Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

16.00.03 ветеринарна мікробіологія та вірусологія

ТРАНСОВАРІАЛЬНА ПЕРЕДАЧА МІКОБАКТЕРІЙ РІЗНИХ ВИДІВ, АДАПТОВАНИХ ДО ОРГАНІЗМУ КУРЕЙ

КРАВЧЕНКО НАТАЛІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук

Науковий керівник - доктор ветеринарних наук, академік УААН

Романенко Володимир Пилипович,

Інститут ветеринарної медицини УААН,

завідувач лабораторії генетики та імунології

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор

Скибіцький Володимир Гурійович,

Національний аграрний університет

завідувач кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології

доктор ветеринарних наук, професор

Ткаченко Олексій Андрійович,

Дніпропетровський державний аграрний університет,

завідувач кафедри епізоотології та інфекційних хвороб

Провідна установа: Одеський державний аграрний університет, кафедра мікробіології та вірусології Міністерства аграрної політики України, м. Одеса

Захист відбудеться "15" січня 2004 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус № 3, ауд.65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус № 4, к.41

Автореферат розісланий "12" грудня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Міськевич С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

кури кролі мікобактерії туберкульоз

Актуальність теми. Незважаючи на багаторічний досвід боротьби та профілактики туберкульозу, дана хвороба продовжує бути однією з важливих і важковирішуваних проблем тваринництва та охорони здоров'я. Так, з 1995 року в Україні захворювання на туберкульоз серед людей перевищило епідемічний поріг, залишається складною епізоотична ситуація щодо цієї хвороби серед поголів'я великої рогатої худоби, нез'ясований фактичний стан щодо туберкульозу птахів, оскільки, згідно чинної "Інструкції про заходи профілактики та оздоровлення тваринництва від туберкульозу" (1994 р.), досліджується лише маточне поголів'я птиці у племінних птахо-господарствах. Разом з тим, вчені усього світу повідомляють про труднощі у визначенні виду культур мікобактерій туберкульозу, виділених як від хворих людей, так і від тварин, що пов'язано із зростанням їх мінливості у сучасних умовах (V. Bogdвnescu, D. Vlвdescu, M. Swavulescu, D. Diaconescu, 1971; К.І. Михайлова, Л.М. Неживенко, 1975; Т.Б. Ильина, Е.И. Княжецкая, 1981; Е.Н. Писаренко,1992).

Однією з головних причин неефективної боротьби та профілактики туберкульозу є недооцінка тісного взаємозв'язку туберкульозу людини, сільськогосподарських тварин і птиці (Я.А. Благодарный, 1980; В.Е. Щуревский, 1981; N.R. Kumthekar, 1982; M.I. Vazgues Raul, 1985; Ю.Я. Кассич, В.А. Кочмарский, А.И. Завгородний и др., 1990). У літературних джерелах відмічається, що у вогнищах туберкульозної інфекції із наявністю хворої людини і великої рогатої худоби найчастіше інфікуються кури (К.К. Курманбаев, Д.Б. Балгужинов, 1981; К.К. Курманбаев, Я.А. Благо-дарный, 1981).

Водночас, питання сприйнятливості курей до мікобактерій туберкульозу людського й бичачого видів залишається дискусійним.

Очевидно, вирішальне значення для розвитку інфекційного процесу у птахів має неодноразове пасажування цих видів мікобактерій в їх організмі.

Рядом дослідників експериментально доведено, що після багаторазових пасажів в організмі курей M. tuberculosis та M. bovis здатні викликати тубер-кульозні ураження внутрішніх органів птиці та наближатися за деякими культурально-морфологічними та біохімічними властивостями до збудника туберкульозу птахів (А.Ф. Кочмарский, 1972, 1974; В.І. Ротов, П.Ю. Савченко, 1981; В.П. Романенко, В.С. Козлов, Г.М. Дяченко, 1995, 1997).

Одним із небезпечних шляхів елімінації мікробів з організму інфікованих курей є яйця. Проте, зустрічаються лише окремі повідомлення відносно інфікованості яєць M. tuberculosis і M. bovis та їх властивостей при трансоваріальному виділенні (О.О. Микитин, А.М. Дяченко, 2000; О.О. Микитин, 2003).

Все вищезазначене обумовлює необхідність вивчення питання збереження властивостей мікобактерій туберкульозу людського й бичачого видів після пасажів через організм курей, шляхів виділення та факторів їх передачі, що дозволить створити науково-обгрунтовані основи для удосконалення діагностики та профілактики туберкульозу.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Обраний напрямок досліджень є частиною науково-дослідних робіт, проведених у відповідності до державного завдання за номером держреєстрації 0198 U 004594 “Вивчити особливості трансоваріальної передачі інфекції у свійських птахів, інфікованих різними видами мікобактерій туберкульозу”.

Мета і завдання роботи. Метою роботи було визначення ступеня збереженності видових властивостей М. tuberculosis та M. bovis після багаторазових пасажів через організм курей і виділених трансоваріальним шляхом. На основі одержаних результатів розробити пропозиції по удосконаленню діагностики та профілактики туберкульозу.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

вивчити властивості М. tuberculosis та M. bovis після восьмиразового послідовного пасажування їх через організм курей і набуття ними характерних для M.avium ознак;

виділити адаптовані М. tuberculosis та M. bovis із яєць експериментально інфікованих курей, визначити частоту їх виділення та місце локалізації у яйці;

визначити особливості трансоваріальної передачі восьмиразово послідовно пасажованих через організм курей М. tuberculosis та M. bovis з наближеними до M. avium властивостями;

порівняти культурально-морфологічні та біохімічні властивості М. tuberculosis та M. bovis, що адаптовані до організму курей та виділені з яєць, з культурально-морфологічними та біохімічними властивостями М. tuberculosis та M. bovis до пасажування на курах;

вивчити в паралельних дослідах патогенні властивості для морських свинок, курей і кролів восьмиразово послідовно пасажованих через організм курей М. tuberculosis та M. bovis;

вивчити шляхом трьох послідовних пасажів на морських свинках стабільність характерних для M. avium ознак, набутих М. tuberculosis та M. bovis в результаті їх адаптації до організму курей.

