфузорій і дозволяє оцінити токсичність кормів протягом 1,5-3 год., враховуючи час підготовки ацетонових та водних розчинів екстрактів.

За умов визначення токсичності понад 40 преміксів, комбікормів, рибного борошна, шротів тощо, установлено, що в окремих випадках токсичність на інфузоріях була вищою, ніж на лабораторних тваринах. Нами не зареєстровано жодного випадку, щоб токсичність якогось із вищевказаних кормів була більшою для тварин, ніж для інфузорій. Усе це свідчить про вищу чутливість цього представника найпростіших до вищевказаних кормів, ніж ссавців. Властиво за цих умов, інфузорію Paramecium caudatum можна рекомендувати для альтернативного визначення токсичності кормів поряд із класичними методами.

На нашу думку розробляючи нові чи удосконалюючи та піддаючи модифікації відомі методи, слід добиватися наступних параметрів:

- вірогідності;

- експресності, яка дозволяла б провести максимальне число аналізів за мінімальний час;

- простоти проведення аналізів;

- простоти утримання тест-організмів.

Враховуючи вище сказане доцільно в першу чергу застосовувати методи, що не вимагають великих витрат на приготування та проведення. Однак варто наголосити лише на тому, що універсальних методів немає, у кожному дослідженні існують свої плюси та мінуси. Власне тому для отримання об'єктивної оцінки токсичності кормів і кормових добавок потрібний комплексний біологічний аналіз на інфузоріях, який поєднував би методи тестування концентрованих водних і ацетонових екстрактів комбікормів в одному зразку з можливістю застосування у водному середовищі.

ВИСНОВКИ

1. Узагальнюючи дані світової співдружності та власні наукові дослідження щодо раціонального проведення гострих і хронічних токсикологічних досліджень, вивчення кумуляції, побічної дії та встановлення віддалених наслідків, розроблено систему токсикологічного контролю, яка включає класичні та альтернативні методи фармако-токсикологічного контролю засобів захисту тварин та кормових добавок.

2. Вивчено та встановлено токсикологічні параметри 163 препаратів імпортного та вітчизняного виробництва, апробовано різні способи визначення токсичності, проведено різносторонній аналіз отриманих даних залежно від фармакологічних груп, ступеня токсичності: LD50 в гострих та хронічних дослідах за різних способів уведення, клас токсичності відповідно до різних класифікацій.

3. Встановлено порядок проведення фармако-токсикологічних досліджень нових засобів захисту тварин, визначено принципи вибору методів, послідовність проведення дослідів залежно від фізико-хімічних властивостей субстанцій та фармацевтичних форм.

4. Визначено порядок поетапного вивчення мутагенної активності, застосування основних і додаткових методів дослідження на генному, геномному і мітохондріальному рівнях. Дослідження на мутагенність лікарських препаратів потрібно починати з теста Еймса на мікроорганізмах або теста соматичного мозаїцизму на дрозофілах. Дані тести можуть застосовуватись на стадії розробки препарату з метою відбору гепатотоксичних сполук і своєчасного виключення проведення більш дорогих і громіздких дослідів.

5. Розроблено і затверджено нормативний документ (Галузевий стандарт України “Ветеринарні препарати. Методи визначення нешкідливості” ГСТУ 46.009-2000), який регламентує основні положення визначення нешкідливості засобів захисту тварин і кормових добавок, вказані загальні принципи, умови проведення, порядок та вимоги до методів визначення нешкідливості ліків. Перевірці на нешкідливість підлягають усі препарати, які застосовуються на живих об'єктах, у тому числі на спермі, ембріонах тощо, якщо це передбачено нормативним документом на препарат.

6. Вимагає уніфікації контроль мікробного забруднення нестерильних лікарських засобів, а також заміна методу встановлення пірогенності стерильних препаратів класичним способом на кролях інструментальними методами (зокрема ЛАЛ-тестом), ураховуючи індивідуальну чутливість тварин, неоднозначні джерела ендотоксинів, широкий їх спектр та економічний аспект.

