Особливості протеолітичних процесів у травному тракті телят

Примітка: У цій і наступній таблиці * - різниця вірогідна порівняно з контролем (Р<0,05).

Збільшення протеолітичної активності вмісту рубця виявлено при додаванні до інкубаційного середовища цинку, причому основною часткою ферментів, що активуються цим мікроелементом, є металопротеїнази. На активність цистеїнових протеїназ вмісту рубця телят помітно впливає нікель. Відомо, що нікель активує уреазу мікробів, а також деякі гідрогенази і фактор F420 метаногенних бактерій (DiMarco S., 1990). Не виключена, однак, його участь і в протеолітичних процесах.

Сірка по-різному впливає на активність протеолітичних ферментів у вмісті рубця ВРХ. Наприклад, окиснена її форма у вигляді сульфату і окисненого глутатіону знижує їх активність, причому це зниження відбувається переважно за рахунок активності цистеїнових ферментів. Водночас цистеїн, відновлена форма глутатіону і дитіотреітол як протектори SH-груп, навпаки, їх активують. При додаванні до інкубаційного середовища додецилсульфату натрію, а також високих концентрацій сечовини, які порушують четвертинну структуру в білках, спостерігається різке зниження протеолітичної активності у вмісті рубця. Це засвідчує наявність серед таких білків ферментів, що містять каталітичні і регуляторні субодиниці та є залежними від впливу різних екзогенних чинників. Цікаво, що цистеїнові та серинові інгібітори знижують активність залежних від додецилсульфату і сечовини протеїназ, засвідчуючи, що переважно у молекулах саме цих ферментів відбувається дисоціація поліпептидних ланцюгів під впливом іонних детергентів.

Протеїнази окремих фракцій рубцевої рідини. Із зазначеного вище випливає, що у вмісті рубця бичків містяться протеїнази, які відрізняються за своїми фізико-хімічними властивостями. Тому цікавим є розподіл цих ферментів серед різних фракцій вмісту рубця. Серед усіх досліджуваних фракцій бактерії відзначаються найвищою активністю нейтральних протеїназ (рН 7,0). В інфузоріях, а також у кормових частинках і безклітинній рідині її рівень значно нижчий (рис.4). Водночас, найвищою активністю кислих протеїназ (рН 5,0) відзначаються кормові частинки і безклітинна рідина. У безклітинну рідину потрапляють ферменти, які виділяють мікроорганізми і деградують рослинні білки, а також протеїнази, які звільняються в результаті лізису клітин мікроорганізмів.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4. Протеїназна активність вмісту рубця телят: 1 - бактерії, 2 - інфузорії, 3 - кормові частинки, 4 - безклітинна рідина.

Фракція бактерій рубця ВРХ містить чимало білків, яким властива протеолітична активність. Це, зокрема, стосується білків з молекулярною масою близькою 400, 200, 100, 60, 40 і 30 кДа. Протеїназну активність виявлено також серед білків меншої молекулярної маси.

Одним із важливих показників у характеристиці протеїназ є залежність їх активності від специфічних інгібіторів, а також вплив на їх рівень різноманітних модуляторів активності (табл.5). Активність протеїназ у клітинах бактерій рубця значною мірою залежить від впливу різних чинників - інгібіторів, іонів мінеральних елементів, макроергічних сполук. Відомо, що деякі протеїнази каталізують енергозалежні реакції і активуються за участю макроергічних сполук. Це, зокрема, стосується високомолекулярних ферментів.

Таблиця 5

Активність протеїназ клітин бактерій рубця бичків під впливом різних модуляторів (субстрат - тирозин, рН - 7,0 )

У групі клітинних білків бактерій молекулярною масою близько 400 кДа виявляється незначна протеолітична активність, рівень якої зростає приблизно у 3 рази при додаванні до середовища інкубації АТФ. У цьому випадку, необхідне відщеплення макроергічного фосфатного залишку від нуклеотиду, оскільки додавання іонів ванадію, який є інгібітором АТФ-ази, різко знижує її активність. Щодо специфічних інгібіторів, то на ці протеїнази значно впливають і п-ХМБ, і ФМСФ, і пепстатин А. Це узгоджується з даними літератури щодо мультикаталітичності АТР-залежних протеїназ і щодо наявності в їхніх каталітичних центрах різних активних груп. На користь активних сульфгідрильних груп в молекулі цих ферментів свідчить зростання їхньої активності за наявності протектора SH-груп - ДТТ. Звертає на себе увагу активуючий вплив іонів кальцію на цю ферментну активність. Цікаво, що додавання ДДС-Na деякою мірою також активує АТФ-залежну протеїназу. Очевидно, під впливом цього іонного детергента від молекули ферменту дисоціюють регуляторні поліпептиди, які гальмують його активність, або розкриваються закриті активні центри. Додавання до середовища інкубації ЕДТА, який зв'язує мінеральні елементи, також не впливає на ці високомолекулярні протеїнази.

