Застосування молекулярно-генетичних маркерів різних класів при визначенні внутрішньо- та міжпородної мінливості свиней

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ РОЗВЕДЕННЯ І ГЕНЕТИКИ ТВАРИН

УДК 636.082. 12:575.1/.2

ЗАСТОСУВАННЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИХ МАРКЕРІВ РІЗНИХ КЛАСІВ ПРИ ВИЗНАЧЕННІ ВНУТРІШНЬО- ТА МІЖПОРОДНОЇ МІНЛИВОСТІ СВИНЕЙ

03.00.15 - генетика

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

МЕТЛИЦЬКА Олена Іванівна

с. Чубинське Київської області 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті свинарства ім. Квасницького Української академії аграрних наук

Науковий керiвник: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Балацький Віктор Миколайович, завідувач лабораторії генетики Інститут свинарства УААН.

Офiцiйнi опоненти: доктор сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник, Подоба Борис Євгенович, завідувач лабораторії генетичних основ селекції Інституту розведення і генетики тварин УААН

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Бердичевський Микола Степанович, завідувач лабораторії розведення і генетики сільськогосподарських тварин Інституту біології тварин

Провiдна установа: Інститут тваринництва УААН, лабораторія генетики, м. Харків, п/в Кулиничі

Захист відбудеться "30" жовтня 2001 р.

о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 27.355.01 при Інституті розведення і генетики тварин УААН, за адресою: вул. Погребняка, 1, с.Чубинське, Бориспільського району, Київської області, 08321.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту розведення і генетики тварин УААН, за адресою: вул. Погребняка, 1, с. Чубинське, Бориспільського району, Київської області, 08321.

Автореферат розісланий " 28" веересня 2001 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, Мільченко Ю.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Підвищення продуктивності сільськогосподарських тварин, як правило, досягається використанням таких традиційних методів селекції і розведення як оцінка за фенотипом, конституційно-екстер'єрними показниками, якістю потомства, репродуктивними функціями. Сучасні системи розведення, насамперед, спрямовані на отримання потомства від високопродуктивних представників породи, які відрізняються високим виходом продукції, тому аналіз їх геному є вельми важливою складовою племінної роботи. Великомасштабна селекція, широке застосування штучного осіменіння з використанням імпортних тварин без урахування їх адаптивних властивостей, поряд з очевидною економічною ефективністю, приводить до скорочення чисельності локальних порід і повної втрати притаманних їм унікальних алелів, небажаному поширенню в популяціях сільськогосподарських тварин генів-носіїв спадкових аномалій. В той же час, у зв'язку з цим існує необхідність детального аналізу геному високопродуктивних особин, пошуку оптимального балансу генів, які визначають продуктивні якості тварин і їх біологічні особливості із залученням сучасних методів його дослідження. При аналізі геному і установленні закономірностей формування генотипів з бажаним комплексом ознак першочергова роль має належати молекулярно-генетичним маркерам [Машуров А.М., 1991; Сулімова П.Н., 1993; Прохоренко П.Н., 1996; Подоба Б.Є., 1997; Почерняєв К.Ф., 1997].

На сучасному етапі, найбільш інформативними маркерами є молекулярно-генетичні системи, що базуються на визначенні поліморфних послідовностей ДНК. Розвиток методів аналізу поліморфізму ДНК з використанням полімеразної ланцюгової реакції відкриває перед дослідниками великі можливості не тільки щодо встановлення фундаментальних закономірностей формування генофонду в процесі спрямованого відбору, а також для вирішення прикладних задач селекції.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертаційна робота виконувалась згідно тематики науково-дослідної роботи лабораторії генетики інституту свинарства УААН : "Розробити нові молекулярно-генетичні методи оцінки генотипів свиней для прискорення селекційного процесу в свинарстві" (N держреєстрації 0197 U 003280).

Мета і задачі роботи. Метою даної роботи є комплексне використання генетичних маркерів для дослідження генетичної структури популяцій, що селекціонуються та оцінки генотипів свиней різного напряму продуктивності.

Для досягнення цієї мети вирішувався ряд конкретних задач:

1. Дослідити поліморфізм гена гормона роста та ріанодин-рецепторного гена, які обумовлюють прояв важливих біологічних і продуктивних якостей свиней:

- розробити техніку виявлення алелів вказаних генів.

- отримати окремі генетико-популяційні параметри для стад свиней вітчизняної селекції.

- провести пошук зв'язків генотипів за цими генами з окремими показниками продуктивності.

2. Оптимізувати умови вивчення двох систем мікросателітних маркерів (SOO97,TNFB), налагодити технологію типування тварин за цими локусами.

3. Проаналізувати структуру популяцій свиней різного напрямку продуктивності і селекції за традиційними і досліджуваними системами молекулярно-генетичних маркерів:

- імуногенетичну структуру популяції свиней миргородської породи (племзаводи ім. Декабристів та ім. Шевченка миргородського району Полтавської області), динаміку мікроеволюційних процесів в стадах провідних племгосподарств,

- імуногенетичну структуру полтавської м'ясної породи і визначити внесок порід-засновників в її формування.

- вивчити генетичні взаємовідносини між генеалогічними групами тварин в стадах; свиня ген порода імуногенетичний

- визначити генетико-популяційні показники за допомогою ДНК-маркерів,

4. Встановити кореляції між мікросателітними і еритроцитарними антигенними локусами; дослідити генетичну варіабельність популяцій, що оцінюється за допомогою імуногенетичних і ДНК-маркерів.

Об'єкт дослідження. Об'єктом досліджень виступає геном свині, його поліморфізм, що виявляється за допомогою імуногенетичних та ДНК-маркерів.

Предмет дослідження. Предметом досліджень є генетичні процеси, які відбуваються в стадах свиней, що належать провідним племінним господарствам Полтавської області: племзаводам ім. Декабристів та ім. Шевченка (миргородська порода), "Світанок" (полтавська м'ясна порода) та ін.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні створені технології типування тварин за геном гормона роста і ріанодин-рецепторним геном і отримані популяційні характеристики вітчизняних комерційних порід свиней за цими локусами.