Обєкт досліджень: восьмиразово послідовно пасажовані через організм курей М. tuberculosis (штам 1848) та M. bovis (штам 8) з наближеними до мікобактерій туберкульозу пташиного виду властивостями.

Предмет досліджень: культуральні, морфологічні, біохімічні, патоген-ні та сенсибілізуючі властивості восьмиразово послідовно пасажованих через організм курей М. tuberculosis (штам 1848) та M. bovis (штам 8).

Методи досліджень: бактеріологічні, алергічні, серологічні, патомор-фологічні та статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що восьмиразово пасажовані в організмі курей культури M. tuberculosis (штам 1848) та M. bovis (штам 8) поряд з набутими властивостями, характерними для збудника туберкульозу птахів, виявляють ряд ознак, характерних для М. tuberculosis та M. bovis.

Експериментально доведено, що при адаптації до організму курей мікобактерії туберкульозу людського й бичачого видів зумовлюють інфікованість яєць, а при інкубації таких яєць - високий відсоток загибелі ембріонів.

Встановлено, що при наступному попаданні в організм курей адаптовані до їх організму мікобактерії туберкульозу людського й бичачого видів виявляють тенденцію до подальшої мінливості властивостей у напрямку збудника туберкульозу пташиного виду, у тому числі і за умов трансоваріального виділення.

Показано, що при виділенні з яйцем адаптовані до організму курей M. tuberculosis (штам 1848) та M. bovis (штам 8) є патогенними як для курей, так і для кролів та морських свинок.

Доведено, що при неодноразовому послідовному введенні в організм морських свинок адаптовані до організму курей M. tuberculosis (штам 1848) та M. bovis (штам 8) відновлюють властивості, характерні для типових представників цих видів мікобактерій туберкульозу.

Практичне значення отриманих результатів. Встановлено, що мікобактерії туберкульозу людського й бичачого видів після багаторазових пасажів через організм курей виділяються трансоваріально і, незважаючи на наближення, за деякими ознаками, до збудника туберкульозу птахів, є небезпечними не лише для птиці, але й для інших видів тварин, а також людей.

Розроблені методичні рекомендації “Система епізоотологічного моніторингу птахівничих господарств (ферм) щодо туберкульозу” та допов-нення до "Інструкції про заходи профілактики та оздоровлення тваринництва від туберкульозу" (1994 р.) і "Настанови по діагностиці туберкульозу тварин та птиці" (1994 р.), впровадження яких у ветеринарну практику забезпечить з'ясування реальної епізоотичної ситуації у птахівничих господарствах, сприятиме своєчасному виявленню можливих джерел, шляхів та факторів передачі інфекції. Методичні рекомендації затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини від 18?20 грудня 2002 р., протокол № 2. Доля участі автора у розробці методичних рекомендацій 40%. Доповнення розглянуті методичною комісією з ветеринарної медицини ІСГМ УААН (від 18.12.2002, протокол № 5) і рекомендовані до подання в Державний департамент ветеринарної медицини України.

Особистий внесок здобувача. Експериментальні дослідження виконані автором особисто або при його безпосередній участі разом з співробітниками лабораторії мікробіології тварин ІСГМ УААН (м. Чернігів). Дисертант самостійно провела підбір та опрацювання наукової літератури, здійснила аналіз та інтерпретацію одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертації доповідались на засіданнях вченої ради Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН (1999-2000) та Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН (1999-2001); на конференції молодих вчених (Чернігів, 1999), II (IX) установчому з'їзді мікробіологів України (Чернігів, 2000), Міжнародній науково-практичній конференції ”ИЭКВМ - 80 лет на передовом рубеже ветеринарной науки” (Харьков, 15-19 октября 2002).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 7 статей, з них 4 статті надруковані у фахових виданнях, зокрема у “Науковому віснику Національного аграрного університету”, у журналі “Ветеринарна медицина Укра-їни”, у міжвідомчому тематичному науковому збірнику “Ветеринарна медицина 80”, у “Віснику Білоцерківського державного аграрного університету”.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 154 сторінках комп'ютерного тексту і складається із вступу, огляду літератури, результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків, пропозицій виробництву, списку використаної літератури, який включає 214 джерел, додатків. Дисертація містить 28 таблиць, 8 рисунків та 4 фотографії.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи. Робота виконувалась протягом 1998-2002 рр. в лабораторії мікробіології тварин Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН (м. Чернігів).

Об'єктами досліджень були культури мікобактерій туберкульозу людського (штам 1848) та бичачого (штам 8) видів, які шляхом восьмиразового тривалого (протягом 720 діб) послідовного пасажування були адаптовані до організму курей. Досліди по адаптації здійснені в лабораторії мікробіології тварин Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН (1991-1995рр.).

У роботі також використовували референтні штами мікобактерій туберкульозу людського (штам 1848), бичачого (штам 8) та пташиного (штам 14141) видів.

У дослідах застосовували бактеріологічні (бактеріоскопічні, культуральні, біологічні), алергічні, серологічні, патоморфологічні та статистичні методи. Всього при проведенні експериментальних досліджень використано 66 курей, 36 кролів, 66 морських свинок, бактеріологічно досліджено 420 проб яєчних жовтків та білків, 798 проб патматеріалу.

Вивчення інфікованості яєць мікобактеріями туберкульозу ссавців, адаптованими до організму птиці, проводили у дослідах на курах з благополучного щодо туберкульозу господарства Чернігівської області, які були досліджені перед зараженням алергічними, серологічними та бактеріологічними (яйця, послід) методами.

Для досліду було сформовано дві дослідні й чотири контрольні групи курей по п'ять голів у кожній, які утримувались у просторих металевих клітках ізольовано одна від одної. Птиці першої дослідної групи було введено адаптовану до організму курей культуру M. tuberculosis, штам 1848, другої адаптовану до організму курей культуру M. bovis, штам 8. Курам контрольних груп № 1, № 2, № 3 було інокульовано відповідно: M. tuberculosis, референтний штам 1848, M. bovis, референтний штам 8, M. avium, референтний штам 14141. Птиця четвертої контрольної групи залишилася інтактною.

