Популяційно-генетичні основи екологічної адаптивності сільськогосподарських видів тварин

Размещено на http://allbest.ru

14

Размещено на http://allbest.ru

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

Популяційно-генетичні основи екологічної адаптивності сільськогосподарських видів тварин

1.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сучасний стан тваринництва характеризується необхідністю його інтенсифікації і, відповідно, індустріалізації. Наслідком цього є зміна використання генофондів сільськогосподарських видів, глобальне поширення генетичного матеріалу щодо невеликої кількості представників комерційних порід. Така практика поєднана з небезпекою зменшення генетичної різноманітності видів, накопичення генетичних дефектів.

Глобальне поширення невеликої кількості комерційних порід, основане на традиційних припущеннях про те, що дотримання технологій утримання і відтворення, достатньо для збереження бажаної продуктивності в практично будь-яких еколого-географічних умовах розведення. У той же час, накопичено велику кількість даних з екологічної генетики сільськогосподарських видів (Серебровский, 1928; Колесник, 1985; Раушенбах, 1949; Глазко, 1998), а також екологічної генетики людини (Ричков, Балановская 1996), у яких достатньо чітко виявлений тісний зв'язок між еколого-географічними особливостями місцеперебування груп організмів і їхньою фенотиповою мінливістю. Очевидно, що саме зв'язок організм (популяція) - середовище лежить в основі таких фундаментальних процесів, як еволюція, доместикація. За визначенням Шварца С.С. (Шварц, 1980), головною рушійною силою еволюційного процесу є “екологічні механізми перетворення популяцій”. Однак популяційно-генетичні процеси адаптації організмів до мінливих умов навколишнього середовища, у зв'язку з відсутністю зручних моделей і методів, досі залишаються недостатньо вивченими.

Одним із методів оцінки впливу, зокрема, умов розведення в нових місцях мешкання, а також при підвищеному техногенному забрудненні може бути аналіз генетичної структури породи, дослідження популяційно-генетичних механізмів адаптації тварин до нових умов. Такий аналіз може мати не тільки прикладний характер (оцінка ерозії генофондів видів сільськогосподарських тварин) в умовах сучасного тваринництва, але і фундаментально-теоретичний, пов`язаний з унікальними характеристиками цих видів у порівнянні з дикими видами. До них відноситься висока колонізаторська спроможність сільськогосподарських видів, широкий ареал, а також унікальна спроможність до формування всередині видів величезного спектру фенотипових варіантів (Baker, Manwell 1981). Так, основні види сільськогосподарських тварин підрозділені в даний час на породи і породні групи, що за своєю кількістю відповідають всім сучасним видам ссавців (Cunningham, 1996).

В зв'язку з цим, завданням даної роботи була оцінка особливостей генетичної структури порід і внутрішньопородних груп великої рогатої худоби й овець в залежності від різних умов природного і штучного доборів, в яких вони відтворюються, а також розробка методів оптимізіції використання генофондів в умовах дії чинників техногенного забруднення і витіснення аутохтонних порід (звуження генетичної різноманітності). Варто підкреслити, що Україна є власником ряду аутохтонних порід великої рогатої худоби й овець, що мають світове значення. Очевидно, що розробка генетично обгрунтованих програм по збереженню, поліпшенню і раціональному використанню генофондів локальних порід неможлива без глибоких досліджень особливостей їхніх генетичних структур. Такі дослідження являються також єдиною основою реконструкції генофондів аутохтонних порід і надалі, при повному їхньому зникненні, з помісних груп тварин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до тематичного плану наукових досліджень Інституту агроекології і біотехнології УААН “Вивчити генетичні наслідки екологічних стресів у різних видів тварин” (№0196U012073); згідно з договорами між Інститутом агроекології і біотехнології УААН і Чорнобильським Науковим Центром Міжнародних Досліджень №143 “Генетичні наслідки екологічного стресу в зоні відчуження Чорнобильської АЕС”, згідно з договором до проекту 3.05.02. /002-92: “Розpoбити методи pанньої дiагностики особливо цiнних бугаїв та баранiв-плiдникiв на основi викоpистання бioхiмiчних маpкеpiв стpуктуpних генiв та аналiзу цитогенетичної мiнливостi клiтин кpoвi” за пpoгpамою 3.5/1994; "Селекцiя тварин за природною резистентнiстю з використанням клiтинної та генної iнженерiї"; проекту Держкомітету науки і технологій України “Вивчення генетичних основ процесів доместикації” (№5/276-94); а також у відповідності з проектами, що пройшли конкурс наукових досліджень Міністерства освіти і науки України: проект “Eколого-генетичні методи збільшення резистентності с./г. видів до біотичних та абіотичних факторів” (№21115-97) і проект “Вивчення генофондів рідкісних та зникаючих порід ВРХ, овець та коней України в різних еколого-географічних умовах розведення” (Ф4/312-97).

Мета і завдання дослідження. Метою досліджень була розробка концепції оптимізіції використання генофондів порід великої рогатої худоби (ВРХ) та овець в різних еколого-географічних умовах розведення. В експериментальній основі концепції було виявлення породних особливостей генетичних структур овець і великої рогатої худоби, з використанням різноманітних типів молекулярно-генетичних маркерів, а також порівняльний аналіз зв'язків цих особливостей з екологічними умовами відтворення порід і внутрішньопородних груп з чинниками штучного добору (історією походження, напрямками продуктивності).

До конкретних задач даного дослідження входило:

Порівняння генетичної структури аутохтонних і синтетичних порід овець (у тому числі і нових порід, які були отримані шляхом міжпородних схрещувань на різних стадіях породотворчого процесу) із використанням різноманітних типів молекулярно-генетичних маркерів.

Аналіз генетичної структури аутохтонних порід ВРХ із використанням молекулярно-генетичних маркерів; зіставлення інформативності використання різноманітних типів молекулярно-генетичних маркерів (у тому числі таких як носогубне дзеркало).

Оцінка внутрішньопородної генетичної диференціації порід ВРХ у зв'язку з біотичними й абіотичними особливостями відтворення тварин (техногенне забруднення, інфікованість вірусом бичачого лейкозу, різноманітні еколого-географічні умови розведення тварин).

Оцінка можливості використання популяційно-генетичного аналізу порід овець і великої рогатої худоби для формування принципів генетично обгрунтованої концепції розведення тварин у різноманітних еколого-географічних регіонах України.

Об'єкт дослідженя. Породи і внутрішньопородні групи овець, великої рогатої худоби окремих еколого-географічних регіонів та різних напрямків продуктивності.

Предмет дослідженя. Популяційно-генетична адаптація різних груп тварин при інтродукції в нові умови відтворення.

Методи досліджень. Електрофоретичне розділення білків з використанням крохмального та поліакриламідного гель-електрофорезу; мікроелектрофорез; метод аналізу поліморфізму та успадкування алельних варіантів анонімних послідовностей геномної ДНК за низкою мікросателітних праймерів з використанням PCR-ISSR аналізу; oцінка поліморфізму структурних генів із використанням PCR-RFLP аналізу; метод візуальної оцінки поліморфізму фенів носогубного дзеркала; методи статистичного опрацювання експериментальних даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше сформульовано концепцію залежності генетичної структури порід сільськогосподарських видів від чинників штучного і природного доборів та видоспецифічного, породоспецифічного співвідношення внеску цих факторів в особливості генетичних структур досліджуваних порід і внутрішньопорідних груп тварин. Вперше наочно показано, що генетична структура порід овець в більшій мірі визначається чинниками штучного добору, а великої рогатої худоби - природного добору, ніж історією їхнього виведення. Виявлено, що у овець генетична структура помісних груп, одержаних при виведенні нових порід шляхом багатопородних схрещувань безпосередньо залежить від добору тварин за комплексом контрольованих морфо-фізіологічних ознак (штучний добір), а у великої рогатої худоби - від еколого-географічних умов розведення. Показано, що спостерігається послідовне підвищення рівня гетерозиготності, за дослідженим комплексом генетико-біохімічних маркерів, від широко поширених аутохтонних порід, далі до локальних аутохтонних порід і потім до синтетичних порід овець. Виявлено міжвидові відмінності у поліморфізмі таких локусів, як пуриннуклеозидфосфорилаза і рецептор до вітаміну Д, які, імовірно, можуть вносити певний доробок у різну “чутливість” овець і великої рогатої худоби стосовно чинників екологічного стресу.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів. Рекомендовано новий метод аналізу і контролю генетичної структури порід і внутрішньопорідних груп овець і великої рогатої худоби, оснований на врахуванні розподілу алельних варіантів і фенів одночасно за групами маркерів, а також на основі врахування асоціацій між ними. Оцінено відносну інформативність різноманітних засобів маркування особливостей генетичної структури (генетико-біохімічні системи, анонімні фрагменти ДНК, фени носогубного дзеркала у великої рогатої худоби). Показано, що поєднання алельних варіантів за різноманітними типами молекулярно-генетичних маркерів може бути використане як додаткова породна характеристика. Показано, що генетична структура внутрішньопорідних груп великої рогатої худоби тісно пов'язана з впливом техногенного забруднення та еколого-географічними умовами їхньго відтворення. Виявлено специфічну залежність генетичної структури великої рогатої худоби молочного напрямку продуктивності (червона степова, голштинська породи) від рівня техногенного забруднення областей, у яких вони відтворюються, що може бути безпосередньо використане при розробці стратегії розведення спеціалізованих порід цього виду в різних регіонах України.

Особистий внесок здобувача. Нові теоретичні та експериментальні ідеї про механізми формування генетичної структури овець і великої рогатої худоби, що розробляються в дисертації, належать автору. Постановка проблеми, розробка програм досліджень, отримання і аналіз експериментальних даних виконувались автором особисто або безпосередньо під його керівництвом.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були подані і доповідались на Міжнародних конференціях, симпозіумах: на I, II, III конференціях “Молекулярно-генетические маркеры животных” (Київ, 1994, 1996, 1999 рр); Congress of Cell Biology (Czechija, Prаga, 1994); “Итоги 8 лет работ по ликвидации последствий аварии на ЧАЭС”(Зеленый Мыс, 1994); “Проблемы сохранения редких пород домашних животных и близкородственных диких видов” (Пущино, 1996); Animal Genetics (ISAG, France, 1996); EAAP (Norway, 1996, 1998); Physiology and Ethology of Wild and Zoo Animal (Berlin, Germany, 1996); “Агробіотехнології рослин і тварин” (Київ, 1997); "ДНК-технології "(Київ, 1997); Conservation of endangered autochtonous animal breeds of danubian countries (Budapest, Hungary, 1998); Animal Genetics (ISAG, Auckland, 1998); “Biodiversity and the animal genetic resources protection” (Koshice, Slovakia, 1999); “Plant and Animal Genome” (San Diego, CA, 2000); Congress on Genes, Gene Families and Isozymes (Stockholm, Sweden, 2001); “Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология” (Москва, 2001); Theriological Congress (Sun Sity, South Africa, 2001); “Перспективи розвитку скотарства в третьому тисячолітті” (Суми, 2001); “Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні” (Київ, 2002); Всеукраїнському з'їзді генетиків та селекціонерів (Ялта, 2002).

Публікації. За матеріалами роботи опубліковано 48 наукових праць - 29 статей у наукових журналах, збірниках праць, наукових вісниках, міжнародних бюлетенях та 19 повідомлень в матеріалах і тезах конференцій.

Обсяг і структура роботи. Дисертація складається з вступу, розділу “Oгляд літератури”, розділу “Матеріали і методи”, трьох розділів отриманих власних результатів досліджень і їх обговорення, заключення, висновків і списку літератури що цитується. Текст дисертації проілюстрований 46 таблицями і 37 рисунками. Перелік літератури, що цитується, містить у собі 457 найменувань. Дисертаційна робота викладена на 301 сторінці друкованого тексту.

2.ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи

Експериментальний матеріал для даної роботи було отримано при проведенні експедиційних досліджень 46-ти груп тварин (12 порід і 17 внутрішньопородних груп овець; 10 порід і 19 внутрішньопородних груп ВРХ) в різних регіонах України та Росії (табл. 1).

Таблиця 1. Основні досліджені породи тварин та їхня кількість

Примітка: в дужках вказані роки відбору зразків крові різних внутрішньопородних груп тварин

Автор виражає щиру подяку член-кор. УААН Макару І.А. (Інститут біології тварин УААН), доктору біологічних наук Кушніру А.В. (Інститут цитології і генетики СВ РАН), доктору с.-г. наук Іовенко В.М., к.с.-г. наук Туринському В.М., (Інститут степових районів УААН), доктору с.-г. наук Романову І.В. (Молдова) за надання зразків крові окремих порід для досліджень.

Аналіз поліморфізму білків і ферментів з використанням методів електрофорезу в крохмальному та поліакриламідному гелях. В якості молекулярно-генетичних маркерів для опису генетичної структури різноманітних груп тварин розглядали розподіл алельних і генотипових частот за локусами, що кодують низку білків і ферментів крові тварин (25 генетико-біохімічних систем - 29 локусів). До них віднесено такі транспортні білки, як гемоглобін (HB), трансферин (TF), посттрансферин-2 (Ptf-2), церулоплазмін (CP), рецептор до вітаміну D (GC D), Х-білок (Х-Protein), амілаза-I АМ-I (КФ 3.2.1.1); ферменти внутрішньоклітинного енергетичного метаболізму - аденілаткіназа АК (К.Ф.2.7.4.3), ферменти гліколізу - поліморфізм регуляторного гену (LDR) лактатдегідрогенази LDН (К.Ф.1.1.1.27), гексокіназа ГК (К.Ф.2.7.1.1.), фосфоглюкомутаза FGM (К.Ф.2.7.5.1), глюкозофосфат ізомераза GFI (К.Ф.5.3.1.9); ферменти циклу Кребса - малатдегідрогеназа MDH (К.Ф.1.1.1.37), малік-ензим ME (К.Ф.1.1.1.40), ізоцитратдегідрогеназа IDG (К.Ф. 1.1.1.42); ферменти пентозофосфатного шунта - 6-фосфоглюконатдегідрогеназа 6-FGD (К.Ф.1.1.1.43), глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа G-6-FD (К.Ф.1.1.1.49); фермент метаболізму екзогенних субстратів - естераза плазми крові ES (К.Ф. 3.1.1.1), лужна фосфотаза АР (К.Ф.3.1.3.1), супероксиддисмутаза SOD (К.Ф.1.15.1.1), аденозиндезаміназа ADA (КФ3. 5.4.4), лейцинамінопептидаза LAP (К.Ф.3.4.1.1), креатинкіназа УК (К.Ф.2.7.3.2); фермент метаболізму перекисних радикалів - діафораза DP (К.Ф.1.6.2.2), фермент метаболізму пуринових основ - пуриннуклеозидфосфорилаза PN (К.Ф.2.4.2.1).

Використовували метод горизонтального мікроелектрофорезу в 11-13% крохмальному гелі (Глазко, 1985), з власними модифікаціями з подальшим гістохімічним фарбуванням, а також метод вертикального поліакріламідного гель-електрофорезу (PAGE) (Gahne еt al. 1977) із деякими власними модифікаціями.

Оцінка поліморфізму структурних генів із використанням PCR-RFLP аналізу. Для ампліфікації фрагмента гену лептину (LEP) використовували пару праймерів 5'GTCACCAGGATCAATGACAT-3'; 5'AGCCCAGGAATGAAGTCCAA-3'. Праймери були підібрані таким чином, щоб ампліфікований фрагмент ДНК містив у собі сайти розпізнавання, специфічні для А-, В- і С- алельних варіантів. Аналіз поліморфізму за локусом лептину проводився шляхом оцінки довжин рестрикційних фрагментів, одержуваних після обробки продукту ампліфікації (1820 п.н.) рестриктазою Sau3AI. Рідкісний поліморфізм по Sau3AI сайту (С-аллель) визначався за додатковими рестрикційними фрагментами у 470 п.н. і 220 п.н.

Для ампліфікації фрагменту гену капа-казеїну (CSN3) були використані праймери: А 5`- ATGTGCTGAGCAGGTATCCTAGTTATGG-3` і B 5`- CCAAAAGTAGAGTGCAACAACACTGG-3`. Фрагмент ДНК довжиною 883 п.н., фланкований цими послідовностями, є ділянкою четвертого екзона гену CSN3 і включає сайти розпізнавання для рестриктаз, специфічних для А- і В- варіантів. Алельний варіант А має два сайти розпізнавання для рестриктази Pst 1, а алельний варіант В - один сайт. Рестрикцію проводили з ендонуклеазою Pst 1 у буфері Red (ендонуклеази і буфер фірми Sibenzime). Для проведення PCR використовувалися термоциклери фірми “ДНК-технология” (Росія), “Eppendorf” (Німеччина).

Аналіз поліморфізму анонімних фрагментів ДНК з використанням праймерів до мікросателітних локусів. Аналіз поліморфізму та успадкування алельних варіантів анонімних послідовностей геномної ДНК за низкою мікросателітних праймерів проводився з використанням PCR-ISSR аналізу.

Для ампліфікації фрагментів ДНК, фланкованих різноманітними мікросателітними локусами, використовували праймери з такими послідовностями: (AGC)6G, (ACC)6G, (CTC)6C, (AC)9G, (GA)9C і (CT)9G. Для визначення розмірів продуктів ампліфікації на кожному блоці використовували маркер молекулярних мас Step Ladder DNA S7025 (SIGMA). Весь спектр отриманих ампліконів підрозділяли на зони, що відрізняються на 100 пар нуклеотидів, і в цих межах умовно позначали амплікони, що відрізняються один від одного приблизно на 25 пар нуклеотидів. У діапазоні довжин ампліконів від 2.6 до 0.9 т.п.н. і понад 3.2 т.п.н. більш точні значення в умовах даного електрофоретичного поділу одержати важко, тому точні показники проміжних довжин ампліконів умовні.

Оцінка поліморфізму фенів носогубного дзеркала у великої рогатої худоби. Використано метод візуальної оцінки характеру нашкірної будови складок, що виконувався по знімках сфотографованих носогубних дзеркал тварин. Інформація оцінювалася на основі створення загального портрету (картини - малюнка). Основу класифікації малюнка складали три, що виділяються, феноознаки: форма, топографія шкірних валиків, наявність борізд (ліній) на носогубній площині тварини. Методика основана на розробках д.б.н. Трофименко О.Л. з власними модифікаціями. Виділяли 5 типів дерматогліфів, що розглядали як окремі фени й оцінювали частоти їх зустрічальності у груп тварин. Типи позначені як “колосок”, “гілка”, “крона”, “зерно” і “комбі”.

Статистичне опрацювання експериментальних даних. Статистичне опрацювання експериментальних даних проводили із застосуванням традиційних прийомів. Статистичну достовірність розходжень між групами оцінювали за допомогою критерію Ст'юдента (Плохинский, 1969). Для статистичного опрацювання даних використовували комп'ютерні програми “QUATTRO PRO”, “STATISTICA” і "BIOSYS-I" для розрахунку генетичних відстаней, побудови дендрограм (кластерний аналіз), а також для оцінки генної рівноваги відповідно до закону Харді-Вайнберга.

“Чистопородне” розведення тварин в Україні

Україна, з багатовіковими традиціями сільського господарства, протягом всього існування колишнього Радянського Союзу, була основним виробником сільськогосподарської продукції. За останнє 10-річчя в Україні відбулася дуже швидка зміна породної і, відповідно, генетичної структури видів сільськогосподарських тварин. Причому, особливості цих змін дотепер залишаються недослідженими з генетичної точки зору, так само як і регіональна специфіка тваринництва. У зв'язку з цим, нижче будуть розглянуті досліджувані нами особливості порід і внутрішньопородних груп овець і великої рогатої худоби.

Формування генетичної структури аутохтонних і синтетичних порід овець під впливом чинників штучного і природного доборів

Особливості генетичної структури аутохтонних порід овець

Локальні аутохтонні породи овець. З метою вивчення особливостей генетичної структури аутохтонних порід, чисельність яких невисока в даний час і їхнє існування перебуває під загрозою, було розглянуто генетичну структуру трьох порід - смушевої сокільскої, грубововнових - кулундинської та уельської. Для зручності викладу надалі ці породи позначаються як локальні, для того щоб підкреслити обмеженість їхнього поширення і жорстку прив`язаність до певних місцеперебувань, сокільської - до України, кулундинської - до Росії (Сибір), уельської - до Англії (графство Уельс).

Особлива увага до сокільської породи викликана тим, що вона відноситься до малочисельних аутохтонних порід овець України, історично сформувалася у певному агроекологічному ландшафті й адаптована до еколого-географічних умов розведення, характеризується унікальними особливостями одержуваної продукції. Розподіл алельних варіантів за 12-ма локусами, що виявилися поліморфними з 29-ти досліджуваних, подано в табл. 2.

тварина генетичний добір

Табл. 2. Генетична структура досліджуваних овець сокільської породи за 12-ма поліморфними генетико-біохімічними системами

Примітка. n - кількість досліджуваних тварин

Виконано також аналіз електрофоретичних спектрів продуктів ISSR-ампліфікації з використанням праймерів (AGC)6G і (AGC)6C. Спектри продуктів ампліфікації ДНК-фрагментів містили 6-27 смуг (ампліконів) у залежності від вибраного праймеру. Розмір продуктів варіював у межах 2,5-0,5 т.п.н. Кожний продукт ампліфікації розглядали як окремий локус. У якості молекулярно-генетичних маркерів розглядалися тільки ті амплікони, що стабільно відтворювались не менш, ніж у 3 процедурах ампліфікації при використанні матриці ДНК тієї самої тварини. Слід зазначити, що отримані спектри при використанні в якості праймерів фрагментів, що відрізняються один від одного тільки на один “якорний” нуклеотид, призводили до формування спектрів, що істотно відрізнялися за кількістю і молекулярною масою ампліконів. Це свідчить про високу точність відпалу і ампліфікацію більшості досліджуваних фрагментів ДНК.

Аналіз поліморфізму анонімних фрагментів ДНК дозволяє одночасно розглядати значну кількість локусів, проте всередині породи вони достатньо часто виявляються мономорфними. Середня гетерозиготність за досліджуваними локусами біохімічних маркерів склала в сокільської породи 18,4% (з врахуванням мономорфних систем). Очікувана гетерозиготність ISSR-PCR маркерів (46 локусів), розрахована за отриманими спектрами ампліконів, склала 36% .

При оцінці інформативності двох типів молекулярно-генетичних маркерів для аналізу внутрішньо- і міжпородної диференціації тварин на прикладі двох порід овець - сокільської і багатоплідного каракулю виявлено, що генетичні відстані (Nei, 1972, DN) між досліджуваними породами за біохімічними маркерами склали 0,070, а за локусами, представленими ампліконами - 0,839. Найбільш втягнутими в міжпородну генетичну диференціацію виявилася група транспортних білків (DN=0,141). Отримані дані дозволяють припускати, що ДНК-маркери зручні для оцінки міжпородних розходжень, а для дослідження внутрішньопородної генетичної диференціації більш інформативні біохімічні маркери.

Аналіз генетичної структури уельської породи (давньої гірської грубововнової породи, історично сформованої в графстві Уельс, Англія) і кулундинської породи (рис.1.) (відріддя овець “Золотої орди”, Сибір, Росія) дозволив одержати дані, що свідчать про виражену своєрідність їхньої генетичної структури.

Загалом, дослідження трьох аутохтонних порід овець України, Росії й Англії дозволяють зробити висновки про те, що кожна порода має своєрідну генетичну структуру.

Так, наприклад, у сокільської породи спостерігали специфічний розподіл алельних варіантів за локусами HB, PTF-2 і PN. Кулундинська порода мала унікальний розподіл алельних варіантів за двома локусами - LDR і DP, для уельської породи відмічено виражену порідну своєрідність розподілу алельних варіантів за локусом TF. Середня гетерозиготність на локус у особин цих трьох локальних аутохтонних порід, якщо враховувати тільки поліморфні локуси, виявилася досить високою (сокільська - 40,5 %, кулундинська порода овець - 35%, уельська гірська -34,7%).

За окремими продуктами ампліфікації (ISSR-PCR) також можливо виявити специфічні особливості генофондів досліджених порід, проте їхнє одержання більш трудомістке для аналізу і менш інформативне у відношенні до конкретної біохімічної функції, у порівнянні з генетико-біохімічними системами.

Генетична структура поширених аутохтонних порід овець (цигаї, прекос, тексель, остфризи). Аналіз генетичної структури цигайських овець із господарств Кишинівської і Івано-Франківської областей показав диференціацію тварин у зв'язку з різними регіонами розведення. В групах Івано-Франківських овець виявлено підвищення гомозиготності за окремими локусами. При оцінці "нерівноваги за зчепленням" між алельними варіантами різних локусів отримано дані, що дозволяють припускати причину підвищеної гомозиготності в зв'язку з близькоспорідненим схрещуванням, оскільки в них, на відміну від групи Кишинівської області, виявляється статистично вірогідною (P>95%) підвищена частота зустрічальності разом визначених алельних варіантів в одному генотипі відразу за декількома локусами: PN і TF; ME і LDR; DP і HB (рис.2 А,Б). Проте, не можна виключити можливість, що така підвищена "інтегрованість" генофонду в цигайських овець даної локальності зумовлена специфічними особливостями штучного і природного добору.

За напрямком продуктивності порода прекос відноситься до тонкорунного напрямку, остфризи і тексель - до напівтонкорунного молочного і м'ясного напрямків. У результаті виконаних досліджень відзначається висока частота зустрічальності алельного варіанту Tf B (0. 500) у породи тексель. Три досліджені породи істотно відрізняються одна від одної за розподілом алельних варіантів за локусами TF, ME, HB, LAP, LDR і не відрізняються за локусами NP, EST, DP. Слід зазначити, що в міжпородну диференціацію цих порід головний доробок вносять інші локуси, ніж в міжпородну диференціацію групи грубововнових овець.

Виконані дослідження свідчать про дещо менш високий рівень середньої гетерозиготності за включеними в аналіз поліморфними генетико-біохімічними системами, у середньому, в широко поширених аутохтонних порід (25,0%, 30,9% і 36,3%) у порівнянні із сокільською - 40,5 %, кулундинською - 35,0% і уельською гірською -34,7%. У даному випадку мова йде про деяку тенденцію до підвищеного рівня середньої гетерозиготності у локальних аутохтонних порід. Не можна виключити, що саме завдяки більш високому тиску штучного добору на широко поширені аутохтонні породи, рівень гетерозиготності у них дещо зменшується.

Генетична структура синтетичних порід овець (алтайська, асканійська, кембридж). Синтетичні породи за своїм походженням є більш складними, ніж аутохтонні породи. Для того, щоб з'ясувати, чи відбивається така складність на генетичних особливостях порід, у даному підрозділі подано дані виконаних досліджень розподілу алельних варіантів поліморфних генетико-біохімічних систем у таких синтетичних порід овець як алтайська, асканійська і кембридж.

Отримані дані свідчать про те, що подібності між породами варіюють від локусу до локусу. Так, за локусом LDR усі породи схожі, за локусом ТF кожна з них характеризується унікальною структурою, за локусом EST унікальний розподіл виявляється тільки в алтайської породи, за локусом HB - у породи кембридж.

Загалом, для всіх трьох синтетичних порід характерний дещо підвищений рівень гетерозиготності у порівнянні із широко розповсюдженими аутохтонними породами. Очікується, що така тенденція до збільшення рівня середньої гетерозиготності у синтетичних порід зумовлена особливостями їхнього походження, участю у формуванні їхніх різноманітних батьківських варіантів порід.

Таким чином, найменший рівень поліморфізму за поліморфними генетико-біохімічними системами виявляється у широко поширених аутохтонних порід, потім у локальних аутохтонних і синтетичних порід.

Диференціація порід у зв'язку з різноманітним походженням і напрямком продуктивності. Визначальний доробок в особливості генетико-біохімічної розмаїтості порід можуть вносити, принаймні, три основні причини - історія створення порід, еколого-географічні умови їхнього виведення і породоспецифічні характеристики продуктивності.

Для виявлення особливостей будови генетичної структури порід овець і оцінки можливого зв'язку їх із переліченими чинниками, виконані порівняння генетичної структури порід овець, кожна з яких мала свої особливості напрямку продуктивності, часу формування й умов розведення. Розглянуто генетичні структури трьох порід м'ясо-вовнового, тонкорунного напрямку: синтетичні асканійська, алтайська і більш давня - прекос; давня м'ясо-вовнова напівтонкорунна цигайська порода; три напівтонкорунних породи - синтетична кембридж, м'ясна - тексель, молочна - остфризи і грубововнові аутохтонні породи - уельська гірська, сокільська, кулундинська і романівська.

В результаті виконаних досліджень було отримано такі дані. За локусом PN у більшості досліджених порід, за деякими винятками (сокільська, наприклад) переважав алельний варіант Np H, за локусом ME - Me F, за винятком цигайської породи. За локусом TF близькі всі тонкорунні породи: алтайська, асканійський мерінос і прекос закарпатський. Загальну групу за цим локусом також утворюють такі напівтонкорунні породи як кембридж, тексель і остфризи. Інша напівтонкорунна порода - цигаї, відрізнялася від них за розподілом алельних варіантів локусу TF, причому він співпадав (індекс ідентичності дорівнює 1) із таким у кулундинської вівці. Сокільська порода подібна за цим локусом з трьома напівтонкорунними породами: кембридж, тексель і остфризи, а гірська уельська порода з тонкорунними породами прекос закарпатський і алтайська. Відмічено унікальність генетичної структури романівської породи овець за цим локусом.

При побудові дендрограм на основі значень генетичних відстаней (рис. 3), отримано два кластери, перший (верхній) сформували породи переважно напівтонкорунного та грубововнового напрямків, інший - в основному, породи тонкорунного напрямку. Романівська порода займає автономне положення на дендрограмі, що, як видно, свідчить про її специфічну генетичну структуру.

Рис. 3. Дендрограма генетичних взаємовідносин (індекс ідентичності) між породами овець, побудована на підставі розподілу алельних варіантів за поліморфними генетико-біохімічними системами.

Таким чином, виконано порівняльний аналіз генетичної структури 11-ти порід овець, що відрізняються за історією створення, еколого-географічними умовами розведення і характеристиками продуктивності. Розподіл алельних частот у різних порід варіюють від локусу до локусу й у більшості випадків не співпадають з міжпородною диференціацією, пов'язаною з історією їхнього походження й еколого-географічними особливостями умов розведення.

Загалом, отримані дані свідчать про те, що основний внесок в міжпородну диференціацію вносять чинники, пов'язані з напрямком продуктивності, до яких належать різні породи, в основному, у зв'язку з приналежністю до тонкорунних, напівтонкорунних або грубововнових типів овець. Очікується, що визначальний вплив на генетичну структуру порід овець мають чинники, пов'язані із штучним добором. Для того, щоб перевірити це припущення, було виконано дослідження змін генетичної структури при створенні шляхом штучного добору нових порід і породних типів із використанням міжпородних схрещувань.

Генетична диференціація груп овець при породоутворенні з використанням багатопородних схрещувань. Впровадження селекційних програм міжпородних схрещувань як одного з методів підвищення генетичного потенціалу продуктивності тварин потребує генетичного контролю цього процесу. Необхідно підкреслити, що використовують одержання багатопородних помісей, тому що вони за комерційними показниками перевершують двохпородні помісі.

Для того, щоб оцінити динаміку генетичної структури в такому процесі, а також виявити залучені в нього молекулярно-генетичні системи, виконано порівняльний аналіз генетичної структури материнської і покращуючих порід овець, що використовувалися при створенні нового породного типу закарпатських тонкорунних м'ясо-вовнових овець на основі тонкорунних порід - прекос закарпатський, асканійської і алтайської порід. За генетичною структурою в алтайської породи відзначається статистично достовірний (P<0.05) дефіцит гетерозигот одночасно за локусами LDR, EST, ME. У нової породної групи (1992, 1994 рр) такий дефіцит виявляється за локусами ТF, EST, LAP. У решти груп досліджених тварин такого підвищння рівня гомозиготності одночасно за декількома локусами не спостерігалося, що свідчить про підвищену стабільність їхньої генетичної структури, у тому числі і нової породної групи 1995 р.

Кластерний аналіз, розрахунок якого оснований на алельних частотах поліморфних локусів, показав, що на ранніх етапах породоутворюючого процесу тварини знаходяться ближче до материнської породи. При селекційній роботі, при доборі тварин за комплексом морфо-фізіологічних ознак в сторону покращувачів, відбувається зближення генетичної структури з батьківською породою - асканійським мериносом (рис. 4).

Рис. 4. Дендрограма генетичних взаємовідносин між породами овець, побудована на підставі індексу подібності М.Нея, розрахованого за розподілом алельних варіантів генетико-біохімічних систем у різноманітних порід овець

Отримані дані свідчать про незалежну мінливість розподілу алельних варіантів генетико-біохімічних систем у трьох вихідних батьківських порід і отриманих від них, шляхом багатопородних схрещувань, нової породної групи овець тонкорунного напрямку. За окремими локусами спостерігається асоційована генетична мінливість, що співпадає з диференціацією тварин за господарсько-цінними ознаками, із напрямком селекційної роботи (LAP, ME). Оскільки між цими локусами відсутнє фізичне зчеплення, очікується, що вони безпосередньо втягуються в полігенні комплекси, що детермінують формування відповідних господарсько-цінних ознак, за якими велася селекційна робота при створенні нового породного типу тонкорунних українських закарпатських овець.

Окремо, вплив ефектів штучного добору на генетичну структуру овець оцінювався на підставі досліджень динаміки розподілу алельних варіантів у нової породної групи асканійського багатоплідного каракуля (АМК). З метою аналізу розподілу алельних варіантів у процесі створення нової породи було виконано порівняння генетичної структури овець романівської і сокільської порід, генофонди яких близькі до батьківських вихідних груп, оскільки в створенні смушевої сокільської породи каракульські вівці приймали безпосередню участь. Використовуючи різні типи молекулярно-генетичних маркерів (структурні гени, ISSR-PCR, рис. 5) розглянуто генетичну структуру АМК у різні роки селекційної роботи.

У досліджених представників сокільської породи, так само як і у романівських овець, було виявлено статистично достовірний дефіцит гетерозигот (P<0.01 і P<0.05 відповідно) за локусом EST, розподілення алельних варіантів за іншими локусами відповідало врівноваженому, відповідно до закону Харді-Вайнберга. У групі АМК-95 статистично достовірним (P<0.01) виявився дефіцит гетерозигот за локусом гемоглобіну, у групі АМК-96 спостерігався надлишок гетерозигот за локусом TF (P<0.05) і дефіцит гетерозигот за локусом LDR (P<0.01). Дефіцит гетерозигот за локусом LDR (P<0.05) виявлений і в групі АМК, взятого для аналізу в 1998 р. У групі АМК 1999 р. спостерігали статистично достовірний надлишок гетерозигот за локусом TF (P<0.01) і дефіцит гетерозигот за локусом LАР (P<0.01). За цими даними вочевидь, як поступово відбувається формування нової генетичної структури при формуванні породи в результаті селекційної роботи.

На підставі розподілу алельних частот за цими локусами було виконано розрахунок генетичних відстаней, а також кластерний аналіз генетичних взаємовідносин між групами досліджених тварин. За результатами дендрограми очевидно, що найбільш близькою до вихідних порід виявляється група АМК-95, вона і найбільш близька до романівської породи, яка займає автономне положення на дендрограмі. Всі інші групи АМК входять в один загальний кластер із сокільською породою, що також відповідає і напрямку штучного добору з цими вихідними помісними тваринами в сторону характеристик вовни, типових для каракулю високої якості.

Таким чином, на моделі виведення нової породи асканійського багатоплідного каракуля чітко видно, що генетична структура проміжних груп селекціонованих помісних тварин істотно змінюється під впливом штучного добору за досліджуваними поліморфними генетико-біохімічними системами.

Для оцінки внеску штучного добору у формування генетичної структури помісного потомства було також розглянуто генетичну диференціацію овець, отриманих від схрещувань цигаї х остфризи. Потомство першого покоління від схрещування - цигаї х остфризи (F1), а також другого - F1 х остфризи (F2) були поділені на дві групи - із "бажаними" сполученнями морфологічних характеристик у зв'язку з їхньою молочною продуктивністю, швидкоспілістю і живою масою і, відповідно, "небажаними". Аналіз генетичних дистанцій, розрахований на основі алельних частот поліморфних генетико-біохімічних систем показав, що найменші генетичні дистанції спостерігаються між групами тварин “бажаного” типу, а також “небажаного” типу, незалежно від їхньої належності до різних поколінь (F1, F2), а також між батьківською породою, що є покращуючою, і групами тварин “бажаного” типу. Отримані дані свідчать про прямий вплив штучного добору, проведеного з комплексом морфо-фізіологічних характеристик, на особливості генетичної структури овець, отриманих при міжпородних схрещуваннях.

Таким чином, в результаті досліджень порід і помісних груп овець виявляються породоспецифічні особливості формування генетичної структури, різноманітні для порід різного напрямку продуктивності. При аналізі генетичної структури помісних груп, що представляють проміжні варіанти селекційної роботи з виведення нових порід із використанням багатопородних схрещувань, виявлено збіг напрямків селекційної роботи і змін генетичної структури в сторону покращуючих порід з бажаною продуктивністю. Отримано прямі дані про внесок добору за морфо-фізіологічними фенотипами овець в особливості генетичної структури помісних овець. Сукупність отриманих даних дозволяє стверджувати, що у формуванні генетичної структури у овець основний внесок роблять чинники штучного добору, у порівнянні з історією походження тварин та впливом умов розведення. Для того, щоб оцінити видоспецифічність такого зв'язку між чинниками штучного добору і формуванням генетичних структур у порід, у наступному розділі розглянуто генетичну структуру порід великої рогатої худоби з використанням такого ж набору молекулярно-генетичних маркерів, що й у овець.

Генетична структура аутохтонних і комерційних порід великої рогатої худоби

Проблема збереження генофондів локальних порід у даний час є важливою за цілою низкою причин. Очевидно, що в збереженні генофондів локальних порід першим принципово необхідним етапом є виявлення породоспецифічних особливостей їхньої генетичної структури. Це особливо важливо з наявною традицією використання для поліпшення локальних порід інших, комерційних. Для вирішення цих питань важливим етапом є оцінка ознак, генетичних маркерів, з використанням яких генетична структура порід може бути описана найбільш адекватно. У зв'язку з цим в наших дослідженнях розглядалися різноманітні підходи до виявлення породоспецифічних особливостей генетичної структури порід великої рогатої худоби, а також виконувалося порівняння інформативності застосування різноманітних типів молекулярно-генетичних маркерів (у тому числі таких, як носогубне дзеркало).

Порівняльний аналіз заводських (комерційних) та аутохтонних порід великої рогатої худоби України.

Україна є однією з небагатьох країн світу, в якій залишилися представники подолянської сірої худоби (сіра українська). Подолянська сіра степова худоба розглядається як проміжна група тварин між туром - диким предковим видом та всіма європейськими породами великої рогатої худоби.

Сучасні породи великої рогатої худоби прийнято підрозділяти на аутохтонні (локальні, аборигенні) та заводські (комерційні), основні відмінності котрих зумовлені різною інтенсивністю штучного добору, а також розповсюдженням в різних еколого-географічних регіонах. Але, сіра подолянська худоба є предковою для обох груп цих порід.

Для того, щоб оцінити особливості генетичної структури порід цих двох груп, а також їхні взаємовідносини з предковою подолянською, було виконано порівняльний аналіз генетичної структури сірої української породи з аутохтонними та заводськими породами молочного і комбінованого напрямків продуктивності за рядом молекулярно-генетичних систем. У представників аутохтонних порід великої рогатої худоби України виявлені деякі виражені породоспецифічні особливості за частотами зустрічальності рідкісних алельних варіантів за рядом структурних генів. Алельний варіант, що зустрічається найрідше, Тf F, був нами виявлений тільки у тварин сірої української і білоголової української порід із частотами, відповідно, 0,050 і 0,017. Наявність алельного варіанту Тf F раніше описаного тільки у представників сірої степової худоби (Воs рrimigenius podolicus) - сіра українська, сіра угорська (Столповская и др., 1992), а також нами, у бурої карпатської породи (Глазко и др., 1996). Передбачалося, що сіра українська порода зберегла в собі деякі унікальні блоки генів, властиві предковій породі, подолянській сірій степовій худобі (Воs рrimigenius podolicus), проміжній формі між диким предковим видом туром (Воs рrimigenius domesticus), що вимер у XVII сторіччі (Браунер, 1927), і сучасними європейськими породами. Тf F мoже служити імовірним маркером таких генних комплексів. Присутність цього алельного варіанта в білоголової української породи описана нами вперше.

З метою оцінки розповсюдження алельних варіантів в некодуючих ділянках структурних генів, виконаний PCR-RFLP аналіз фрагменту гену лептину, з 1221 по 3041 нуклеотид, в основному, перший інтрон (позиції 1252 - 3005, GenBank). Аналіз продуктів рестрикції локусу лептину (LЕP) дозволяє виявляти три алельних варіанти, описаних у літературі (Pomp et al., 1997), - А, В и С. За цим локусом у досліджених тварин спостерігали чотири генотипи - АА (розмір фрагментів ДНК 740, 690 і 400 п.н.); АВ (фрагменти 740, 690, 400, 310 і 90 п.н.); ВВ (740, 690, 310 і 90 п.н.); АС (розмір фрагментів 740, 690, 470, 400 і 220 п.н.). Рідкісний алельний варіант Lep С виявлений тільки у тварин двох порід із низькою частотою зустрічальності: білоголової української - 0,022 і червоної польської - 0,125. В усіх групах тварин переважаючим був алельний варіант Lep А. При аналізі алельних варіантів гену капа-казеїну (CSN3) найвища частота зустрічальності алельного варіанта В, серед досліджених порід великої рогатої худоби, спостерігалася у тварин бурої карпатської породи.

Аналіз генетичних дистанцій (М.Nеi, 1972), отриманих шляхом порівняння розподілу алельних варіантів за 9-ти поліморфними генетико-біохімічними системами показав, що найменші генетичні відстані виявлені між сірою українською і червоною польською (0,085), між білоголовою українською і червоною польською (0,058), а найбільші - між сірою українською і білоголовою українською (0,150).

Виконаний аналіз генетичної структури порід з використанням багатолокусних спектрів продуктів ампліфікації анонімних фрагментів ДНК показав, що такі спектри, не зважаючи на виражений поліморфізм, виявляються складними для інтерпретування (рис. 6) і, мабуть, менш зручні, для пошуку рідких алельних варіантів, ніж структурні гени.

Отримані дані свідчать про те, що збереження рідкісних алельних варіантів у різних локальних порід локус-специфічне й, імовірно, для виявлення генних ансамблів у таких порід, що зв'язують їх із давнім предковим видом, необхідний аналіз багатьох локусів.

Генетична диференціація деяких м'ясних порід за молекулярно-генетичними маркерами. В умовах зменшення кількості поголів'я і в зв'язку з необхідністю, що зумовлена соціально-економічними причинами, перехід до ринкових відносин, одним з головних завдань тваринництва України є надійне виробництво високоякісної продукції: яловичини, телятини, шкірсировини, що можливо при розвитку області спеціалізованого м'ясного скотарства (Зубець, 1997). При виведенні порід в окремих випадках виникає необхідність додаткового прилиття крові порід, що історично брали участь у їхньому формуванні. Тому вивчення генетичної структури за молекулярно-генетичними системами дозволяє виявляти генетичні особливості селекційного матеріалу, оцінювати ступінь консолідації порід, ліній і їхньої диференціації в процесі селекції.

З метою виявлення породоспецифічних особливостей генетичної структури і розмаху внутрішньопородної мінливості, у наших дослідженнях було проведено порівняльний аналіз генетичної структури таких порід, як симентали вітчизняні та австрійської селекції, ангуси американської селекції і група абердин-ангусів шотландської і канадської селекції, що приймають участь у формуванні масиву м'ясної худоби в Україні.

Очевидно, що виявлення внутрішньопородних генетичних відмінностей, оцінка генетичної спорідненості між різними групами цих порід, допоможе уточнити селекційні схеми створення нових порід шляхом добору бажаних, із генетичної точки зору, варіантів схрещування.

Виконані дослідження показали, що внутрішня диференціація більш виражена для сименталів (DN=0,037), ніж для абердин-ангусів. Цікаво відзначити, що абердин-ангуси обох груп (особливо британські абердин-ангуси) виявилися ближче за генетичними відстанями до українських сименталів, ніж до австрійських. З метою збільшення ефективності селекційної роботи і збереження генофонду, адаптованого до умов вітчизняної селекції, необхідно враховувати ці дані при багатопородних схрещуваннях за участю сименталів і абердин-ангусів при виведенні нових м'ясних порід, високоадаптованих до умов розведення в Україні.

Носогубне дзеркало і генетико-біохімічні маркери як додаткові породні характеристики у великої рогатої худоби. Центральне місце в сучасних програмах по збереженню генетичних ресурсів сільськогосподарських видів тварин займає проблема збереження порід, що зникають (наприклад програми FAO, 1985-2001). Очевидно, що розробка методів ефективного збереження генофондів, неможлива без розвитку зручних методів діагностики специфічних особливостей генетичної структури кожної конкретної породи. У цьому зв'язку, одним із важливих напрямків у пошуках додаткових породоспецифічних характеристик порід великої рогатої худоби є порівняльний аналіз інформативної цінності, в цьому відношенні, різноманітних молекулярно-генетичних маркерів і фенотипових ознак (фенів, Яблоков, 1980), мінливість яких не залежить від факторів зовнішнього середовища, може бути виявлена в молодих тварин та може бути використана для ідентифікації їхньої породної належності. У зв'язку з чим розглянуто закономірності межпородної диференціації за носогубним дзеркалом і рядом генетико-біохімічних систем у трьох локальних порід (бура карпатська, пінцгау, червона польська).

Особливий інтерес до цих порід пов'язаний із тим, що вони відносяться до порід, що зникають, істотно відрізняються за своїм походженням, історично сформувалися й адаптувалися до різних еколого-географічних умов. При оцінці статистичної достовірності відмінностей у частотах зустрічальності алельних варіантів різних локусів досліджуваних порід були отримані слідуючі дані. Статистично достовірні відмінності (Р<0.05; Р<0.01; Р<0. 001) виявлені, в основному, між породами пінцгау і червоної польської за розподілом алельних варіантів TF і HB.