Високою протеолітичною активністю відзначаються також ферменти, елюйовані серед білків з молекулярною масою близько 200 кДа. Вони переважно належать до серинових і металопротеїназ, що у значній мірі інгібуються ФМСФ та ЕДТА. Одночасно з тим активність протеїназ цистеїнового і аспартатного типів серед цієї групи білків є низькою. На активність цих ферментів не впливають АТФ і ДТТ, тоді як ДДС-Na знижує їхню активність майже наполовину. Досить значна активація протеїназ з молекулярною масою близько 200 кДа спостерігається під впливом катіонів Ca2+, Mg2+, Zn2+, що разом зі значним інгібуванням їх активності за наявності ЕДТА засвідчує існування серед цих білків металопротеїназ.

У наступній за молекулярною масою (~100 кДа) групі елюйованих при гельфільтрації білків, з якими пов'язана протеїназна активність, переважають протеїнази цистеїнової групи, тоді як активність протеїназ серинового, особливо аспартатного, типу досить низька. На їхню активність значною мірою впливає цинк, тоді як дія інших катіонів на неї незначна. Очевидно, серед білків з молекулярною масою близько 100 кДа є декілька протеолітичних ферментів, що володіють різними властивостями, що пов'язано з їхнім різним функціональним значенням у метаболічних перетвореннях і особливостями регуляції їх активності. Про це може свідчити їхня різна чутливість до специфічних інгібіторів та інших модуляторів. З усіх перелічених інгібіторів протеїназ, які додавали до інкубаційної суміші, найбільше впливає на протеолітичну активність ФМСФ. Тому можна вважати, що основна частина активності серед цих білків припадає на ферменти серинового типу. Разом з тим п-ХМБ також інгібує деяку їхню частку. Тобто, серед цих протеїназ є і ферменти, які нагадують калпаїни - нейтральні цистеїнові регуляторні протеїнази в тканинах вищих тварин. Свідченням цього є виявлений досить значний позитивний вплив кальцію на їхню активність.

Протеїнази серед білків з молекулярною масою близько 60 кДа, за інгібіторним аналізом, також є гетерогенною групою ферментів, оскільки різні застосовувані інгібітори пригнічують їх активність. Виразний вплив на рівень їх активності з досліджуваних катіонів виявляє лише цинк. ДДС-Na також гальмує їх активність, що засвідчує розрив під впливом цього детергента іонних зв'язків у молекулах цих ферментів і наявність у них третинної і четвертинної структури. Щодо протеїназ з молекулярною масою ~ 40 кДа, то з інгібіторів лише ФМСФ і ЕДТА вірогідно змінюють їхню активність.

Бактеріальні білки з молекулярною масою ~ 30 кДа також володіють досить високою протеолітичною активністю, причому серед них спостерігаються ферменти, чутливі до різних типів інгібіторів. Найактивніші серед них аспартатні протеїнази, оскільки при додаванні пепстатину А казеїнолітична активність білків цієї групи знижується більше, ніж на половину. Необхідно зазначити, що під вливом ДТТ спостерігається вірогідне зростання активності протеїназ серед цієї групи білків, що вказує на важливе значення відновленої сірки у їхній активності. Щодо ДДС-Na, то додавання цього детергента до інкубаційної суміші інактивує в деякій мірі ці протеїнази.

Отже, протеїнази вмісту рубця і 12-палої кишки характеризуються значною різноманітністю. Серед них є, безперечно, ферменти, яким властиві специфічні регуляторні властивості; інші володіють значно ширшою білокдеградуючою специфічністю. До перших належать АТФ-залежні високомолекулярні протеїнази, які каталізують реакції, зв'язані з затратами енергії. Вони включені в процесінг біологічно активних поліпептидів, процеси транспорту та інші реакції, пов'язані з регуляторними функціями клітин. До другої групи протеїназ, які каталізують деградацію білкових молекул, можна зачислити ферменти з меншою молекулярною масою.

ВИСНОВКИ

У дисертації подано теоретичне узагальнення і нове вирішення наукового завдання, яке полягає у визначенні особливостей деградації білків у рубці та 12-палій кишці телят у перші місяці їхнього життя. Наведено дані щодо протеолітичних ферментів різних фракцій вмісту рубця, їхніх деяких фізико-хімічних властивостей, залежності їхньої активності від концентрації протонів водню, наявності інгібіторів, активаторів, катіонів.