7. Установлено, що в ДСТУ 3570-97 “Зерно фуражне, продукти його переробки, комбікорми. Методи визначення токсичності” крім експрес-методу на інфузоріях і методу шкірної проби необхідно ввести, як арбітражний, метод ентерального тестування на білих мишах. На основі наших даних шкірна проба встановлює, в основному, мікологічну токсичність, а проба на мишах дозволяє ввести строго визначену кількість корму через зонд у шлунок і прослідкувати його вплив на весь організм в процесі травлення.

8. Доведена кореляція між визначенням токсичності препаратів в експериментах на теплокровних тваринах і цитотоксичною оцінкою їх за допомогою культури клітин. Установлено, що токсична доза препаратів першого класу коливається в межах від -9,25 до -9,75 lg; другого - від -6,75 до -8,5 lg; третього і четвертого від -4,5 до -5,5 lg, Це дало змогу нам розробити експрес-метод оцінки класу токсичності ветеринарних препаратів за допомогою культур клітин.

9. Вивчено вплив ветеринарних препаратів, які належать до різних фармакологічних груп, на морфологію та функції інфузорії Paramecіum caudatum (локомоторну, травну, осморегуляторну, репродуктивну) в гострих і хронічних токсикологічних дослідах. Виявлено етапи отруєння парамецій високими концентраціями препаратів (зміна рухів, форми тіла, лізис і загибель особин).

10. Установлено високу чутливість інфузорії Paramecіum caudatum до препаратів за критерієм час загибелі парамецій. За цим показником препарати, що досліджувались, розташовувались у порядку зменшення токсичності: бутокс - аверсект - дексатоманол - томанол - лінкоміцин. Доведено впорядкований характер змін фізіологічних функцій у гострому експерименті, порівняно з хронічним. Найбільш чутливою до дії токсикантів є травна, а найменше - репродуктивна функція.

11. Виявлено, що повна загибель інфузорії Paramecіum caudatum знаходиться у прямій залежності від концентрації препарату, що досліджувався як в гострих, так і в хронічних експериментах, а на рівні встановлення класу токсичності доведено прямий зв'язок між токсичністю препаратів для теплокровних тварин (щурів) та інфузорій.

12. Найбільш оптимальними термінами є годування інфузорій тушшю - 10 хв. і дводенний - для визначення токсичності препаратів із застосуванням таких тест-критеріїв як настання повної загибелі та порушення функції травлення і осморегуляції. При визначенні токсичності ветеринарних препаратів запропоновано оптимальні періоди вимірювання цих функцій /15 хв. 3, 6, 24, 48 год./. На основі отриманих даних розроблена класифікація, яка дала змогу прогнозувати токсичність ветеринарних препаратів по результатах гострих (тривалістю 48 год.) дослідів на інфузоріях Paramecium caudatum за допомогою тест-критерію ЛК100 - концентрація препарату, при якій загинуло 100% особин.

13. Розроблено і впроваджено в практику методику визначення за допомогою інфузорій Paramecium caudatum токсичності кормів і кормових добавок, яка включає метод тестування водних розчинів і їх ацетонових екстрактів.

14. За умов уведення в рибне і м'ясо-кісткове борошно антиоксидантів, міко- і бактерицидних препаратів, а також при наявності важких металів, застосування як тест-об'єктів одноклітинних організмів не виправдано і тому потрібно проводити визначення токсичності в дослідах на білих мишах.

Практичні рекомендації

1. Методичні рекомендації “Токсикологічний контроль засобів захисту тварин”. - Київ, 1997. - 33 с. (затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини України, грудень, 1997 р.).

2. Методичні рекомендації “Токсикологічний контроль кормів та кормових добавок”. - Київ, 1998. - 110 с. (затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини України, грудень, 1998 р.).

3. Галузевий стандарт України “Препарати ветеринарні. Методи визначення нешкідливості” (ГСТУ 46.009-2000). Вимоги цього стандарту є обов'язковими для підприємств, організацій, установ, що діють на території України, а також громадян - суб'єктів підприємництва, незалежно від форм власності та видів діяльності.