Встановлено зв'язок генотипів RYR1-гена з показником життєздатності поросят раннього віку.

Вперше були досліджені мікросателітні локуси ДНК свиней полтавської м'ясної і миргородської порід.

Модифікований метод виділення ДНК із м'язевої тканини свиней.

Проведена оцінка генетичної диференціації полтавської м'ясної породи і порід-засновників та ступеня внеску кожної з них в формування її генетичної структури із застосуванням імуногенетичних маркерів та сучасних статистико-математичних моделей.

Вперше досліджено динаміку мікроеволюційних процесів, що відбувалися в провідному стаді миргородської породи свиней.

Проведено співставленя генетичної інформативності систем мікросателітних маркерів з традиційними імуногенетичними.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень вносять значний внесок у розвиток окремих галузей генетики свині.

Продемонстрована можливість застосування поліморфних систем (гормона росту та ріанодинрецепторного гена) для прогнозування продуктивних якостей свиней. Аналіз високополіморфних систем мікросателітної ДНК, поряд з традиційними імуногенетичними, є надійним підходом щодо характеристики генофондів різних популяцій і порід свиней. Реалізація методів, які були розроблені, здатні прискорити ефективність селекційного процесу за рахунок підвищення точності родоводів, дослідження процесів диференціації та консолідації порід, типів, та генеалогічних груп.

Запропановані нами молекулярно-генетичні системи придатні для дослідження генофонду малочисельних та аборигенних порід з метою планування заходів по їх збереженню та вдосконаленню.

Особистий внесок здобувача. При виконанні дисертаційної роботи автором особисто проведена серія лабораторних дослідів по типуванню свиней за имуногенетичними і ДНК-маркерними системами, методики досліджень останніх розроблені дисертантом особисто. Обгрунтування теоретичних положень, виконання збору, обробки і аналізу експериментальних даних належать особисто здобувачеві. При проведенні ретроспективного аналізу мікроеволюційних процесів в популяціях полтавської м'ясної і миргородської порід свиней, використовувалися матеріали лабораторії генетики ІСУААН за попередні роки.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на Вчених Радах ІСУААН, науково-практичній конференції по проблемам свинарства (м. Жодіно, Білорусь, 1995), міжнародній конференції по агробіотехнологіям рослин і тварин (Київ,1997), міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених "Наукові досягнення в галузі ветеринарної медицини" (м. Харків, 1997), II міжнародній конференції "Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях" (м.Одеса,1998), VII -міжнародній науково-практичній конференції "Сучасні проблеми розвитку тваринництва" (м. Жодіно, Білорусь,2000).

Публікації. Результати дисертаційних досліджень викладені в 7 статтях, друкованих в журналах і збірниках, та 5 тезах наукових конференцій.

Впровадження результатів в практику. Впроваджено в практику селекційної роботи племзаводу "Світанок" дослідного господарства ІС УААН молекулярно-генетичного тесту на стрессиндром свиней. Запропановані методи ДНК-типування застосовуються для проведення генетичного моніторингу стад свиней місцевої селекції.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 146 сторінках містить 24 таблиці, 17 рисунків і складається з вступу, огляду літератури, загальної методики і основних методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків і рекомендацій виробництву, використаних джерел (234 джерела, в тому числі 135 іноземних авторів) та 1 додаток.

Матеріали та методи досліджень

Виконані дослідження є складовою частиною тематичного плану науково-дослідних робіт Інституту свинарства УААН. Весь обсяг лабораторних досліджень був проведений на базі лабораторії генетики ІС УААН. Основний об'єм робіт було виконано на чистопородних свинях полтавської м'ясної породи (племзавод "Світанок" Полтавського району, Полтавської області), миргородської породи (племзавод ім. Декабристів, ім. Шевченка, Миргородського району, Полтавської області).

Відбір проб крові і тканин від свиней для проведення імунологічних досліджень і ДНК-типування проводили за загальновизнаною методикою (Тихонов В.М., 1991 р.). Виділення ДНК проводили трьома методами: сольовим (Соколов Б.П., Джемелинский В.В., 1989), сорбентним ("БАТ", м. Харків, 1996р.) і за допомогою реагенту "Chelex-100" (Claude R., 1997). Концентрацію та ступінь очищення ДНК визначали спектрофотометрично. Нативність ДНК - шляхом електрофорезу в 1% агарозному гелі (Маниатис Т., та ін., 1984). Електрофоретичне розділення фрагментів ДНК проводили в 1%, 2% агарозному та 6%, 10% поліакріламідному гелях у тріс-боратному електрофорезному буфері, згідно методичних рекомендацій (Маниатис Т., та ін. 1984). Фарбування гелів здійснювали за допомогою бромистого етидію. Візуалізацію фрагментів ДНК проводили в УФ світлі та фотографували на плівку високої чутливості (Мікрат-300). Розміри фрагментів ДНК визначали за допомогою маркерів молекулярної маси (ДНК фага , плазміди рВR 322, що оброблені ферментами рестрикції, відповідно, pSTI та Hae II) на електрофореграмах (Маниатис, Фрич Э, Сембрук Д., 1984).

Локус-специфічну ампліфікацію фрагментів гена гормону росту проводили в автоматичному режимі на термоциклері "Bioterm 91" (Росія) за схемою, яка складається з 30 циклів з такими параметрами: денатурація ДНК- 1 хв., 94С, ренатурації праймерів- 1.5 хв., 58С, синтез ДНК - 3 хв., 70С. Використовували олігонуклеотидні праймери які обмежували різні ділянки гена гормона росту (Балацкий В.Н., 1998).

Локус-специфічну ампліфікацію фрагмента ріанодин-рецепторного гена проводили за допомогою ПЛР, згідно методичних рекомендацій (Брем Г., Бренінг, 1993). Рестрикцію отриманого ампліфікату здійснювали додаванням безпросередньо в реакційну суміш 2 од. активності фермента Cfo-1 і інкубації зразка 1,5 години при температурi 37 С.