У результаті вирішення поставленого завдання зроблено такі висновки:

Вміст білків у рубці і 12-палій кишці телят у перші два місяці життя вірогідно зростає, а в старшому віці змінюється незначно. З 1- до 6-місячного віку у рубці телят вірогідно збільшується кількість клітин симбіотичних бактерій і інфузорій. Причому кількість перших зростає за цей період у 3 рази, останніх - у 6 разів.

З віком телят у вмісті рубця і хімусі 12-палої кишки зростає активність протеїназ. Рівень їхньої активності за нейтральних значень рН протягом перших 6-ти місяців життя тварин підвищується у 3 рази, а рівень активності кислих протеїназ - у 2 рази.

Протеїнази рубця і 12-палої кишки телят відзначаються значною гетерогенністю і спорідненістю до білків-субстратів. Порівняно швидко деградується ними казеїн, гемоглобін, а також альбумін. Розщеплення перших двох білків відбувається переважно завдяки сериновим протеїназам, а останнього - завдяки ферментам цистеїнового типу.

Інтенсивність розщеплення у вмісті рубця білків макухи протеїназами після її екструзії знижується, а інтенсивність розщеплення білків гороху - підвищується. Деградація білків макухи і гороху в рубці здійснюється переважно цистеїновими протеїназами, а у 12-палій кишці - сериновими.

Активність казеїнолітичних протеїназ у рубці телят з віком знижується; активність ферментів деградуючих гемоглобін і альбумін у 6-місячних телят вища, ніж у 1-місячних. Активність протеїназ, що розщеплюють білки гороху і макухи у рубці телят підвищується після переходу з молочної годівлі на рослинну.

Найбільше впливають на протеолітичну активність рубцевої рідини і хімусу 12-палої кишки інгібітори серинових протеїназ (в середньому інгібування, відповідно, на 80 і 50%); вплив інгібіторів цистеїнових протеїназ, аспартатних протеїназ і металопротеїназ значно менший (18 і 10%, 11 і 19%, 10 і 15%, відповідно).

Значна активація протеолітичної активності у вмісті рубця спостерігається при додаванні до середовища іонів металів, причому вони неоднаково впливають на різні групи протеїназ. Кальцій значно стимулює цистеїнові ферменти, цинк - металопротеїнази. Магній дещо більше впливає на ферменти серинового типу, ніж на аспартатні, тоді як марганець, навпаки, значною мірою активує останні. Хром(ІІІ), кобальт(ІІ), мідь(ІІ) у концентраціях 10 мМ на активність протеїназ вмісту рубця помітно не впливає, а кадмій у цій же концентрації значно її інгібує.

Різні сполуки сірки неоднаково впливають на активність протеолітичних ферментів вмісту рубця і хімусу 12-палої кишки телят. Окиснені сполуки цього елемента (сульфати, окиснений глутатіон) знижують їх активність, причому це зниження відбувається переважно за рахунок ферментів цистеїнового типу. Цистеїн, відновлений глутатіон, дитіотреітол, навпаки, їх активують.

У рубці телят максимальна активність протеїназ виявлена при рН ~7, тоді як у 12-палій кишці вона вища при кислих значеннях рН, і нижча при нейтральних значеннях.

У вмісті рубця телят протеїнази розподілені серед білків різних фракцій. Найвищим рівнем активності цих ферментів з оптимумом дії за нейтральних значень рН відзначається бактеріальна фракція (48%); у фракціях інфузорій, кормових частинок і безклітинній рідині їх рівень значно нижчий (відповідно, 23, 10 і 19%). Найвищу активність кислих протеїназ виявлено в безклітинній рідині і кормових частинках вмісту рубця.

Протеїнази фракцій бактерій і інфузорій вмісту рубця телят за фізико-хімічними і функціональними властивостями відзначаються значною гетерогенністю. Основна частина протеолітичної активності симбіотичних мікроорганізмів пов'язана, за даними гельфільтрації, з білками молекулярною масою ~400, 200, 100, 60, 30-40 і 10-20 кДа. Ці ферменти відзначаються неоднаковою чутливістю до різних значень рН середовища, катіонів та деяких інших регуляторних чинників.

Здійснено часткове очищення нейтральної серинової протеїнази (в ~70 разів) із безклітинної рідини рубця телят і досліджено деякі її властивості.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Сологуб Л.І, Герасимів М.Г., Якимовець О.М. Метаболізм азотових сполук в рубці жуйних тварин// Біологія тварин.-1999. - Т.1, №1. - С.11-21.(Дисертант брала участь в аналізі літературних джерел та написанні статті).