Курей інфікували одноразово внутрішньом'язево у дозі 1мг (40 млн мікробних тіл) бактеріальної маси відповідної культури мікобактерій.

За час досліду, який тривав 6 місяців, проводили алергічні та серологічні дослідження птиці.

Усі одержані від курей за час спостереження яйця як дослідних, так і контрольних груп були бактеріологічно досліджені на наявність в них мікобактерій туберкульозу. Частину яєць досліджували одразу після знесення, а частину після їх попередньої інкубації в термостаті.

Експеримент з вивчення трансоваріальної передачі адаптованих до організму курей мікобактерій туберкульозу ссавців проводили на курячих ембріонах. Для їх штучного зараження використовували ізольовані з яєць адаптовані до організму курей культури M. tuberсulosis (штам 1848) та M. bovis (штам 8). Для контролю використовували ембріони, заражені M. avium, референтний штам 14141 (контроль 1), та не інфіковані (контроль 2).

Інокуляцію відповідної культури мікобактерій туберкульозу прово-дили на хоріон-алантоїсну оболонку курячих ембріонів у дозі 0,1 мл (з розрахунку 0,0001 мг бактеріальної маси в 1 мл ізотонічного розчину хлориду натрію). Далі інфіковані курячі ембріони поміщали у термостат для інкубації із додержанням необхідного режиму температури і вологості. Спостереження за розвитком ембріонів проводили шляхом овоскопії.

Вивчення стабільності набутих культурально-морфологічних, біохімічних та патогенних ознак адаптованими до організму курей мікобактеріями туберкульозу ссавців проводили у дослідах на морських свинках. Тварин заражали адаптованими до оганізму курей культурами M. tuberculosis (штам 1848) та M. bovis (штам 8), виділеними з жовтків яєць. Контрольні тварини були інфіковані референтними штамами цих видів збудника туберкульозу. Тварини третьої контрольної групи були не інфіковані (чистий контроль).

Кожна група складалась з трьох морських свинок, яких заражали підшкірно у дозі 1 мг бактеріальної маси відповідної культури мікобактерій. Виділені з внутрішніх органів мікобактерії використовували для зараження нових тварин. Таким чином проведено три послідовні пасажі на морських свинках тривалістю 90 діб кожен.

Для дослідження внутрішніх органів загиблих та вимушено забитих морських свинок, кролів, курей, курчат та тканин ембріонів й ембріональних

оболонок застосовували патоморфологічний метод. Дослідженню підлягали лімфатичні вузли, паренхіматозні органи, кишечник. У курей особливу увагу звертали на стан яйцеводів і яєчників. Оцінку змін у внутрішніх органах морських свинок проводили за схемою М.В. Тріус (1951).

Передпосівну обробку проб патматеріалу здійснювали за методом А.П. Алікаєвої (1940). Яйця, за винятком шкаралупи, перед висівом на поживне середовище спеціальній обробці не піддавали.

Вивчення властивостей у виділених мікобактерій проводили у першій генерації за допомогою ряду культурально-морфологічних та біохімічних тестів.

У культур мікобактерій вивчали морфологію, характер та швидкість росту, ріст колоній мікобактерій при різних температурах (25, 37, 41С), стійкість до знебарвлення активним хлором (Л.Е. Скрябіна, 1955). Досліджу-вали також активність та термостабільність каталази (А.Е. Зімін, 1965; Н.М. Макаревіч, 1973), уреазну (Заксе), нітратредуктазну (М.Т. Tsukamura et al., 1966), дегідрогеназну (проба H. Blochа, 1950) та формамідазну (H. Nagajama, K. Konno, S. Oka, 1941, у модифікації М.М. Дихно, С.М. Земцової, В.Н. Зайдес, 1964) активності.

Для вивчення патогенних властивостей культури мікобактерій вводили морським свинкам підшкірно, а кролям та курам внутрішньовенно у дозі 1мг бактеріальної маси, суспендованої в 1мл фізіологічного розчину хлориду натрію.

Через місяць після введення культур тварин та птицю досліджували алергічним методом. Туберкулінізацію здійснювали за допомогою двох туберкулінів (ППД для ссавців і ППД для птахів) згідно діючої "Настанови по діагностиці туберкульозу тварин та птиці", затвердженої ГУВМ з Держветінспекцією МСГП України 26 травня 1994 року.

Наявність антитіл у крові піддослідних тварин визначали у кров'яно-крапельній реакції аглютинації (ККРА) з використанням двох антигенів, виготовлених із мікобактерій туберкульозу людського й пташиного видів.

Одержані результати математично обробляли константним методом, а також за Стьюдентом.

Вивчення основних біологічних властивостей адаптованих до організму курей M. tuberсulosis (штам 1848) та M. bovis (штам 8). Ріст адаптованої до організму курей культури мікобактерій туберкульозу людського виду на середовищі Левенштейна-Йєнсена спостерігався на 10-12 добу у вигляді блискучих, кремових колоній S-форми при оптимальній температурі росту 37С. При температурі 22С та 41С відмічали ледь помітний ріст колоній через три тижні після початку інкубації. Бактеріальна маса досліджуваної культури мікобактерій добре суспендувалась в ізотонічному розчині хлориду натрію.

Морфологічно це були прямі і дещо вигнуті з добре помітною зернистістю кислотостійкі палички, що не знебарвлювалися 1 % розчином гіпохлориту натрію.

За біохімічними властивостями досліджувана культура мікобактерій не відрізнялась від референтного штаму 1848 M. tuberculosis. У піддослідних курей адаптований до організму птиці збудник туберкульозу людини викликав специфічні для туберкульозу ураження у селезінці, печінці, нирках та кишечнику, у кролів туберкульозні зміни відмічали у легенях та нирках, у морських свинок спостерігали гіперплазію регіонарних лімфатичних вузлів з казеозним вмістимим у центрі та поодинокі ураження у легенях і селезінці, що свідчить про зниження у адаптованих до організму курей культур M. tuberculosis вірулентності для морських свинок.

