Удосконалення способів кріоконсервації сперми бугаїв шляхом визначення оптимального співвідношення компонентів розріджувачів

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ РОЗВЕДЕННЯ І ГЕНЕТИКИ ТВАРИН

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата

сільськогосподарських наук

УДОСКОНАЛЕННЯ СПОСОБІВ КРІОКОНСЕРВАЦІЇ СПЕРМИ БУГАЇВ ШЛЯХОМ ВИЗНАЧЕННЯ ОПТИМАЛЬНОГО СПІВВІДНОШЕННЯ КОМПОНЕНТІВ РОЗРІДЖУВАЧІВ

Гунтік Людмила Михайлівна

Чубинське Київської області - 2003

Анотації

Гунтік Л.М. Удосконалення способів кріоконсервації сперми бугаїв шляхом визначення оптимального співвідношення компонентів розріджувачів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 06.02.01 - розведення та селекція тварин. - Інститут розведення і генетики тварин УААН, Чубинське Київської області, 2003.

Дисертаційна робота присвячена оптимізації складу розріджувачів для кріоконсервації сперми бугаїв на основі визначення оптимального співвідношення вуглеводів і солей (а саме, лактози і цитрату натрію) в їх складі при певному вмісті гліцерину.

Викладено методику складання рецептів розріджувачів, а також розроблені кращі розріджувачі за цією методикою. Для їх використання підібрані оптимальні режими обробки сперми: спосіб розрідження, період еквілібрації, температура заморожування і відтаювання.

На цій основі запропоновано удосконалений спосіб заморожування сперми бугаїв у необлицьованих гранулах, який дає можливість підвищити на 10-30% якісні показники заморожено-розмороженої сперми та запліднюючу здатність сперміїв, простий у використанні, не потребує додаткових реактивів та обладнання.

Ключові слова: кріоконсервація, спермії, нативна, заморожено-відтаяна сперма, осмоляльність, розріджувачі, рухливість, виживаність, запліднююча здатність.

Гунтик Л.М. Усовершенствование способов криоконсервации спермы быков путем определения оптимального соотношения компонентов разбавителей. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 06.02.01. - разведение и селекция животных. - Институт разведения и генетики животных УААН, с. Чубинское Киевской области, 2003.

Диссертационная работа посвящена оптимизации состава разбавителей для криоконсервации спермы быков на основе определения оптимального соотношения углеводов и солей (а именно, лактозы и цитрата натрия) в их составе при определенном содержании глицерина.

Изложена методика составления рецептов разбавителей, а также разработаны лучшие разбавители по этой методике.

В качестве исходного был принят усовершенствованный лактозо-глицерино-желточный разбавитель (УЛГЖ), предложенный В.М. Кушниром (1996). Установлено, что он имеет значительные преимущества над лактозо-глицерино-желточным разбавителем (ЛГЖ), рекомендованным действующей инструкцией (1981). Разработан новый, лактозо-цитратно-глицерино-желточный разбавитель (ЛЦГЖ), который имеет такую же общую осмоляльную концентрацию растворенных веществ, как УЛГЖ (1372 мосм/л), такое ж содержание глицерина и желтка, но отличается от последнего наличием цитрата натрия и определенным процентным соотношением между лактозой и цитратом натрия - 90/10. Для создания одинаковой по концентрации растворенных веществ окружающей спермии среды при всех кратностях разбавления спермы к ЛЦГЖ опытным путем был подобран корректирующий лактозо-желточный разбавитель (ЛЖ), изотонический по отношению к сперме (323 мосм/л). В работе приведен состав обоих разбавителей, но количество компонентов на 100 мл воды не является постоянным, рецепты надо корректировать для каждой конкретной партии препаратов.

Для использования новых разбавителей подобраны оптимальные режимы обработки спермы: разбавления (корректирующим ЛЖ до получения 60-90 млн. спермиев в дозе при температуре +32-35?С, основным ЛЦГЖ до получения 30 млн. спермиев в дозе при температуре +2-5?С), эквилибрации (5-6 часов при +2-5?С), замораживания в открытых гранулах объемом 0,2 мл (при -130?С) и оттаивания (при +38-40?С в водяном термостате).

На этой основе предложен усовершенствованный способ замораживания спермы быков в необлицованных гранулах, эффективность которого доказана путем сравнения его с апробированным на практике.

Установлено, что обработка нашим способом дала возможность повысить качественные показатели заморожено-розмороженной спермы, а именно, подвижность спермиев повысилась на 0,34-0,49 балла (11,6-13,3 %), выживаемость - на 1,54-1,66 часа (32,5-34,1%), абсолютный показатель выживаемости (АПВ) - на 4,34-4,75 условной единицы (34,1-39,6 %). Разница статистически достоверна (Р < 0,001).

Доказано, что морфологические показатели спермы, замороженной по инструкции и предложенным способом, тоже отличаются в пользу последнего: живых спермиев в опытных образцах по сравнению с контролем больше на 7,9 %, патологических, наоборот, меньше на 5,4 % (Р < 0,001).

