Генетично модифіковані толерантні до фосфінотрицину цукрові буряки як нова форма вихідного матеріалу для селекції

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут цукрових буряків

Українська академія аграрних наук

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

06.01.05. - селекція та насінництво

Генетично модифіковані толерантні до фосфінотрицину цукрові буряки як нова форма вихідного матеріалу для селекції

Сливченко Олег Андрійович

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі селекції Інституту цукрових буряків УААН та його Філіалi. Деякi експерименти зроблено у Plant Research International (м. Вагенiнген, Нiдерланди).

Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук, академік УААН, Роїк Микола Володимирович, Інститут цукрових буряків УААН, директор

Офіційні опоненти:

доктор сільськогосподарських наук, професор, академік НАН України і УААН, Созінов Олексій Олексійович, завідувач відділу агробіотехнології (Інститут агроекології та біотехнології УААН)

кандидат сільськогосподарських наук, Чемерис Ліна Миколаївна, завідувач відділу селекції поліплоїдних буряків (Білоцерківська ДСС, ІЦБ, УААН).

Провідна установа: Інститут картоплярства УААН, смт. Немішаєве.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Кірсанова Ю.В.

Анотація

цукровий буряк селекційний трансген

Сливченко О.А. Генетично модифіковані толерантні до фосфінотрицину цукрові буряки як нова форма вихідного матеріалу для селекції. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 06.01.05. - селекція та насінництво. Інститут цукрових буряків УААН, Київ, 2001.

Фосфінотрицин-толерантні цукрові буряки являються цінним і перспективним вихідним матеріалом для селекційних досліджень. В процесі роботи автором ідентифіковано bar-трансген, який відповідає за стійкість фенотипу рослин до гербіциду, а також встановлено, що він успішно передається шляхом гібридизації і успадковується як домінантний, відповідно до генетичних закономірностей. Інтеграція даної конструкції в геномі стабільна, не позначується впливом на експресію функціональних та структурних генів і має додатковий характер.

Інтродукція bar-гену в гомозиготному стані у батьківському компоненті позначується повною фосфінотрицин-толерантністю одержуваних гібридів. Продуктивність та господарські ознаки трансгенних матеріалів залежать від їх генетичної цінності і не залежать від присутності трансгену у геномі рослин. Метод насичуючих схрещувань, постійний відбір за комплексом господарських властивостей і толерантністю фенотипу є ефективними заходами покращення відповідних показників.

Ключові слова: цукрові буряки, вихідний матеріал, гібрид, толерантність, генетична модифікація, трансген, фосфінотрицин, Баста.

Аннотация

Сливченко О.А. Генетически модифицированная фосфинотрицин-толетантная сахарная свекла как новая форма исходного материала для селекции. Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 06.01.05. - селекция и семеноводство. - Институт сахарной свеклы УААН, Киев, 2001.

В диссертации представлены результаты исследований генетически модифицированной фосфинотрицин-толерантной сахарной свеклы с целью определения особенностей ее использования в качестве исходного материала в селекционном процессе.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что генетически модифицированная устойчивость к фосфинотрицину у исследуемых материалов сахарной свеклы обуславливается только ядерными факторами, а не цитоплазматическими. Подтверждено, что трансген наследуется как доминантный, в соответствии с генетическими закономерностями.

Методом ДНК-анализа подтверждено, что устойчивость данных растений к гербициду сплошного действия глюфосинат аммония (фосфинотрицин) обусловлена наличием в их геноме искусственно внедренной конструкции bar из гриба Streptomyces hygroscopicus, присутствие которой можно успешно идентифицировать, используя специфические праймеры РАТ-1 и PAT-2.

Уровень трансгенной экспрессии высокий и обеспечивает полную устойчивость растений к рекомендованной норме внесения препарата. Условия выращивания и количество проведенных скрещиваний не приводят к ее снижению.

Введенная в геном растений конструкция bar не влияет на экспрессию функциональных и структурных генов и имеет придаточный характер. Ею можно индуцировать как диплоидные многосемянные материалы, так и односемянные закрепители стерильности и МС форму. Установлено, что наличие bar-трансгена в гомозиготном состоянии у отцовского компонента обеспечивает полную устойчивость к гербициду получаемых гибридов.

В целом, использование трансгенных материалов сахарной свеклы требует разработки специальных селекционных схем. Относительно данного исходного материала, учитывая показатели его семянности, самой простой является схема поддержания трансгена в 2хММ компоненте, когда для переведения его в гомозиготное состояние необходимо получить F₂ с последующим проведением анализирующих скрещиваний.

Для введения признака в материнский компонент гибрида, необходимо получить устойчивые материалы О-типа с последующим насыщением МС-линии. Однако, данная методика несколько усложняется необходимостью одновременного соединения как трансгенного признака, так и односемянности и закрепительной способности О-типа.

В процессе работы установлено, что продуктивность и хозяйственные признаки трансгенных материалов зависят от их генетической ценности и не зависят от наличия трансгена в геноме растений. Метод возвратных скрещиваний, постоянный отбор по комплексу хозяйственных свойств и толерантностью фенотипа являются эффективными приемами улучшения соответствующих показателей трансгенных исходных материалов.

Изучение bar-трансгена и продуктов его активности свидетельствует о безопасности биологического, экологического и токсикологического аспектов его использования. Существует возможность неконтролированного перехода трансгена в экологическую систему путем гибридизации с генетически совместимыми дикорастущими формами. Однако, толерантность к гербициду фосфинотрицин не дает преимущества трансгенным растениям в природных условиях. Существование в экологической системе bar-трансгена не является опасным, так как уровень конкурентной способности растений при этом не изменяется.

Ключевые слова: сахарная свекла, трансген, генетическая модификация, исходный материал, гибрид, толерантность, фосфинотрицин, Баста.

Summary

Slyvchenko O.A. Genetically modified phosphinotrycin-tolerant sugar beet as new kind of parental materials for breeding. Manuscript.

Dissertation for Candidate of Sciences degree on the specialised field 06.01.05 - breeding and seed growing. The Institute for Sugar Beet of the UAAS, Kiev, 2001.

Genetically modified phosphinotrycin-tolerant sugar beet is a valuable kind of parental material for breeding. Author identified bar-transgene, which is responsible for herbicide resistance of plants and observed it successful transmission by hybridisation. Transgene is stable and inherits as dominant gene, according to Mendelian law. It has not influents on expression of structural and functional genes and has only additional affect.