Ріст адаптованої до організму курей культури мікобактерій туберкульозу бичачого виду (штаму 8) на середовищі Левенштейна-Йєнсена був виявлений при температурі 37С на 13-15 добу у вигляді дрібних, округлих, матових колоній R-форми, кольору слонової кістки. При мікроскопії мазків, пофарбованих за Ціль-Нільсеном, спостерігали кислотостійкі, зернисті палички, які не знебарвлювались активним хлором.

На відміну від референтного штаму 8 M. bovis, досліджувана культура мікобактерій туберкульозу цього виду характеризувалась слабкою уреазною активністю.

У курей адаптована до їх організму культура M. bovis (штам 8) зумовила туберкульозні ураження у печінці та кишечнику, а у кролів загибель на 24-26 добу після зараження від туберкульозного сепсису.

Досліджувана культура мікобактерій бичачого виду загибелі морських свинок не викликала. У тварин при розтині спостерігали 1-2 напівпрозорих вузлики у легенях, а також гіперплазію регіонарних лімфатичних вузлів.

Таким чином, M. tuberculosis (штам 1848) та M. bovis (штам 8), восьмиразово послідовно пасажовані протягом 720 діб в організмі курей, поряд з набутими культурально-морфологічними та біохімічними ознаками, характерними для M. avium, виявляють ряд видових для M. tuberculosis та M. bovis властивостей. Адаптовані до організму курей M. tuberculosis та M. bovis, крім здатності викликати туберкульозні ураження внутрішніх органів у курей, володіють зниженою вірулентністю для морських свинок та підвищеною - для кролів.

Вивчення інфікованості яєць курей, штучно заражених адаптованими до їх організму M. tuberculosis (штам 1848) і M. bovis (штам 8). Встановлено, що, незалежно від виду та наявності адаптації до організму курей, мікобактерії туберкульозу ссавців виділяються з яйцем. Найвищий відсоток (28,5) зараженості курячих яєць зумовили досліджувані мікобактерії туберкульозу людського виду.

Інфікованість яєць адаптованим до організму птиці збудником туберкульозу великої рогатої худоби була нижчою і становила 13%.

Культури мікобактерій туберкульозу референтних штамів викликали значно нижчу зараженість яєць.

група 1 адаптовані M. tuberculosis, штам 1848;

контроль 1 M. tuberсulosis, референтний штам 1848;

група 2 адаптовані M. bovis, штам 8;

контроль 2 M. bovis, референтний штам 8 (конроль 2);

контроль 3 M. avium, референтний штам 14141 (конроль 3).

Важливим як з точки зору впливу на розвиток зародка, так і виживання мікобактерій є визначення локалізації їх у яйці.

Отримані дані свідчать, що адаптовані до організму курей мікобактерії туберкульозу бичачого виду, як і референтний штам 8 цього виду збудника туберкульозу, у найбільшій кількості виділяються з жовтком.

Так, із жовтків адаптовані до організму курей культури мікобактерій туберкульозу бичачого виду були ізольовані у 9,7 % випадків, а з білків у 3,3 % випадків.

Аналогічну закономірність спостерігали при виділенні референтного штаму 8 M.bovis: майже удвічі більше культур мікобактерій туберкульозу виділено з жовтків (5,1 %), ніж з білків (2,6 %).

Водночас, мікобактерії туберкульозу людського виду, як адаптовані, так і не адаптовані до організму курей, локалізуються, за нашими даними, здебільшого у білку, відповідно у 17,8 % та 10 % випадків.

Крім того, встановлена пряма корелятивна (r = 0,46) залежність відсотку виділення мікобактерій із яєць від інкубації їх перед дослідженням. Так, 62 % культур мікобактерій (15 культур із 24 виділених) були ізольовані з яєць після попередньої їх інкубації у термостаті, що майже удвічі більше від відсотку виділених культур мікобактерій (38 %) з яєць, які перед бактеріологічним дослідженням не інкубували.

Вивчення розвитку інфекційного процесу у курей, експериментально заражених адаптованими до їх організму мікобактеріями туберкульозу різних видів. Підтвердженням розвитку інфекційного процесу у курей, зумовленого адаптованими до їх організму мікобактеріями туберкульозу людського та бичачого видів, були результати алергічних, серологічних та патолого-анатомічних досліджень. При визначенні алергічного стану у птахів встановлено, що обидві досліджувані культури викликали у курей більш інтенсивні реакції на ППД-туберкулін для птахів, ніж на ППД-туберкулін для ссавців.

Як відомо, розвиток інфекційного процесу в організмі птиці супроводжується утворенням аглютининів. Рядом дослідників встановлено, що ККРА виявляє додатково від 6 до 41,7 % хворих на туберкульоз курей, які не дають позитивної реакції на туберкулін [Р.В. Тузова, 1983].

В результаті проведених досліджень виявлено, що адаптовані до організму курей мікобактерії туберкульозу бичачого виду (штам 8) у 100 % випадків, людського (штам 1848) - у 75 % випадків зумовлюють позитивні реакції у ККРА з антигенами, виготовленими як з мікобактерій людського, так і з мікобактерій пташиного видів.

При патолого-анатомічному дослідженні внутрішніх органів курей, експериментально інфікованих адаптованими до їх організму мікобактеріями туберкульозу людського та бичачого видів, встановлено у 80 % випадків туберкульозні ураження печінки та відповідно у 60 % і 80 % випадків - селезінки. Адаптований до організму птахів збудник туберкульозу людського виду спричинив навіть загибель однієї курки на 89 добу після зараження з ураженнями печінки, селезінки та кишечника.

Окремо бактеріологічно досліджувались проби яєчників і яйцеводів. Культури мікобактерій туберкульозу з досліджуваних проб яйцеводів були виділені у 24 % випадків (з 6 із 25 досліджених проб), 16 % з них (з 4 проб) ізольовані з проб яйцеводів без видимих туберкульозних змін, а 8% (з 2 проб) - із уражених туберкульозом проб яйцеводів.

Вивчення трансоваріальної передачі адаптованих до організму курей мікобактерій туберкульозу людського та бичачого видів молодняку птиці. У дослідах на штучно заражених курячих ембріонах встановлено, що ізольовані з жовтків та білків яєць адаптовані до організму курей мікобактерії туберкульозу людського та бичачого видів зумовлюють загибель ембріонів.