4. Методичні рекомендації “Токсикологічний контроль засобів захисту тварин, кормів та кормових добавок з використанням інфузорії Paramecium caudatum”. - Київ, 1999. - 29 с. (затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини України, грудень, 1999 р.)

5. Додаток до ДСТУ 3570-97 "Зерно фуражне, продукти його переробки, комбікорми. Методи визначення токсичності" крім експрес-методу на інфузоріях і арбітражного контролю, метод тестування на білих мишах у “гострому” досліді.

6. У вітчизняний стандарт на рибне та м'ясо-кісткове борошно як арбітражний метод запропоновано ввести визначення токсичності на білих мишах. До складу борошна, особливо імпортного, дуже часто вводять антиоксиданти, бактерицидні та мікоцидні препарати різної хімічної природи, що згубно впливає на одноклітинні організми, які не володіють подібно вищим тваринам, захисними буферними системами. Тому в даному випадку вони не можуть служити адекватною біомоделлю, тим більше як арбітражний метод.

7. Методичні рекомендації “Визначення мутагенності засобів захисту тварин”. - Київ, 2000. - 23 с. (затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини України, грудень, 2000 р.).

8. Розроблені методичні рекомендації та нормативні документи рекомендується включити до курсу ветеринарної фармакології і токсикології для студентів вищих навчальних закладів ветеринарної медицини III - IV рівня акредитації у вигляді тем: “Система токсикологічних досліджень засобів захисту тварин” і “Токсикологічний контроль нових ветеринарних препаратів та кормових добавок”.

Список основних праць, опублікованих за темою дисертації

1. Коцюмбас І.Я. Встановлення токсичності ветеринарних препаратів з використанням інфузорій // Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії і сільського господарства. - Львів, 1997. - С. 85-88.

2. Коцюмбас І.Я. Проблеми створення системи екологічного та генетичного фармакотоксикологічного моніторингу засобів захисту тварин в Україні // 3б. матер. міжн. наук.-практ. конф. "Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми". - Харків, 1997. - С. 212-213.

3. Коцюмбас І.Я. Альтернативні методи контролю засобів захисту тварин // 3б. мат. "Всеукраїнської науково-методичної конференції ветеринарних фармакологів і токсикологів". - Київ, 1998 . - С. 57-58.

4. Коцюмбас І.Я. Методичні підходи до доклінічного дослідження фармакодинаміки та хронічної токсичності нових засобів захисту тварин // Наук. статті ІІ міжнарод. конф. "Проблеми неінфекційної патології тварин". Вісн. Білоцерківського держ. аграрного ун-ту. - Б. Церква, 1998. - Вип.5, Ч. 1. - С.20-23.

5. Коцюмбас І.Я. Особливості визначення гострої токсичності нових ветеринарних препаратів // Міжвід. темат. наук. зб. - Харків, 1998. -№74. - С.221-225.

6. Коцюмбас І.Я. Вивчення хронічної токсичності нових засобів захисту тварин //"Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії і сільського господарства" Книга наукових статей. - Четверта книга. - Львів, 1998. - С.288-290.

7. Коцюмбас І.Я. Токсикологічна оцінка комбікормів і кормових добавок // Ветеринарна медицина України, -1999. - №4. - С.34.

8. Коцюмбас І.Я Дослідження токсичності і біологічної активності ізофлаву // Передгірне та гірське землеробство і тваринництво. - К.: Аграрна наука -1999. -Вип. 40-41. - С. 183-185.

9. Коцюмбас І.Я. Методи визначення нешкідливості засобів захисту тварин та кормових добавок // Наук. вісн. Львів. держ. акад. вет. мед. ім. С.З. Ґжицького. -Львів, 1999. -Вип. II. - С.82-87.

10. Коцюмбас І.Я. Експрес-метод визначення токсичності кормів та кормових добавок з використанням інфузорії Рагаmecium саudatum (модифікація методу) // Наук. вісн. Львів. держ. акад. вет. мед. ім. С.З. Ґжицького. - Львів, 1999. -Вип. 3, Ч. II. - С.57-59.