Сравнение оплодотворяющей способности показало, что оплодотворяемость маток после первого осеменения спермой, замороженной в рекомендованных разбавителях и усовершенствованным способом, была на 20,3% выше, чем маток, осемененных спермой, замороженной по инструкции (70,5 против 50,2). Количество приплода после первого осеменения было выше на 16,3 % (57,4 против 41,1).

Внедрение описанного выше способа криоконсервации спермы быков в производство дало возможность уменьшить количество осеменений на отел (с 4,4 до 3,2), увеличить выход телят (с 86 до 95 на 100 коров), уменьшить продолжительность сервис-периода (с 120 до 94 дней). Экономическая эффективность внедрения составила 12602 грн. на 100 коров.

Ключевые слова: криоконсервация, сперматозоиды, свежеполученная, заморожено-оттаянная сперма, осмоляльность, разбавители, подвижность, выживаемость, оплодотворяющая способность.

Guntik L.M. The Improvement of bull semen cryopreservation methods by determining optimal correlation between diluent components. - Мanuscript.

Thesis for a candidate's degree ( Agr. Sc.) speciality 06.02.01--animal breeding and selection.--UAAS Institute of animal breeding and genetics, Chubinske, Kyiv region, 2003.

The thesis is devoted to optimizing the composition of diluents for bull semen cryopreservation.

The thesis represents a technique for making up prescriptions of diluents, as well as the best diluents composed according to this technique and methods of their use.

The thesis also offers an improved method for freezing bull semen in non-dressed pellets. This method is simple in use, requires no additional chemical components and equipment and increases qualitative indices frozen and thawed semen by 10-30 %.

Key words: cryopreservation, spermatozoon, native, frozen-thawed semen, osmolality, diluents, motility, survival, fertility ability.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Серед багатьох факторів, що забезпечують інтенсивне відтворення поголів`я великої рогатої худоби, важлива роль належить якості сперми, застосуванню досконалих розріджувачів, які сприяють збереженню життєздатності сперміїв після їх технологічної обробки.

Для розбавлення сперми бугаїв і її наступного заморожування у гранулах і соломинках на більшості спеціалізованих підприємств України та інших країн СНД з 1968 року і до цього часу використовують лактозо-гліцерино-жовтковий розріджувач (ЛГЖ). Із багатьох спеціальних літературних джерел відомо, що при використанні цього розріджувача значна частина заморожено-розмороженої сперми має невисоку якість (Н.И. Мунтаниолов, В.В. Николаев, 1983; М.Г. Ковалев, Т.В. Цеханович, Г.М. Дробышевская, 1985; А.П. Кругляк, 1986). При обробці кращих за рухливістю і концентрацією сперміїв еякулятів отримують гіршу якість сперми після заморожування-розморожування (В.М. Кушнір, 1995; В.М. Кушнір, К.І. Пасічна, Л.М. Гунтік, 1997).

Тому давно вже виникла необхідність покращити якість заморожено-розмороженої сперми бугаїв у гранулах шляхом використання більш ефективних розріджувачів сперми.

Одним із таких шляхів є врахування осмоляльної концентрації середовища, що утворюється після розбавлення еякулятів розріджувачами з гліцерином і співвідношення в ньому осмотично активних речовин (J. Lovelock, 1953, 1957; І.В. Смирнов, 1951-1975; Ф.І. Осташко, 1963-1980; П. Пакенас, 1972, 1993).

Крок у цьому напрямку зроблений В.М. Кушніром (1974, 1995). Він теоретично обґрунтував і експериментально визначив певне співвідношення між кількістю гліцерину в складі розріджувача, з одного боку, і кількістю інших осмотично активних речовин, з другого боку. На основі цього були запропоновані нові, досить ефективні, розріджувачі і способи розрідження еякулятів. Однак не визначались оптимальні співвідношення вуглеводів і солей в складі розріджувачів при певному вмісті в них гліцерину, в зв`язку з чим тема даної роботи є актуальною.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у відділі відтворення тварин Інституту розведення і генетики тварин Української академії аграрних наук за завданням “Розробити на основі осмотично-дифузійної теорії розріджувачі і способи кріоконсервації сперми бугаїв”, що входило до теми “Вдосконалити і впровадити системи застосування молекулярно-генетичних, біохімічних, фізіологічних і біотехнологічних методів в селекції сільськогосподарських тварин за 1996-2000 роки” (№ держреєстрації 0196U016325).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було удосконалити спосіб кріоконсервації сперми бугаїв у відкритих гранулах шляхом розроблення нового лактозо-цитратно-гліцерино-жовткового розріджувача (ЛЦГЖ) і на цій основі досягти поліпшення якісних показників заморожено-відтаяної сперми та запліднюючої здатності сперміїв.