Найбільший відсоток загибелі ембріонів викликали ізольовані з яєчних жовтків культури адаптованих до організму курей M.tuberculosis та M.bovis, відповідно 100 % і 80 %. Загибель ембріонів, викликана цими культурами мікобактерій, виділеними з яєчних білків, спостерігалась відповідно у 80 % і 60 %.

У переважній більшості випадків загибель ембріонів відмічалась на 15-16 добу їх розвитку.

При розтині в усіх загиблих ембріонів виявлялись набряки та потовщення стінок хоріон-алантоїсу з наявністю некротизованих ділянок, гіперемія тіла й крововиливи на шкірі та у підшкірному шарі ембріону. Проте, специфічних для туберкульозу змін виявлено не було.

Висіви з проб тканин та ембріональних оболонок на живильне середовище Левенштейна-Йєнсена давали рясний ріст колоній мікобактерій, які через 10-20 діб після появи набували кільцеподібної форми. В мазках-відбитках з тканин ембріону та хоріон-алантоїсу спостерігали різні за розміром скупчення дрібних кислотостійких мікобактерій, розташованих у вигляді “кіс”. Підтвердженням загибелі курчат та ембріонів, спричиненої мікобактеріями туберкульозу, слугували позитивні результати бактеріологічного дослідження проб внутрішніх органів.

Встановлено також, що при експериментальному зараженні ембріонів адаптованими до організму курей культурами мікобактерій людського й бичачого видів у дозі 0,0001 мг в 1мл ізотонічного розчину хлориду натрію спостерігається низький відсоток виводу курчат.

Найвищий відсоток (40 %) виводу курчат спостерігали з інкубаційних яєць, інфікованих M.bovis, виділеними з білка. Виведений молодняк був жвавий, без помітних відхилень фізіологічних норм розвитку.

За час спостереження, який тривав 2 місяці, для курчат були створені сприятливі умови утримання та годівлі. У місячному віці вони були досліджені алергічно (одночасно двома туберкулінами: ППД-туберкулін для ссавців і ППД-туберкулін для птахів), а послід від них бактеріологічно.

Дослідами встановлено, що, незважаючи на відсутність у курчат позитивних реакцій на обидва алергени, при бактеріологічному дослідженні проб посліду від них спостерігався ріст колоній мікобактерій туберкульозу.

Таким чином, адаптовані до організму птиці збудники туберкульозу людського й бичачого видів, які виділяються трансоваріальним шляхом за умов їх локалізації як у білку, так і в жовтку, розмножуються там і викликають високий відсоток загибелі ембріонів.

Культурально-морфологічні та біохімічні властивості адаптованих до організму курей мікобактерій туберкульозу людського виду (штам 1848), виділених з яєць. Ріст ізольованих з яєць адаптованих до організму курей мікобактерій туберкульозу людського виду на щільному середовищі Левенштейна-Йєнсена спостерігається на 10-12 добу у вигляді колоній S-форми кольору слонової кістки, з доброю суспендованістю в ізотонічному розчині хлориду натрію, більшість яких були кільцеподібні (табл.1).

Таблиця 1 - Властивості виділених з яєць адаптованих M. tuberсulosis (штам 1848)

Досліджувані властивості	Адаптовані M.tuber сulosis шт. 1848	Адаптовані M.tuberсulosis, шт. 1848, ізольовані з:	Референтні штами:
		Білка яйця	Жовтка яйця	внутрішніх органів	1848, M.tuber сulosis	14141, M.avium
швидкість росту (діб)	10-12	10-12	10-12	10-12	18-20	7-10
ріст при:	22С	+	+	+	+		+
	37С	+++	+++	+++	+++	+++	++++
	41С	+	+	+	+		+++
форма колоній	S-форма	S-форма	S-форма	S-форма	R-форма	S-форма
біохімічна активність	нітратредуктазна	+	+		+	+
	уреазна	+		+	+	+
	дегідрогеназна	12	6	12	12	12	6
	каталазна	+	++	++	++	+	+++
	термостабільність каталази			+			+

Примітки: (тут і далі)

1.“+” поодинокі колонії (1-10); “++” значна кількість колоній (11-50); “+++” безліч колоній (51-100); “++++” суцільний ріст злитих колоній;

2.біохімічна активність: ”+” позитивний результат; “” слабовиражена реакція; “” негативний результат. Для оцінки каталазної активності: “+” поодинокі бульбашки газу; ”++”, замкнене кільце бульбашок газу; “+++” бульбашки газу вкривають поверхню шаром 1-2 мм.

Оптимальна температура росту була 37С, проте, ріст колоній мікобактерій відмічали і при 22 та 41С. У мазках з цих колоній досліджуваних M. tuberсulosis, пофарбованих за Ціль-Нільсеном, спостерігали кислотостійкі, з добре помітною зернистістю палички, які не піддавались знебарвленню розчином гіпохлориту калію.

В адаптованих до організму курей M. tuberсulosis, виділених з яєць, були виявлені зміни ферментативних властивостей. У культур, виділених з жовтка, спостерігалась відсутність нітратредуктазної активності та поява термостабільної каталази, а у культур, виділених з білка - зниження уреазної та підвищення дегідрогеназної активності. Помітних змін активності інших ферментів за час досліджень не відмічали.

Культурально-морфологічні та біохімічні властивості адаптованих до організму курей мікобактерій туберкульозу бичачого виду, виділених з яєць. Виділені з яєчного жовтка та білка адаптовані до організму курей мікобактерії туберкульозу бичачого виду росли у вигляді колоній S-форми на 13-15 добу з часу висіву на живильне середовище Левенштейна-Йєнсена. Оптимальна температура росту мікобактерій становила 37С (табл. 2).