11. Kotsumbas I. Die organisation der toxikologischen Kontrolle der tiera rtzichenarzneimittel // III symposium Ukraine-Osterreich. Landwirtschaft: Wissenschalft und Praxis Sektion I. Aktuelle Fragen der Bodenressourcenverwaitung. - Tschernivci. -2000. - P.90.

12. Коцюмбас І.Я. Метод культури клітин та перспективи його використання для визначення токсичності хімічних речовин // Наук. вісн. Львів. держ. акад. вет. мед. імені С.З. Ґжицького. -Львів, 2000. - Т.2, №1. - С. 69-75.

13. Коцюмбас І.Я. Нешкідливість ветеринарних лікарських засобів (основні методичні підходи) // Вет. мед. Міжвід. темат. наук. зб. -Харків, 2000. - № 78 (11). - С. 94-103.

14. Коцюмбас І.Я. Особенности токсикологического контроля ветеринарных лекарственных средств // Тез. докл. Всерос. науч. конф. "Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов". -М, 2001. - С. 33-35.

15. Коцюмбас І.Я. Нові аспекти ветеринарного контролю засобів захисту втарин та кормових добавок // Наук. вісн. Львів. держ. акад. вет. мед. імені С.З. Ґжицького. -Львів, 2001. - Т.3, №1. - С. 102-105.

16. Методика токсикологічного контролю нових ветеринарних препаратів / І.Я.Коцюмбас, І.П.Патерега, Д.О.Чура, О.Г.Малик // Вет. мед. Укр. - 2001. - № 2 . - С. 17-20.

17. ГСТУ 46.009-2000. Препарати ветеринарні. Методи визначення нешкідливості. -2000. -19 с.

18. Коцюмбас І.Я., Коцюмбас Г.І. Особливості морфологічних досліджень при вивченні токсичності нових лікарських засобів // Вісник Білоцерківського державного аграрного Університету.- Б. Церква, 2000. - Вип.13, Ч.2. - С. 79-84.

19. Патент 30232 А Україна, 7 G 01N 33/15. Застосування інфузорії Рагаmecium саudatum ehrenberg для експрес-визначення токсичності лікарських засобів / Дітчук О.Р., Малик О.Г., Коцюмбас І.Я. ДНДКІ ветпрепаратів № 98010528; Заявл. 30.01.1998; Опубл. 15.11.2000. Бюл. № 6-11.

20. Токсичність препаратів та матеріалів для сперміїв тварин / Косенко М.В., Коцюмбас І.Я., Чайковська О.І. та ін. // Наук. вісн. Львів. акад. вет. мед. ім. С.З. Ґжицького "До сторіччя від дня народження Ґжицького Степана Зеноновича, заслуженого діяча науки, члена-кореспондента Академії наук України, академіка УАСГН, доктора біологічних наук, професора". - Львів: ЛДАВМ, 2000. - Т.2, Ч.І. - С.87-89.

21. Довідник ветеринарних препаратів і кормових добавок зарубіжного виробництва / під редакцією М.В. Косенка, П.П.Достоєвського, А.В. Березовського, П.І.Вербицького та ін. -К.: Ветінформ, 1999. - 344 с.

22. Культура клітин як біологічна модель для визначення токсичності засобів захисту тварин / Коцюмбас І.Я., Авдосьєва І.К., Засадна З.С. та ін. // Наук.-теорет. журнал "Біологія тварин". -Львів, 1999. - Т. 12. - С. 156-160. с

23. Коцюмбас І.Я., Патерега І.П., Малик О.Г. Фармакокінетика інгредієнтів палехіну // Наук.-техн. бюл. ін-ту землеробства і біол. тв. (серія фізіологія і біохімія) - Львів, 1999. -Вип. 1, №3. - С.184-187.

24. Токсикологічний контроль кормів та кормових добавок / Косенко М.В., Коцюмбас І.Я., Величко В.О. та ін. // Методичні рекомендації. Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини з державною ветеринарною інспекцією Міністерства АПК України. Протокол № 2 від 17-18 грудня 1998р. - Київ, 1999. - 110 с.