Using of homozygous pollinator will cause 100% tolerance in F₁. Productivity and technological properties of transgenic materials depends from their genetic value. B-crosses and selection for high technological properties are sufficient methods of their improvement.

Key words: sugar beet, breeding, hybrid, tolerance, genetic modification, phosphinotrycin, Basta.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Традиційними методами досягнуто значних успіхів у селекції цукрових буряків. Проте, сучасне виробництво потребує гібриди з невластивими для рослин ознаками, які можливо індукувати лише штучно. Використання генетично модифікованих рослин у якості нового виду вихідного матеріалу для селекційних програм є надзвичайно перспективним напрямом досліджень. Забур'яненість посівів - один із основних факторів трудомісткості, втрат продуктивності та значного пестицидного пресингу на довкілля. А тому, проведення комплексного дослідження вихідних матеріалів з генетично модифікованою стійкістю до гербіциду суцільної дії фосфінотрицин є досить актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в 1998-2000 рр. в Інституті цукрових буряків (ІЦБ) УААН та у Філіалі інституту цукрових буряків (ФІЦБ), згідно завдання 01 “Розробити генетичні, біотехнологічні та фізіолого-біохімічні технології створення нових вихідних матеріалів цукрових буряків для селекції на гетерозис, стійких до комплексу несприятливих факторів”, складового Науково-технічної програми УААН “Цукрові буряки” на 1996-2000рр (реєстраційний номер 03.04-МВ/1196).

Мета і задачі дослідження. Мета дослідження полягала у встановленні особливостей використання генетично модифікованих фосфінотрицин-толерантних рослин цукрових буряків як вихідного матеріалу для селекційних програм.

Для досягнення мети потрібно вирішити такі задачі:

- провести комплексну оцінку фосфінотрицин-толерантних матеріалів;

- встановити закономірності передачі і успадкування стійкості цукрових буряків до фосфінотрицину;

- ідентифікувати трансген методом ДНК-аналізу;

- адаптувати існуючі селекційні методики для роботи із трансгенними матеріалами;

- вивчити екологічні аспекти використання фосфінотрицин-толерантних цукрових буряків. Об'єкт дослідження. Генетично модифіковані рослини цукрових буряків.

Предмет дослідження. Толерантні до фосфінотрицину трансгенні матеріали цукрових буряків.

Методи дослідження. Для визначення основних напрямків досліджень і встановлення деяких екологічних аспектів використання фосфінотрицин-толерантних цукрових буряків провели ретельне вивчення і аналіз сучасної наукової літератури. Методом реципрокних та аналізуючи схрещувань досліджували закономірності передачі і успадкування стійкості трансгенних цукрових буряків до фосфінотрицину. Методом ДНК-аналізу ідентифікували трансген. Оцінку фенотипу та господарських характеристик матеріалів провели шляхом спостережень і безпосередніх вимірювань із послідуючим аналізом одержаних показників. Достовірність одержаних результатів перевірили методами статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні проведено глибоке комплексне дослідження генетично модифікованих рослин цукрових буряків. Теоретично обґрунтовані і практично доведені особливості передачі і успадкування фосфінотрицин-толерантності трансгенних цукрових буряків, встановлено додатковий характер даної властивості, розроблено рекомендації щодо використання матеріалів у селекційних програмах.

Вперше в Україні впроваджено ДНК-аналіз, як складову селекційної програми з цукровими буряками, удосконалено метод ізоляції ДНК культури і успішно ідентифіковано трансген.

Встановлена можливість неконтрольованого виходу трансгену в природне середовище шляхом вільного перезапилення із генетично сумісними дикими видами на насіннєвих посівах культури.

Практичне значення одержаних результатів. Створено вихідні селекційні матеріали толерантних до фосфінотрицину цукрових буряків на основі вітчизняних лiнiй. Серед них відібрано 5 ліній диплоїдних багатонасінних запилювачів, які передані відділу селекції ФIЦБ для подальшої селекційної роботи.

Особистий внесок здобувача. Дослідження по темі дисертації виконані здобувачем особисто.

За темою дисертації вивчено і систематизовано вітчизняну та зарубіжну літературу. На основі опанування сучасних методик селекційних досліджень ним особисто виконані польові та лабораторні експерименти, зроблено генетико-статистичний аналіз та висновки з отриманих даних.

Автор висловлює вдячність працівникам Інституту цукрових буряків та його Філіалу за допомогу у проведенні дослідів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації автор доповів на науково-виробничих нарадах лабораторії селекції (1998-2000рр.), на вченій раді Інституту цукрових буряків УААН (2001 р.) та на Міжнародній конференції “Селекція, насінництво і технологія вирощування цукрових буряків та інших культур бурякової сівозміни” (Київ, 2001 р.).

Публікації. Основні положення дисертації опубліковані в 5-ти наукових статтях у фахових виданнях, затверджених ВАК Українию.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 129 сторінках машинописного тексту, що містить 24 таблиці і 18 ілюстрацій. Текстова частина складається із вступу, 7 розділів, висновків, пропозицій для селекційної практики, 4 додатків. Список використаних джерел літератури містить 203 найменування, в тому числі 197 іноземних

2. Зміст роботи

Розділ 1. Генетична модифікація цукрових буряків (огляд літератури)

Проведено аналіз наукових праць з питань генетичної модифікації цукрових буряків. Узагальнення свідчать про те, що сучасні можливості щодо штучних змін у геномi рослин шляхом молекулярних маніпуляцій є кардинально новим напрямком наукових досліджень. Вчені пов'язують з ним великі надії щодо забезпечення постійно зростаючих вимог людства.

Встановлено особливості i розроблено дієві системи створення генетично модифікованих цукрових буряків. Одержано певні результати щодо екологічних аспектів їх впровадження. Проте, в літературі майже відсутня інформація щодо шляхів і результатів використання трансгенних матеріалів цукрових буряків у селекції.

Розділ 2. Умови, матеріали та методика досліджень

Дослідна робота проводилась безпосередньо у відділі селекції Інституту цукрових буряків УААН та на експериментальній базі його Філіалу протягом 1998 - 2000 років. Деякі лабораторні експерименти зроблено у Plant Research International (м. Вагенiнген, Нiдерланди).