Ампліфікацію мікросателітних локусів ДНК в ПЛР здійснювали із використанням праймерів (Ellegren H., et al., 1993) за методикою (Почерняєв К.Ф., 1997). Проводили 30 циклів ампліфікації за слідуючими параметрами: 1 хвилина - 94 C, 1 хвилина - 60 C (SOO97) та 65C (SSTNFB), 1 хвилина - 70C. Останній цикл ампліфікації: 1 хвилина - 94 C, 3 хвилини - 60 C, 6 хвилин - 70С.

Антигени еритроцитів свиней A,B,D,E,F,G,H,K,L,M визначали з використанням ідентифікованих за міжнародними стандартами реагентів у лабораторії генетики ІС УААН за реакцією агглютинації, непрямої проби Кумбса і гемолітичного теста [Тихонов В.Н., 1991; Тихонов В.Н., 1966].

Основні популяцийно-генетичні параметри груп тварин були обчислені за домопогою персонального комп'ютера IBM PC АT 386 в лабораторії генетики ІСУААН з використанням стандартної програми "BYOSIS-1" (Swofford D.L., Selander A.W.F., 1981), що була модифікована і адаптована в лабораторії генетики ІС УААН для обробки даних імуногенетичного аналізу.

Популяційно-генетичні характеристики та основні статистичні параметри (вірогідність, крітерій ²) за іншими класами маркерів обчислені за допомогою мікрокалькулятора МК-61, згідно відповідних методик [Айала Ф., 1984; Плохинский Н.А., 1969].

Результати роботи та їх обговорення

Поліморфна система гена гормона росту. Ген гормона росту свині складається з 2231 пар основ та містить у собі такі складові частини: п'ять екзонів, чотири інтрони та фланкуючі ділянки.

При оптимізації умов ампліфікації використовували набір праймерів (PG1, PG2, M, N, L2, I2, K), а також праймери до гена гормона росту бугая (BG3M, BG10M, BG4 ). Праймери використовувалися у різних варіантах поєднань. Найбільш вдалі комбінації утворювали специфічний продукт ампліфікації: BG3/BG10 давали фрагмент розміром 343 п.н., BG3/N - 1061 п.н.

При підборі оптимальних умов ампліфікації змінювали температурні параметри, а також концентрацію основних реакційних компонентів: хлориду магнію, полімерази та геномної ДНК. На подальших етапах проводився рестриктний аналіз фрагментів гена з метою виявлення його алельних варіантів.

В результаті обробки ділянки гена гормону росту свиней миргородської породи, що обмежені праймерами BG3/BG10 ферментом рестрикції BSuR1 виникали фрагменти розміром 80, 78, 75, 60, 31 і 17 п. н., що сумарно цілком відповідало первинній структурі ампліфікованого фрагмента ДНК.

У декількох тварин виявлявся фрагмент розміром 48 п. н. замість двох розміром 31 та 17 п. н. Цей факт свідчить про те, що сайт рестрикції для ендонуклеази BSuR1 і розташований у 1 інтроні на відстані 16 п. н. вище екзона 2 ( за сиквенсом - у 297 позиції карти гена) є поліморфним. Присутність цього сайту приводить, при обробці рестриктазою до появи фрагментів, розмір яких прогнозується на основі відомої структури гена, його відсутність спричинює утворення ділянки в 48 п.н.

В локусі GH свині було виявлено два алеля: BSuR1+ та BSuR1- (відповідно, за наявністю і відсутністю поліморфного сайту) в позиції 297 карти гена. Сімейним аналізом на поголів'ї свиней миргородської породи (n=34) встановлений менделівський характер успадкування BSuR1 алелів GH.

Частота алеля 297BSuR1+ = 0, 526; 297BSuR1= 0, 474. Долі генотипів: 297BSuR1⁺/297BSuR1⁺= 0,368; 297BSuR1⁺/297BSuR1= 0,316; 297BSuR1/207BSuR1= 0,316. За розподілом генотипів встановлена перевищена кількість 297BSuR1+/297BSuR1- та 297BSuR1-/207BSuR1 порівняно з очікуваним значенням (² = 5.095), р<0.05. Таким чином, відсутність врівноваженого розподілу BsuRI генотипів вказує на селекційну роль цього локусу в маркіруванні спадкової інформації.

Поліморфізм гена гормону росту свині за HaeII- сайтом рестрикції. Відомо про існування поліморфізму по рестриктазі Hae II гена гормона росту свині в положенні 555-556 карти гена (другий екзон) [Kirkpatrick, 1990], що призводить до амінокислотної заміни у білку (гліціна на аспарагін). В лабораторії генетики були підібрані оптимальні умови для гідролізу рестриктазою Hae II фрагмента BG3\N гена, який містив цей поліморфний сайт, і обстежено кілька тварин миргородської породи. Виявлені тварини, у яких зустрічалися обидва алельних варіанти гена в різних генотипічних комбінаціях: гомозиготному та гетерозиготному стані. Так, гомозиготні тварини Hae II⁺/HaeII⁺ мали фрагменти рестрикції розміром 595, 316 і 149 п. н., гомозиготи HaeII/HaeII виявляли два фрагменти розміром 911, 595, 316, і 149 п. н.. Таким чином, поліморфізм, що виявлявся за допомогою фермента рестрикції Hae II, має місце і в популяції вітчизняної породи.

Поліморфний Msp I- сайт гена гормона росту свині знаходиться у третьому інтроні (положення 742 карти гена) [Kirkpatrick, 1990]. За цією генетичною системою нами були виявлені тільки тварини з генотипом 742MspI⁺/742MspI⁺.

За трьома рестриктазами в початковій ділянці гена гормона росту свині виявлено 5 гаплотипів:

- 297BSuR1+/555Hae11+/742MspI+; - 297BSuR1+/555HaeII+/742MspI-;

- 297BsuR1+/555HaeII-/742MspI-; - 297BSuR1-/555HaeII-/742Msp1-;

- 297BSuR1-/555HaeII+/742Msp1+.

