Диагностика африканской чумы

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФАКУЛЬТЕТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ

КАФЕДРА МОРФОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

КУРС ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ

РЕШЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЗАДАЧИ № 23

Ляпуновой Анастасии

группа ВВ-322



План

1. Диагностическая задача №23

2. Анализ задачи

3. Этиология болезни

4. Выбор патологического материала и метод консервирования

5. Сопроводительная

6. Подготовка вируссодержащего материала

7. Методы лабораторной диагностики данного заболевания

7.1 Экспресс методы

7.2 Вирусологические методы

7.2.1 Доказательство этиологической роли выделенного вируса

7.2.2 Идентификация выделенного вируса

7.3 Ретроспективная и серологическая диагностика

7.4 Дифференциальная диагностика

8. Заключение



1. Диагностическая задача № 23

В свиноводческом хозяйстве вспыхнуло заболевание среди свиней всех возрастов, которые в течение 3-4 дней распространилось на все фермы данного хозяйства. Заболевание протекало со следующими клиническими признаками: повышение температуры до 41-42С, угнетение, сонливость, парез задней части туловища, учащенное поверхностное дыхание, кашель; на животе, ушах, нижней части шеи красно-фиолетовые пятна. У некоторых свиней понос, фекалии содержат кровь. Летальность - 90 %.

На вскрытии павших животных установлено: цианотические пятна на ушах, животе, нижней части шеи. На серозных оболочках внутренних органов множественные кровоизлияния; висцеральные узлы геморрагичны; селезенка увеличена, сильно гиперимирована с гемморагиями; легкие отечны со студневидными перегородками; печень и почки темно-вишневого цвета с кровоизлияниями.



2. Анализ задачи

чума диагностика вирус африканский

Я изучила литературу, связанную с вирусными и инфекционными заболеваниями свиней, симптомы, описанные в задаче имеют сходство с рожей свиней, пастереллезом, классической чумой свиней (КЧС) и африканской чумой (АЧС).

При роже свиней наблюдается повышение температуры тела, признаки воспалительной эритемы (красно-буро-синие пятна на поверхности кожи) что может свидетельствовать о сходстве подозреваемого заболевания, но отличительным признаками, которые позволяют опровергнуть предположение - это отсутствие контагиозности; а также регистрация таких признаков только у молодых животных (3-12 месяцев), что не соответствует нашим данным.

Возникло подозрение на контагиозное инфекционное заболевание как пастереллез, поскольку при сверхостром течении болезнь проявляется внезапным повышением температуры до 42 С, угнетением, отказом от корма, жаждой, учащенным и затрудненным дыханием. Через 1-2 дня наступает летальный исход. Острое течение характеризуется, одышкой, сильным кашлем, синюшностью слизистых оболочек, носового зеркальца и ушей, нижней части живота. Сходным признаком также служит изменения в легочной ткани. Летальность - 40%. Но заболевание этой бактериальной инфекцией свиней чаще наблюдают у поросят-отъемышей и животных из группы откорма, а в нашем случае заболеванию подвергаются свиньи всех возрастов без исключений.

Классическая чума свиней: также отмечается повышение температуры до 42С, на коже ушей, животе появляются точечные и более крупные кровоизлияния, повышение жажды, лейкопения, понос; патанатомическая картина: множественные кровоизлияния, увеличенные лимфоузлы, очаги гемморагичных инфарктов в виде плотных черно-красных бугорков, почки резко анемичны сходства с данными наиболее подходящая, но при вскрытии у всех павших животных отмечается увеличение селезенки, при КЧС селезенка не увеличена.

На основании сравнения и изучения клинических признаков и патологоанатомических изменений предложенного заболевания и заболеваний со сходными клиническими проявлениями можно сделать вывод, что заболевание, возникшее в свиноводческом хозяйстве, африканская чума свиней (АЧС).

АЧС характеризуется повышением температуры до 41-42с, появление на ушах, животе, нижней части шеи красно-фиолетовых пятен; общее угнетенное состояние; заболевание распространилось на все фермы в течение 3-4 дней, что служит доказательством высокой контагиозности, болеют свиньи всех возрастов. У некоторых свиней понос, фекалии содержат кровь; летальность - 90%. При вскрытии на серозных оболочках внутренних органов обнаружены кровоизлияния; селезенка увеличена, сильно гиперимирована с гемморагиями; легкие отечны; множественные кровоизлияния на слизистых и серозных оболочках; печень и почки темно-вишневого цвета.