ФІЦБ розташований на Правобережжі Дніпра, у зоні центрального Лісостепу України. Рельєф поверхні ґрунту, де розміщені поля сівозмін, переважно рівнинний та слабкохвилястий. Ґрунти - темно-сірі лісові, опідзолені, вилуговані, середньо-суглинисті, середньо-гумусні чорноземи із вмістом гумусу 2,7-3,5% і належать до високородючих.

Метеорологічні умови вегетаційного періоду за роки проведення досліджень були задовільними для вирощування цукрових буряків.

У якості вихідного матеріалу для виконання науково-дослідних робіт використали трансгенні, стійкі до гербіциду суцільної дії глюфосинат амонію (синтетичний аналог фосфінотрицину, відомий під марками Баста, Фінал, Радикал) рослини цукрових буряків. Також використано 4 багатонасінні диплоїдні номери, добрані за комбінаційною здатністю і продуктивністю, лінії ЧС та О-типу, генетично-сумісні дикоростучі види. Значне місце у роботі посідали одержані гібриди і індивідуальні добори з них. У якості нетрансгенного контролю використали гібрид Український ЧС 70.

Контрольовані парні схрещування здійснювали під плівковими ізоляторами у теплиці та бязевими у полі.

Визначення стерильності ЧС-матеріалів проводили за класифікацією Ф.Оуена (1945). Збирання насіння проводили індивідуально з кожного насінника. Ступінь роздільноплідності матеріалів, визначали на кожному насіннику шляхом безпосереднього підрахунку однонасінних клубочків та розділення насіння по фракціям за кількістю плодів у клубочку.

Визначення енергії проростання та схожості насіння проводили на фільтрувальному папері та у піску по методиці контрольно-насіннєвих лабораторій. Маса 1000 плодів визначалась шляхом зважування та підрахунку їх кількості у середніх пробах у триразовій повторності.

Відбір за фенотипом фосфінотріцин-толерантних особин проведено шляхом обприскування рослин розчином препарату Баста у фазу розвитку 2-3 пар справжніх листків, відповідно до D'Halluin et al. (1992) та R.D.Hall et al. (1996).

Дослідження ефективності використання рослинами сонячної енергії проводили за допомогою фотосинтез-метра EARS-PPM, а вмісту хлорофілу у листках - за допомогою хлорофіл-метра SPAD-502. ДНК-аналіз рослин проведено відповідно до R.D.Hall et al. (1996) з використанням специфічних праймерів. Перераховані дослідження виконувались на експериментальній базі Plant Research International (Нідерланди).

Випробування буряків першого року життя на продуктивність проводились по методиці сортовипробування, яка прийнята на всіх дослідно-селекційних станціях ІЦБ. Повторність - чотирикратна, ділянки трирядкові, залікова площа - 13,5м², а розміщення рендомізоване.

Урожайність визначали шляхом зважування коренеплодів із усієї ділянки. Вміст цукру, калію і натрію визначали у 40-кореневих пробах методом "холодної дигестії" у поляризаційній лабораторії ФІЦБ на автоматичній лінії "Венема".

Визначення життєздатності пилку провели за методикою Г. Козубова (1965), фертильності та розміру пилкових зерен - за методикою Г. Ярмолюк та Е. Ширяєвої (1982).

Вивчення деяких біологічних особливостей рослин проведено шляхом фенологічних спостережень, аналізу і описування. Одержані експериментальні дані оброблені відповідно до Б.А. Доспєхова (1963).

Детальніший опис деяких інших методик, що використали при проведеннi досліджень, наведено у відповідних розділах роботи.

Розділ 3. Закономірності успадкування і передачі ознаки толерантності до фосфінотрицину трансгенних цукрових буряків

З метою вивчення закономірностей успадкування генетично модифікованої ознаки ми одержали перше покоління (F₁) у результаті парних схрещувань вихідних трансгенних матеріалів із лініями багатонасінних цукрових буряків (2хММ), що є добрими за загальною комбінаційною здатністю запилювачами.

Проведені дослідження свідчать, що стійкість до дії гербіциду Баста обумовлюють не цитоплазматичні, а ядерні фактори, підтвердженням чого є можливість її передачі шляхом звичайних схрещувань (табл. 1).

Таблиця 1. Успадкування фосфінотрицин-толерантності нащадками першого покоління, вирощених із насіння вітчизняних матеріалів 2хММ цукрових буряків (пряма комбінація) (1998рік)

Комбінації схрещування	Число рослин
реципієнт: 2хММ гібридів	донор ознаки	до обробітку	загинуло	толерантних
		поле	теплиця	поле	теплиця	поле	теплиця
		шт.	%	шт.	%	шт.	%	шт.	%	шт.	%	шт.	%
Уманський ЧС 76: 1354	1328	18	100	42	100	14	77,8	34	81,0	4	22,2	8	19,1
1390	1407	65	100	16	100	36	55,4	8	50,0	29	44,6	8	50,0
Разом	-	83	100	58	100	50	60,2	42	72,4	33	39,8	16	27,6
Ювілейний: 1367	1372	72	100	35	100	64	88,9	32	91,4	8	11,1	3	8,6
1374	1391	31	100	9	100	25	80,7	9	100,0	6	19,4	0	0,0
Разом	-	103	100	44	100	89	86,4	41	93,2	14	13,6	3	6.8
Український ЧС70: 1376	1392	47	100	36	100	32	68,1	26	72,2	15	31,9	10	27,8
1380	1403	69	100	52	100	62	89,9	47	90,4	7	10,1	5	9,6
Разом	-	116	100	88	100	94	81,0	73	82,3	22	19,0	15	17,1
Верхняцький 038: 1359	1327	75	100	46	100	67	89,3	40	87,0	8	10.7	6	13,0
1371	1387	64	100	60	100	35	54,7	32	53,3	29	45,3	28	46,7
Разом	-	139	100	106	100	102	73,4	72	67,8	37	26,6	34	32,1
ВСЬОГО	-	441	100	296	100	335	76,0	228	77,0	106	24,0	68	23,0
Разом у полі і у теплиці: шт. %	- -	737 100	563 76,4	174 23,6
Контроль	108	100	71	100	108	100	71	100,0	0	0,0	0	0,0

Виявлена взаємна невідповідність співвідношення кількості нестійких і фосфінотрицин-толерантних рослин між окремими комбінаціями. Так, найбільша частка стійких особин, як у польових випробуваннях, так і у теплиці, спостерігалась по комбінаціях 2 (відповідно 44,6% та 50,0%) і 8 (відповідно 45,3% та 46,7%), а найменша - по комбінаціях: 3 (відповідно 11,1% та 8,6%); 4 (відповідно 19,4% та 0,0%); 6 (відповідно 10,7% та 13,0%); 7 (відповідно 10,7% та 13,0%).

