Регуляція дозрівання ооцитів та відтворювальної функції корів при дії гормонів in vitro та in vivo

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

ШТАПЕНКО ОКСАНА ВСЕВОЛОДІВНА

УДК 636.2:577.17:591.465.12

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

РЕГУЛЯЦІЯ ДОЗРІВАННЯ ООЦИТІВ ТА ВІДТВОРЮВАЛЬНОЇ ФУНКЦІЇ КОРІВ ПРИ ДІЇ ГОРМОНІВ IN VITRO ТА IN VIVO

03.00.04 - біохімія

Львів - 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології тварин УААН.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор Розгоні Іван Іванович, Інститут біології тварин УААН, головний науковий співробітник лабораторії біотехнології і генетики.

Офіційні опоненти:

доктор сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник Стапай Петро Васильович, Інститут біології тварин УААН, завідувач лабораторії фізіолого-біохімічних основ вовноутворення;

доктор ветеринарних наук, професор Хомин Степан Петрович, Львівська національна академія ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького, завідувач кафедри акушерства і штучного осіменіння сільськогосподарських тварин.

Провідна установа: Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок Міністерства аграрної політики України, відділ фармакології і імунології, м. Львів.

Захист відбудеться ''2'' червня 2004р. о12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН за адресою: вул. В. Стуса,38, м. Львів 79034.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН (вул. В. Стуса, 38, м. Львів 79034).

Автореферат розісланий ''29'' квітня 2004р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Віщур О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Широке запровадження методу трансплантації ембріонів у практику молочного скотарства для того, щоб одержати максимальну кількість телят від високопродуктивних корів вимагає вдосконалення окремих його стадій (Шаловило С.Г., 1996; Буркат В.П., 1997; Gandolfi F. et al., 2000; Безуглий М.Д., 2002; Шеремета В.І., 2002). Насамперед це стосується методів викликання суперовуляції у корів, культивування ооцитів та їх запліднення in vitro з метою одержання максимальної кількості повноцінних ооцитів та ембріонів (Лобченко В.А., 1991; Osaki S., 1997; Кузнецов В.Є., 1998; Campbell B.K., 1999; Kikuchi K., 1999; Гузеватий О.Є., 2002). У вирішенні цих питань важливе значення мають дослідження біохімічних і молекулярних механізмів гормональної регуляції оогенезу в яєчниках корів та дозрівання ооцитів. Вихід повноцінних зрілих ооцитів у процесі культивування їх in vitro значною мірою залежить від культурального середовища, яке повинно максимально наближатися до середовища у яйцепроводі і матці та забезпечувати високу життєздатність яйцеклітин, їх дозрівання і запліднення (Howard H.J., 1992; Хомин С.П., 1997; Greve T., 1998; Лобачева І.В., 2001; Guler A., 2002;). Згідно з цим, науково-практичний інтерес становить дослідження впливу окремих гормонів та інших біологічно активних речовин під час додавання їх до культурального середовища на біохімічні і морфологічні процеси в ооцитах, здатність їх до запліднення in vitro, з одного боку, та впливу виготовлених на основі отриманих результатів гормональних препаратів на оо- та фолікулогенез у корів і телиць - з іншого.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Подані у дисертації результати є фрагментом досліджень, проведених у лабораторії клітинної інженерії Інституту біології тварин УААН у 1996-2000 роках при виконанні завдання “Вивчити молекулярні механізми регуляції обмінних процесів у репродуктивних органах самок, ооцитах і ембріонах та розробити способи стимуляції процесів відтворення у корів і свиноматок. Удосконалити склад інкубаційних середовищ для запліднення in vitro” (шифр 07.12.01 № держреєстрації 0196U010474).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - дослідити дію гормонів на біосинтетичні процеси в клітинах ооцит-кумулюсних комплексів з яєчників корів та клітинах тканин статевозрілих телиць з метою підвищення ефективності гормональної стимуляції обмінних процесів у репродуктивних та інших органах корів і телиць.

Для досягнення цієї мети поставлено такі завдання:

з'ясувати вплив біологічно активних речовин, які продукують клітини яєчника, яйцепроводу та епідидимісу, під час додавання їх до культурального середовища на морфофункціональний розвиток і біохімічні процеси в ооцитах, отриманих з яєчників корів;

вивчити вплив інсуліну, преднізолону, гідрокортизону, естрадіолу і прогестерону при додаванні їх до культурального середовища на морфологічний розвиток і біохімічні процеси в ооцитах;

дослідити морфо-функціональні особливості яєчників телиць при введенні їм інсуліну і преднізолону у формі ліпосомальної емульсії;

- дослідити вплив інсуліну і преднізолону при введенні їх телицям у складі гормонально-вітамінних препаратів на вміст білка, РНК і ДНК у субклітинних фракціях ендометрію, яєчників, печінки, наднирників;

розробити ефективний гормонально-вітамінний препарат для стимуляції функції яєчників у корів з метою отримання максимальної кількості повноцінних ооцитів.