Це свідчить про значний рівень поліморфізму, що притаманний гену гормону росту і створює передумови його використання для маркірування генотипів.

Поліморфна система ріанодин-рецепторного гена. Ріанодин-рецепторний ген відповідає за формування Са²⁺ каналів мембрани клітини. Він картований на 6 хромосомі свині і контролює таку важливу селекційну ознаку як підвищена чутливість тварин до стресів - PSS. Виявлена мутація в RYR1-гені галотанового локуса в позиції 1843, що призводить до заміни цитозину на тимін і, в свою чергу, до заміни аргиніну на цистеїн в 615 позиції амінокислотної послідовності білку [Fuji J., Otsu K., 1991]. Iнсерція в позиції 1843 п.н. гену веде до виникнення його рецесивного алельного варіанту, що у гомозиготному стані обумовлює розвиток стрес-синдрому у свиней, а в гетерозиготному стані - тварина є носiєм мутантного алеля.

Нами здійснена модифікація методу виявлення поліморфізму RYR1- гена, яка дозволила значно спростити та скоротити процедуру тестування тварин за цим локусом. Було тестовано 48 голів свиней полтавської м'ясної породи племзаводу "Світанок" за допомогою молекулярно-генетичного тесту, з яких у 30 тварин була визначена реакція на галотан [Fischer K., 1987] і зазначена адекватність ДНК-діагностичного теста, заснованого на типуванні за RYR1-геном, класичному галотановому. Незначне розходження їх результатів (на рівні 10%) може бути пов'язане з неповною пенетрантністю рецесивного алеля в прояві ознаки стресчутливості в галотановому тесті, а також фізіологічним станом тварин в момент його проведення.

За допомогою ДНК-тест системи були отримані популяційно-генетичні характеристики щодо розповсюдження мутантного алеля RYR1 гена в стадах свиней різного напрямку продуктивності (табл. 1).

Розподіл RYR-I алелів і генотипів в популяціях свиней різних порід

Групи тварин і популяції	n	Частота алелів	Частота генотипів
		RYR-I C	RYR-I T	RYR-I C/C	RYR-I C/T	RYR-I T/T
племзавод "Світанок", полтавська м'ясна	57	0,789	0,211		0,596			0,386			0,018
					0,622			0,333			0,045
"Стрілецький", полтавська м'ясна	25	0,820	0,180		0,640			0,360			0,000
					0,672			0,295			0,032
Полтавська м'ясна, вцілому	82	0,799	0,201		0,610			0,378			0,012
					0,639			0,321			0,040
Дослідна група полтавська м'ясна	51	0,941	0,059	0,902	0,087	0,020
Група 2-х міс. тварин полтавська м'ясна "Світанок"	43	0,686	0,314		0,396			0,581			0,023
					0,431			0,431			0,098
українська м'ясна	34	0,897	0,103		0,794			0,206			0,000
					0,805			0,184			0,011
червоно-поясна спеціалізована м'ясна лінія	26	0,981	0,019		0,962			0,038			0,000
					0,962			0,038			0,000
велика біла	67	1,000	0,000	1,000	0,000	0,000
миргородська	54	1,000	0,000	1,000	0,000	0,000
Примітка: в знаменнику наведені очікувані значення частот генотипів.

Встановлено, що популяції свиней великої білої породи і миргородської вільні від мутантного алеля RYR1-гена. Суттєва концентрація рецесивного алеля RYR1-гена характерна тільки для полтавської м'ясної породи свиней, що обумовлено участю в формуванні генофонду ПМ породи п'єтрен.

Зафіксована нами високодостовірна різниця (р<0,001) між розподілом RYR1-C/C і RYR1-С/T генотипів в експериментальній групі ПМ (поросята, що пали) та вибірці дорослих тварин, що належали до основного стада племзаводу "Світанок" дає підстави стверджувати про вплив мутантного алеля RYR1 гена в гетерозиготному стані на показник збереження поросят у ранньому віці.

Для свиней показано, що тільки одна мутація в позиції 1843 RYR1 гена достовірно асоційована з ознаками стрес-синдрому свиней [Vцgeli P. et al., 1994]. Таким чином, модифікований нами метод ДНК-RYR1 типування, є цілком адекватним для діагностики MHS свиней.

Використання високополіморфних систем мікросателітних локусів в генетико-популяційних дослідженнях.

За SOO97 мікросателітним локусом були досліджені стада полтавської м'ясної і миргородської порід, що дозволило встановити характер розподілу алельних частот в них і отримати основні популяційно-генетичні характеристики. Значення алельних частот, рівня гетерозиготності і кількість ефективних алелів наведені в табл. 2.

Розподіл частот алелів, генотипів, рівні гетерозиготності та ефективна кількість алелів за S0097 локусом полтавської мясної і миргородської порід свиней

Л О К У С S 0 0 9 7
Полтавська м'ясна порода n = 32	Миргородська порода n = 21
Частоти аллелів	Генотипів	Частоти аллелів	Генотипів
A	(206)	0.344	BE	0.125	A	(206)	0.167	DF	0.048
B	(216)	0.219	CF	0.063	B	(216)	0.095	EF	0.048
C	(218)	0.094	BC	0.03	C	(218)	0.214	FG	0.238
D	(234)	0.141	BF	0.031	D	(234)	0.071	CF	0.238
E	(238)	0.156	DE	0.031	E	(238)	0.024	AD	0.048
F	(242)*	0.047	AC	0.031	F	(242)*	0.310	AB	0.095
G	(264)*	0.000	AE	0.094	G	(264)*	0.119	AC	0.190
H	(282)	0.000	AB	0.094	H	(282)	0.000	BF	0.048
J	(298)	0.000	AD	0.094	J	(298)	0.000	BD	0.048
			BD	0.156
Hс **		0.813			Hс **		1.000
Но		0.779			Но		0.801
ne (с		5.344			ne (с)		-
ne (о)		4.520			ne (о)		5.025

Примітка: 1. * - вірогідність різниці: р<0.05 2. ** - вірогідність різниці: р<0.01

3. В дужках наведені розміри алелів, п.н.