Деталізуючи аналіз у межах комбінацій із генетично однорідними рослинами реципієнта, можна відмітити вплив генотипу вихідних трансгенних матеріалів. Спостерігається значна різниця частки стійких особин між комбінаціями: 5 (у польових випробуваннях - 31,9% і у теплиці - 27,8%) та 6 (відповідно 10,1% та 9,6%); 7 (у польових випробуваннях - 10,7% і у теплиці - 13,0%) та 8 (відповідно 45,3% та 46,7%). Також існує вплив генотипу реципієнта на результати елімінації трансгенної властивості. У межах комбінацій, де в якості реципієнта використані матеріали запилювача гібриду Уманський ЧС 76, частка стійких особин у дослідженнях у польових умовах і в теплиці відповідно становила разом 39,8% та 27,6%; запилювача гібриду Верхняцький 038 - відповідно 26,6% і 32,1%; тоді як по комбінаціях із матеріалами запилювача гібриду Ювілейний - відповідно 13,6% та 6,8%.

Іншою причиною спостережуваних відхтлень може бути часткове самозапилення рослин реципієнта через певне неспівпадання строків цвітіння компонентів схрещувань (крім комбінацій 2;5;8) і недостатню кількість утвореного пилку рослинами трансгенних вихідних матеріалів.

Результати випробувань нащадків від зворотних схрещувань цих же комбінацій, дещо відрізняється від прямих комбінацій (табл. 2).

Таблиця 2. Успадкування фосфінотрицин-толерантності нащадками першого покоління, вирощених з насіння рослин донорів (зворотна комбінація) (1998 рік)

Комбінації	Кількість рослин	Но*	2
реципієнт	донор	до обробітку	загинуло	толерантних
		шт.	%	шт.	%	шт.	%
1328	1354	340	100	93	27,4	247	72,6	1:1	84,7000
1327	1359	75	100	30	38,7	45	61,3	1:1	3,0000
1372	1367	37	100	22	59,5	15	40,5	1:1	1,3243
1387	1371	67	100	39	58,2	28	41,8	1:1	1,8060
1391	1374	62	100	34	54,8	28	45,2	1:1	0,5806
1399	1376	28	100	13	46,4	15	53,6	1:1	0,1429
1403	1380	33	100	15	45,5	18	54,5	1:1	0,2727
1407	1390	50	100	27	54,0	23	46,0	1:1	0,3200
Разом	692	100	272	39,3	420	60,7	-	-

Примітки:

1. Но* - теоретично очікуване співвідношення між нестійкими і толерантними рослинами;

2. Максимально допустиме значення ²₀₅ = 3,84 ; ²₀₁ = 6,63.

У межах кожної окремої родини, виявили відносно рівне співвідношення між кількістю нестійких і фосфінотрицин-толерантних нащадків (крім комбінації 1 - залишилось неушкодженими 72,6%). Це свідчить про гетерозиготність вихідних трансгенних матеріалів за домінантним трансгеном. Відповідно із генетичними закономірностями, у даному випадку між рослинами що загинули і стійкими співвідношення у F₁ має становити 1:1. Провівши математичний аналіз, ми підтвердили його достовірність по всіх комбінаціях, крім 1. Деяке розходження фактично одержаних показників із теоретично очікуваними у цьому випадку можна пояснити схильністю до самозапилення даного номера донора стійкості і більш значним неспівпаданням строків цвітіння компонентів схрещування.

Слід зазначити, що використовуваний у нашій роботі та у науковій практиці термін про гетерозиготність генетично модифікованих матеріалів за трансгеном є загально прийнятим, проте умовним, так як конструкція є штучно і додатково введеною у геном. Більш точним у такому випадку є твердження, що єдина відповідна конструкція локалізована в одній хромосомі.

Наступне покоління одержали шляхом аналізуючих схрещувань стійких нащадків із ЧС лінією 2039 (табл. 3), а також провели сестринські схрещування.

Таблиця 3. Успадкування фосфінотрицин-толерантності нащадками аналізуючих схрещувань (1999 рік)

Комбінація схрещування	Число рослин	Но*	2
	до обробітку	загинуло	толерантних
	шт.	%	шт.	%	шт.	%
2039 x (1354x1328)	87	100	39	44,8	48	55,2	1:1	0,9411
2039 x (1390x1407)	92	100	41	44,6	51	55,4	1:1	1,1000
2039 x (1359x1327)	73	100	39	53,4	34	46,6	1:1	0,2890
2039 x (1371x1387)	89	100	51	57,3	38	42,7	1:1	1,9403
2039 x (1367x1372)	75	100	33	43,5	42	56,5	1:1	1,0958
2039 x (1374x1391)	68	100	40	58,8	28	41,2	1:1	2,1857
2039 x (1376x1399)	96	100	55	57,3	41	42,7	1:1	2,0860
2039 x (1380x1403)	81	100	35	43,2	46	56,8	1:1	1,0188
Контроль	79	100	79	100	0	0,0	-	-

Примітки:

1. Но* - теоретично очікуване співвідношення між нестійкими і толерантними рослинами;

2. Максимально допустиме значення ²₀₅ = 3,84; ²₀₁ = 6,63.

Результати свідчать про те, що генетично модифікована ознака фосфінотрицин-толерантності цукрових буряків, обумовлена тільки ядерними факторами, а не цитоплазматичними. Це переконливо доведено можливістю її успішної передачі проведеними схрещуваннями із ЧС лінією. Крім того, трансген успадковується як домінантний. Відсоток фосфінотрицин-толерантних і нестійких рослин по кожній комбінації свідчить про відносно рівне співвідношення між їх кількістю. Якщо стійкість фенотипу обумовлюється наявністю у геномі рослин єдиного домінантного гену, співвідношення між нестійкими і фосфінотрицин-толерантними особинами має становити 1:1. Проведений математичний аналіз підтвердив достовірність даного припущення. Кількість проведених схрещувань і генотип реципієнта не позначились зменшенням рівня трансгенної експресії - одержані стійкі нащадки не проявляли жодних візуальних симптомів пошкоджень чи порушень у рості та розвитку.