Таблиця 2 - Властивості виділених з курячих яєць адаптованих до організму курей M. bovis, штам 8

Досліджувані властивості	Адаптовані M.bovis, шт. 8	Адаптовані M.bovis, шт. 8, ізольовані з:	Референтні штами:
		білка	жовтка	внутрішніх органів	8, M.bovis	14141, M.avium
швидкість росту	13-15	13-15	13-15	13-15	20-22	7-10
ріст при:	22С		+	+	+		+
	37С	++	++	++	++	+++	+++
	41С		+	+	+		+
форма колоній	R-форма	S-форма	S-форма	S-форма	R-форма	S-форма
біохімічна активність	каталазна	+	++	++	++		+++
	уреазна					+
	дегідрогеназна (годин)	12	6	6	6	12	6

Проте, слабкий ріст дрібних колоній мікобактерій спостерігали і при 22С та 41С. За морфологією колонії були світло-кремового кольору, складались з кислотостійких зернистих паличок, які при обробці розчином гіпохлориту калію залишались малиновими.

За швидкістю росту колоній при різних температурах та їх формою ця культура відрізнялась від референтного штаму M. bovis, а за формою колоній, культивованих при різних температурах від вихідної адаптованої до організму курей культури мікобактерій, що була взята в дослід.

При дослідженні біохімічних властивостей в адаптованих мікобактерій туберкульозу бичачого виду як у виділенних з яєць, так і у виділених з внутрішніх органів курей виявлено збереження набутого в результаті багаторазових пасажів послаблення уреазної активності. Водночас, спостерігалась тенденція до посилення каталазної та дегідрогеназної активностей.

Патогенність та сенсибілізуючі властивості адаптованих до організму курей M. tuberculosis (штам 1848), M. bovis (штам 8), виділених з яєць. Відомо, що мікобактерії туберкульозу людського та бичачого видів зумовлюють туберкульозні ураження у внутрішніх органах морських свинок і кролів. Сприйнятливість курей до цих видів мікобактерій недостатньо вивчена.

Проте, результати наших досліджень показали, що M. tuberculosis та M. вovis при адаптації до організму курей зберігають здатність викликати туберкульозні ураження у птиці навіть при трансоваріальному виділенні.

При штучному зараженні курей адаптованими до їх організму мікобактеріями туберкульозу людського виду, виділеними трансоваріально, спостерігається гіперплазія та наявність специфічних для туберкульозу вузликів у печінці та селезінці.

Ізольований з яєць збудник туберкульозу бичачого виду у дозі 1 мг в 1 мл фізрозчину хлориду натрію зумовлює у курей не лише туберкульозні ураження печінки, селезінки та кишечника, а навіть загибель зараженої птиці.

Для кролів виділені з яєць культури адаптованих до організму курей M. tuberculosis посилили свою вірулентність, зумовлюючи у них специфічні для туберкульозу зміни у нирках та міліарний туберкульоз легень.

Ізольовані з яєць адаптовані до організму курей M. bovis, як і збудник туберкульозу птахів, викликали у кролів туберкульозний процес по типу Йєрсена (туберкульозний сепсис) та їх загибель на 2530 добу.

Для морських свинок досліджувані культури мікобактерій ссавців виявили залишкову вірулентність і, на відміну від референтних штамів цих видів збудника, їх загибелі за час спостереження не викликали.

У внутрішніх органах морських свинок досліджувана культура мікобактерій людського виду зумовлює утворення специфічних вузликів у регіонарних лімфатичних вузлах та селезінці.

Адаптована культура бичачого виду, виділена трансоваріальним шляхом, виявила дещо вищу вірулентність для цих тварин, оскільки видимі туберкульозні зміни спостерігали не лише у лімфатичних вузлах та селезінці, а й у печінці та легенях.

При вивченні сенсибілізуючих властивостей було встановлено, що, на відміну від референтних штамів M. tuberculosis, M. bovis та M. avium, які зумовлюють позитивні реакції у тварин лише на гомологічні алергени, досліджувані культури мікобактерій туберкульозу викликали у морських свинок підвищену чутливість до обох алергенів (ППД - туберкуліну для птахів і ППД- туберкуліну для ссавців). Разом з тим слід відмітити, що M. bovis у 75 % тварин зумовили більш інтенсивні реакції на ППД- туберкулін для птахів.

Вивчення стабільності ознак у адаптованих до організму курей M. tuberculosis (штам 1848). За культурально-морфологічними властивостями адаптовані до організму курей та виділені трансоваріально мікобактерії туберкульозу людського й бичачого видів після третього послідовного пасажу через організм морських свинок наблизилися до референтних штамів цих видів збудника.

У культури мікобактерій людського виду після першого пасажу спостерігали відновлення активності нітратредуктази, після другого термолабільності каталази, швидкості та температурного діапазону росту, а після третього форми колоній.

Мікобактерії туберкульозу бичачого виду після другого пасажу на морських свинках відновили форму колоній, а після третього активність каталази, дегідрогенази та уреази й за швидкістю та температурним діапазоном росту наблизились до референтного штаму M. bovis.

Крім того, зі збільшенням кількості пасажів на морських свинках у цих культур мікобактерій туберкульозу спостерігалась тенденція до поступового відновлення вірулентності для морських свинок (табл. 3).

Таблиця 3 - Ступінь туберкульозного ураження внутрішніх органів морських свинок після пасажів адаптованих M. tuberсulosis (штам 1848) та M. bovis (штам 8)

Інокульовані культури мікобактерій	Кількість пасажів	Середній індекс ураження за М.В. Тріус, М ± m, n = 3	Висівання МБТ з органів
M.tuberсulosis, шт.1848, адаптовані до організму курей та виділені з жовтка	I	6 ± 1	+
	II	13 ± 1	+
	III	16,6 ± 1	++
M.tuberсulosis, референтний штам 1848	Контроль 1	24 ± 1,2	++
M.bovis, штам 8, адаптовані до організму курей та виділені з жовтка	I	9 ± 1,5	+
	II	14 ± 0,6	+
	III	17 ± 0,5	++
M.bovis, референтний штам 8	Контроль 2	22 ± 1	++
Інтактні тварини	Контроль 3

Примітка: “+” поодинокі колонії (1-10); “++” значна кількість колоній (11-50).

Доказом того були результати патолого-анатомічного розтину тварин та співставлення середніх показників індексу ураження органів після кожного послідовного пасажу на морських свинках.

Адаптовані до організму курей M. tuberculosis (штам 1848), ізольовані з яєць, вже після другого пасажу на цих тваринах зумовили утворення від одного до декількох специфічних дрібних вузликів не лише у регіонарних лімфатичних вузлах, як після першого пасажу, а й у печінці та легенях заражених тварин.

Середній індекс ураження внутрішніх органів морських свинок після першого пасажу M. tuberculosis, адаптованих до організму курей, становив 6 ± 1, тоді як після третього він вже був 16,6 ± 1, що є підтвердженням поступового посилення їх вірулентності для морських свинок.

Аналогічна тенденція спостерігалась і при співставленні середніх індексів ураження органів морських свинок, зумовлених виділеними з яєць адаптованими до організму курей M. bovis. Якщо при першому пасажі середній індекс ураження органів становив 9 ± 1,5, то при другому і третьому пасажах він підвищився відповідно до 14 ± 0,6 та 17 ± 0,5. Рівень ймовірності одержаних даних був високий (р = 99,6 %, р = 99,9%).

З наростанням пасажів цих культур на морських свинках відмічено також збільшення кількості колоній мікобактерій, виділених з проб патматеріалу від інфікованих тварин (від декількох дуже дрібних при перших пасажах до понад 20 в останніх).

ВИСНОВКИ

У адаптованих до організму курей M. tuberculosis та M. bovis в результаті восьмиразового пасажування в їх організмі поряд з характерними для M. avium властивостями обґрунтована можливість збереження ознак, характерних для М. tuberculosis та M. bovis. Експериментально показано, що при послідовному пасажуванні їх через організм морських свинок відновлюються властивості, характерні для типових представників цих видів мікобактерій туберкульозу. При адаптації до організму курей M. tuberculosis та M. bovis зумовлюють інфікованість яєць, а при інкубації таких яєць - загибель ембріонів, що доводить їх небезпеку як для цих видів птахів, так і для інших видів тварин, а також людей.

M. tuberculosis (штам 1848) та M. bovis (штам 8), восьмиразово послідовно пасажовані протягом 720 діб в організмі курей, поряд з набутими культурально-морфологічними та біохімічними ознаками, характерними для M. avium, виявляють ряд видових властивостей, характерних для M. tuberculosis та M. bovis.

Адаптовані до організму курей M. tuberculosis та M. bovis, крім здатності викликати туберкульозні ураження внутрішніх органів у курей, володіють зниженою вірулентністю для морських свинок та підвищеною - для кролів.

M. tuberculosis (штам 1848), адаптовані до організму птиці, при експериментальному зараженні курей у дозі 1 мг зумовлюють інфікованість яєць у 28,5% випадків, з яких у 17,8 % збудник локалізується у білку, а у 10,7 % в жовтку. Інфікованість яєць при експериментальному зараженні курей адаптованими до їх організму M. bovis (штам 8) становить 13 %, з яких у 9,7 % збудник локалізується у жовтку, а у 3,3 % у білку.

При інкубації яєць, штучно заражених адаптованими до організму курей мікобактеріями туберкульозу людського й бичачого видів, встановлена загибель ембріонів відповідно у 80-100 % та 60-80 % випадків.

Адаптовані до організму курей мікобактерії туберкульозу ссавців персистують в організмі курчат, виведених з експериментально інфікованих ембріонів, та виділяються назовні, що може сприяти поширенню туберкульозу.

Виділені трансоваріальним шляхом адаптовані до організму курей M. tuberculosis (штам 1848) та M. bovis (штам 8) зумовлюють у курей інфекційний процес, який супроводжується патолого-анатомічними змінами, інколи їх загибеллю, та володіють зниженою вірулентністю для морських свинок.

Мікобактерії туберкульозу людського виду, адаптовані до організму курей, які виділяються з яйцем, володіють новими, характерними для мікобактерій туберкульозу пташиного виду, ознаками (відсутність нітратредуктазної активності та поява термостабільності каталази у культур, виділених із жовтка, та зміна уреазної та дегідрогеназної активності у культур, виділених з білка).

В організмі морських свинок адаптовані до організму курей M. tuberculosis (штам 1848) і M. bovis (штам 8) вже після третього пасажу на цих тваринах поступово відновлюють вихідні ознаки. Відновлення культурально-морфологічних (форма колоній, швидкість та температурний діапазон їх росту) та біохімічних ознак (здатність до редукції нітратів та термолабільність каталази у M. tuberculosis, уреазна та дегідрогеназна активність у M. bovis) виявляється одночасно з підвищенням вірулентності мікобактерій для морських свинок.

Пропозиції виробництву

На основі одержаних результатів для удосконалення діагностики та профілактики туберкульозу рекомендуються:

Методичні рекомендації “Система епізоотологічного моніторингу птахівничих господарств (ферм) щодо туберкульозу” (розглянуті та затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини України, 18-20 грудня 2002 р, протокол № 2);

Доповнення до:

а) "Інструкції про заходи профілактики та оздоровлення тваринництва від туберкульозу"(1994р.):

до п. 2.5.3. Проводити алергічні дослідження дорослого поголів'я птиці один раз на рік:

у птахівничих господарствах незалежно від форм власності, що знаходяться в районах, неблагополучних щодо туберкульозу великої рогатої худоби;

у приватних господарствах громадян, фермерів, де виявлена реагуюча на туберкулін велика рогата худоба, або самі власники чи члени їх родин знаходяться на обліку в тубдиспансері;

до п. 4.10. При виявлені в господарствах серед птахопоголів'я реагуючих на туберкулін проводити їх діагностичний забій та, незалежно від наявності патолого-анатомічних змін, відбирати матеріал для бактеріологічних досліджень.

б)"Настанови по діагностиці туберкульозу тварин та птиці" (1994р.):

до п. 6.4.2. Для біопроби при бактеріологічному дослідженні на туберкульоз матеріалу від курей використовувати, крім курей, морських свинок.