3. Этиология болезни

Систематика вируса.

С. Asfarviridae

Р. Asfivirus

Диаметр вириона африканской чумы от 175 до 225 нм. Капсид вириона состоит из 812 капсомеров. ДНК двунитиевая покрыта суперкапсидной оболочкой клеточного происхождения. Имеет симметрию икосаэдра.

Устойчивость.

Вирус характеризуется выраженной вариабельностью вирулентных свойств, высокоустойчив к факторам среды: сохраняется в диапазоне рН от 2 до 13, длительное время -- от недель до месяцев -- сохраняется в продуктах свиного происхождения, не подвергнутых термической обработке (солёные и сырокопчёные пищевые изделия, пищевые отходы, идущие на корм свиньям). Вирус устойчив к высушиванию и гниению; при температуре 60 °C инактивируется в течение 10 минут.

Восприимчивость.

Восприимчивы все домашние и дикие свиньи всех возрастов.

Источник и пути передачи инфекции.

Источник возбудителя АЧС - больные животные. Фактор передачи вируса - корм, пастбища, необезвреженные столовые отходы, загрязненные выделениями больных. Насекомые, хищные птицы и звери могут быть переносчиками. Резервуаром вируса в природе служат африканские дикие свиньи и клещи рода орнитодорос.

Одна туша, инфицированная вирусом африканской чумы может заразить 3 миллиона голов свиней!

Антигенная структура.

Вирус АЧС содержит комплементсвязыющий, преципитирующий и гемадсорбирующий антигены, но не обладают иммуногенной активностью. Установлена иммунологическая множественность типов вируса, обусловленная циркуляцией возбудителя между дикими и домашними свиньями.

Патогенез.

Вирус проникает в лимфоидную ткань и кровь, репродуцируется, распространяется по всему организму, вызывает генерализованную инфекцию с явлениями токсикоза. Затем возникают тяжелые сосудистые расстройства в виде множественных кровоизлияний, тромбозов сосудов, инфарктов и некрозов тканей, то и приводит к массовой гибели заболевших животных.



4. Выбор патологического материала

От животных с повышенной температурой тела, имеющих клинические признаки болезни, отбирают пробы крови (3-5 мл) и добавляют в них антикоагулянт. Материал направляют в запаянных пастеровских пипетках, стерильных пробирках или во флаконах, герметически закрытых стерильными резиновыми пробками. От павших животных отбираются: лимфоузлы подчелюстные или мезентеральные, кусочки селезенки, печени, миндалин по 10-15 г, помещают во флаконы, обрабатывают снаружи 5% раствором хлорамином осветленным, 20% раствором хлорной извести, обертывают марлей, смоченной дезинфицирующим раствором которые помещают в термос с охлаждающей смесью и опечатывают. Материал отправляют в лабораторию с сопроводительной.

Лучше вируссодержащий материал сохранять в лиофилизированном виде. Его можно также длительно (6 месяцев при 2 - 4⁰) сохранять в насыщенном растворе поваренной соли.

В лаборатории готовят 10-20% суспензии органов на физиологическом растворе. Суспензию отстаивают центрифугированием при 1-2 тыс. об/мин. к надосадочной жидкости добавляют антибиотики (пенициллина и стрептомицина) по 500ЕД\мл, выдерживаю 2 часа, затем используют ее для выделения вируса.



5. Сопроводительная

В Кировскую областную ветеринарную лабораторию. Северное кольцо 9а.

Направляется для вирусологического исследования патологический материал: лимфатические узлы, селезенка, кусочки легких от хряка-производителя в возрасте 9 месяцев; принадлежащего ОАО «Искра»; 23.12.2000-26.12.2000 г.

Клинические признаки: повышение температуры тела до 42С, поверхностное дыхание, появление красно-фиолетовых пятен на ушах, животе, нижней части туловища, парез задних конечностей, у некоторых животных фекалии содержат примесь крови. При вскрытии на серозных оболочках обнаруживаются множественные кровоизлияния, висцеральные узлы геморрагичны, селезенка увеличена, печень и почки темно-вишневого цвета.