Паралельно відповідними схрещуванням встановили можливість передачі трансгену у генотип закріплювача стерильності, що також стабільно інтегрується без зміни експресії. Таким чином, вплив генотипу реципієнта на механізм успадкування не простежується, а результати проведених схрещувань доводять можливість концентрації фосфінотрицин-толерантності і у материнському компоненті при створенні гібридів генетично модифікованих цукрових буряків.

Приблизно 70%-80% нащадків по кожній комбінації сестринських схрещувань проявили толерантність (табл. 4).

Таблиця 4. Успадкування фосфінотрицин-толерантності у нащадків, одержаних внаслідок сестринських схрещувань (1999рік)

Походження	Комбінація	Число рослин	Но*	2
		до обробітку	загинуло	толерантних
		шт.	%	шт.	%	шт.	%
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1354 х 1328	в1 х в2 в2 х в1 Разом в3 х в4 в4 х в3 Разом	238 226 464 205 212 417	100 100	64 66 130 57 60 117	28,0 28,1	174 160 334 148 152 300	72,0 71,9	1:3 1:3	2,2529 2,0792
1390 х 1407	в3 х в4 в4 х в3 Разом в5 х в6 в6 х в5 Разом	198 185 383 241 211 452	100 100	51 53 104 72 53 125	27,2 27,7	147 132 279 169 158 327	72,8 72,3	1:3 1:3	0,9707 1,6991
1359 х 1327	в1 х в2 в2 х в1 Разом в3 х в4 в4 х в3 Разом	236 225 461 235 184 419	100 100	69 61 130 49 44 93	28,2 22,2	167 164 331 186 140 326	71,8 77,8	1:3 1:3	2,5169 1,7573
1371 х 1387	в1 х в2 в2 х в1 Разом в3 х в4 в4 х в3 Разом	172 185 357 230 195 425	100 100	47 52 99 68 53 121	27,7 28,5	125 133 258 162 142 304	72,3 71,5	1:3 1:3	1,4208 2,7301
1367 х 1372	в3 х в4 в4 х в3 Разом в5 х в6 в6 х в5 Разом	243 179 422 157 172 329	100 100	52 44 96 45 46 91	22,7 27,7	191 135 326 112 126 238	77,3 72,3	1:3 1:3	1,1407 1,2412
1374 х 1391	в1 х в2 в2 х в1 Разом в3 х в4 в4 х в3 Разом	234 167 401 159 183 342	100 100	58 50 108 36 39 75	26,9 21,9	176 117 293 123 144 267	73,1 78,1	1:3 1:3	0,7988 1,7193
1376 х 1399	в1 х в2 в2 х в1 Разом в3 х в4 в4 х в3 Разом	237 190 427 249 221 470	100 100	62 53 115 61 45 106	26,9 22,6	175 137 312 188 176 364	73,1 77,4	1:3 1:3	0,8501 1,5007
1380 х 1403	в1 х в2 в2 х в1 Разом в5 х в6 в6 х в5 Разом	241 177 418 166 142 308	100 100	48 43 91 45 44 89	21.8 28,9	193 134 327 121 98 219	78,2 71,1	1:3 1:3	2,3253 2,4935
Контроль	157	100	157	100	0	0,0	-	-

Примітки:

1. Но* - теоретично очікуване співвідношення між нестійкими і толерантними рослинами;

2. Максимально допустиме значення ²₀₅ = 3,84; ²₀₁ = 6,63.

Враховуючи гетерозиготність матеріалів F₁ за трансформованим геном, у результаті проведених схрещувань теоретично ми одержали генотипи: нетрансгенний, гетерозиготний і гомозиготний за геном стійкості, у співвідношенні 1:2:1. За фенотипом нетрансгенні рослини виділили, провівши обприскування гербіцидом. При цьому вони загинули. Тому співвідношення між кількістю нестійких і фосфінотрицин-толерантних особин має становити 1:3. Проведений математичний аналіз одержаних результатів підтвердив його достовірність. Таким чином, трансген стабільно передається шляхом гібридизації і успадковується як домінантний.

F₂ теоретично являє суміш гомозиготних і гетерозиготних за домінантним трансгеном багатонасінних фертильних рослин у співвідношенні 1:2. Фенотипічно ці генотипи не відрізняються. Тому провели аналізуючі схрещування їх із ЧС лінією (табл. 5).

Нащадки п'яти комбінацій із одержаних 17 виявились повністю толерантними. У даному випадку можна стверджувати про те, що відповідні рослини запилювачі (F₂: 1390х1407 в2, 1359х1327 в1, 1367х1372 в1, 1374х1391 в2, 1376х1399 в1) виявились гомозиготними за домінантним трансгеном. Рівень трансгенної експресії у всіх одержаних рослинах є цілком достатнім для забезпечення стійкості їх фенотипу. Достовірність частки гомозиготних запилювачів підтвердили математичним аналізом: критерій ^{2 =} 0,1176.

Можна зробити загальний висновок, що використання трансгенних матеріалів цукрових буряків у селекції передбачає розробку спеціальних схем. Проведеними схрещуваннями доведено можливість успішної інтродукції толерантності у багатонасінні диплоїдні матеріали, ЧС форму та лінії О-типу. Стосовно даного вихідного матеріалу, враховуючи показники його роздільноплідності, найпростішою є схема підтримки трансгену у компоненті 2хММ, коли для його переведення у гомозиготний стан достатньо одержати F₂. Подальше проведення аналізуючих дозволяє виділити гомозиготні особини.