25. Токсикологічний контроль засобів захисту тварин, кормів та кормових добавок з використанням інфузорії Рагаmecium саudatum / Коцюмбас І.Я., Малик О.Г., Патерега І.П. та ін. // Методичні рекомендації. Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Мінагропрому України. 2 лютого 1999 р. -Київ, 1999. - 29 с.

26. Коцюмбас І.Я., Патерега І.П., Малик О.Г. Проблема віддалених наслідків дії препаратів у ветеринарній медицині // Матер. V націон. з'їзду фармац. Укр. “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті”. - Харків: УкрФА, 1999. - С. 387-388.

27. Коцюмбас І.Я., Філіппова О.Б., Кісців О.С. Вивчення мутагенної дії препарату Бутокс в короткостроковому мікроядерному тесті // Книга наукових статей "Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії і сільського господарства". -Львів, 1998. - Четверта книга. - С. 205-206.

28. Морфологічна картина крові та шкіри тварин при вивченні шкірно-резорбтивної дії натрійвмісних препаратів / Малик О.Г., Коцюмбас І.Я., Чура Д.О. та ін. // Вісн. Білоцерківського держ. аграрного ун-ту. - Б. Церква, 1998. - Вип.5, Ч.2. - С. 154-157.

29. Токсикологічний контроль нових засобів захисту тварин (виявлення віддалених наслідків) / І.Я.Коцюмбас, О.Г.Малик, І.П.Патерега, Д.О.Чура // Вет. мед. Укр. - 1998. - № 2. - С. 30-31.

30. Проблеми та завдання токсикологічного контролю засобів захисту тварин / О.Г.Малик, І.Я.Коцюмбас, І.П.Патерега, Д.О.Чура // 3б. Всеукр. наук.-метод. конф. вет. фармакологів і токсикологів "Акт. пробл. вет. фармакології і токсикології". -Київ, 1998. - С. 59-60.

31. Особливості функціонування інфузорії Paramecium caudatum під впливом різних концентрацій аверсекту / Дітчук О.Р., Патерега І.П., Чура Д.О. та ін.// Міжвід. темат. наук. зб. "Вет. мед.". -Харків, 1998. - № 74. - С. 298-302.

32. Особливості токсикологічного контролю нових засобів захисту тварин (гострі досліди і кумуляція). Повідомлення 2 / І.Я.Коцюмбас, О.Г.Малик, І.П.Патерега, Д.О.Чура // Вет. мед. Укр. - 1998. -№ 6. - С. 30-31.

33. Основні вимоги до токсикологічного контролю нових ветеринарних препаратів / О.Г.Малик, І.Я.Коцюмбас, Д.О.Чура, І.П.Патерега // Міжвід. темат. наук. зб. "Вет. мед.”. - Харків, 1998. - №74. - С. 227-239

34. Токсикологічний контроль нових засобів захисту тварин / Косенко М.В., Малик ОТ., Коцюмбас І.Я. та ін. // Метод. рекомендації. Схвалені Наук.-техн. Радою (секція "Вет. мед." Мінсільгосппроду України). -Київ, 1999. - 33с.

35. Порівняльне вивчення фармакодинаміки у лабораторних тварин під впливом антигельмінтних засобів / І.Я.Коцюмбас, І.П.Патерега, Д.О.Чура, О.Г.Малик // Зб. стат. міжнар. наук.-практ. конф. "Сучасні проблеми біології, вет. мед., зооінженерії та технологій продуктів твар-ва". -Львів: ЛАВМ ім. С.З. Ґжицького, 1997. -С. 194-195.

36. Косенко М.В., Коцюмбас І.Я., Малик О.Г. Дослідження мутагенності засобів захисту тварин // Метод. рекомендації. Схвалені наук.-техн. Радою секція “Вет. мед.” Міністерства аграрної політики України, грудень 2000 р. - Київ, 2001. - 31с.

37. Проблема визначення ендотоксинів як основної причини пірогенності / І.Коцюмбас, Г.Тесляр, А.Костюк, Д.Янович // Ветеринарна медицина України. - 2001. - №8. - С. 34-36.