Для досягнення поставленої мети ставились такі завдання:

порівняти якісні показники заморожено-розмороженої сперми при використанні ЛГЖ і УЛГЖ (удосконаленого ЛГЖ);

розробити новий ЛЦГЖ шляхом встановлення оптимального співвідношення для життєздатності сперміїв лактози і цитрату натрію;

підібрати для розробленого нового розріджувача кращий коректуючий розріджувач;

визначити оптимальні режими розрідження, еквілібрації, заморожування і розморожування сперми;

дослідити якісні показники заморожено-розмороженої сперми за рекомендованим і апробованим способами її обробки;

впровадити рекомендований спосіб обробки сперми у виробництво.

Об'єкт дослідження - сперма бугаїв-плідників, розбавлена і заморожено-розморожена, розріджувачі і їх компоненти, прийоми обробки сперми (спосіб розрідження, тривалість еквілібрації, температура заморожування і розморожування).

Предмет дослідження - співвідношення лактози і цитрату натрію в складі розріджувачів та його вплив на якість заморожено-розмороженої сперми.

Методи дослідження: фізіологічні - визначення об`єму еякуляту, концентрації сперміїв в 1 мл, рухливості і виживаності сперміїв; морфологічні - підрахунок живих і мертвих сперміїв, нормальних і патологічних; біохімічні - визначення осмоляльної концентрації та осмотичного тиску розріджувачів і розчинів їх компонентів; технологічні - визначення оптимальних режимів обробки сперми; зоотехнічні - оцінка запліднюючої здатності сперміїв за запліднюваністю маток після першого осіменіння і кількістю одержаного приплоду; біометричні - визначення середніх величин, їх похибок, коефіцієнтів варіації, критеріїв вірогідності; економічні - економічна оцінка результатів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблений новий, ефективний спосіб кріоконсервації сперми бугаїв у відкритих гранулах.

Спосіб передбачає застосування двох розріджувачів: основного ЛЦГЖ і коректуючого ЛЖ. Розбавляючи розробленими розріджувачами різні за концентрацією сперміїв еякуляти, вперше одночасно одержують в дозі необхідну кількість рухливих сперміїв і створюють для них однакове за концентрацією і оптимальне за співвідношенням осмотично активних речовин оточуюче середовище.

Для використання розріджувачів визначені кращі режими розбавлення, еквілібрації, заморожування і відтаювання сперми.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлено, що при використанні розробленого способу кріоконсервації рухливість заморожено-розмороженої сперми вища в порівнянні з контролем на 11,6-13,3%, виживаність - на 32,5-34,1%, а запліднююча здатність - на 16,3-20,3%.

Впровадження результатів наукових досліджень здійснюється з 2002 року на масиві тварин чорно-рябої молочної худоби у господарствах Новоград-Волинського району Житомирської області (акт впровадження від 01 квітня 2003 року). Економічний ефект від впровадження розробки становить 12602 гривні в рік на 100 корів.

Методика оптимізації розріджувачів може стати основою для удосконалення існуючих технологій кріоконсервації сперми.

Особистий внесок здобувача. Добір і аналіз даних літератури, експериментальні дослідження, статистична обробка даних, їх опис, аналіз та теоретичне обґрунтування виконані автором особисто. Вибір напряму досліджень та методики проведений разом з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Одержані в експериментах наукові матеріали доповідалися і обговорювалися на щорічних засіданнях відділу відтворення тварин і аспірантських сесіях Інституту розведення і генетики тварин УААН (1997-2000), на науково-практичних конференціях професорсько-викладацького складу зооінженерного факультету та факультету ветеринарної медицини ДАУ (м. Житомир, 1998-2001), на конференціях: “Біотехнологічні, селекційні та організаційні методи відтворення, зберігання і використання генофонду тварин” (Київ, 1997); “Проблеми виробництва екологічно чистої сільськогосподарської продукції на межі 3-го тисячоліття” (Житомир, 2000); “Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні” (Київ, 2002); на розширеному засіданні лабораторій відділення розведення молочної худоби та відділу відтворення тварин Інституту розведення і генетики тварин УААН (2003).

Публікації. Результати експериментальних досліджень опубліковані у 4 статтях, що вийшли у збірниках наукових праць.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків та пропозицій виробництву, списку використаних джерел наукової літератури. Робота викладена на 132 сторінках машинописного тексту, містить 1 рисунок, 26 таблиць. Список використаних літературних джерел складається з 245 найменувань, у тому числі 40 іноземних.

2. Загальна методика і основні методи досліджень

Експериментальна частина роботи проведена на трьох племпідприємствах України: ВАТ “Коростенське агроплемоб'єднання”, ВАТ “Новоград-Волинське агроплемоб'єднання”, ВАТ “Лубенське племпідприємство”.

Для дослідів використані еякуляти 40 бугаїв молочних і м'ясних порід: голштинської, симентальської, поліської м'ясної, української червоно-рябої молочної, української чорно-рябої молочної.

Для розробки рецептів розріджувачів використали методику зустрічних рядів (В.К. Милованов, 1962), дещо змінену нами. Адже методика ця придатна тільки для ізотонічних розчинів і для зберігання сперми при 2-5?С.