Таблиця 5. Кількість і частка фосфінотрицин-толерантних рослин у нащадків від схрещувань ЧС лінії із трансгенними 2хММ F₂ (2000 рік)

Комбінації	Число рослин	Но*	2
ЧС лінія 2039	F2: 2хММ	до обробітку	загинуло	толерантних
		шт.	%	шт.	%	шт.	%
В1	1354х1328 В1	122	100	54	44,3	68	55,7	1:1	1,6066
В2	-//- В2	115	100	57	49,6	58	50,4	1:1	0,0087
В3	1390х1407 В1	106	100	59	55,7	47	44,3	1:1	1,3585
В4	-//- В2	124	100	0	0	124	100	0:1	0,0000
В5	-//- В3	104	100	44	42,3	60	57,7	1:1	2,4615
В6	1359х1327 В1	129	100	0	0	129	100	0:1	0,0000
В7	-//- В2	137	100	65	47,4	72	52,6	1:1	0,3577
В8	1371х1387 В1	126	100	68	54,0	58	46,0	1:1	0,7937
В9	-//- В2	138	100	74	53,6	64	46,4	1:1	0,7246
В10	1367х1372 В1	135	100	0	0	135	100	0:1	0,0000
В11	-//- В2	109	100	60	55,0	49	45,0	1:1	0,7431
В12	1374х1391 В1	111	100	52	46,8	59	53,2	1:1	0,4414
В13	-//- В2	121	100	0	0	121	100	0:1	0,0000
В14	1376х1399 В1	95	100	0	0	95	100	0:1	0,0000
В15	-//- В2	141	100	62	44,0	79	56,0	1:1	2,0496
В16	1380х1401 В1	133	100	71	53,4	62	46,6	1:1	0,6090
В17	-//- В2	98	100	43	43,9	55	56,1	1:1	1,4694
Контроль	127	100	127	100	0	0	-	-

Примітки:

1. Но* - теоретично очікуване співвідношення між нестійкими і толерантними рослинами;

2. Максимально допустиме значення ²₀₅ = 3,84; ²₀₁ = 6,63.

Для введення ознаки у материнський компонент гібриду потрібно одержати толерантні матеріали О-типу із послідуючим насиченням ЧС-лінії. Проте, дана методика дещо ускладнена необхідністю одночасного поєднання як трансгенної властивості, так і роздільноплідності та закріплювальної здатності О-типу.

Розділ 4. ДНК-аналіз фосфінотрицин-толерантних матеріалів цукрових буряків

Дані дослідження займають особливе місце в роботі, так як вперше в Україні використано ДНК-аналіз як складову селекційного процесу у цукрових буряків. Метод дозволяє проводити широкомасштабні генетичні дослідження великої кількості ліній (екземплярів) протягом короткого проміжку часу і надає можливість безпосереднього порівняння генотипу індивідуальних рослин, запобігаючи впливу оточуючого середовища на генну експресію, підвищуючи ефективність відбору. Крім того, його можна використовувати на ранніх стадіях розвитку рослин, заощаджуючи час на створення нових гібридів, а також для одночасного поєднання у матеріалах кількох цінних ознак.

У процесі роботи удосконалена методика ізоляції ДНК культури, яка забезпечує високий вихід ДНК доброї якості. За допомогою специфічних праймерів РАТ-1 (5'-AGATTAGGCCAGCTACAGCAGCTGATA) і PAT-2 (5'-GCCTTGGAGGAGCTGGCAACTCAA AAT) ідентифіковано bar-трансген. Однакова довжина одержаного фрагменту ампліфікації (500 bp) свідчить про його ідентичність як у вихідної лінії, так і у стійких нащадках. Аналіз переконливо доводить, що толерантність фенотипу обумовлена саме наявністю bar-трансгену у геномі рослин, що стабільно успадковується.

Виходячи із результатів цих та попередніх досліджень, можна рекомендувати дві селекційні схеми одержання гібридів трансгенних фосфінотрицин-толерантних цукрових буряків на ЧС основі. Перша передбачає інтродукцію bar-трансгену, як стабільну властивість, у диплоїдний запилювач і підтримку його у гомозиготному стані. Вона застосовується для створення диплоїдних гібридів. Друга базується на інтродукції трансгену у материнському компоненті гібридів. При цьому інбредна ЧС лінія і інбредний закріплювач стерильності мають бути гомозиготними за інтегрованим bar-трансгеном і тільки за умовою повністю однакової позиції у геномі. Використовувати дану схему можна для створення диплоїдних і триплоїдних гібридів на ЧС основі.

Розділ 5. Морфологічні, цитологічні та біологічні особливості фосфінотрицин-толерантних цукрових буряків

Аналізуючи одержані результати в цілому, ми не виявили істотних розбіжностей при порівняльній оцінці деяких морфологічних властивостей фосфінотрицин-толерантних і нетрансгенних матеріалів. Цитологічними дослідженнями певна різниця встановлена по фертильності і життєздатності пилку, що може бути спричинено наявністю bar-трансгену у геномі рослин. Проте, на одержані результати може мати вплив і генотип донорів властивості. Так, варіювання відповідних показників у різних сортів культури доведено у роботах Е.Ширяєвої (1966). Незважаючи на це, пилок фосфінотрицин-толерантних рослин цукрових буряків характеризується досить високою фертильністю (86,2 %) і життєздатністю (92,8).

Визначення ефективності використання рослинами сонячної енергії провели за допомогою фотосинтез-метра EARS-PPM, а вмісту хлорофілу на одиницю листкової поверхні - за допомогою хлорофіл-метра SPAD-502. Виходячи із одержаних результатів, можна зробити висновок, що використання рекомендованої дози гербіциду у селекційній роботі із фосфінотрицин-толерантними матеріалами цукрових буряків немає наслідків стресового фактору для рослин. При використанні препарату генетично модифіковані матеріали мають значну перевагу над нестійкими, не проявляючи симптомів деструктивного впливу препарату. Виявлене зменшення ефективності використання сонячного світла (на 3% через 1 день після обприскування гербіцидом) і вмісту хлорофілу у їх листках (на 1,3 мкг/см.кв через 4 дні) свідчить про певний вплив фосфінотрицину, проте величина показників вцілому значно вища стресового рівня (у нестійких матеріалів відповідні показники зменшились на 34,2% та 8,7 мкг/см.кв).