Гідролітичні процеси в рубці телят у зв'язку з онтогенезом / О.М. Якимовець, М.Г. Герасимів, В.С. Скварук, І.С. Пашковська, Л.І. Сологуб // Наук.-техн. бюл. ІЗіБТ (Сер.- фізіологія і біохімія). - 1999. - Вип.1, №3. -С.88-91. (Дисертант провела дослідження протеолітичної та целюлолітичної активностей, брала участь в опрацюванні експериментальних даних, написанні статті).

Клепач Л.В., Снітинський В.В, Якимовець О.М. Зміни інтенсивності протеолітичних процесів у рубці телят під впливом екструзії корму // Наук.-техн. бюл. ІЗіБТ (Сер.- фізіологія і біохімія). - 1999. - Вип. 1, №3. - С.120 - 122. (Дисертант провела дослідження розщеплюваності протеїну кормів, статистичне опрацювання експериментальних даних, брала участь в аналізі результатів досліджень).

Мікроорганізми рубця великої рогатої худоби і їх гідролітична активність при годівлі їх різними раціонами / О.М. Якимовець, О.А. Войтюк, Л.І. Сологуб, М.Г. Герасимів // Науковий вісник Львів. держ. акад. вет.мед. ім.С.З. Гжицького. -. 2000. - Т.2, №2. - С.197 - 200.(Дисертант брала участь у проведенні досліджень підрахунку кількості клітин бактерій та інфузорій в рідині рубця, кількості протеолітичних бактерій, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні статті).

Стефанишин О.М., Сологуб Л.І. Протеази вмістимого рубця великої рогатої худоби// Біологія тварин. - 2000. - Т.2, №2. - С.76-79. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні статті).

Стефанишин О.М., Сологуб Л.І. Позаклітинні нейтральні протеїнази вмістимого рубця бичків// Наук.-техн. бюл. ІБТ. - Львів, 2000. -Вип.2. - С.99-103. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні статті).

Огородник Н.З., Стефанишин О.М. Вікові особливості обмінних процесів в рубці телят// Наук.-техн. бюл. ІБТ. - Львів, 2001. -Вип.1-2. - С.215-219. (Дисертант провела дослідження загальної протеолітичної активності, визначенні мікробної маси, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні статті).

Вміст білків і протеолітична активність в рубці і 12-палій кишці бичків у зв'язку з віком / О.М. Стефанишин, М.Г. Герасимів, Л.І. Сологуб, Л.В. Клепач // Вісник Полтавського с.-г. ін-ту.-2001.-№2.- С.138. (Дисертант провела дослідження протеолітичної активності, визначенні кількості білків бактерій, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні статті).

Stephanishyn O.M., Solohub L.I Proteinases of protozoa in rumen of cattle// Біологія тварин. - 2002. - Т.4,№1-2. - С.136-140. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та перекладі статті).

Стефанишин О. М. Вміст білків і активність протеїназ в рубці і 12-палій кишці телят в перші місяці після народження // Наук.-техн. бюл. ІБТ. - Львів, 2002. -Вип.4, №1. - С.134-137.

Влияние типа кормления на рост популяции микроорганизмов и гидролитическую активность в рубце телят / О. М.Якимовец, А. А.Войтюк, М. Г.Герасымив, Л.И. Сологуб // Тез. докл. ІІІ Междун. конф. “Актуальные проблемы биологии в жывотноводстве”. - Боровск (Россия): ВНИИФБиП с.-х. животных. - 2000. -С.255-256. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень протеолітичної та целюлолітичної активностей, підрахунку кількості клітин бактерій та інфузорій, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та перекладі тез доповіді).

Stephanishyn O., Solohub L. The investigations of proteases in the rumen content of steers // 1-Polish-Ukrainian Sci.Conf.”Animal Sciences in the XXI Century”. - Kracow, 2001. - Р.207-211. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та перекладі тез доповіді).

АНОТАЦІЯ

Стефанишин О. М. Особливості протеолітичних процесів у травному тракті телят. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. Інститут біології тварин УААН, Львів, 2003.