До складу ж розріджувачів для заморожування сперми входить ще проникаючий в клітину кріопротектор - гліцерин. Тому ці розріджувачі повинні бути гіпертонічними навіть без врахування концентрації кріопротектора.

Спочатку для розріджувачів підбирали концентрацію осмотично активних речовин близьку до такої апробованого розріджувача. У нашому випадку прототипом служив удосконалений В.М. Кушніром ЛГЖ (УЛГЖ), дозволений до впровадження у виробництво НТР Міністерства сільського господарства і продовольства України 18 грудня 1996 року (протокол № 5) і впроваджений на ВАТ Коростенського і Лубенського агроплемоб'єднань.

При постійному вмісті гліцерину, сануючих препаратів і жовтка підбирали концентрацію лактози і цитрату натрію методом арифметичних зустрічних рядів з різним співвідношенням цих компонентів з інтервалом 25%:

При цьому отримали 5 розріджувачів і шляхом біоконтролю при розбавленнях сперми в 2, 3, 4, 8, 16, 32, і 64 рази за показниками рухливості і виживаності сперміїв вибрали два кращі з них. Ними виявились два перших розріджувачі з процентним співвідношенням лактоза/цитрат натрію 0/100 і 25/75.

Основний розріджувач використовували з первинним коректуючим розріджувачем, який теж підбирався дослідним шляхом.

Кількість розріджувачів визначали за формулами В. М. Кушніра (1996):

;

;

де О_ОР- об'єм основного розріджувача, мл;

О_Е - об'єм еякуляту, мл;

К - концентрація сперміїв в еякуляті, млрд./мл; Р - рухливість сперміїв, бали;

О_Д - об'єм дози, мл;

Р_О- оптимальна кратність розбавлення сперми основним розріджувачем;

1,10 - постійні величини;

Н - необхідна кількість рухливих сперміїв в дозі до заморожування, млрд.;

О_КР - об'єм коректуючого розріджувача.

Осмоляльну концентрацію розчинів речовин, які використовувались для приготування розріджувачів, визначали електричним напівпровідниковим мікрокріоосмометром.

Об`єм еякуляту, концентрацію сперміїв в 1 мл, їх рухливість, співвідношення нормальних і патологічних форм сперміїв визначали згідно з ГОСТом 20909.3-6-75 та ДСТУ 3535-97.

Оцінену і визнану придатною до обробки нативну сперму ділили на частини і піддавали обробці. Розбавляли, охолоджували, еквілібрували, заморожували і розморожували контрольні зразки за чинною інструкцією (1981), а дослідні - за встановленими автором цієї роботи параметрами.

Розморожену сперму оцінювали за рухливістю, виживаністю і абсолютним показником виживаності (АПВ) згідно з ГОСТом 27777-88.

Запліднюючу здатність розмороженої сперми визначали шляхом осіменіння телиць і корів в першу охоту після отелення ректальним дослідженням через 60-90 днів і за отеленнями.

Для обробки результатів дослідів використаний варіаційно-статистичний метод (Н.А. Плохинский, 1969; Е.К. Меркурьева, 1970; Н.Г. Балашов, 1980).

Економічна оцінка одержаних результатів здійснена за методикою О.С. Мітюкова, З.І. Екселєвої (1988) та В.І. Костенка (1996).

Розроблення нових розріджувачів для кріоконсервації сперми бугаїв

Розроблення основного ЛЦГЖ-розріджувача починалось з того, що для нього підбирали концентрацію лактози і цитрату натрію, рівну концентрації лактози в УЛГЖ. Склад УЛГЖ: вода дистильована - 100 мл, лактоза - 12,5 г, жовток - 20 мл, гліцерин - 6,65 мл, спермосан - 50 тис. од. Його осмоляльна концентрація - 1372 мосм/л, осмотичний тиск - 30,7 атм.

Виробнича перевірка на ВАТ “Коростенське агроплемоб'єднання” показала, що УЛГЖ має значні переваги над ЛГЖ, рекомендованим чинною інструкцією.

УЛГЖ взагалі не містить солей. В ЛЦГЖ ми ввели цитрат натрію в різних співвідношеннях, не змінюючи загальну осмоляльну концентрацію розчинених речовин, кількість гліцерину, жовтка і сануючих препаратів.

У процесі роботи виявилось, що різні партії лактози, цитрату натрію та гліцерину дещо відрізняються між собою за своїми осмоляльними характеристиками. Якщо, наприклад, розчинити 12,5 г лактози, випущеної різними заводами, в 100 мл дистильованої води, то осмотичний тиск розчинів буде коливатись в межах 8,0-8,6 атм. Це відбувається основним чином внаслідок втрати речовинами води в процесі зберігання або, навпаки, поглинання її з повітря. Тому в подальшому для приготування розріджувачів використовували тільки перевірені компоненти.

Результати першої серії дослідів з визначення кращих розріджувачів для сперми бугаїв представлені в таблиці 1. Вони показали, що кращими є розріджувачі №1 і №2 з співвідношенням лактоза/цитрат натрію 100/0 і 75/25. Сперма, розбавлена ними, при розрідженні в 2-3 рази мала рухливість 3,6-4,1 бала, виживаність - 4,1 - 4,4 години, АПВ - 11,0 - 12,9 умовної одиниці.