Запропоновані доповнення розглянуті методичною комісією з ветеринарної медицини ІСГМ УААН (від 18.12.2002, протокол № 5) і рекомендовані до розгляду Державним департаментом ветеринарної медицини України.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Романенко В.П., Дяченко Г.М., Кравченко Н.О. Трансоваріальна передача збудників туберкульозу різних видів, адаптованих до організму птиці // Науковий вісник Національного аграрного університету. Вип. 36. Київ, 2001.С.136140. (Проведення експериментів на курах, бактеріологічне дослідження яєць, аналіз та узагальнення результатів, написання статті).

Кравченко Н.О. Романенко В.П., Вербицький П.І., Дяченко Г.М. Трансоваріальна передача збудників туберкульозу ссавців, адаптованих до організму курей, та їх порівняльна характеристика // Ветеринарна медицина України.2002.№ 10. С. 1214. (Проведення експериментів на курах, бактеріологічне дослідження яєць, вивчення властивостей у виділених культур мікобактерій, написання статті).

Романенко В.П., Кравченко Н.О. Патогенні властивості виділенних з яєць мікобактерій туберкульозу різних видів, адаптованих до організму курей // Міжвідом.темат. наук. зб. ”Ветеринарна медицина 80”.Вип. 80.Харків, 2002.С. 518521. (Експериментальні дослідження на тваринах, лабораторні дослідження, аналіз результатів, підготовка статті до друку).

Кравченко Н.О., Романенко В.П. Трансоваріальна передача адаптованих до організму курей мікобактерій різних видів в експерименті // Вісник Білоцерків. держ. аграр. універ. Вип. 21. Біла Церква, 2002. С. 124127. (Експерименти на курячих ембріонах, лабораторні дослідження, аналіз результатів, підготовка статті до друку).

Романенко В.Ф., Вербицкий П.И., Дяченко А.М., Кравченко Н.А. Характеристика адаптированных к организму птицы M.tuberculosis и M. bovis // Ветеринария.2002. № 8. С. 24-26. (Проведення досліджень, підготовка статті до друку).

Романенко В.Ф., Вербицкий П.И., Дяченко А.М., Кравченко Н.А. Эпидемиологическое значение трансовариальной передачи возбудителя туберкулеза разных видов, адаптированных к организму птицы // Пробл. туберк. 2002. № 7. С. 36-38. (Проведення досліджень, аналіз результатів, написання статті).

Романенко В.Ф., Дяченко А.М., Кравченко Н.А, Микитин О.О. Экспериментальные данные по изучению роли куриных яиц в эпидемиологии туберкулеза // Пробл. туберк. 2001. № 6. С. 40-41. (Проведення експериментів на курах, бактеріологічне дослідження яєць, підготовка статті до друку).

Кравченко Н.О. Трансоваріальна передача мікобактерій різних видів, адаптованих до організму курей. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 ветеринарна мікробіологія та вірусологія. Національний аграрний університет, Київ, 2003.

Дисертація присвячена вивченню питання трансоваріальної передачі адаптованих до організму курей мікобактерій туберкульозу людського й бичачого видів, збереження стабільності набутих ними ознак в організмі невластивого хазяїна. Встановлено, що M. tuberculosis (штам 1848) та M. bovis (штам 8), восьмиразово послідовно пасажовані протягом 720 діб в організмі курей, поряд з набутими культурально-морфологічними та біохімічними ознаками, характерними для M. avium, виявляють ряд видових для M. tuberculosis та M. bovis властивостей. Адаптовані до організму курей M. tuberculosis та M. bovis, крім здатності викликати туберкульозні ураження внутрішніх органів у курей, володіють зниженою вірулентністю для морських свинок.

Експериментально показано, що мікобактерії туберкульозу людського й бичачого видів за умов адаптації їх до організму курей зумовлюють інфікованість яєць, а при їх інкубації високий відсоток загибелі ембріонів і персистують в організмі курчат.

У дослідах на лабораторних тваринах доведено, що при трансоваріальному виділенні адаптовані до організму курей M. tuberculosis (штам 1848) та M. bovis (штам 8) виявляють патогенність для курей і кролів, не втрачаючи її для морських свинок. У кролів адаптовані мікобактерії туберкульозу бичачого виду, виділені з яєць, викликають септичний процес та їх загибель протягом місяця.

При неодноразовому послідовному пасажуванні через організм морських свинок у адаптованих до організму курей M. tuberculosis (штам 1848) та M. bovis (штам 8) проявляється тенденція до відновлення властивостей, характерних для типових культур мікобактерій туберкульозу цих видів. За результатами досліджень розроблені пропозиції виробництву.

Ключові слова: адаптація, мікобактерії туберкульозу, патогенність, трансоваріальна передача, властивості, інфікованість, пасаж, вид.

Кравченко Н.А. Трансовариальная передача микобактерий разных видов, адаптированных к организму кур. Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 ветеринарная микробиология и вирусология. Национальный аграрный университет, Киев, 2003.

Диссертация посвящена изучению вопроса трансовариальной передачи адаптированных к организму кур микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов, сохранения стабильности приобретенных ими в организме несвойственного хазяина свойств. Определено, что восьмиразово последовательно пассированные на протяжении 720 суток в организме кур M. tuberculosis (штамм 1848) и M. bovis (штамм 8) наряду с приобретёнными культурально-морфологическими и биохимическими особенностями, характерными для M. avium, проявляют ряд видовых для M. tuberculosis и M. bovis свойств. Адаптированные к организму кур M. tuberculosis и M. bovis, кроме способности вызывать у зараженных кур туберкулезные изменения внутренних органов, обладают сниженной вирулентностью для морских свинок.

Експериментально установлено, что адаптированные микобактерии туберкулеза млекопитающих выделяются с яйцом инфицированных кур. Микобактерии туберкулеза человеческого вида (штамм 1848), адаптированные к организму кур, обусловили инфицированность яиц в 28,5% случаев, 17,8 % из которых выделено с белка и 10,7 % с желтка. Адаптированные к организму кур микобактерии туберкулеза бычьего вида (штамм 8) вызвали инфицированность яиц в 13% случаев, из которых в 9,7 % случаев возбудитель локализовался в желтке и в 3,3 % в белке.

...