Дисертацію присвячено вивченню властивостей протеолітичних ферментів у рубці і дванадцятипалій кишці, їхніх регуляторних особливостей на різних етапах постнатального розвитку телят залежно від дії ендогенних і екзогенних чинників та з'ясуванню можливостей скеровано впливати на їхній рівень з метою збільшення або зменшення їхньої активності, водночас інтенсивності розщеплення окремих білкових полімерів. З віком у телят у рубцевій рідині та хімусі дванадцятипалої кишки активність протеїназ зростає. Рівень їхньої активності при нейтральних значеннях рН протягом перших шести місяців життя тварин підвищується у 3 рази, а активність кислих протеїназ - у 2 рази. Протеїнази рубця і дванадцятипалої кишки телят відзначаються значною гетерогенністю і спорідненістю до білків субстратів. Порівняно швидко деградується ними казеїн, гемоглобін, а також альбумін. Розщеплення перших двох білків відбувається, в основному, сериновими протеїназами, а останнього - ферментами цистеїнового типу.

Виконано хроматографічне розділення білків фракцій бактерій і інфузорій рубцевої рідини, яким властива протеолітична активність, та продемонстровано значну їхню гетерогенність як за молекулярною масою, так і за фізико-хімічними властивостями.

Ключові слова: рубець, дванадцятипала кишка, протеолітична активність, протеїнази, бактерії, інфузорії.

АННОТАЦИЯ

Стефанишин О. М. Особенности протеолитических процессов в пищеварительном тракте телят. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. Институт биологии животных УААН, Львов, 2003.

Диссертация посвящена актуальному вопросу - исследованию особенностей протеолитических процессов в пищеварительном тракте телят разных возрастов и влиянию на их активность эндогенных и экзогенных факторов.

Наиболие влияют на протеолитическую активность содержимого рубца и химуса двенадцатиперстной кишки ингибиторы сериновых протеиназ (в среднем на 80 и 50% соответственно). Влияние ингибиторов цистеиновых, аспартатных и металлопротеиназ значительно меньше (18 и 10%, 11 и 19%, 10 и 15%, соответственно).

Установлено также, что протеиназы рубца и двенадцатиперстной кишки телят характеризируются значительной гетерогенностью и различным сродством к белкам субстратов. Сравнительно быстро ими деградируются казеин, гемоглобин, альбумин. Расщепляемость первых двух белков происходит, в основном, сериновыми протеиназами, а последнего - ферментами цистеинового типа.

В рубце телят максимальная активность протеиназ выявлена при рН~7, тогда как в двенадцатипертной кишке она выше при кислых значениях рН.

В содержимом рубца телят протеиназы распределены среди белков разных фракций. Наиболие высокий уровень активности этих ферментов с оптимумом действий при нейтральных значениях рН установлено в бактериальной фракции (48%). В фракциях инфузорий, грубых остатках кормов и бесклеточной жидкости уровень активности протеиназ значительно ниже (23, 10 и 19%, соответственно). Высокой активностью кислых протеиназ характеризируются фракции бесклеточной жидкости и грубых остатков кормов содержимого рубца.

Осуществлено хроматографическое разделение белков фракций бактерий и инфузорий рубцовой жидкости, которым свойственна протеолитическая активность, показана значительная их гетерогенность как по молекулярному весу, так и по физико-химическим свойствам.

Осуществлено частичную очистку нейтральной сериновой протеиназы (в ~70 раз) из бесклеточной жидкости рубца телят и исследовано некоторые её свойства.

Ключевые слова: рубец, двенадцатиперстная кишка, протеолитическая активность, протеиназы, бактерии, инфузории.

SUMMARY

Stephanishyn O.M. The peculiarities of proteolytic processes in the digestive tract of calves.- Manuscript.

Thesis for degree of candidate of biology sciences by speciality 03.00.04 - biochemistry. - Institute of Animal Biology of UAAS, L'viv, 2003.

The dissertation is devoted to investigations of properties of proteolytic enzymes and their regulatory peculiarities in the rumen content and duodenal chyme from 1 till 6 month old calves.

The changes of bacteria and protozoa proteins concentration in the rumen content during the first month of postnatal life markedly increases, simultaneously with the intensification of feed proteins degradation. The ratio between the quantity of feed proteins and microorganisms proteins with the age of calves decreases. The levels of protozoa proteins and bacteria proteins in the rumen liquid is approximately equal and their ratio with the age slightly rises. The proteolytic activity of rumen content during postnatal period increases.

The investigations of physical and chemical properties of rumen proteinases showed their great heterogeneity.

Key words: calves, rumen, microorganisms, bacteria, protozoa, duodenal chyme, proteolytic enzymes.

Підписано до друку 18.03.2003 р. Формат видання 145х215 мм

Формат паперу 60х90/16. Друк різогр. Папір офсетний.

Умовних аркушів 0,9. Тираж 100 прим. Замовл. №21.

Віддруковано з готових діапозитивів у друкарні

Львівського обласного управління статистики,

79058, Львів, просп. В. Чорновола, 4.

Размещено на Allbest.ru