Порівнюючи фосфінотрицин-толерантні і нестійкі матеріали без застосування препарату, ми не виявили істотної різниці між відповідними показниками (трансгенні: ефективність використання сонячного світла - 76,1-78,9% і вміст хлорофілу - 27,5-28,8 мкг/см. кв; нестійкі: відповідно - 74,8-78,4% і 27,2-28,6 мкг/см. кв) Це свідчить про відсутність впливу трансгену на експресію відповідних функціональних та структурних генів і додатковий характер обумовленої ним властивості. Ідентичність впливу на досліджувані матеріали суміші звичайних гербіцидів підкреслює специфіку стійкості, утвореної bar-геном.

Розділ 6. Характеристика трансгенних фосфінотрицин-толерантних матеріалів, створених із використанням ліній вітчизняної селекції

У даному розділі висвітлені результати досліджень основних господарсько цінних властивостей. Одержані на основі вітчизняних селекційних номерів трансгенні запилювачі мають хорошу насіннєву продуктивність (97-157 гр. з рослини), а показники якості їх насіння знаходяться в межах існуючих нормативів (схожість - 91,6-97,0%; енергія - 82,2-88,8%). Рівень відповідних показників одержаних пробних фосфінотрицин-толерантних гібридів відповідає вимогам стандартів для насіння цукрових буряків.

Важливою особливістю будь-яких матеріалів є їх стійкість до найбільш поширених і потенційно небезпечних хвороб - коренеїду, борошнистої роси, церкоспорозу, вірусної жовтяниці та гнилей коренеплодів. Рівень ураженості хворобами фосфінотрицин-толерантних матеріалів вцілому дещо вищий, ніж у стандарту, але значно нижчий, ніж у нестійких матеріалів. Проте, ряд номерів проявили хорошу стійкість до церкоспорозу (F₂:1374х1391), вірусної жовтяниці (F₂:1359х1327), гнилей коренеплодів (F₂:1371х1387), що має важливе значення для їх подальшого використання у селекційному процесі.

Особливу увагу приділили дослідженню продуктивності трансгенних матеріалів. Внаслідок гібридизації вихідних рослин-донорів з хорошими за комбінаційною здатність запилювачами вітчизняної селекції, ми одержали покоління, що і було першим об'єктом дослідження (табл. 6).

Результати свідчать, що найкращою врожайністю і збором цукру з гектара (335,6 ц/га і 52,4 ц/га відповідно) відзначилась комбінація 1380х1403. Дещо нижчі показники були у 1374х1391 (331,4 ц/га і 51,0 ц/га). Та у порівнянні із груповим стандартом, матеріали проявили значно нижчу продуктивність - рівень урожайності найкращої комбінації становить 87,2%, а збір цукру - 84,0%. Найнижчі показники - у 1376х1392, що становлять 80,1% і 76,6% відповідно за збором коренеплодів і цукру від групового стандарту. Одержані результати можна пояснити низькими господарськими властивостями генотипу рослин-донорів.

Таблиця 6. Продуктивність матеріалів, одержаних від гібридизації рослин-донорів 2хММ (1999 рік)

Комбінації	Урожай коренеплодів, ц/га	Цукрис-тість, %	Збір цукру, ц/га	Від групового стандарту, %
				урожай корене-плодів	цукристість	збір цукру
1354х1328	325,4	15,6	50,7	84,5	96,9	81,3
1390х1407	316,5	15,2	48,1	82,2	93,8	77,1
1367х1372	311,9	15,5	48,3	81,0	95,7	77,4
1374х1391	331,4	15,4	51,0	86,1	95,0	81,8
1376х1392	308,4	15,5	47,8	80,1	95,7	76,6
1380х1403	335,6	15,6	52,4	87,2	96,3	84,0
1359х1327	322,2	15,3	49,3	83,7	94,4	79,0
1371х1387	309,5	15,7	48,6	80,4	96,9	77,9
НІР05	9,96	0,43	1,03	-	-	-

Методом насичуючих схрещувань одержали наступне покоління фосфінотрицин-толерантних рослин. Аналогічно провели дослідження його продуктивності (табл. 7).

Таблиця 7. Продуктивність трансгенних матеріалів після проведеного насичуючого схрещування (2000 рік)

Матеріали	Урожай коренепло-дів, ц/га	Цукрис-тість, %	Збір цукру, ц/га	Від групового стандарту, %
				урожай корене-плодів	цукристість	збір цукру
БК-1354х1328	535,4	13,5	72,3	95,6	97,1	92,9
БК-1390х1407	530,2	13,6	72,1	94,7	97,8	92,7
БК-1367х1372	518,9	13,6	70,6	92,7	98,6	90,8
БК-1374х1391	540,2	13,6	73,5	96,5	97,8

Подобные документы

• Використання різного за тривалістю вегетаційного періоду вихідного матеріалу у гетерозисній селекції кукурудзи

  Збагачення генофонду вихідного матеріалу, який використовується при створенні нових високоврожайних гібридів із заданими ознаками. Комбінаційна здатність ліній і вплив на її прояв генотипів різних зародкових плазм.
  
  автореферат [38,3 K], добавлен 00.00.0000
  

• Цукрові буряки

  Продуктивність цукрових буряків залежно від застосування різних видів органічних добрив. Ботанічна і біологічна характеристика цукрових буряків, агротехніка їх вирощування. Технологічні якості коренеплодів буряків у залежності від застосування добрив.
  
  дипломная работа [66,4 K], добавлен 16.01.2008
  

• Створення вихідного матеріалу для селекції сорго різного напряму використання

  Новий вихідний матеріал, самозапилені лінії, стерильні аналоги, сорти й гібриди сорго різного напряму використання. Грунтово-кліматичні умови. Гібридний та селекційний розсадники. Розплідник самозапилених ліній. Використання селекційних зразків сорго.
  
  научная работа [419,8 K], добавлен 20.08.2010
  

• Історія селекційної роботи по виведенню нових сортів м’якої озимої пшениці

  Ботаніко-морфологічна характеристика біологічних особливостей культури. Аналіз методів створення вихідного матеріалу для селекції: гібридизації, мутагенезу, генної інженерії. Вивчення народногосподарського значення озимої пшениці та виробництва насіння.
  
  курсовая работа [54,2 K], добавлен 02.05.2011
  

• Статистичний аналіз і прогнозування урожайності цукрових буряків в господарствах Андрушівського району Житомирської області

  Поняття про урожай та урожайність. Динаміка та прогнозування урожайності цукрових буряків. Оцінка досягнутого рівня урожайності цукрових буряків в господарствах Андрушівського району. Залежність урожайності цукрових буряків від факторів виробництва.
  