38. Проблема визначення ендотоксинів як основної причини пірогенності / І.Коцюмбас, Г.Тесляр, А.Костюк, Д.Янович // Ветеринарна медицина України. - 2001. - №9. - С. 36-37.

Анотація

Коцюмбас І.Я. Система токсикологічного контролю засобів захисту тварин та кормових добавок. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.04 - ветеринарна фармакологія і токсикологія. - Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок, Львів, 2001.

Дисертація присвячена вивченню та розробці системи токсикологічного контролю кормових добавок та засобів захисту тварин.

Уперше запропонована науково обґрунтована система здійснення токсикологічного контролю засобів захисту тварин та кормових добавок, яка вміщує вивчення гострої та хронічної токсичності, кумуляції, побічної дії, віддалених наслідків. Визначений порядок вивчення об'єкту проведення токсикологічних досліджень, послідовність постановки дослідів із вибором конкретної методики.

Проведено модифікацію та адаптацію до умов сьогодення ряду методик та методів установлення токсикологічних параметрів, зокрема мутагенності, нешкідливості, фармакокінетики та фармакодинаміки в хронічних дослідах.

За період проведення досліджень (1991-2000 рр.) вивчено та встановлено токсикологічні параметри 163 препаратів імпортного та вітчизняного виробництва, апробовано різні способи визначення токсичності, проведено різносторонній аналіз отриманих даних, залежно від фармакологічних груп і ступеня токсичності. Встановлено їх ЛД50 в гострих та хронічних дослідах за різних способів уведення та визначено їх клас токсичності стосовно до різних класифікацій.

На основі різностороннього вивчення та повного токсикологічного дослідження 23 препаратів узагальнено, систематизовано та встановлено порядок проведення фармако-токсикологічних досліджень нових засобів захисту тварин, визначено принципи вибору методів, послідовність проведення дослідів, залежно від фізико-хімічних властивостей субстанцій та фармацевтичної форми.

Для препаратів, де застосовуються нові субстанції, обов'язковими є дослідження токсикокінетики, токсикодинаміки, кумулятивних властивостей, побічної дії та віддалених наслідків.

Уперше проведені дослідження щодо визначення дії лікарських засобів, які різняться за ступенем токсичності, будовою і функціональним призначенням на виживання, розмноження, поведінку, морфологічний стан, функціонування травної системи, осморегуляторну функцію Paramecium саudatum у гострих і хронічних дослідах.

Розроблено, запатентовано і запропоновано експрес-метод визначення токсичності нових засобів захисту тварин та кормових добавок за допомогою інфузорій. Доведено можливість використання культури клітин як модельної системи для токсикологічного контролю ветеринарних препаратів. Уперше прослідковано наявність кореляції між визначенням токсичності в експериментах на теплокровних тваринах і цитотоксичною оцінкою їх за допомогою культури клітин.

Науково обґрунтовано і встановлено загальні принципи, порядок і вимоги до визначення нешкідливості та розроблено нормативний документ (галузевий стандарт), який регламентує основні положення визначення нешкідливості ветеринарних препаратів та дозволяє забезпечити їх належну якість.

Проведено порівняння методів токсикологічного контролю комбікормів та сировини з використанням лабораторних тварин, риб гуппі, інфузорій різних видів, визначено позитивні та негативні сторони кожного методу.

Застосовано інфузорію туфельку для експрес-визначення токсичності кормів та кормових добавок.

Ключові слова: токсикологічний контроль, засоби захисту тварин, кормові добавки, гостра і хронічна токсичність, кумуляція, віддалені наслідки, альтернативні методи, інфузорія, культура клітин, лабораторні та сільськогосподарські тварини.

Kots'umbas I. System of toxicological control of agents for protecting animals and fodder additives. - Manuscript.

The dissertation for the degree for Doctor of Veterinary Sciences in speciality 16.00.04 - veterinary pharmacology and toxicology. - State research control institute of veterinary preparations and fodder additives, Lviv, 2001.

The dissertation is dedicated to the study and development of the systems of toxicological control of the fodder additives and agents for protecting animals.