Краща кратність розбавлення - в 3 рази, хоча різниця між якісними показниками сперми при розрідженні в 2 і 3 рази незначна. Із збільшенням кратності розрідження якісні показники заморожено-розмороженої сперми знижувались.

Якість сперми при використанні розріджувачів №1 і №2 не має достовірної різниці за показниками рухливості, виживаності і АПВ. Проте ці два розріджувачі достовірно кращі за перерахованими показниками від усіх інших (Р<0,001…0,05). При трикратному розрідженні різниця за рухливістю склала від 0,7 до 1,7 бала, за виживаністю - від 0,7 до 1,7 години, за АПВ - від 3,6 до 6,2 умовної одиниці.

Результати другої серії дослідів з визначення оптимального розріджувача для сперми бугаїв представлені в таблиці 2. Вони свідчать, що кращими є перші чотири розріджувачі з перевагою розріджувача за № 3 з співвідношенням лактоза/цитрат натрію 90/10 %, оптимальне розбавлення - в 2-3 рази, з незначною перевагою трикратного. Рухливість сперміїв в заморожено-розмороженій спермі була практично однаковою при застосуванні розріджувачів №1, №2, №3, №4 і становила 3,8-3,9 бала. Виживаність і АПВ були кращими при застосуванні розріджувача №3 і склали при розбавленні в 3 рази відповідно 5,700,15 години та 14,80,90 умовної одиниці. Причому за виживаністю розріджувач №3 був достовірно кращий від розріджувачів №1, №5 і №6 (Р<0,001…0,05).

2. Середні якісні показники заморожено-розмороженої сперми бугаїв при використанні розріджувачів №1, №2, №3, №4, №5, №6, Mm (n = 10)

Оптимальним співвідношенням лактоза / цитрат натрію в складі ЛЦГЖ є 90/10 %. Тому для наступних досліджень був вибраний розріджувач № 3. Його склад: лактоза - 11,25 г, натрій лимоннокислий тризаміщений 5,5-водний - 0,37 г, гліцерин - 6,65 мл, жовток - 20 мл, спермосан - 50 тис.од., вода дистильована - 100 мл. Оптимум розбавлення - в 2-3 рази.

Результати наших досліджень не узгоджуються з висновками Н.Г. Балашова і М.Є Євсюкова (1981), за їх даними солі в складі розріджувача (цитрат натрію і хлорид натрію) негативно впливають на виживаність і рухливість сперміїв після їх заморожування.

Для отримання постійної і оптимальної осмоляльної концентрації розчинених речовин в розрідженій спермі при всіх кратностях розрідження еякулятів основний розріджувач (ЛЦГЖ) використовували з декількома первинними або коректуючими розріджувачами: лактозо-жовтковим (ЛЖ) і лактозо-цитратно-жовтковим (ЛЦЖ). Ці розріджувачі ізотонічні стосовно сперми, їх осмоляльна концентрація становила 323 мосм/л. Для того, щоб отримати в дозі (0,2 мл) заморожено-розмороженої сперми 15 млн. рухливих сперміїв, треба розрідити сперму до отримання 30 млн. рухливих сперміїв; для того, щоб розбавити сперму основним розріджувачем в 2-3 рази (до отримання в дозі 30 млн. рухливих сперміїв), коректуючим розріджувачем її треба розбавити до отримання 60-90 млн. рухливих сперміїв.

Встановлено, що кращим із первинних розріджувачів є ЛЖ як при дво-, так і при трикратному розрідженні еякулятів. При його поєднанні з основним ЛЦГЖ рухливість становила 3,7-3,8 бала, виживаність - 5,3-5,5 години, АПВ - 13,7-14,1 умовної одиниці (табл.3). Різниця за рухливістю склала 0,2 бала (Р>0,05), виживаністю - 0,6-0,8 години (Р<0,05), АПВ - 1,4-1,8 умовної одиниці (Р>0,05).

3. Середні якісні показники заморожено-розмороженої сперми при використанні розріджувача №3 в комплексі з двома коректуючими розріджувачами (n = 10)

Склад ЛЖ-розріджувача: лактоза - 9,6 г, жовток - 20 мл, спермосан - 50 тис.од., вода дистильована - 100 мл.

Визначення оптимальних режимів обробки сперми при використанні розроблених розріджувачів

При розбавленні сперми одним ЛГЖ в залежності від кратності розрідження спермії оточує різне за концентрацією і за співвідношенням між гліцерином та іншими осмотично активними речовинами середовище (В.М. Кушнір, 1996). Тому, власне, на практиці неможливо для всієї множини концентрацій підібрати оптимальні режими обробки. Але це можливо і необхідно зробити при використанні розроблених нами розріджувачів.