В миргородській породі відмічено доволі високий рівень поліморфізму, оскільки з 9 відомих алелів [Johansson M. et al. 1992] нами було виявлено 7. Найвища частота зустрічання (0.310) зафіксована для алеля розміром 242 п.н., тоді як в популяції полтавської м'ясної породи цей алель зустрічався із самою низькою частотою (0.047), різниця в їх розподілі, в залежності від порідної належності, достовірна (р<0.05).

Рівень гетерозиготності SOO97 локуса М породи, виявився максимальним (1.000) і достовірно відрізнявся від цього ж показника в полтавській м'ясній породі (0.813), (р<0,01).

За досліджуваною генетичною системою TNFB локусу, миргородська порода свиней виявила дуже високий рівень поліморфізму, а кількість зафіксованих нами алелів в цій популяції дорівнювала 21. Розміри ампліфікованих фрагментів (алелів системи TNFB локуса), отриманих завдяки локус-специфічній ампліфікації, коливалися в межах від 192 п.н. до 270 п.н. Рівень поліморфізму TNFB локуса в полтавскій м'ясній породі виявився більш низьким, ніж в миргородській породі, оскільки кількість виявлених нами алелів в цій популяції дорівнювала 16.

Алель разміром 180 п.н., що зустрічався з високою частотою в миргородській породі, в популяції свиней полтавської м'ясної породи взагалі не був виявлений. Оскільки встановлена достовірна різниця у розподілі частот цього алеля у двох порівнюваних популяціях (р<0.05), то у відношенні миргородської породи цей алель може бути визначений як маркерний.

Вивчення специфіки досліджуваних порід за розподілом алельних частот свідчить про їх дивергенцію та наявність відмінних ознак, що проявлюються не тільки на фенотиповому, але і на геномному рівні.

Вивчення внутрішньо-та міжпородної мінливості полтавської м'ясної та миргородської порід свиней із застосуванням імуногенетичних маркерів.

Було проведено імуногенетичне тестування стад базових племінних господарств по полтавській м'ясній, миргородській, великій білій та породі ландрас, станом на 1992 р. Розподіл частот алелів за 10 системами груп крові характеризувався чітко вираженими міжпородними особливостями. Аналіз алельного спектру груп крові полтавської м'ясної породи продемонстрував, що на її формування значно вплинули як свині місцевої селекції, так і тварини імпортних генотипів, в результаті чого сформувався своєрідний проміжний генофонд за рядом досліджених генетичних систем.

Згідно використаних формул [Rogers J.S., 1972; Edvards A.W., 1967] найбільша генетична дистанція зафіксована між породами полтавська м'ясна і ландрас, найменша - між полтавською м'ясною та великою білою породами (табл.3).

Згідно дендрограми, спільний кластер був сформований полтавською м'ясною та великою білою і миргородською породами, окреме відгалуження створила порода ландрас, (рис.1.).

Коефіцієнти генетичних дистанцій, що розраховані з використанням формул Едвардса (нижня діагональ) і Роджерса (верхня діагональ)

	Породи	1	2	3	4
1	Миргородська	*****	0,212	0,158	0,186
2	Ландрас	0,243	*****	0,196	0,169
3	Полтавська м'ясна	0,183	0,241	*****	0,141
4	Велика біла	0,195	0,209	0,136	*****

В нашому випадку за своєю генетичною структурою ПМ більш наближена до ВБ, яка згідно прийнятої схеми схрещування виступала на різних етапах породостворення в якості як материнської, так і батьківської форм.

Рисунок 1 Дендрограма філогенетичних взаємовідносин популяцій, побудована за результатами генетичних відстаней Едвардса, методом незваженої парно-групової кластерізації Вагнера

У зв'язку з цим, потрібно підкреслити необхідність імуногенетичного моніторингу як в процесі створення, так і на етапах подальшого становлення порід синтетичного походження.

Динаміка мікроеволюційних процесів в популяції свиней миргородської породи. При дослідженні мікроеволюційних процесів, що відбувалися в миргородській породі в ретроспективі з 1971 по 1997 рік за допомогою імуногенетичних маркерів було показано, що "замкнена" популяція є стабільною, консолідованою генетичною структурою. Але, певні селекційні методи і деякі природні події на тривалий час виводять її зі стану рівноваги. Так, наприклад, "прилиття" крові кнурів породи гемпшир виявилося ефективним засобом підвищення генетичної різноманітності тварин стада, завдяки специфічній системі племінної роботи в ньому, а також високоефективному поєднанню цих порід. Відбір тварин бажаного типу сприяло тривалому збереженню у стаді свиней миргородської породи "генетичного матеріалу" породи поліпшувача, що підтверджується розрахунком ряду популяційно-генетичних параметрів. Наприклад, вплив породи поліпшувача відбився на зміні алельного спектру, як в лініях, так і в основних родинах стада. Дослідження динаміки змін генетичних дистанцій [Rogers J.S., 1972] між провідними лініями стада показали, що максимальне їх значення припадає саме на 1991 рік і коливається в значних межах: від 0,058 (Швидкий, Дніпро) до 0,200 (Камиш, Ловчик).

Співставлення імуногентичних характеристик популяцій тварин, що належать племзаводам ім.Декабристів та ім.Шевченка, дозволило встановити високовірогідну різницю між ними як на алельному так і генотиповому рівні.

У стаді племзаводу ім.Шевченка рівень загальної гетерозиготності (0,207) виявився нижчим ніж у господарстві замкненого типу - племзаводу ім.Декабристів (0,221). Отримані популяційні параметри вказують на більш високий рівень племінної роботи, налагоджену систему відбору тварин в репродуктивно ізольованому стаді.