The scientifically proved system of carrying out toxicological control of agents for protecting animals and fodder additives including the study of the subject of the definition of acute and chronic toxicity, cumulation, side effect and remote consequences has been proposed for the first. The order of study of the object of carrying out the toxicological research, the sequence of doing experiments with a choice of concrete procedure has been defined.

The paravariation and adaptation to the present-day conditions of a series of procedures and methods of establishing toxicological parameters, in particular, mutagenity, harmlessness, pharmakokinetics and pharmacodynamics during chronic experiments have been carried out.

During the period of carrying out the research (1991-2000) the toxicological parameters of 163 imported and home preparations have been studied and defined. Various methods of defining toxicity have been approved. The versatile analysis of the received facts has been carried out depending on the pharmacological bunches and the degree of toxicity. Their LD50 have been determined during acute and chronic experiments by means of various methods of insertion. According to different classifications their class of toxicity has been defined.

On the basis of versatile study and complete toxicological research of 23 preparations the order of carrying out pharmaco- toxicological research of the new agents for protecting animals has been generalized, systematized and determined The principles of the choice of the methods and the sequence of carrying out the experiments have been defined depending on the physico-chemical properties of substances and pharmaceutical form.

For the preparations where the new substances are applied, the research toxicokinetics, toxicodynamics, cumulative properties, side effect and remote consequences is obligatory

For the first time the research has been carried out concerning the definition of the action of medical agents which differ as to the degree of toxicity, constitution and functional assignment for surviving, breeding, behaviour, morphological state, the functioning of the digestive system, osmoregulatory function of Paramecium саudаtum during the acute and chronic experiments.

The express-method for defining the toxicity of the new agents for protecting animals and fodder additives by means of infusoria has been developed, patented and offered. The possibility of using the cell cultures as a model system for toxicological research of veterinary preparations has been proved. For the first time the presence of the correlation between the definition of toxicity during the experiments on hematothermal animals and their cytotoxic evaluation by means of the cell culture has been traced.

The general principles, the order and demands for defining harmlessness have been scientifically proved and fixed. The normative document (branch standard) regulating the basic principles for defining harmlessness of veterinary preparations and permitting to ensure their appropriate quality has been worked out.

The comparison of methods of the toxicological control by means of the laboratory animals, fish, infusoria of different species for combined fodder and raw material has been carried out. The positive and the negative sides of each method have been determined.

The infusorian has been used for the express definition of toxicity of fodder and fodder additives.

Key words: toxicological control, agents for protecting animals, fodder additives, acute and chronic toxicity, cumulation, alternative methods, infusorian, cell culture, laboratory and agricultural animals.

Коцюмбас И.Я. Система токсикологического контроля средств защиты животных и кормовых добавок. - Рукопись.

Диссертация на получение научной степени доктора ветеринарных наук по специальности 16.00.04 - ветеринарная фармакология и токсикология. - Государственный научно-исследовательский контрольный институт ветеринарных препаратов и кормовых добавок, Львов, 2001.

Диссертация посвящена изучению и разработке системы токсикологического контроля средств защиты животных и кормовых добавок.

Впервые предложена научно обоснованная система проведения токсикологического контроля средств защиты животных и кормовых добавок, которая включает определение острой и хронической токсичности, кумуляции, побочных действий, отдаленных последствий. Определенный порядок изучения объекта проведения токсикологических исследований, последовательность постановки опытов с выбором конкретной методики.

Проведено модификацию и адаптацию к условиям сегодняшнего дня методик и методов определения токсикологических параметров, в частности мутагенности, безвредности, фармакокинетики и фармакодинамики в хронических опытах.

За период проведения исследований (1991-2000 гг.) изучены и установлены токсикологические параметры 163 препаратов импортного и отечественного производства, апробированы разные способы определения токсичности, проведен разносторонний анализ полученных данных в зависимости от фармакологических групп и степени токсичности. Установлено их ЛД50 в острых и хронических опытах при разных способах введения и определен их класс токсичности соответственно разных классификаций.

На основе разностороннего изучения и полного токсикологического исследования 23 препаратов обобщен, систематизирован и установлен порядок проведения фармако-токсикологических исследований новых средств защиты животных, определены принципы выбора методов, последовательность проведения опытов в зависимости от физико-химических свойств субстанций и фармацевтической формы.