Иммунизация проводилась от классической чумы свиней с 4х месячном возрасте сухой лапинизированной вирусвакциной (АСВ) из штамма «К» против чумы свиней.

Предварительный диагноз: африканская чума свиней.

Ветврач: Ляпунова А.А.

26.12.2000 г. Подпись:



6. Подготовка вируссодержащего материала

1. Извлекаем законсервированный патматериал, промываем в 3 порциях стерильной воды.

2. Вырезаем кусочек органа, готовим мазки отпечатки для микроскопических методов исследования (так поступаем со всеми типами взятого патматериала).

3. Затем, берём примерно 1 грамм ткани и помещаем в ступку, добавляем стерильный кварцевый песок, растираем до гомогенной массы (можно применить для этой цели гомогенизатор или УЗ-дезинтегратор).

4. К растертой массе добавляем физиологический раствор 1:5; 1:10.

5. Полученную суспензию дважды замораживаем и размораживаем, либо обрабатываем хлороформом.

6. Обработанную таким образом суспензию центрифугируем 5 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость отсасываем.

7. Потом проводим фильтрацию через бактериальный фильтр (либо проводим обработку антибиотиками).

8. Делаем посев на среды Сабуро и Чапека, этим доказываем отсутствие грибов.

9. Приготовленную суспензию используем в лабораторном исследовании на биологических моделях: куриных эмбрионах, культурах клеток и животных.



7. Методы лабораторной диагностики

Для обнаружения возбудителя в исследуемых образцах используют РИФ, ПЦР. Выделения вируса проводят на культуре лейкоцитов свиней и клетках костного мозга свиней. Идентификацию выделенного возбудителя осуществляют с помощью реакции гемадсорбции и метода флуоресцирующих антител. Параллельно ставят биопробу на вакцинированных и не вакцинированных против КЧС поросятах. Для серологических исследований применяют РСК, РДП в реальном времени.

7.1 Экспресс-методы: РИФ, ПЦР

РИФ: 1. Готовим мазки-отпечатки из легких, селезенки, лимфатических узлов;

2. Высушиваем на воздухе, фиксируем ацетоном при комнатной температуре 10 мин, высушиваем при 37С в течении 20 мин;

3. Наносим меченные антитела и оставляем на 30 мин при температуре 37С во влажной камере;

4. Отмываем фосфатным буфером(рН 7);

5. микроскопируем в люминисцентный микроскоп;

6. учет: наблюдаем специфическое свечение зеленого цвета.

Параллельно реакцию проводим на препаратах, приготовленных из органов, заведомо здоровых животных (контроль). В нашем случае реакцию можно считать положительной, так как специфическое свечение наблюдается в виде отдельных гранул и скоплений, а так же реакцию расцениваем положительной на основании отсутствия флюоресцирующих включений в контрольных препаратах; при отсутствии светящихся включений в инфицированных препаратах путем предварительной обработки их немеченой антисывороткой к вирусу АЧС.

Для данного метода необходимо использование специального оборудования для детекции флюоресцентного сигнала. ПЦР - тест-система позволяет достичь высокого уровня чувствительности с помощью 2-х праймеров, используемых в стандартный ПЦР. Это позволяет в течение 5-и часов обнаружить 10 частиц в 1 мл инфекционного вируса в различных материалах, включая пробы органов свиней с хроническими и латентными формами течения болезни.

1. Проводим многократное повторение циклов денатурации исследуемой ДНК при 94С;

2. Проводим гибридизацию ДНК со специфическими праймерами Kingb-s последовательность 5'JCTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA J3', Kingb-a последовательность 5'JGATACCACAAGATCRGCCGT J3' при температуре 55 С и синтеза в них комплементарных цепей ДНК с помощью ДНК-полимеразы прит температуре 72С;

3. В амплификаторе проводим синтез в этом участке - стадии амплификации проводим 30-40 раз за 1,5 - 3 часа;

4. Учет реакции проводим с помощью электрофореза в агарозном геле.

7.2 Вирусологические методы

Вначале проводим выделение вирусов на чувствительной модели - это может быть культура клеток костного мозга свиньи (ККС). Также при помощи КК проводим постановку реакции гемадсорбции, которая позволит судить об отсутствии возбудителя КЧС.