  курсовая работа [198,4 K], добавлен 30.09.2010
  

• Методологія генетичної трансформації рослин

  Цілі та етапи трансформації рослин. Основні методи та напрями створення генетично модифікованих сільськогосподарських культур. Основні етапи агробактеріальної трансформації рослин. Гени-маркери для відбору трансформантів та регенерація трансформантів.
  
  контрольная работа [3,3 M], добавлен 25.10.2013
  

• Контроль чисельності шкідників в посівах цукрових буряків та їх насінників в умовах Центрального Лісостепу України

  Видовий склад шкідників цукрових буряків. Вивчення ґрунтово-кліматичних особливостей лісостепу України. Розробка системи захисту цукрових буряків від бурякових блішок, листкової бурякової попелиці. Аналіз впливу інсектицидів на чисельність шкідників.
  
  дипломная работа [3,0 M], добавлен 19.10.2013
  

• Становлення селекції та насінництва цукрових буряків в Україні (друга половина ХІХ – початок ХХ ст.)

  Критичне осмислення наукової спадщини як умова поступу аграрного сектору економіки. Напрямки та перспективи становлення та розвитку даної галузі. Насінництво та селекція цукрових буряків в Російській імперії, їх досягнення. Експорт маточного насіння.
  
  статья [19,0 K], добавлен 14.08.2017
  

• Машини для збирання цукрових буряків

  Технологія та система машин для вирощування цукрових буряків. Способи збирання цукрових буряків. Агротехнічні вимоги до бурякозбиральних машин. Пасивний дисковий кореневикопувальний апарат. Схема зигзагоподібного вальцевого очисника коренеплодів.
  
  лекция [7,0 M], добавлен 10.03.2013
  

• Наукове обґрунтування резервів підвищення інтенсивності виробництва цукрових буряків

  Резерви підвищення ефективності виробництва цукрових буряків. Особливості галузі буряківництва. Інноваційна політика держави в цукробуряковому підкомплексі України. Бізнес-план перспективного розвитку виробництва цукрових буряків ПП АФ "Жуківська".
  
  дипломная работа [93,6 K], добавлен 20.10.2009
  

• Ринок цукру

  Проблеми і перспективи розвитку цукробурякового комплексу. Державне регулювання економічних відносин в сфері виробництва, заготівлі і переробки цукрових буряків. Застосування прогресивних способів зберігання буряків та переробки їх на цукрових заводах.
  
  контрольная работа [25,1 K], добавлен 07.10.2010
  

• Організація, планування і шляхи підвищення економічної ефективності виробництва цукрових буряків на площі 350 га в умовах СВК "Перемога"

  Природно-економічна характеристика господарства СВК "Перемога". Фактичний стан виробництва і економічної ефективності цукрових буряків за останні роки. Організація виробництва, зберігання, збуту продукції. Фінансові результати вирощування буряків.
  
  дипломная работа [55,0 K], добавлен 16.01.2014
  

• Аналіз і прогноз кон’юнктури ринку цукру

  Значення та біологічні особливості цукрових буряків, сутність інтенсивної технології їх вирощування та оцінка її економічної ефективності. Визначення вмісту цукру в коренях буряків. Методика впровадження більш прогресивних технологій в даний процес.
  
  контрольная работа [33,1 K], добавлен 07.10.2010
  

• Котки. Проріджувачі. Грунтообробні комбіновані агрегати

  Застосування котків для ущільнення та вирівнювання поверхні поля від грудок, розпушування грунту. Використання проріджувачів для формування заданої густоти рослин цукрових буряків і знищення бур'янів у зоні рядка. Комбіновані агрегати для обробки грунту.
  
  реферат [4,7 M], добавлен 02.08.2010
  

• Удосконалення виробництва цукрових буряків за енергозберігаючою технологією з розробкою технології та організації сільскогосподарського процесу збирання його

  Характеристика господарства та технологічна схема при виробництві цукрових буряків. Розрахунок агрегату для збирання буряку, опис пристосування. Організація робіт та технічного обслуговування процесу. Визначення собівартості виготовлення пристосування.
  
  дипломная работа [163,3 K], добавлен 18.07.2011
  

• Вивчення ознак і властивостей нових сортів ячменю ярого селекції МІП з метою залучення їх в селекційний процес

  Ботанічна характеристика та біологічні особливості ячменю ярого, історія селекції та сучасний стан в Україні. Вивчення сортів ячменю, що вирощуються в господарстві. Дослідження росту і розвитку рослин селекції МІП. Оцінка ґрунтово-кліматичних умов.
  
  курсовая работа [131,4 K], добавлен 16.07.2015
  

• Селекційна робота з сільськогосподарськими культурами

  Напрямки селекційної роботи з культурами сільськогосподарських рослин. Практичне використання ефекту гетерозису в селекції кукурудзи. Типи гібридів у виробництві. Досягнення селекції, проблеми та перспективи. Особливості насінництва гідридів кукурудзи.
  
  курсовая работа [73,7 K], добавлен 29.11.2011
  

• Агротехнічні прийоми вирощування овочевих культур

  Морфо-біологічні особливості буряка столового. Анатомічна будова і забарвлення коренеплоду цукрових буряків. Вирощування, насіння, ділянка під ревінь. Вимоги перцю овочевого до вологи та тепла. Перець як одне із найбільш вимогливих рослин до температури.
  
  контрольная работа [28,9 K], добавлен 26.07.2011
  

• Основні відомості про шкідників

  Шкідники та хвороби сільськогосподарських овочевих, зернових та технічних культур: зернобобових, цукрових буряків, картоплі. Ураження садів та ягідників. Види багатоїдних шкідників. Агротехнічні заходи боротьби, використання хімічних препаратів.
  
  лекция [39,0 K], добавлен 01.07.2009
  

• Проект риборозплідника потужністю 1,5 млн. екз. однорічок європейського сома

  Технологія відтворення та вирощування рибопосадкового матеріалу. Хвороби об’єкта культивування та профілактичні заходи. Розрахунок потреб господарства у різновікових групах біологічного матеріалу. Потреба у гонадотропній речовині (ацетонованому гіпофізі).
  
  курсовая работа [845,9 K], добавлен 28.10.2014
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам