Цукровий буряк (Beta vulgaris l.) в культурі in vitro: регенерація, морфогенез і генетична трансформація
Процеси морфогенезу в культурі тканин цукрового буряка (Beta vulgaris L.) in vitro різних сортів та селекції. Визначення типу регенераційних процесів в черешках листків цукрового буряка. Метод регенерації рослин з калюсу шляхом соматичного ембріогенезу.
| Рубрика | Сельское, лесное хозяйство и землепользование |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 06.07.2014 |
| Размер файла | 741,1 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук
ЦУКРОВИЙ БУРЯК (Beta vulgaris L.) В КУЛЬТУРІ IN VITRO: РЕГЕНЕРАЦІЯ, МОРФОГЕНЕЗ І ГЕНЕТИЧНА ТРАНСФОРМАЦІЯ
03.00.20 - біотехнологія
ГОЛОВКО Андрій Ерастович
Київ - 2003
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України (м. Київ).
Науковий керівник: доктор біологічних наук професор, академік НАН України Глеба Юрій Юрійович, Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, директор
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук професор, чл.-кор. НАН України Кунах Віктор Анатолійович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу генетики клітинних популяцій
доктор біологічних наук Ларченко Катерина Андріївна, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, провідний науковий співробітник відділу експериментального мутагенезу
Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Захист відбудеться “ 25 ” вересня 2003 року о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою 03143 Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143 Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148
Автореферат розісланий “15” cерпня 2003 року
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, к.б.н. О.А.Кравець
АНОТАЦІЯ
Головко А.Е. Цукровий буряк (Beta vulgaris l.) в культурі in vitro: регенерація, морфогенез і генетична трансформація.- Рукопис.
Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія.- Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України. Київ, 2003.
За темою дисертації захищається 8 наукових робіт.
Вивчалися процеси морфогенезу в культурі тканин цукрового буряка (Beta vulgaris L.) in vitro з використанням 14 сортів вітчизняної і закордонної селекції. Відпрацьовано системи індукції калюсу і регенерації цукрового буряка з різних експлантів і калюсу, підібраний оптимальний склад середовищ для одержання великої кількості регенерантів. Гістологічний аналіз показав що регенераційні процеси в черешках листків цукрового буряка в культурі in vitro, проходять за типом органогенезу. Запропоновано ефективний метод регенерації рослин з калюсу шляхом соматичного ембріогенезу. Вперше отримано вторинні ембріоїди буряка і оптимізовано умови підтримки їх у культурі in vitro без втрати регенераційної активності і здатності коренеутворення у регенерантів. Розроблені методи регенерації рослин було використано для трансформації цукрового буряка за допомогою Agrobacterium tumefaciens і бомбардування мікрочастинками золота. Вперше отримані трансгенні калюсні лінії буряка зі зміненим біосинтезом вуглеводів. Виявлено стабільну експресію гена GUS у калюсі і листках при використанні A. tumefaciens, а також транзієнтну експресію цього гена, внесеного у клітини калюсу в результаті бомбардування мікрочастинками золота. Отримані трансгенні рослини цукрового буряка зі стійкістю до PURSUIT при використанні A. tumefaciens. Відібрано три лінії цукрового буряка (Beta vulgaris L.), що показали позитивний сигнал при аналізі PCR і гібридизації за Саузерном.
Ключові слова: цукровий буряк (Beta vulgaris L.), органогенез, ембріогенез, регенерація, трансформація, Agrobacterium tumefaciens, стійкість до гербіцидів, ген АНАS.
АННОТАЦИЯ
Головко А.Э. Сахарная свекла (Beta vulgaris L.) в культуре in vitro: регенерация, морфогенез и генетическая трансформация.- Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология.- Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины. Киев, 2003.
По теме диссертации защищается 8 научных работ.
Диссертация посвящена изучению индукции каллюсогенеза, регенерации и генетической трансформации сахарной свеклы (Beta vulgaris L.). Целью работы была разработка эффективной системы регенерации и методов трансформации сахарной свеклы при помощи агробактерии Agrobacterium tumefaciens и бомбардировки микрочастицами золота с преципитированной ДНК, получение клеточных линий и трансгенных растений, а также их молекулярно-биологический анализ.
Изучались процессы морфогенеза в культуре тканей сахарной свеклы in vitro с использованием 14 сортов отечественной и зарубежной селекции. Отработаны системы индукции каллюса, изучены процессы спонтанного и индуцируемого органогенеза сахарной свеклы из различных эксплантов и каллюса, подобран оптимальный состав сред для получения большого количества регенерантов. Гистологический анализ показал что регенерационные процессы в черешках листьев сахарной свеклы в культуре in vitro проходят по типу органогенеза, приводящего к образованию почек с последующим их развитием и образованием листьев. Получена и изучена регенерация из каллюса путём соматического эмбриогенеза. Впервые получены вторичные эмбриоиды свеклы и оптимизированы условия поддержания их в культуре in vitro без потери регенерационной активности и способности корнеобразования у регенерантов. Поддерживая культуру эмбриогенного каллюса, оказалось возможным получить постоянную высокоэффективную (c частотой 15-20%) регенерацию растений.
В работе также было опробовано несколько подходов к определению концентраций антибиотиков и гербицидов, подавляющих рост каллюса сахарной свеклы, и установлены оптимальные концентрации PURSUIT и канамицина для селекции каллюса и растений. Разработанные методы регенерации растений были использованы для трансформации сахарной свеклы при помощи A. tumefaciens и бомбардировки микрочастицами золота. Предварительно был проведен скрининг способных к трансформации эксплантов различного генезиса нескольких сортов и отобраны наиболее оптимальные сорта и ткани. В результате работ по трансформации впервые получены трансгенные каллюсные линии свеклы с изменённым биосинтезом углеводов, некоторые из которых обнаpужили способность к коpнеобpазованию на селективных сpедах. При использовании A. tumefaciens отобраны несколько химерных по экспрессии GUS гена канамицинустойчивых растений, и показана стабильная экспрессия трансгена в листьях.
Используя широкий арсенал методов для повышения эффективности трансформации и регенерации получены трансгенные растения сахарной свеклы с устойчивостью к PURSUIT при использовании A. tumefaciens. Отобраны три линии сахарной свеклы, которые показали положительный сигнал на наличие мутантного гена АНАs при анализе PCR и гибридизации по Саузерну. Бомбардирование тканей микрочастицами золота с нанесенной плазмидой, содержащей ген глюкуронидазы, с последующим гистохимическим анализом позволило получить транзиентную экспрессию гена GUS в клетках каллюса. Таким образом, разработанные методы соматического эмбриогенеза и органогенеза сахарной свеклы в культуре in vitro могут быть использованы в массовом размножении ценных генотипов, включая растения сахарной свеклы с измененным метаболизмом, устойчивые к гербицидам или неблагоприятным условиям окружающей среды.
Ключевые слова: сахарная свекла (Beta vulgaris L.), органогенез, эмбриогенез, регенерация, трансформация, Agrobacterium tumefaciens, устойчивость к гербицидам, ген АНАs.
SUMMARY
Golovko A.E. Sugar beet (Beta vulgaris L.) in vitro cultivation: regeneration, morphogenesis and genetic transformation.- Manuscript.
Thesis for a Ph D degree (Biology) by speciality 03.00.20 - biotechnology.- Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.
The results of 8 scientific publications are defended.
The processes of morphogenesis were investigated in sugar beet tissue culture in vitro using 14 Ukrainian and foreign cultivars. Methods for callus induction were developed; spontaneous and induced regeneration from various explants and callus were studied; the media composition was optimized to maximize the number of regenerants. Histology analysis showed that regeneration from petioles cultivated in vitro occurs through organogenesis which results in bud formation followed by leaf development. Regeneration through somatic embryogenesis in friable callus was induced and studied. Repetitive embryo culture has been initiated for the first time; culture conditions and media composition were optimized to maintain the repetitive embryos in vitro for very long time without losing the capability to regenerate normal plants. Carefully maintained embryogenic culture was able to regenerate plants on a regular basis with very high efficiency (15-20%). Several methods for determining the concentrations of herbicides and antibiotics that effectively inhibited sugar beet callus growth were used, and optimal concentrations of PURSUIT and kanamycin for selection of callus and shoots were determined. Developed regeneration methods were used to transform sugar beet via Agrobacterium tumefaciens and particle bombardment. The most susceptible to genetic transformation explants were identified for each sugar beet variety prior to beginning the transformation experiments. Transgenic calli carrying genes for altered carbohydrate biosynthesis have been obtained for the first time as a result of these experiments; some of the transgenic lines were able to form roots in presence of a selective agent. Several kanamycin-resistant chimeras stably expressing GUS gene in leaves were isolated after transformation with Agrobacterium tumefacien. Also, through modifying the protocol for agrobacterium-mediated transformation with the purpose of increasing the frequency of transformation and regeneration, three transgenic lines carrying mutant AHAS gene were obtained and analyzed. The transgenic nature of the plants was confirmed through PCR and Southern analyses. Finally, transient expression of GUS gene was observed in cells after bombardment of callus with gold particles carrying plasmid with glucuronidase gene followed by histochemical analysis for GUS. Therefore, the optimized protocol for particle gun transformation can be effectively used for obtaining transgenic sugarbeet plants with altered metabolism, resistant to herbicides and tolerant to environmental stress.
Key words: sugar beet (Beta vulgaris L.), organogenesis, embryogenesis, regeneration, transformation, Agrobacterium tumefaciens, herbicide resistance, AHAS gene.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Цукровий буряк (Beta vulgaris L.), дворічна рослина, є однією з найбільш важливих технічних культур. Близько 35-40% всесвітнього цукрового виробництва здійснюється з цукрового буряка (Winner, 1993). Площа посівів цукрового буряка в Україні складає приблизно 1 млн га з середньою урожайністю коренеплодів 3 т/га. Незважаючи на величезну промислову цінність рослини, особливо в північній півкулі, і досить тривалий період її досліджень, все ще дуже важко створювати рослини цукрового буряка, що мають нові, важливі в сільськогосподарському відношенні властивості, такі як: стійкість до гербіцидів, пестицидів і хвороб, підвищений вміст цукру в коренеплодах, цитоплазматична чоловіча стерильність тощо. Створення нових сортів цукрового буряка з цінними властивостями є трудомістким процесом з величезними витратами часу, здійснюваним методами традиційної селекції і класичної генетики. Оскільки цукровий буряк - перехреснозапильна, гетерозиготна і дворічна рослина, то використовуючи методи класичної генетики, необхідно здійснити до 8 зворотних схрещувань, щоб одержати рослини з поліпшеними властивостями. У такий спосіб розробка діючих схем мікроклонування рослин у культурі in vitro та регенерації, які для цукрового буряка вивчалися протягом майже 30 років, разом з ефективними методами трансформації дозволили б одержати сорти з новими властивостями.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках бюджетних тем відділу цитофізіології і клітинної інженерії Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАНУ “Дослідження молекулярно-генетичних процесів у реконструйованих клітинних системах і трансгенних рослинах” і “Вивчення молекулярно-біологічних процесів у трансгенних і трансгеномних клітинних лініях і рослинах”. Дослідження також проводилися в рамках наукових проектів пріоритетного напрямку 01.11.00 “Біотехнологія”, у рамках Державної науково-технічної програми 02.12 “Перспективи біотехнології” Міністерства України в справах науки і технологій, проекту Програми підтримки наукових досліджень у країнах колишнього СРСР Міжнародного наукового фонду (ISF) і відповідно до тематичних планів відділу.
Мета і завдання роботи. Метою роботи була розробка ефективної системи регенерації і методів трансформації цукрового буряка за допомогою агробактерії і бомбардування мікрочастинками золота з нанесеною на них ДНК, одержання клітинних ліній і трансгенних рослин та їх молекулярно-біологічний аналіз.
Поставлена мета досягалася при послідовному вирішенні таких завдань:
Розробити ефективну систему регенерації рослин цукрового буряка in vitro.
Провести гістологічний аналіз процесів регенерації у вихідних і трансгенних лініях буряка.
Розробити методики генетичної трансформації буряка за допомогою Agrobacterium tumefaciens і бомбардування мікрочастинками золота.
Одержати за допомогою розроблених методів трансгенні клітинні лінії і/чи рослини цукрового буряка;
Провести молекулярно-біологічний аналіз відібраних трансформантів.
Об'єкт дослідження - індукція калюсогенезу, регенерація і генетична трансформація цукрового буряка (Beta vulgaris L.).
Предмет дослідження - отримання та молекулярно-біологічний аналіз трансгенних клітинних ліній цукрового буряка.
Методи дослідження - методи генетичної трансформації за допомогою Agrobacterium tumefaciens, методи соматичного ембріогенезу та бомбардування мікрочастинками золота; методика гістологічного аналізу процесів регенерації, методи аналізу трансгенності отриманих трансформантів (виділення сумарної рослинної ДНК, полімеразно-ланцюгова реакція, саузерн-блотинг гібридизація, тест на активність в-глюкуронідази /GUS/, імуноферментне визначення активності гена NPTII).
Основні положення, які виносяться на захист:
Регенераційні процеси в черешках листків цукрового буряка, поміщених in vitro, проходять за типом органогенезу.
Розмноження рослин цукрового буряка in vitro можна здійснювати шляхом соматичного ембріогенезу, при цьому вторинні ембріоїди підтримуються в культурі in vitro без втрати регенераційної активності і здатності коренеутворення у регенерантів протягом досить тривалого часу.
Вперше отримані трансгенні калюсні лінії буряка зі зміненим біосинтезом вуглеводів.
Методом генетичної трансформації досліджено стабільну та транзієнтну експресію гена GUS у клітинах калюсу і листків при використанні відповідно Agrobacterium tumefaciens та бомбардування мікрочастинками золота.
Отримані трансгенні рослини цукрового буряка зі стійкістю до PURSUIT при співкультивуванні з A.tumefaciens.
Наукова новизна отриманих результатів.
У процесі визначення підходів до трансформації цукрового буряка вивчено регенераційну здатність різних тканин Beta vulgaris. Вперше уніфіковано системи індукції калюсу і регенерації цукрового буряка з різних експлантів і калюсу, підібрано оптимальний склад середовищ для одержання великої кількості регенерантів, проведено гістологічний аналіз регенерації.
Вперше отримано і вивчено регенерацію з калюсу шляхом соматичного ембріогенезу. При цьому отримані вторинні ембріоїди буряка й оптимізовані умови підтримки їх в культурі in vitro без втрати регенераційної активності і здатності до коренеутворення у рослин, отриманих в результаті регенерації.
Проведено підбір умов трансформації й отримано транзієнтну експресію гена GUS у клітинах калюсу в результаті трансформації за допомогою гармати і стабільну експресію GUS у листках при використанні Agrobacterium tumefaciens.
Вперше отримані трансгенні калюсні лінії буряка зі зміненим біосинтезом вуглеводів. Вперше отримані трансгенні калюсні лінії буряка, протрансформовані генами, що відповідають за зміну біосинтезу вуглеводів. Вперше отримані рослини цукрового буряка, стійкі до PURSUIT. Відібрано три лінії цукрового буряка (Beta vulgaris L.), що показали позитивний сигнал при аналізі PCR і гібридизації за Саузерном.
Практичне значення отриманих результатів. Розроблені методи генетичної трансформації з використанням Agrobacterium tumefaciens і бомбардування мікрочастинками золота дозволяють одержувати трансгенні рослини цукрового буряка з цінними сільськогосподарськими ознаками.
Розроблені методи соматичного ембріогенезу й органогенезу цукрового буряка in vitro можуть бути використані для масового розмноження рослин буряка цінних генотипів. Використання методу соматичного ембріогенезу є особливо цінним у тих випадках, коли важко одержати насіння важливих генотипів. Методи мікроклонального розмноження дозволяють, незважаючи на кліматичні умови, розмножити унікальний селекційний матеріал, підвищити коефіцієнт розмноження та збагатити генофонд цукрового буряка.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведені експерименти по генетичній трансформації буряка з використанням Agrobacterium tumefaciens і бомбардування мікрочастинками золота, оптимізації умов одержання і культивування соматичних ембріоїдів і регенерації рослин, а також молекулярно-біологічний аналіз рослин, цитологічний аналіз і деякі експерименти з генетичної трансформації проведені разом із співавторами публікацій. Аналіз трансгенності трансформантів був проведений в компанії “Америкен Ціанамід” (м. Принстон, США).
Апробація роботи. Результати роботи було представлено на II Російському симпозіумі "Новые методы биотехнологии растений" (1993, Пущино, Росія), на IV Європейському конгресі з клітинної біології (26 червня - 1 липня 1994, Прага, Чехія), на ІХ Міжнародному конгресі з культури рослинних клітин та тканин, біотехнології рослин і біології in vitro в 21 сторіччі (червень 1998 р., Ізраїль, Єрусалим), Міжнародній конференції Американського агрономічного товариства (листопад 2000 р., Мінесота, США), а також на численних семінарах Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, та відділу біотехнології компанії “Америкен Ціанамід”, США.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 наукових праць, із них 4 статті у провідних фахових виданнях та отримано 1 патент на винахід.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, чотирьох розділів (огляд літератури, матеріали та методи досліджень, 2_х експериментальних розділів), висновків і списку використаних джерел. Текст дисертації викладено на 191 сторінці комп'ютерного друку, ілюстровано 22 таблицями і 18 рисунками. Список використаних джерел включає 355 найменувань.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Рослинний матеріал. У роботі використовувалося насіння цукрового буряка 14 сортів вітчизняної і закордонної селекції, люб'язно надані Інститутом цукрових буряків УААН (Україна) - Льговський однонасінний-52, Уладовський ЧС-5, Міжотненський гібрид-18, Рамонський однонасінний-47 і Рамонський ЧС-54; Institut fur Genbiologische Forschung (Німеччина) - KWS, VRB і 3915 та Crystal & Maribo Beet Seeds, Inc. (США) - ACH199, ACH31 і ACH203.
Бактерії і вектори. Найчастіше здійснювали трансформацію, використовуючи плазмідні конструкції, створені на базі широко використовуваного вектора pBin19: 1) pCB004, котра несе кодуючу послідовність арабідопсисного гена синтази ацетогідроксикислоти (AHAS) з мутацією в положенні 653 (Ser653Asn) під нативним промотором і термінується нативним поліаденілуючим сигналом; 2) pCB001, похідну від комерційного вектора pBI101 (Jefferson, 1987) з кодуючою послідовністю гена в-глюкуронідази (GUS) під промотором CaMV35S з вбудованим інтроном рослини (з метою виключити бактеріальну GUS активність), що термінується поліаденілуючим сигналом нопалинсинтази (NOS), а також химерним NPTII геном. Також використовували конструкції з генами для зміни біосинтезу вуглеводів, контрольовані тканиноспецифічним промотором, що експресується в коренях і коренеплодах, люб'язно надані Лотаром Вилмитцером, Німеччина.
Використовуючи метод прямої бактеріальної трансформації, агробактеріальні вектори були протрансформовані в Agrobacterium tumefaciens, штами LBA 4404 чи EHA101, що несуть інактивовану Ti-плазміду pMP90.
Середовища. Як базове середовище для культивування рослин і експлантів цукрового буряка використовували середовище Мурашиге-Скуга (Murashige, Scoog, 1962), скорочено MS. Для різних цілей були підібрані модифікації цього середовища. Базове середовище для швидкого розмноження вторинних ембріоїдів складалося з мінеральних солей (MS) з додаванням наступних складових: міоінозитол 100 мг/л, нікотинова кислота 0,5 мг/л, піроксидин-HCl 0,5 мг/л, тіамін-HCl 1 мг/л. Базове середовище для проростання ембріоїдів складалося з мінеральних солей (MS) плюс наступні компоненти: сахароза 3%, міоінозитол 100 мг/л, нікотинова кислота 0,5 мг/л, піроксидин-HCl 0,5 мг/л, тіамін-HCl 1 мг/л і агар Difco 0,8 % (в/о).
Стерилізація, проростання насіння і умови культивування рослин. Оптимізація процесу стерилізації насіння була проведена за відомою схемою (Банникова, 1995). Пророщення здійснювалося в чашках Петрі на агаризованому середовищі MS20. По досягненні рослинами розмірів близько 5 см обрізали корені, гіпокотиль і сім'ядолі, пагони пересаджували на середовище MSsh. Субкультивування здійснювали відсадженням одиничних бруньок (як правило, листків, що утворювалися в пазухах чи на базальній тканині), чи пагонів на свіже середовище. Частина рослин підтримувалася в укоріненому вигляді на середовищі MS, щоб постійно мати достатню кількість рослинного матеріалу. Рослини культивували при температурі 24єC і 16 годинному світловому періоді.
Методи культури тканин
Щільний калюс індукували з різних експлантів (як правило, сім'ядоль і черешків) після їх 2-3-тижневого культивування при розсіяному освітленні на середовищі MSCF. Утворення пухкого калюсу відбувалося в результаті переносу як цілих пагонів, так і окремих черешків листкових пластинок із середовищ MSRP і MSsh на середовище MS.
При культивуванні пухкого калюсу на регенераційному середовищі (MSRP) в умовах інтенсивного освітлення відбувалася його диференціація (утворення твердої зеленої тканини, іноді окремих пагонів) у 2-3-тижневий термін; в основному ж для регенерації з калюсу використовувалося середовище MSCR.
Регенерацію з різних експлантів здійснювали на середовищі MSRP відповідно до описаної методики (Банникова, 1995).
Укорінення пагонів здійснювали на середовищі MSRI. Формування коренів також спостерігалося при переносі пагонів зі збагачених гормонами середовищ (MSsh, MSRP) на безгормональне MS.
Трансформація цукрового буряка за допомогою Agrobacterium tumefaciens
Базову методику трансформації рослин, застосовану у роботі, описано раніше (Головко, 2002), проте в подальшій роботі вона зазнавала різноманітних змін.
Трансформація рослин методом бомбардування мікрочастинками золота з преципітованою ДНК
Біолістичний метод використовували для ядерної трансформації калюсу цукрового буряка, що регенерує. Принцип роботи пристрою PDS-1000/HE Biolistic ® Particle Delivery System, так само як і базова методика трансформації рослин цим пристроєм, описані в літературі (Castillo, 1994; Hartman, 1994). У процесі роботи параметри варіювали.
Гістологічний аналіз
Для гістологічних досліджень матеріал фіксували хpомацетофоpмолом (10:4:1) за С.Г.Навашиним (1951), подальшу обробку проводили за відомою цитологічною методикою (Паушева, 1970). Препарати фарбували реактивом Шиффа за Фельгеном з дофарбуванням світлим зеленим.
Методи аналізу ДНК
ДНК цукрового буряка була ізольована за допомогою набору “Dneasy” для одержання рослинної ДНК (Qiagen, Hilden, Нiмеччина). Виділена в такий спосіб ДНК використовувалася для PCR і гібридизації за Саузерном.
PCR (ланцюгова реакція полімеризації) була виконана з використанням апарата HYBAID PCR Тhermocycler з підігрівом кришки (Hybaid Ltd., Ashford, Великобританія), реактивів набору для PCR з Taq ДНК полімеразою (Qiagen, Hilden, Нiмеччина) і умов реакції рекомендованих фірмою-виробником реактивів.
Гібридизація за Саузерном здійснювалася відповідно до методики, описаної Sambrook (1989). Плазміда pCB004, що несе мутантний ген AHAS, використовувалася як матриця для одержання б 32 P-dCTP-міченого зонда за допомогою PCR, використовуючи праймери 4F і 4R. Для фрагментації рослинної ДНК використовувався фермент рестрикції BamHI. Оскільки цей фермент розрізає кодуючу послідовність мутантного гена AHAS у двох сайтах, а зонд обраний таким чином, що він гібридизується з внутрішнім фрагментом такої рестрикції, трансгенна ДНК повинна показувати сигнал, що відповідає приблизно 800 п.о.
Визначення активності GUS гена
Постановка реакції здійснювалася відповідно до запропонованої методики (Jefferson, 1987). Для гістохімічного аналізу експресії гена GUS також застосовувався метод, що дозволяє пригнічувати дію фенолоксидаз (Krens, 1996).
Визначення активності NPTII гена
Імуноферментне визначення активності гена NPTII проводили відповідно до методу, запропонованого Нейджелом та ін. (Nagel et al, 1992). Для аналізу використовували стандартний набір для детектування і кількісного визначення NPTII фірми 5 Prime - 3 Prime, Inc.
Результати досліджень та їх обговорення
Вивчення процесів калюсоутворення і ембріогенезу з експлантів цукрового буряка.
Численні літературні дані вказують на здатність цукрового буряка до калюсоутворення з різних експлантів: гіпокотиля (Jacq, 1992), сім'ядоль /котиледонів/ (Catlin, 1990), черешків (Jacq, 1992), листків (Ritchie, 1989). У своїх експериментах ми спробували використовувати запропоновані в літературі методи, адаптуючи їх у міру необхідності до використовуваних сортів. Культивування різних експлантів на середовищі MSCF, що містить 2,4_Д, як і вказувалося в літературі, приводило до утворення щільного калюсу жовтого чи світло-зеленого кольорів. Однак цей калюс виявився нездатним до регенерації рослин.
Крім процесу спонтанного органогенезу з калюсу, відзначеного у деяких лініях Міжотненського гібрида-18 (сорту Рамонський однонасінний-47 - в одиничних випадках), був також підібраний гормональний склад, що дозволяє цілеспрямовано індукувати цей процес для калюсів Міжотненського гібрида-18, сорту Рамонський однонасінний-47 і одержати регенерацію з калюсних ліній сорту Уладовський ЧС-5.
Особлива увага була приділена одержанню калюсу, здатного до ембріогенезу. Як виявилося, це явище ще більш сортоспецифічне, оскільки тільки для одного сорту, ACH199, у результаті використання відзначеної вище субкультиваційної зміни середовищ, нам удалося одержати калюс, що спонтанно утворює білу диференційовану тканину, і показати її ембріоїдний характер (рис. 1, А).
морфогенез регенераційний цукровий буряк
Рис. 1. Вторинні ембріоїди цукрового буряка і регенерація з них:
А - білий ембріоїд, що росте в пухкому калюсі;
Б - білі ембріогенні тканини, що з'являються як включення в меристеми ембріоїда, що проростає;
В - суспензійна культура вторинних ембріоїдів;
Г - регенерація з ембріоїда.
Частота ембріогенезу була невисокою: сім окремих ембріоїдів були знайдені в двох з 40 незалежних ліній калюсу. Через 1-2 тижні після переносу ембріоїдів на свіже середовище, можна було спостерігати утворення пагонів з цих тканин. Деякі з цих пагонів зберегли білі ембріогенні тканини, що проявилися як включення в меристему (рис. 1, Б). Ці білі включення були відділені вручну і поміщені в рідке середовище, що містило невеликі кількості БАП. Білі ембріогенні тканини продовжували рости і через два тижні нові білосніжні конгломерати сформувалися на поверхні старих тканин (рис. 1, В). Була проведена оптимізація умов культивування цих тканин, в результаті якої середовище MS6B, що складається з базового середовища MS для підтримки ембріоїдів (”Матеріали та методи досліджень”), сахарози 6%, БАП 0,1 мг/л і гліцину 2 мг/л, виявилося найбільш відповідним для підтримки вторинних ембріоїдів у суспензії. Підтримуючи культуру ембріогенного калюсу, можна одержати постійну високоефективну (з частотою 15-20%) регенерацію.
Щоб підібрати найбільш оптимальне середовище для проростання ембріоїдів, були перевірені середовища з декількома концентраціями БАП і ТДЗ. Останній в концентрації 0,1 мг/л був найбільш ефективний для формування адвентивних пагонів (рис. 1, Г).
Таким чином, розроблена нами система калюсоутворення і регенерації рослин у цукрового буряка дає можливість застосовувати сучасні методи генетичної інженерії з метою одержання нових високоврожайних і стійких до стресових умов сортів цукрового буряка.
Вивчення процесів органогенезу з експлантів цукрового буряка
Відомо, що певні лінії (генотипи) цукрового буряка мають здатність регенерувати рослини з окремих черешків з дуже високою частотою (Freytag, 1988). На прояв регенераційної здатності експлантів цукрового буряка крім генотипу істотно впливає склад поживних середовищ, концентрація в них регуляторів росту. Узагальнивши літературні дані і врахувавши специфіку сортів, що досліджувалися, ми зупинилися на наступній схемі регенерації, універсальної для всіх сортів, що використовувалися. Експланти (черешки, базальну тканину, гіпокотиль, листкові пластинки) поміщали на середовище MSRP і культивували при інтенсивному освітленні. Через 2-4 тижні спостерігали утворення пагонів. Основним типом регенерації було утворення бруньок на поверхні експлантів (рис. 2, А).
Рис. 2. Органогенез з експлантів цукрового буряка:
А - регенерація пагона - pегенеpанта з черешка;
Б - зони меристематичних клітин і горбики.
Процес регенерації спостерігався: 1) з центральної жилки листка, черешка при культивуванні як цілих пагонів, так і окремих експлантів на середовищах, що містять БАП (на середовищах, що містять БАП, донорна рослина повинна перенести 2-3 пасажі); 2) з меристематично активних зон основи пагона і базальної тканини при додаванні в культуральні середовища зеатину 2 мг/л і БАП 1-2 мг/л (після культивування пагонів-донорів на безгормональних середовищах); 3) з котиледонів в області примикання листкової пластинки до гіпокотиля на середовищі з БАП будь-якої концентрації.
Результати гістологічного аналізу регенерантів показали, що для черешків листків цукрового буряка, культивованих in vitro, характерний органогенез, що веде до утворення бруньок з наступним їх розвитком і утворенням листків.
Гістологічний аналіз регенерації з черешків показав, що органогенез відбувається із клітин верхніх епідермальних шарів (рис. 2, Б), що не зовсім відповідає існуючій в літературі думці, що регенерація відбувається із глибоко розташованої, так званої “меристеми, що мовчить” (D'Hаlluіn, 1992). Таким чином, імовірна можливість одержання трансформованих пагонів шляхом прямої регенерації з черешків у випадку використання різних методів введення ДНК у клітини рослин, за винятком агробактеріальної.
Агробактеріальна трансформація калюсу цукрового буряка
Хоча цукровий буряк досить чутливий до інфекції Agrobacterium (Wang, 1985; Paul, 1987; Krens, 1988), одержання трансформованих регенерантів має значні труднощі. Врахувавши помилки і використовуючи досягнення інших авторів, у своїй роботі ми спробували здійснити трансформацію цукрового буряка. Було випробувано кілька підходів до визначення концентрацій антибіотиків і гербіцидів, які пригнічують ріст калюсу цукрового буряка. На підставі отриманих даних був зроблений висновок, що оптимальні концентрації PURSUIT для селекції як калюсу, так і рослин знаходяться в межах 0,01_0,05 мкМ і залежать від генотипу цукрового буряка та умов культивування; при селекції на канаміцині можна цілком пригнітити ріст нетрансгенних твердих калюсних колоній використовуючи середовища з концентрацією 200 мг/л протягом 2-2,5 місяців; селекція pослин-pегенеpантів на середовищах з канаміцином можлива при концентраціях 200_400 мг/л.
Використовуючи описані вище методи одержання пухких і твердих калюсів, було проведено понад 100 дослідів з одержання трансгенних клітинних ліній за допомогою Agrobacterium tumefaciens і регенерації з них. В одному з експериментів, в результаті обробки експлантів Agrobacterium tumefaciens, що несе pCB001, удалося одержати одну трансгенну лінію пухкого калюсу Міжотненського гібрида-18, стійку до 150 мг/л канаміцину з позитивною активністю гена GUS.
У дослідах з одержання трансгенних твердих калюсів використовувалися штами агробактерій, що несуть конструкції з геном GUS (pCB001), а також з генами для зміни біосинтезу вуглеводів (рSPS, рINV, рS21 і рPPA) і експланти цукрового буряка сортів Уладовський ЧС-5 (№5), Рамонський однонасінний-47 (№47) та Міжотненського гібрида-18 (№18). Результати досліду наведено в таблиці 1.
Підсумки роботи з одержання трансгенного твердого калюсу можна підвести в такий спосіб:
1) Частота трансформації склала 4-7%. Позитивний контроль трансформації - колонії, отримані після трансформації агробактерією з pCB001- мають як GUS, так і NPTII позитивні активності. Лінії з іншими конструкціями мали тільки NPTII активність (таблиця 1). GUS активність вони не виявляли, скоріше за все через тканиноспецифічність промотору В33.
2) Більше всього отримано колоній - трансформантів, що несуть ген SPS. Фенотипічно вони виглядають як великі щільні утворення оранжевого, жовто-червоного, темно-зеленого і світло-зеленого кольорів.
3) Колонії, трансформовані pCB001 і рSPS, виявили здатність до коренеутворення на середовищах з ауксинами в присутності канаміцину (до 250 мг/л), при цьому корені калюсу, що несе ген SPS, мали жовтий колір і виділяли жовту субстанцію в середовище; корені pCB001 мали позитивні як GUS, так і NPTII активності, тоді як калюси, що несуть ген SPS, мали тільки NPTII активність.
4) В результаті регенерації з експлантів, що трансформувалися геном SPS, отримано найбільшу кількість життєздатних пагонів на середовищі з Km 100 мг/л, але нетрансформованих, як показав аналіз NPTII.
Таблиця 1. Результати аналізу колекції трансформованих калюсів.
|
Конструкції |
№ сорту |
Загальна кількість ліній |
GUS+лінії |
Утворили корені |
GUS + корені |
NPTII, нг/мг білка |
|
|
pCB001 |
5 47 18 |
49 12 3 |
47 12 - |
3 - - |
3 - - |
24 |
|
|
рSPS * |
5 |
51 |
- |
12 |
- |
7 (калюс) 5 (корені) |
|
|
рPPA * |
5 18 |
22 7 |
- - |
1 - |
- - |
4,8 |
|
|
рS21* |
5 |
5 |
- |
- |
- |
не визначалось |
|
|
рINV * |
5 18 |
32 1 |
- - |
- - |
- - |
не визначалось |
* - конструкції несуть GUS ген під тканиноспецифічним B33 промотором.
Агробактеріальна трансформація експлантів цукрового буряка з наступною регенерацією рослин шляхом органогенезу
Беручи до уваги, що принциповою проблемою здійснення трансформації є виділення клітин, здатних як до трансформації, так і до регенерації, нами був проведений власний скринінг здатних до трансформації експлантів різного генезису для вітчизняних сортів. В подальшому як основний матеріал були використані калюсоутворююча диференційована тканина сорту VRB і експланти базальної тканини і черешків сортів №5 і №52, що відповідало наявним методичним вказівкам (D'Hаlluіn, 1992; Lindsey, 1991).
Внаслідок застосування базової методики трансформації цукрового буряка, була проведена велика кількість дослідів з використанням штаму Agrobacterium tumefaciens, що несе pCB001, однак тільки в одному випадку виявлена позитивна активність гена GUS всередині експланту листка одного з численних регенерантів. Оптимізація процесу трансформації з використанням цього ж штаму агробактерії дозволила одержати 18 синіх секторів на трьох рослинах через 4-5 тижнів після співкультивування. Листок однієї з рослин був цілком синій, у той час як у двох інших рослин листки були частково сині. На рис. 3 видно інтенсивно пофарбовані темні сектори листка однієї з таких химерних рослин, що експресують ген GUS. Варто також відзначити, що опуклість сектора, розташованого на поверхні експланта, дає можливість припустити, що в цьому місці почала формуватися брунька.
Рис. 3. Результати гістохімічного аналізу активності в-глюкуронідази після 4 тижнів культивування регенеруючих тканин сорту VRB, оброблених агробактеріальним штамом, що несе плазміду pCB001, і селекції на середовищі MSRP, що містить неоміцин (100 мг/л).
Загальним підсумком роботи з трансформації буряка за допомогою штаму агробактерії, що несе плазміду з модельним геном GUS з наступною регенерацією шляхом органогенезу, стало одержання декількох химерних за експресією GUS гена канаміцинстійких ліній для сортів №5 і VRB. Величина частоти селекції (0,03-0,1%) виявилася на два порядки нижче від вказаних у літературних джерелах (D'Hаlluіn, 1992).
Досліди з трансформації цукрового буряка мутантним геном AHAS проводилися одночасно з дослідами з трансформації модельним вектором, що містить ген GUS. Таким чином, у ранніх дослідах використовувалася базова методика трансформації, яка описана в розділі ”Матеріали та методи досліджень”. В подальшому було проведено кілька експериментів з трансформації цукрового буряка агpобактеpією, що несе плазміду pCB004, відібрано велику кількість стійких до гербіциду PURSUIT рослин, однак усі вони виявилися не трансгенними.
У процесі оптимізації методики трансформації застосовувався цілий арсенал методів для підвищення ефективності трансформації і регенерації: вакуумне проникнення Agrobacterium tumefaciens, мацерація експлантів, збільшення ранової поверхні за допомогою маленьких скляних намистин, використання фідерного шару, використання ацетосирингону; середовища з різною концентрацією гормонів, а також різні схеми селекції після співкультивування. В результаті після співкультивування експлантів цукрового буряка сортів VRB і ACH-199 із супервірулентним штамом Agrobacterium tumefaciens EHA101, що несе pCB004, були отримані 15 регенерантів, що ростуть на середовищі з 50 нМ PURSUIT. Рослини були проаналізовані за допомогою PCR і три рослини (сорт VRB, лінії №5 і №6; сорт ACH-199, лінія №22) дали позитивний сигнал у вигляді смуги 300 п.о. (рис. 4). ДНК цих ліній також була проаналізована гібридизацією за Саузерном (рис. 5) і одна з ліній (№5) показала позитивний результат.
Рис. 4. PCR аналіз імовірно трансгенних рослин цукрового буряка на предмет інтеграції в їх геном мутантного гена АНАs:
К - контрольна (нетрансгенна) рослина;
+/- - позитивний контроль реакції (використовували плазміду pCB004).
Рис. 5. Аналіз за Саузерном ДНК імовірно трансгенних рослин цукрового буряка на предмет інтеграції в їх геном мутантного гена АНАS:
К - контрольна (нетрансгенна) рослина;
+/- - позитивний контроль реакції (використовували плазміду pCB004).
Всі три лінії, що показали позитивні за PCR і Саузерном результати, були розміщені в середовищі для коренеутворення MSRI і ті, котрі сформували корені, були пересаджені в ґрунт для наступних досліджень і одержання насіння. Щоб одержати насіння, коренеплоди всіх PURSUIT-стійких рослин, що ростуть у ґрунті, були піддані верналізації при +4°C . Отримане насіння використовувалося в дослідах по обприскуванню PURSUIT (15, 30 і 60 г/га, що відповідає 0,3; 0,5 та 1_кратній дозі, що рекомендується для польових обробок, відповідно), однак паростки виявилися не стійкими. Повторний аналіз за Саузерном ДНК рослин лінії №5, отриманих з насіння, не дав позитивного сигналу. Можливо, трансгенні лінії виявилися мозаїчними з низьким відсотком трансгена, що призвело до втрати трансгенних тканин або під час субкультивування рослин, або під час утворення гамет (тобто була відсутня трансмісія трансгена в першому поколінні). Химерністю отриманих рослин також можна пояснити і низьку їхню стійкість до гербіцидів.
Трансформація експлантів цукрового буряка методом бомбардування мікрочастинками золота.
Відомо, що гармата моделі PDS-1000 була успішно застосована для одержання транзієнтної експресії при обстрілі клітинної суспензії (Ingersoll, 1996), а також клітин продихів (Hall, 1997) цукрового буряка. В нашій роботі ми використовували інші експланти - сегменти листків і калюс. Після обстрілу експланти поміщали на середовища для регенерації. Через три дні експланти були проаналізовані. Для аналізу використовували модифікований метод гістохімічного аналізу GUS активності, що дозволяє пригнічувати дію фенолоксидаз. Модифікований метод дозволив провести аналіз експлантів цукрового буряка. В результаті в двох калюсних колоніях було виявлено зафарбовані зони. На рис. 6 представлено одну з них (сорт ACH-199). Колом позначений сектор, що зафарбувався в блакитний колір. Фарбування групи клітин характерне для транзієнтної експресії після бомбардування експлантів мікрочастинками золота.
Рис. 6. Результати гістохімічного аналізу активності глюкуронідази через три дні після бомбардування пухкого калюсу сорту ACH-199 плазмідою pCB002.
Обстрілювання тканин частками з нанесеною плазмідою, що містить ген глюкуронідази, з наступним гістохімічним аналізом проводилося з метою оптимізації параметрів трансформації для подальшого використання їх з метою одержання стабільних трансформантів. Позитивні результати цих експерименттів є практичною базою для використання регенеруючого ембріогеного калюсу для прямої трансформації. Відпрацьовані параметри і методи трансформації з використанням гармати можуть бути застосовані для практичних цілей одержання рослин цукрового буряка зі зміненим метаболізмом - стійких до гербіцидів чи несприятливих умов навколишнього середовища.
ВИСНОВКИ
Відпрацьовано системи індукції калюсоутворення і регенерації у рослин цукрового буряка (Beta vulgaris L.) з різних експлантів і калюсу, підібрано оптимальний склад середовищ для масового одержання регенерантів.
Гістологічним аналізом встановлено, що регенераційні процеси в черешках листків цукрового буряка в культурі in vitro проходять по типу органогенезу.
Запропоновано ефективний метод регенерації рослин з калюсу шляхом соматичного ембріогенезу. Вперше отримано вторинні ембріоїди цукрового буряка та оптимізовано умови підтримки їх у культурі in vitro без втрати регенераційної активності і здатності коренеутворення з регенерантів.
Розроблено умови і підібрано методи генетичної трансформації буряка за допомогою Agrobacterium tumefaciens і бомбардування мікрочастинками золота з преципітованою ДНК.
Вперше отримані трансгенні калюсні лінії буряка зі зміненим біосинтезом вуглеводів.
Виявлено стабільну експресію гена GUS у калюсі і листках буряка при використанні A. tumefaciens, а також транзієнтну експресію цього гена, внесеного у клітини калюсу шляхом бомбардування експлантів мікрочастинками золота.
За допомогою A. tumefaciens в рослини цукрового буряка перенесено ген стійкості до гербіциду PURSUIT. Експресію цього гена виявлено у трьох ліній цукрового буряка на основі позитивного сигналу при аналізі PCR і гібридизації за Саузерном.
СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Гирич А.М., Череп Н.Н., Скаржинская М.В., Головко А.Э., Глеба Ю.Ю. Генетическая трансформация рапса Brassica napus с помощью Agrobacterium tumefaciens // Цитология и генетика.- 1995.- №2.- С. 20-25.
2. Банникова М.А., Головко А.Э., Хведыныч О. А., Кучук Н.В. Регенерация растений сахарной свеклы. Гистологическое изучение процессов регенерации // Цитология и генетика. - 1995.- №6.- С. 14-22.
3. Golovko A. Genetic variability of somatic embryogenesis in tissue cultures of sugar beet breeding lines // Цитология и генетика.- 2001.- №6.- С. 10-17.
4. Головко А.Э., Погребняк Н.Я., Банникова М.А. Особенности культивирования in vitro и трансформации сахарной свеклы // Физиология и биохимия культурных растений.- 2002.- 34, №5.- С. 394-405.
5. Golovko Andrei. Methods for somatic embryo formation and plant regeneration of Beta vulgaris. Patent US 6,555,375 B1. Int. Cl. C12N 5/00, C12N 5/02. Filled 14.06.2000 (Issued to American Cyanamid by United States Patent and Trademark Office on 29.04.2003).
6. Банникова М.А., Головко А.Э., Кучук Н.В., Глеба Ю.Ю. Разработка методов генетической трансформации у коммерческих сортов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) // Сборник тезисов II Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", 1993.- Пущино, 1993.- С. 11(245).
7. Bannikova M.A., Golovko A.E., Khvedynich O.A., Kuchuk N.V., Gleba Y.Y. In vitro organogenesis and protoplast cultivation of sugar beet (Beta vulgaris L.) // Abstracts of IVth European Cell Biology Congress Prague, June 26th - July 1st 1994. - Prague, 1994. - P. 546.
8. Merkulov S.M., Pasternak T.P., Golovko A.E., Gleba Y.Y. Agrobacterium - mediated transformation of pear cultivars (Pyrus communis L.) // Abstracts of IVth European Cell Biology Congress Prague, June 26th - July 1st 1994.- Prague, 1994. - P. 542.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Господарське значення, ботанічна характеристика та біологічні особливості буряка цукрового; особливості вирощування: технологія, селекція, живлення, система захисту посівів від бур'янів, хвороб та шкідників. Особливості насінництва гібридів буряка.
контрольная работа [56,5 K], добавлен 25.03.2013Аналіз технології організації посіву цукрового буряка. Вибір оптимального складу оптимального складу машинно-тракторного парку. Розрахунок техніко-економічних показників роботи посівного агрегату. Розрахунок собівартості сільськогосподарської продукції.
дипломная работа [173,6 K], добавлен 09.08.2015Цукровий буряк як найважливіша технічна культура, що дає сировину для цукрової промисловості. Досягнуті успіхи у виробництві цукру. Кормова цінність цукрового буряка. Перспективи розвитку даної промисловості. Динаміка посівних площ під цукровим буряком.
реферат [22,3 K], добавлен 15.06.2009Овочівництво як галузь сільського господарства. Роль овочів у харчуванні людини. Технологія вирощування столового буряка. Зберігання столового буряка. Технологія переробки столового буряка. Техніка безпеки при вирощуванні й переробці столового буряка.
реферат [22,5 K], добавлен 18.01.2008Загальна характеристика та методика вирощування цукрового буряку, підвищення його урожайності. Основний та весняний обробіток ґрунту. Порядок підготовки насіння та його сорти. Шкідники та хвороби цукрового буряку, найпоширеніші шляхи боротьби з ними.
реферат [34,1 K], добавлен 07.10.2009Морфо-біологічні особливості буряка столового. Анатомічна будова і забарвлення коренеплоду цукрових буряків. Вирощування, насіння, ділянка під ревінь. Вимоги перцю овочевого до вологи та тепла. Перець як одне із найбільш вимогливих рослин до температури.
контрольная работа [28,9 K], добавлен 26.07.2011Технологія вирощування цукрового буряку. Основний обробіток ґрунту. Вибір способу догляду за посівами. Аналіз конструкцій сільськогосподарських машин. Обґрунтування кількісного і структурного складу механізованої ланки для вирощування цукрового буряку.
дипломная работа [677,5 K], добавлен 21.02.2013Ботанічна характеристика та біологічні особливості ячменю ярого, історія селекції та сучасний стан в Україні. Вивчення сортів ячменю, що вирощуються в господарстві. Дослідження росту і розвитку рослин селекції МІП. Оцінка ґрунтово-кліматичних умов.
курсовая работа [131,4 K], добавлен 16.07.2015Буряк як цінна сільськогосподарська культура. Вивчення його генетики. Удосконалювання технології вирощування рослини. Систематика і походження кормових, столових та цукрових буряків. Ефективний метод їх одержання та розмноження. Забарвлення коренеплоду.
презентация [257,9 K], добавлен 08.09.2014- Становлення селекції та насінництва цукрових буряків в Україні (друга половина ХІХ – початок ХХ ст.)
Критичне осмислення наукової спадщини як умова поступу аграрного сектору економіки. Напрямки та перспективи становлення та розвитку даної галузі. Насінництво та селекція цукрових буряків в Російській імперії, їх досягнення. Експорт маточного насіння.
статья [19,0 K], добавлен 14.08.2017 Морфо-біологічні особливості нуту. Районовані сорти цукрового сорго та їх характеристика. Стан сівозмін господарства. Структура посівних площ і врожайність сільськогосподарських культур. Підготовка насіння до сівби. Розрахунок дійсно можливого врожаю.
курсовая работа [89,9 K], добавлен 28.04.2015Класифікація походження і біологічні особливості капусти. Сучасний стан і досягнення селекції в Україні і за кордоном. Характер ураження капусти білоголової килою та біологія збудника. Завдання і методи селекції. Оцінювання і добір гібридних популяцій.
курсовая работа [54,4 K], добавлен 16.01.2008Цілі та етапи трансформації рослин. Основні методи та напрями створення генетично модифікованих сільськогосподарських культур. Основні етапи агробактеріальної трансформації рослин. Гени-маркери для відбору трансформантів та регенерація трансформантів.
контрольная работа [3,3 M], добавлен 25.10.2013Опис практичного досвіду селекції молочного скотарства. Аналіз основних показників ознак молочної продуктивності корів голштинської породи залежно від типу інтенсивності формування організму. Вплив прискорених процесів під час росту на продуктивність.
статья [25,9 K], добавлен 07.11.2017Технологія вирощування і селекції озимої пшениці. Стан і перспектива виробництва продукції сільськогосподарської культури, використання її сортових ресурсів. Характеристика зовнішніх умов вирощування, основні напрямки селекції нових сортів культури.
курсовая работа [751,7 K], добавлен 29.11.2010Продуктивність цукрових буряків залежно від застосування різних видів органічних добрив. Ботанічна і біологічна характеристика цукрових буряків, агротехніка їх вирощування. Технологічні якості коренеплодів буряків у залежності від застосування добрив.
дипломная работа [66,4 K], добавлен 16.01.2008Напрямки селекційної роботи з культурами сільськогосподарських рослин. Практичне використання ефекту гетерозису в селекції кукурудзи. Типи гібридів у виробництві. Досягнення селекції, проблеми та перспективи. Особливості насінництва гідридів кукурудзи.
курсовая работа [73,7 K], добавлен 29.11.2011Народно-господарче значення соняшника. Адаптивний потенціал – основа технології селекції ліній і гібридів. Розрахунок коефіцієнта кореляції. Результати екологічного сортовипробування гібридів, сортів насіння, материнських та батьківських ліній соняшнику.
курсовая работа [73,1 K], добавлен 17.11.2014Проблеми вирощування продовольчого зерна, особливості адаптації сортів пшениці озимої до зміни агрокліматичних умов півдня України. Фенологічні спостереження за розвитком сортів. Економічна та біоенергетична ефективність вирощування насіннєвого матеріалу.
дипломная работа [725,6 K], добавлен 02.06.2015Особливості адаптації сортів пшениці озимої до зміни агрокліматичних умов України. Фенологічні спостереження за розвитком сортів. Дослідження сортової мінливості елементів структури врожаю. Мінливість польової схожості і зимостійкості пшениці озимої.
дипломная работа [905,5 K], добавлен 28.10.2015