Мы приготовим культуру клеток костного мозга свиньи (Методическое пособие В.Н. Сюрин; В.А. Бурлаков):

1) Берем трубчатые кости плеча, бедра, предплечья или голени; кости очищаем;

2) Диафизы обертываем марлей, хрящевые части эпифизов срезаем, обрабатываем спиртом и прижигаем; выскребаем ткань костного мозга в стерильные колбы с магнитом и добавляем 8-10 частей питательной среды 199;

3) В течение 8-10 минут на электромагнитной мешалке клетки вымываем в среду;

4) Полученную суспензию разводим питательной средой до посевной концентрации, которая выражается в количестве 4-6 млн клеток в 1 мл.

5) Разливаем по культуральным сосудам и культивируем при 37 - 38 С.

Для исключения токсического действия материала на культуру клеток суспензию готовим в последовательных 10-кратных разведениях.

Для заражения КК отбираем 2 - 4-суточные культуры лейкоцитов без признаков дегенерации, просматривая их под микроскопом (Ч80 - 100).

6) Вносим исследуемый материал в виде суспензии из селезенки, легких, лимфатических узлов по 1мл в чашки Карреля и по 0,2 мл в пробирки (на каждое разведение готовим 4 пробирки культуры лейкоцитов).

7) Зараженные культуры инкубируем при 37 - 38С, пока не наступит гемадсорбция. Ежедневно просматриваем под микроскопом.

Наши пробы дали положительную реакцию, так как в культурах лейкоцитов, зараженных исследуемым материалом на 3-и сутки при микроскопировании отмечается отчетливая гемадсорбция в виде принятия зараженной клеткой формы шара ярко-красного цвета, расположенных в несколько слоев в виде ягод малины.

Окончательное подтверждение необходимо дать при проведении прямого метода МФА. Он позволяет избежать возможных ошибок связанных с неспецифической агглютинацией эритроцитов, так как некоторые штаммы вирусов могут утратить свои гемадсорбирующие свойства, а РИФ же способна обнаружить их.



7.2.1 Доказательство этиологии выделенного вируса

Этот вирус является причиной вспышки этого заболевания, что подтверждено клиническими признаками заболевания - цианические пятна на коже и внутренних органах, на ушах, на подгрудке, как следствие, нарушения функций сосудов, приводящим к их разрывам и множественным кровоизлияниям; парез задних конечностей; из патологоанатомической картины - увеличенная селезенка, наиболее характерный признак.

Проверим это предположение при помощи биологической пробы на восприимчивых животных.

Для постановки биопробы берём (биопроба проводится с разрешения Главного управления ветеринарии):

1. Восемь 2-4 месячных подсвинков, 4 их них иммунных к вирусу классической чумы;

2. Заражаем внутримышечно вирусом КЧС;

3. Остальных 4 заражаем - испытуемым материалом - суспензией, приготовленной из селезенки павшего хряка;

4. Ежедневно проводим термометрию;

5. Проводим учет: зараженные животные заболели и погибли в течении 10 дней, а все инфицированные вирусом КЧС остались здоровыми, на основании этого делаем вывод, что испытуемый материал содержит вирус АЧС, гибель подтверждена клиническими признаками и на основании выделения вируса из патматериала павшего животного на культуре клеток костного мозга свиней.

Но поскольку африканская чума - заболевание высококонтагиозное и представляет опасность для всей популяции свиней, чаще биопробу не ставят, им предпочитают более безопасные и менее затратные с экономической точки зрения методы диагностики.



7.2.2 Идентификация выделенного вируса

Для идентификации выделенного вируса будем применять следующие серологические реакции: МФА, РСК, РДП.

МФА - метод флуоресцирующих антител.

1. Готовим мазки-отпечатки из легких, селезенки, лимфатических узлов; а также из мазки из проб костного мозга;

2. Высушиваем мазки и отпечатки на воздухе, фиксируем ацетоном при комнатной температуре 10 мин, высушиваем при 37С в течении 20 мин;

3. Наносим меченные антитела и оставляем на 30 мин при температуре 37С во влажной камере;

4. Отмываем фосфатным буфером (рН 7);

5. Микроскопируем в люминисцентный микроскоп;

6. Учет: наблюдаем специфическое свечение, которое выглядит в виде гранул зеленого цвета, диффузных скоплений.

РСК - реакция связывания комплемента.