Для препаратов, где применяются новые субстанции, обязательными являются исследования токсикокинетики, токсикодинамики, кумулятивных свойств, побочного действия и отдаленных последствий.

Порядок поэтапного изучения мутагенности и заключение о мутагенной активности средств защиты животных делали с учетом основных и дополнительных методов исследований на генном, геномном и митохондриальном уровнях.

Единственного метода, при помощи которого можно зарегистрировать все виды мутаций, не существует, поэтому используют комплекс методов. Для полной оценки используют тесты с использованием млекопитающих, которые позволяют не только определять разные категории мутаций, но и разработать нормы и регламенты применения препаратов с определенной мутагенной активностью. Для оценки хромосомных нарушений в соматической ткани применяли метод цитогенетического анализа клеток крови и костного мозга млекопитающих (метафазный или анафазный анализ). Для выявления мутаций в ткани зародышей использовали метод учета доминантных летальных мутаций. И как дополнительный тест для учета мутаций половых клеток использовали метод учета аномальных головок сперматозоидов мышей.

Выявлено, что токсическая доза препаратов первого класса была в границах от -3,25 до -9,75 lg; второго - от -6,75 до 8,5 lg; третьего и четвертого - от -4,5 до -5,5 lg. Установлена корреляция между определением токсичности препаратов в экспериментах на теплокровных животных (мыши, крысы) и цитотоксической оценкой их при помощи культуры клетки, что послужило предусловием разработки экспресс-метода оценки класса токсичности ветеринарных препаратов.

Впервые проведены исследования относительно определения действия лекарственных средств, которые различаются за степенью токсичности, строением и функциональным назначением на выживание, размножение, поведение, морфологическое состояние, функционирование травной системы, осморегуляторную функцию Paramecium саudаtum в острых и хронических опытах. Определены этапы отравления парамеций (изменение движения, формы тела, лизис и гибель особей).

Разработан, запатентован и предложен экспресс-метод определения токсичности новых средств защиты животных и кормовых добавок с помощью инфузорий. Установлено высокую чувствительность инфузории туфельки к действию препаратов по критерию смертности парамеций. Доказан последовательный характер изменений физиологических функций в остром эксперименте по сравнению с хроническим. Наиболее чувствительной к действию токсикантов оказалась функция пищеварения, а наименее - репродуктивная.

Разработан и утвержден нормативный документ (отраслевой стандарт Украины “Ветеринарные препараты. Методы определения безвредности”), которым регламентированы основные положения определения безвредности, указаны общие принципы, условия проведения, порядок и методы определения безвредности лекарств. Положения этого стандарта используют при разработке, изготовлении, реализации, использованию препаратов, а также в арбитражных случаях различными учреждениями и организациями независимо от их формы собственности и подчинения.

Важным является вопрос унификации контроля за микробным загрязнением готовых нестерильных лекарственных средств, а также замена определения пирогенности стерильных препаратов классическим способом на кроликах, инструментальными методами (в особенности ЛАЛ-тестом), учитывая индивидуальную чувствительность животных, неоднотипные источники эндотоксинов, широкий их спектр и экологический аспект.

При условиях введения в рыбную и мясо-костную муку антиоксидантов, мико- и бактерицидных препаратов, присутствие солей тяжелых металлов применение как тест-объектов одноклеточных организмов не оправдано и поэтому необходимо, как арбитражный метод, ввести определение токсичности на белых мышах.

Проведены сравнения методов токсикологического контроля с помощью лабораторных животных, рыб гуппи, инфузорий разных видов для комбикормов и сырья, определены положительные и отрицательные стороны каждого метода.

Для экспресс-определения токсичности кормов и кормовых добавок применена инфузория туфелька.

Ключевые слова: токсикологический контроль, средства защиты животных, кормовые добавки, острая и хроническая токсичность, кумуляция, отдаленные последствия, альтернативные методы, инфузория, культура клеток, лабораторные и сельскохозяйственные животные.

Размещено на Allbest.ru

...