Визначення способу розрідження. Розбавляють сперму бугаїв при заморожуванні, згідно з чинною інструкцією, за різними технологіями при температурі (322) С через 5-6 хвилин після її одержання. На практиці проводять одномоментне або двомоментне її розбавлення із розрахунку отримання в дозі необхідної кількості рухливих сперміїв.

Наша методика сама по собі передбачає двомоментне розбавлення. Розбавлення первинним розріджувачем проводиться для створення однакової і оптимальної концентрації розчинених речовин для життєздатності сперміїв при всіх кратностях розрідження, вторинним - для захисту клітин від дії низьких температур. У досліді вивчались три способи розрідження:

Спосіб 1: еякулят розбавляли первинним ЛЖ при температурі 32-35 С, а після 5-6 хвилин витримки - вторинним ЛЦГЖ - теж при температурі 32-35 С;

Спосіб 2: еякулят розбавляли первинним ЛЖ при температурі 32-35 С, витримували розріджену сперму 15 хвилин, вторинне розбавлення проводили ЛЦГЖ при кімнатній температурі (16-20 С);

Спосіб 3: еякулят розбавляли первинним ЛЖ при температурі 32-35 С, витримували розріджену сперму 15 хвилин, потім ставили в холодильник і через 30 хвилин розбавляли холодним (2-5 С) ЛЦГЖ.

Порівняльним аналізом встановлено, що найкращим є 3-й спосіб розрідження. При його застосуванні рухливість сперміїв в заморожено-розмороженій спермі становила 4,10,10 бала, виживаність - 6,40,15 години, АПВ - 17,30,70 умовної одиниці (табл.4). Різниця за якістю сперми, замороженої 3-м і першими двома способами, склала: за рухливістю від 0,3 до 0,4 бала, за виживаністю від 0,6 до 0,9 години, за АПВ - від 2,8 до 3,1 умовної одиниці (Р 0,05).

4. Середні якісні показники заморожено-розмороженої сперми при різних способах розрідження сперми (n = 10)

Наукова література теж містить дані про те, що оптимальною температурою для розбавлення сперми розріджувачем з гліцерином є температура 2-5 ?С, а не 35-37 ?С (О.Д. Бугров, 1965; І.В. Смирнов, 1976).

Визначення періоду еквілібрації. Згідно з інструкцією, перед заморожуванням сперми у гранулах об'ємом 0,1-0,2 мл період еквілібрації становить 3-4 години.

У досліді розбавлену сперму еквілібрували: 3, 4, 5, 6 і 7 годин. Результати свідчать про те, що при 5- і 6-годинній еквілібрації отримують кращу сперму, практично однакову за рухливістю - 3,9 бала, і майже однакову за виживаністю - 5,4 -5,8 години (табл.5). Сперма, еквілібрована 5 і 6 годин, достовірно краща від тієї, що була еквілібрована 3, 4 і 7 годин. При цьому різниця за рухливістю склала від 0,4 до 0,8 бала, за виживаністю - від 0,5 до 1,5 години, АПВ - від 2,7 до 5,4 умовної одиниці (Р<0,001…0,05). Таким чином, оптимальний період еквілібрації - 5-6 годин.

5. Середні якісні показники заморожено-розмороженої сперми при різній тривалості періоду еквілібрації (n = 10)

Результати наших досліджень узгоджуються із висновками В.Ф. Турбіна (1968) і Н.П. Ющенка (1979) про те, що при заморожуванні сперми бугаїв у відкритих гранулах період еквілібрації розрідженої сперми повинен становити 4-6 годин, хоча є й інші точки зору.

Визначення температури заморожування. Згідно з інструкцією, сперму слід заморожувати на фторопластових пластинах, які мають температуру -160-170 ?С або на блоках твердої вуглекислоти (-78 ?С).

У досліді вивчались температури заморожування від -80 до -190 ?С. Температуру визначали мідно-константановою термопарою. Побічний спай знаходився в рідкому азоті, робочий - в отворі (2,5-3,0 см) верхньої половини фторопластової пластини.

Кращих результатів досягнуто, коли сперму накапували в лунки при -130 ?С. Така температура була на пластині після 5-хвилинної витримки. При цьому рухливість сперміїв в заморожено-відтаяній спермі становила 4,10,08 бала, виживаність - 6,30,21 години, АПВ - 16,8 0,93 умовної одиниці.

Режим заморожування при -130С достовірно кращий від усіх інших. При його застосуванні суттєво збільшується і рухливість, і виживаність, і АПВ заморожено-розмороженої сперми. Різниця за рухливістю склала від 0,5 до 1,5 бала, за виживаністю - від 0,6 до 2,1 години, за АПВ - від 2,7 до 9,8 умовної одиниці (Р<0,001…0,05).

6. Середні якісні показники заморожено-розмороженої сперми при різній температурі заморожування (n = 10)

Визначення температури розморожування. Згідно з інструкцією, гранули об'ємом 0,1-0,2 мл відтаюють у флаконі з 1 мл 2,9%-ного розчину лимоннокислого натрію при температурі 38-40С. Відтаювання триває 5-8 секунд.