Этот метод чувствителен при обнаружении антигена вируса африканской чумы в испытуемых тканях, взятых от свиней в период острого течения заболевания.

1. Готовим ВСМ путем экстракции ткани селезенки смесью ацетона и эфира в равных объемах, готовим в соотношении 1:20;

2. Центрифугируем при низкой скорости, затем Аg элюируем из осадка солевым раствором и надосадочную жидкость используем как Ag.

3. ВСМ по 0,2 мл + комплемент в рабочей дозе по 0,2 мл;

4. Помещаем на водяную баню при 37С на 20 минут;

5. Гемолизин 0,2 мл + взвесь эритроцитов в разведении 1:5;

6. Снова помещаем на водяную баню при 37С на 20 минут;

7. Проводим учет: в нашем случае реакция дала положительный результат, так как в пробирке наблюдается гемолиз.

РДП, реакция предложена больше как дифференциальная диагностика, поскольку имеет не очень высокую чувствительность, для этого используют сыворотку свиней, иммунизированных аттенуированным вариантом вируса, которая дает преципитацию с материалами от больных свиней.

Постановка реакции:

1. наливают слой 1% агара, содержащего 0,1 % тиомерсала, рН=7,2;

2. делаем 7 лунок;

3. тканевую культуру помещаем в 3 лунки (№2,4,6);

4. лунки заполняем мелкими кусочками ткани, отмытые от крови;

5. лунки (№1 и 3) заливаем стандартную иммунную сыворотку;

6. последнюю пятую заполняют стандартной нормальной сывороткой;

7. центральную лунку заполняем заведомо известной вируссодержащей тканью;

8. учет реакции положительный (рис.1)

Рисунок 1

7.3 Ретроспективная серологическая диагностика

Проведя идентификацию при помощи специфических методов можно судить о наличии вируса африканской чумы, но также необходимо подкрепить это исследованием крови, для чего будем использовать реакцию связывания комплемента. Сыворотку крови на лабораторное исследование берут в интервале - 2 недели, с целью выявления специфических антител.

Постановка реакции:

1. В пробирки добавляем 0,1мл исследуемой сыворотки крови;

2. затем добавляем антиген в виде преципитированной метанолом культуры инфицированных клеток + 0,1 мл непрогретой нормальной сыворотки теленка;

3. комплемент в рабочей дозе по 0,1 мл (прокомплементарные свойства сыворотки свиней устраняем формалином);

4. Помещаем на водяную баню при 37С на 20 минут;

5. Гемолитическая система 0,1 мл;

6. Снова помещаем на водяную баню при 37С на 30 минут;

7. Проводим учет: при исследовании в РСК выявлен титр - 1:40, что свидетельствует о положительной реакции - выжившие животные было инфицировано.

7.4 Дифференциальная диагностика

АЧС дифференцируем по патоморфологии, гемадсорбции в культуре клеток лейкоцитов свиней и МФА. Введение в культуру лейкоцитов свиней других вирусов, типичных для свиней (вирус болезни Ауески, КЧС) не вызывает явления гемадсорбции в культуре клеток, что и позволяет опровергнуть болезнь Ауески.

Пастереллез не рассматривать как причину, потому что в нашем хозяйстве проводилась вакцинация против данного заболеваний, а также пастереллез как правило, не принимает характера эпизоотии, поражает преимущественно взрослых животных. Для него характерны отек подкожной клетчатки подчелюстного пространства, распространяющийся на шею и глотку, серозный лимфоденит, слабо выраженный геморрагический диатез. Кроме того, при пастереллезе обнаруживают возбудителя при бактериологическом и биологическом исследованиях.



8. Заключение

Таким образом, проведя лабораторное исследование патологического материала выявлено, что заболевание, вызвавшее гибель большей части поголовья в свиноводческом хозяйстве - африканская чума.

Мер борьбы данным вирусным заболеванием нет, специфических препаратов не разработано, поэтому проводим только профилактические меры борьбы.

Успех ликвидации болезни и прекращение распространения возбудителя из первых очагов зависят в значительной мере от быстроты и точности диагноза. Диагноз ставим на основании эпизоотических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований. Используют следующие методы: РИФ, ПЦР, РСК, РДП, биопроба на восприимчивых животных, в частности - свиньях.

Размещено на Allbest.ru

...