Кореляція між рівнем генетичної мінливості імуногенетичних і мікросателітних локусів. Знайдені позитивні кореляції між окремими імуногенетичними і мікросателітними локусами (табл. 4) є наслідком дії спільних факторів, що впливають на зміну порівнювальних параметрів, серед яких можливо зазначити: а) високий рівень поліморфізму мікросателітних локусів і Е, L-локусів груп крові, що роблять основний внесок у формування підсумкового показника гетерозиготності популяцій, на основі яких і проводилося виявлення кореляційного зв'язку; б) односпрямованість залучення алелів двох досліджуваних класів маркерів в селекційний процес.

Кореляції між гетерозиготністю за локусами груп крові і мікросателітними локусами

Локуси систем груп крові	Мікросателітні локуси
	TNFB	S0096
E	+0,640±0,164***	+0,637±0,172**
L	+0,317±0,202	+0,285±0,214
K	-0,077±0,212	+0,256±0,216
B	+0,080±0,213	+0,127±0,222
D	+0,436±0,192**	+0,530±0,190*
10 локусів	-0,394±0,196*	+0,135±0,211

Примітка: *** - р<0,05; ** - р<0,01; * - р<0,001

10 лок х 2 лок = +0,586±0,217 **

Це свідчить про доцільність комплексного поєднання груп крові і ДНК-маркерів при вирішенні питань популяційно-генетичного характеру, з урахуванням їх специфіки, переваг і недоліків, в залежності від конкретної мети, що поставлена перед селекціонерами.

Висновки

1. Для ефективного моніторингу селекціонованих стад свиней і індивідуальної оцінки генотипів тварин при розв'язанні прикладних задач у свинарстві, необхідне комплексне використання імуногенетичних і ДНК-маркерів. Розробка методів виявлення поліморфізму генів, що контролюють прояв важливих господарських ознак, з використаням маркерів різних класів, є актуальною задачею генетики сільськогосподарських тварин.

2. Розроблена методика визначення поліморфізму гена гормону росту за ендонуклеазами BsuR1, HaeII, MspI. В миргородській породі свиней виявлено 5 гаплотипів за gGH. Визначено окремі генетико-популяційні показники цієї породи у відношенні зазначеного гена.

3. Здійснено модифікацію технології типування свиней за RYR-1 геном, що дозволило значно спростити та скоротити процедуру ДНК-діагностики тварин за стресчутливістю. Проведений популяційно-генетичний аналіз за RYR-1 геном різних порід свиней вітчизняної селекції. Мутантний алель RYR-1 гена в стадах свиней великої білої і миргородської порід не виявлений, проте його суттєва концентрація відмічена в стадах свиней полтавської м'ясної породи (20,1%).

4.Зафіксовано високовірогідну різницю між розподілом
RYR-1-С/С і RYR-1-С/Т генотипів в групі загиблих поросят полтавської м'ясної породи та вибірці тварин основного стада п/з “Світанок” (р<0,001), що пов'язане із впливом RYR-1-Т алеля в гетерозиготному стані на показник збереженості молодняку.

5. Продемонстрована адекватність ДНК-діагностичного теста, заснованого на типуванні за RYR-1-геном, галотановому методу. Незначне розходження їх результатів (10%) може бути пов'язане з неповною пенетрантністю рецесивного алеля, а також наявністю суб'єктивних факторів, що впливають на результат галотанового типування.

6. Оптимізовано умови ампліфікації і електрофоретичного визначення алелів мікросателітних локусів генома свині: S0097, TNFB. Специфічність синтезу підвищується при додатковому очищенні зразків ДНК. Додавання формаміду в реакційну суміш не впливає на якість ПЛР-продукту.

7. Вперше отримана популяційно-генетична характеристика полтавської м'ясної породи за мікросателітними локусами алелі яких визначалися за допомогою ампліфікації в полімеразній ланцюговій реакції. Виявлено високу індивідуальну своєрідність розподілу S0097, TNFB-алелів і генотипів в стадах полтавської м'ясної і миргородської порід. Визначена гетерозиготність досліджуваних популяцій за мікросателітними локусами. Для S0097 в полтавської м'ясної вона становила 0,813, миргородської - 1,000. Гетерозиготність TNFB-локусу для цих порід склала відповідно 0,968 і 0,900.

8. Визначений значний поліморфізм по TNFB мікросателітного локусу (21 алель) дає змогу стверджувати про більш високу ступінь інформативності цього класу маркерів, порівняно з окремими системами груп крові свині.

9. Популяційно-генетичні дослідження, проведені з використанням високополіморфних імуногенетичних і ДНК-систем маркерів продемонстрували нижчий рівень поліморфізму в полтавській м'ясній породі, порівняно з миргородською, що пояснюється значним селекційним тиском на цю новостворену популяцію. Результати імуногенетичного аналізу новоствореної полтавської м'ясної породи, порівняно з породами - засновниками (великою білою, миргородською, ландрас) свідчать про наявність специфічних особливостей, що визначають оригінальність її генофонду. Вперше проведена оцінка генетичної диференціації полтавської м'ясної і вихідних порід з використанням методів розрахунку генетичних дистанцій і кластерного аналізу. Найбільш генетично наближеною до полтавської м'ясної виявилася велика біла (D=14,1%, Rodgers, 1974), віддаленою - ландрас (D=19,6%).

Значення генетичної дистанції між суміжними генераціями тварин стада п/з “Світанок” - по полтавській м'ясній породі (D=96,3%, Nei, 1972) свідчить про консолідованість досліджуваної популяції тварин.

11. Вперше, методом імуногенетичного маркірування, здійснений аналіз мікроеволюційних процесів, що відбувався в миргородській породі в ретроспективі. Продемонстровано високу ступінь стабільності генетичного матеріалу з 1971 по 1974 та з 1994 по 1997 роки. Максимальне значення гетерозиготності ліній (0,333) та родин (0,298) в 1991 може бути наслідком впливу породи - поліпшувача (гемпшир).

12. Проведене зіставлення імуногенетичних характеристик двох репродуктивно ізольованих популяцій свиней миргородської породи дозволили виявити високовірогідну різницю між ними за B, L, G, F, E - системами груп крові і наявність маркерних алелів у них.

13. Встановлено існування кореляції між несинтенними Е, S0097, TNFB-локусами (р<0,001). Кореляційний коефіцієнт між рівнями гетерозиготності, що визначені за 10 локусами груп крові та мікросателітними маркерами, в популяціях полтавської м'ясної та миргородської порід становив +0,586 (р<0,01).

Пропозиції виробництву

Ввести в практику селекційної роботи ДНК-діагностичний тест на стресчутливість який, на відміну від галотанового, дозволяє оцінювати свиней за генотипом і враховуючи відомий зв'язок між м'ясністю та стресчутливістю, більш ефективно вести селекцію, спрямовану на підвищення м'ясних якостей свиней.

Для контролю походження тварин з метою покращення зоотехнічного обліку при закладці нових ліній та родин проводити їх тестування як за групами крові, так і за високополіморфними системами ДНК-маркерів, які перевищують імуногенетичні за інформативністю.

При підборі варіантів схрещувань з метою підтримки генетичної різноманітності можна рекомендувати визначення генетичних відстаней між різними генеалогічними групами тварин з використанням розроблених систем молекулярно-генетичних маркерів.

Список наукових робіт опублікованих за темою дисертації

1. Балацький В.М., МЕТЛИЦЬКА О.І. Кореляційні зв'язки між вмістом форм соматотропіну і деякими показниками розвитку свиней // Свинарство. 1997. Вип.53. С. 67-69.

2. МЕТЛИЦЬКА О.І. Поліморфна система гена гормона росту свині. // Науково-виробничий бюллетень "Селекція", число четверте. 1997. С. 138-139.

3. Балацкий В.Н., МЕТЛИЦЬКА О.І. Ревенко А.И. Достижения генетики- в практику селекционной работы. // Свиноводство. 1998. №5. С. 2-3.

4. Слинько В.Г., Оксинюк А.Н., МЕТЛИЦЬКА О.І., Балацький В.М Стресчутливість ремонтних свинок різних генотипів. // Вісник Полтавського державного сільськогосподарського інституту. 1999. №5. С. 25-27.

5. Коваленко В.Ф.Балацький В.М. Метлицька О.І.Біндюг О.А.ДНК- діагностика стрес-синдрому в популяції свиней м'ясного напряму продуктивності // Вісник аграрної науки. 1999. №9. С. 40-43.

6. Гришина Л., МЕТЛИЦЬКА О.І., Пономаренко А Динамика изменения иммуногенетической структуры популяции свиней УКБ-1 // Свиноводство. 2000. №4. С. 8-10.

7. Балацкий В., МЕТЛИЦЬКА О.І., Биндюг А.Генная диагностика гипертермического синдрома в популяциях свиней разных генотипов. // Свиноводство. 2000. №6. С. 8-10.

8. Балацкий В.Н., МЕТЛИЦЬКА О.І. Полиморфная система гена гормона роста свиньи. // Тез. докл. научно-практической конф."Совершенствование существующих и создание новых генотипов и технологий содержания свиней". Жодино, 1995. С. 29.

9. Почерняев К., Балацкий В., МЕТЛИЦЬКА О.І., Курман А., Малюта С. Поиск нестабильных микросателлитных локусов для разработки биотестов мутагенного давления на геном. // Тез.докладов междун.конф. "Агробиотехнологии растений и животных". К., 1997. С. 31.

10. МЕТЛИЦЬКА О.І., Балацький В.М., Почерняєв К.Ф. Молекулярно-генетична діагностика злоякісного гіпертермічного синдрому свиней. // Науково-прак. Конферен. Молодих вчених "Наукові досягнення в галузі ветеринарної медицини" Харків., 1997. С. 105-106.

11. Балацкий В.Н., МЕТЛИЦЬКА О.І. Распространение мутантного аллеля RYR1 гена в популяциях свиней различного направления продуктивности. // Збірник матер. II міжнар. конф."Використання сучасних молекулярно-генетичних розробок у генетико-селекційних дослідженнях. К., 1998. С. 119-120.

12. Войтенко С.Л., Коротков В.А., МЕТЛИЦЬКА О.І. Сравнительная оценка определения генетической подобности животных // Материалы 7-ой междун. научно-произ. конф. "Современные проблемы развития свиноводства". Жодино, 2000. С. 75-76.

13. Гришина Л.П. МЕТЛИЦЬКА О.І., Влияние генетических и паратипических факторов на продуктивность свиней крупной белой породы. // Материалы 7-ой междун. научно-произ. конф. "Современные проблемы развития свиноводства". Жодино, 2000. С. 35-36.

Анотація

Метлицька О.І. Застосування молекулярно-генетичних маркерів різних класів при визначенні внутрішньо- та міжпородної мінливості свиней. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика, сільськогосподарські науки. - Українська академія аграрних наук, Інститут розведення і генетики тварин УААН, с.Чубинське, 2001.

Дисертація присвячена питанням розробки методів виявлення поліморфізму систем ДНК-маркерів і співставленню рівнів їх інформативності з традиційними імуногенетичними. З використанням маркерних систем різних класів проведена популяційно-генетична характеристика полтавської м'ясної і миргородської порід свиней, встановлені закономірності проходження генетичних процесів при різних методах розведення. Розроблена методика типування тварин за геном гормона росту і модифікований ДНК-тест на стрессиндром можуть бути використані для підвищення ефективності селекції племінних стад свиней. Показано, що мікросателітні S0097, TNFB локуси поряд з імуногенетичними маркерами є зручними системами генетичної паспортизації порід і генеалогічних груп, окремих особин племінних свиней.

Ключові слова: свиня, ген, генотип, поліморфізм, полімеразна ланцюгова реакція, алель, популяція, дендрограма, мікросателітна ДНК.

Аннотация

Метлицкая Е.И. "Использование молекулярно-генетических маркеров разных класов при определении внутри- и межпородной изменчивости свиней."- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельськохозяйственных наук по специальности 03.00.15 - генетика, сельськохозяйственные науки.-Украинская академия аграрных наук. Институт разведения и генетики животных УААН, Чубинское, 2001 г.

Диссертация посвящена вопросам разработки методов выявления полиморфизма систем ДНК-маркеров и сопоставлению уровней их информативности с традиционными иммуногенетическими. Разработана методика определения аллельных вариантов гена гормона роста с использованием трех эндонуклеаз BsUR1,Hae II, Msp I. В миргородской породе свиней выявлено 5 гаплотипов по указанному локусу, получены отдельные популяционно-генетические характеристики в отношении данного гена.

Осуществленная нами модификация техники типирования свиней по RYR1-локусу позволила значительно сократить и упростить процедуру тестирования животных. Впервые был проведен популяционно-генетический анализ свиней разного направления продуктивностьи отечественной селекции по RYR1-гену. У животных крупной белой и миргородской пород мутантный аллель RYR1-гена не выявлен, тогда как существенная концентрация его отмечена в стадах полтавской мясной породы (20.1%). Обнаружено высокодостоверное различие в распределении RYR1-C/C и RYR1-C/T генотипов в выборке мертвых поросят полтавской мясной породы и группе животных основного стада племзавода "Рассвет" (р < 0.001), что является следствием влияния RYR1-T аллеля в гетерозиготном состоянии на показатель выживаемости поросят. Показано соответствие ДНК-диагностического теста, основанного на типировании животных по RYR1-локусу, галотановому методу. Незначительное расхождение их результатов (на уровне 10%) может быть связано с неполной пенетрантностью рецессивного аллеля в проявлении симптомов стресс-чувствительности в галотановом тесте, а также физиологическим состоянием животных в момент его проведения.

Впервые проведен популяционно- генетический анализ полтавской мясной породы по микросателлитным локусам, аллели которого определялись путем амплификации в полимеразной цепной реакции. Отмечена высокая специфичность распределения SOO97, TNFB аллелей и генотипов полтавской мясной и миргородской пород. Определена гетерозиготность исследуемых популяций по микросателлитным локусам для S0097 в полтавской мясной, она составила 0.813, для миргородской - 1.000. Гетерозиготность TNFB локуса для этих пород составила,соответственно 0.968 и 0.900.

По исследуемой генетической системе TNFB локуса миргородской порода свиней выявила очень высокий уровень полиморфизма, а количество зафиксированных нами аллелей в этой популяции равнялось 21. Полученные результаты дают возможность утверждать, что степень информативности этого класса маркеров более значительна, по сравнению с отдельными системами групп крови свиней.

Результаты иммуногенетического анализа недавно созданной полтавской мясной породы, по сравнению с породами-основателями, свидетельствуют о наличии специфических особенностей, определяющих оригинальность ее генофонда. Впервые проведена оценка генетической дифференциации полтавской мясной и исходных генотипов с использованием методов рассчета генетических дистанций и кластерного анализа. Наименьшее генетическое расстояние обнаружено между полтавской мясной и крупной белой (D=14,1%, Rodgers,1974), наибольшее - между полтавской мясной и породой ландрас (D=19,6%).

Впервые, методом иммуногенетического маркирования осуществлен анализ микроэволюционных процессов, происходивших в миргородской породе во временном аспекте. Отмечена высокая степень стабильности генетического материала с 1971 по 1974 г.г. и с 1994 по 1997 г.г. Максимальное значение гетерозиготности линий (0.333) и семейств (0.298) в 1991 году может быть следствием влияния породы-улучшателя (гемпшир). При сопоставлении иммуногенетических характеристик двух репродуктивно изолированных популяций свиней миргородской породы удалось установить высокодостоверную разницу между ними как на уровне аллельного, так и генотипического распределения. В стаде племзавода им. Шевченко, уровень общей гетерозиготности (0.207) оказался более низким, чем в хозяйстве "закрытого" типа племзавода им. Декабристов (0.221), что объясняется более совершенной системой проведения племенной работы в последнем из названных хозяйств.

Установлено существование ассоциативных связей между несинтенными E, S0097, TNFB локусами (р< 0.001) а корреляционный коэффициент между уровнями гетерозиготности, вычисленными по 10 локусам групп крови и микросателлитным маркерам, в популяциях свиней полтавской мясной и миргородской пород составил +0,586 (р<0.01). Очевидно, что обнаруженные позитивные корреляции являются следствием высокого уровня полиморфизма микросателлитных локусов и E группы крови и однонаправленностью вовлечения аллелей двух исследуемых классов маркеров в селекционный процесс.

Представляется целесообразным комплексное сочетание групп крови и ДНК-маркеров при решении вопросов популяционно-генетического характера, с учетом их специфики, в зависимости от конкретной цели, стоящей перед селекционерами.

Ключевые слова: свинья, ген, генотип, полиморфизм, полимеразная цепная реакция, аллель, популяция, дендрограмма, микросателлитная ДНК.

Annotation

O.I.Metlitskaya. Use of the different molecular-genetic classes markers for in- and interbreeds pig's variability. - Manuscript.

Thesis for a candidate degree of agricultural sciences on the speciality-03.00.15.- genetics.- Ukrainian academy of agrarian sciences, Institut of Animal Breeding and Genetics.- v.Chubinske, Kyiv Region, 2001.

The thesis deals with both elaborations of methods for revealing of polymorphism of DNA-marker systems and comparison of levels of its informative capacity with traditional immunogenetical systems. Marker systems of different classes were used in othe to: characterize population of both Poltava meet and Myrgorod breeds in terms of genetics; find regularities in course of genetical processes when verious methods of pig breeding were used.

Elaborated both methods for animal typing on growth hormone gene and improved DNA test for stressyndrome evaluation can be used to increase efficiancy of pig breeding in herd core. Described in the work microsatellite locuses S0097 and TNFB together with immunogenetics markers are comfortable systems of genetic passportization for particular individuals of breed pigs.

Key words: pig, gene, genotype, polymorphism, polymerase chain reaction, allele, population, phylogenic tree, microsatellites-DNA.

Размещено на Allbest.ru

...