У літературі є дані про використання для відтаювання замороженої сперми бугаїв більш високих температур - від +50 до +75С і вище (Ф.І. Осташко, О.Д. Бугров, 1981; В.А. Киреева, 1993).

Для розморожування сперми, замороженої розробленим нами способом, застосовували різні температури для виявлення оптимальної: 38-40 С, 45 С, 50 С, 55С, 60 С.

Якісні показники сперми, розмороженої при температурах 38-40 С, 45 С і 50 С виявились практично однаковими: рухливість склала 3,9-4,0 бала, виживаність - 5,9-6,0 години, АПВ - 13,1-13,9 умовної одиниці. Підвищення ж температури відтаювання до 55-60 С призвело до погіршення всіх якісних показників заморожено-розмороженої сперми.

Тому пропонуємо розморожування сперми проводити при температурі 38-40 С, в межах фізіологічних температур, тобто згідно з інструкцією.

Порівняння нового способу кріоконсервації сперми бугаїв із способом, який застосовується на практиці

Контрольні зразки обробляли за інструкцією, дослідні - рекомендованим нами способом. Для порівняння якісних показників сперму через 24 години розморожували по 5 гранул у флаконі, що знаходився в біотермостаті при 38С (по 15 зразків), і по 1 гранулі в 1 мл підігрітого до 38 С 2,9%-ного цитрату натрію, як це робиться на племпідприємствах (по 30 зразків). сперма бугай кріоконсервація заморожений

Встановлено, що обробка дослідним способом дозволила підвищити якісні показники заморожено-розмороженої сперми, а саме, рухливість підвищилась на 0,34-0,49 бала (11,6-13,3%), виживаність - на 1,54-1,66 години (32,5-34,1%), АПВ - на 4,34-4,75 умовної одиниці (34,1-39,6%). Різниця виявилась достовірною.

Згідно з ГОСТом 26030-83 та чинною інструкцією (1981), заморожено-розморожена сперма повинна мати такі показники: рухливість - не нижче 4 балів, виживаність - не менше 5 годин, кількість сперміїв у дозі з прямолінійно-поступальним рухом - не менше 15 млн. Цим вимогам відповідає лише 17 еякулятів з 30, заморожених за інструкцією (56,7 %) і 29 з 30 еякулятів (96,7 %), заморожених запропонованим способом.

Таким чином, запропонований спосіб кріоконсервації дає можливість заморозити майже всі якісні еякуляти бугаїв.

7. Середні якісні показники сперми, замороженої за інструкцією і удосконаленим способом

З метою більш об'єктивної оцінки було проведено порівняння двох морфологічних показників сперми, замороженої за інструкцією і запропонованим способом: 1) % живих сперміїв, 2) % патологічних сперміїв.

Встановлено, що % живих сперміїв в дослідних зразках був достовірно вищим і становив 61,6 (проти контролю 53,7); % патологічних сперміїв, навпаки, в дослідних зразках був нижчим - 13,7 (проти контролю 19,1).

Основною ж і найбільш оптимальною оцінкою якості заморожено-розмороженої сперми є її оцінка за запліднюючою здатністю сперміїв.

Виробничу перевірку запліднюючої здатності сперми, замороженої за інструкцією і удосконаленим способом, провели в дванадцяти господарствах зони обслуговування ВАТ “Новоград-Волинське агроплемоб'єднання” на 977 українських чорно-рябих молочних і чорно-рябо-голштинських коровах та телицях парувального віку.

Одержані результати свідчать про те, що запліднюваність маток від першого осіменіння спермою, замороженою в рекомендованих розріджувачах і за удосконаленим способом, була на 20,3% вища ніж маток, осіменених спермою, замороженою за інструкцією, і становила 70,5%. Запліднюваність корів в контрольній групі становила 48,2%, дослідній - 67,3% (Р<0,001). Запліднюваність телиць в контрольній групі становила 80,0%, дослідній - 90,8% (Р>0,05) (табл.8). Недостовірність різниці між запліднюваністю телиць дослідної і контрольної груп пояснюється порівняно малою вибіркою.

Кількість одержаного приплоду від першого осіменіння в дослідній групі виявилась вищою на 16,3 % (57,4 проти контролю 41,1).

Одержані дані є цілком задовільними і теж свідчать на користь запропонованого нами способу. Адже на думку Д.Т. Вінничука і П.М. Мережка (1991), добрими показниками можна вважати запліднюваність від першого осіменіння всіх маток 70% і більше, телиць - 80-85% і більше. Мінімальною можна вважати запліднюваність всіх маток від першого осіменіння 55-60%, в тому числі корів - 45-50% і телиць - 70%.

Різниця між кількістю маток, що не прийшли повторно в охоту і результатами отелень, варіює в залежності від часу після осіменіння і в нашому випадку (60-90 днів) за методикою Н.Г. Балашова (1980) повинна дорівнювати 5-15%. Ця закономірність повністю підтверджується стосовно всього дослідженого поголів`я (контрольна група - 8,8 %, дослідна - 13,1 %).

8. Порівняння запліднюючої здатності сперми бугаїв, замороженої за інструкцією та запропонованим способом

Згідно з проведеними розрахунками, запропонований спосіб кріоконсервації сперми бугаїв дав можливість зменшити кількість осіменінь на отелення з 4,4 до 3,2 (при двократному осіменінні). Внаслідок цього зменшились витрати на одне запліднення на 5,76 гривень, в перерахунку на 100 корів це становить 576 гривень.

Середня тривалість сервіс-періоду зменшилась з 120 до 94 днів. Відповідно вихід телят на 100 корів в рік становив в контрольній групі - 86, дослідній - 95. Тобто, рекомендований нами спосіб дає можливість додатково отримати 9 телят або 675 гривень на 100 корів.

І, нарешті, при використанні неякісної сперми господарство зазнає збитків від недоотримання молока внаслідок яловості корів. При розрахунку цього показника була використана середня тривалість міжотельного періоду, яка склала в контрольній групі 405 днів, дослідній - 379 днів. Це дозволило додатково отримати 22702 кг молока на 100 корів або 11351 гривню.

Отже, запропонований нами спосіб кріоконсервації сперми бугаїв економічно ефективний внаслідок: 1) зменшення числа осіменінь на отелення; 2) збільшення виходу телят; 3) зменшення збитків від яловості корів. Економічна ефективність від застосування запропонованого способу кріоконсервації бугаїв склала на 100 корів: 576 + 675 + 11351 = 12602 (гривні).

Висновки

Розроблений новий, ефективний спосіб кріоконсервації сперми бугаїв у необлицьованих гранулах, який базується на застосуванні двох розріджувачів: основного ЛЦГЖ з процентним співвідношенням лактоза / цитрат натрію 90 / 10 і загальною осмоляльною концентрацією розчинених речовин 1372 мосм/л та коректуючого ЛЖ, ізотонічного стосовно сперми (323 мосм/л ).

Склад розробленого основного ЛЦГЖ-розріджувача: лактоза - 11,25 г, натрій лимоннокислий трьохзаміщений 5,5-водний - 0,37 г, гліцерин - 6,65 мл, жовток - 20 мл, вода - 100 мл, сануючі препарати відповідно до інструкції (1981). Склад коректуючого ЛЖ-розріджувача: лактоза - 9,60 г, жовток - 20 мл, вода - 100 мл, сануючі препарати відповідно до інструкції (1981).

Маса розчинюваних компонентів розріджувачів на 100 мл води не є постійною, рецепти треба корегувати після одержання нових партій препаратів або при тривалому їх зберіганні.

Визначені оптимальні технологічні режими розрідження сперми (коректуючим ЛЖ до отримання 60-90 млн. рухливих сперміїв в дозі при температурі +32-35єС, основним ЛЦГЖ до отримання 30 млн. рухливих сперміїв в дозі при температурі +2-5єС), еквілібрації (5-6 годин при +2-5єС), заморожування у відкритих гранулах об'ємом 0,2 мл (при -130єС) та відтаювання (при +38-40єС у водяному термостаті).

Встановлено, що біологічна повноцінність сперміїв краще зберігається при заморожуванні їх запропонованим способом. При цьому рухливість сперміїв в заморожено-розмороженій спермі вища в порівнянні з контролем на 11,6- 13,3 %, виживаність - на 32,5-34,1 %, а запліднююча здатність - на 16,3-20,3%.

Розроблений спосіб кріоконсервації сперми бугаїв впроваджений у виробництво на ВАТ “Новоград-Волинське агроплемоб`єднання”, що дало можливість зменшити число осіменінь на отелення (з 4,4 до 3,2), збільшити вихід телят (з 86 до 95 на 100 корів), зменшити тривалість сервіс-періоду (з 120 до 94 днів).

Економічна ефективність використання сперми, замороженої запропонованим способом, склала 12602 гривні на 100 корів.

Метод оптимізації розріджувачів може стати основою для удосконалення існуючих технологій кріоконсервації сперми.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

Гунтік Л.М. Визначення кращих розріджувачів для сперми бугаїв // Розведення і генетика тварин. - 2000. - Вип.33. - С.33-37.

Гунтік Л.М. Визначення кращих розріджувачів для сперми бугаїв і способів їх використання // Вісн. ДААУ. Спецвип: Пробл. вир-ва екологічно чистої продукції. - 2000. - С.144-145.

Гунтік Л.М. Нові розріджувачі для сперми бугаїв і спосіб їх використання // Вісн. Сум.держ.аграр.ун-ту. - 2001. - Вип.5. - С.44-46.

Кушнір В.М., Пасічна К.І., Гунтік Л.М. Основні причини зниження якості сперми при використанні існуючих технологій кріоконсервації // Біотехнологічні, селекційні та організаційні методи відтворення, зберігання і використання генофонду тварин: Зб.наук.праць. - К., 1997.-С.96-98. (Дисертант виконав експериментальну частину, статистичну обробку результатів та їх аналіз).

Размещено на Allbest.ru

...