Об'єкт дослідження - вплив інсуліну, преднізолону, гідрокортизону, кортикотропіну, естрадіолу, прогестерону на морфологічний розвиток і біохімічні процеси в ооцитах при додаванні їх до культурального середовища на дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів (ОКК) в умовах in vitro, вплив інсуліну і преднізолону при введенні їх телицям у складі гормонально-вітамінного препарату на вміст нуклеїнових кислот і співвідношення окремих фракцій білків у тканині ендометрію, яєчника, печінки, наднирника.

Предмет дослідження - ооцит-кумулюсні комплекси, яєчники, ендометрій, печінка, наднирники.

Методи дослідження - біохімічні (дослідження концентрації загального білка і його фракцій у сироватці крові та тканинах репродуктивних органів; виділення ядер з клітин тканин; визначення вмісту нуклеїнових кислот в ОКК і тканинах); біотехнологічні (одержання, дозрівання ооцитів поза організмом, виділення клітин гранульози, одержання цитозолю клітин гранульози, яйцепроводу, епідидимісу, гормональна стимуляція); морфологічні (оцінка ОКК за морфологічними показниками); морфометричні (встановлення органометричних показників яєчника); ветеринарні (ректальні дослідження та визначення загального клінічного стану телиць); радіологічні (інкубація ОКК з міченою амінокислотою).

Наукова новизна одержаних результатів. З'ясовано, що додавання інсуліну, естрадіолу і преднізолону в культуральне середовище стимулює мейоз в ооцитах, синтетичні процеси у ядерному та цитоплазматичному апараті клітин кумулюсу, підвищує інтенсивність їх поділу та росту і покращує морфологічну характеристику ооцитів та кумулюсних клітин. Виявлено стимулюючий вплив клітин гранульози та цитозолю клітин слизової оболонки яйцепроводу на мейотичне дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів in vitro. ооцит корова статевозрілий

Удосконалено культуральне середовище для дозрівання ооцитів великої рогатої худоби in vitro шляхом додавання до нього естрадіолу, прогестерону, інсуліну, преднізолону, клітин гранульози фолікулів, цитозолю клітин слизової оболонки яйцепроводів. З'ясовано перевагу використання у системі культивування in vitro ооцитів різних доз гормонів та показано позитивний вплив комбінованого їх використання при дозріванні ооцит-кумулюсних комплексів.

Розроблено комплексні гормональні препарати, до складу яких входить інсулін або преднізолон, для стимуляції охоти у телиць і корів.

Практичне значення одержаних результатів. На основі проведених досліджень і теоретичних узагальнень, які описано у дисертаційній роботі, удосконалено метод дозрівання in vitro ооцитів великої рогатої худоби під час додавання до культурального середовища інсуліну, преднізолону та їхнього комплексу. Розроблено новий гормонально-вітамінний препарат пролонгованої дії, що містить інсулін, гонадотропін, естрадіол, вітаміни А, D₃, Е для стимуляції охоти у телиць і корів та отримання більшої кількості високоякісних ОКК.

Запропоновано комплексний гормонально-вітамінний препарат у вигляді ліпосомальної емульсії з преднізолоном з метою пролонгованого впливу на овуляторні процеси в яєчнику корів при стимуляції естрального циклу.

Результати, одержані при дослідженні механізмів дозрівання ооцитів поза організмом, можуть використовуватися у навчальному курсі з біотехнології розмноження сільськогосподарських тварин.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно провела аналіз літератури за темою дисертаційної роботи, виконала експериментальні дослідження і проаналізувала отримані результати, опублікувала матеріали досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення і результати досліджень доповідались та обговорювались на: щорічних звітних сесіях Інституту біології тварин УААН (1997-2000); XV з'їзді фізіологів України (м. Львів, 12-15 травня 1998 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми ветеринарної медицини з питань фізіології і патології відтворення тварин” (м. Київ, 19-20 травня 2000 р., НАУ); Міжнародній науково-практичній конференції, приуроченій 100-річчю від дня народження академіка О.В. Квасницького “Проблеми відтворення, трансплантації та фізіології травлення с.-г. тварин” (м. Полтава, лютий 2000 р., ПДСГІ); Міжнародній конференції до 100-річчя від дня народження академіка С.З. Гжицького (м. Львів, 4-6 травня 2000 р., ЛДАВМ); науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів “Досягнення молодих вчених у вирішенні проблем тваринництва” (м. Львів, 8 грудня 2003 р., ІБТ).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 7 наукових праць, з яких 6 статей у фахових виданнях ВАК України та 1 тези доповідей.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, їхнього аналізу і узагальнення, висновків, практичних рекомендацій, списку використаної літератури, який містить 309 праць, у тому числі 167 іноземних. Робота викладена на 154 сторінках друкованого тексту, містить 37 таблиць, 11 рисунків та 2 додатки. Загальний обсяг ілюстрацій і таблиць - 27 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Складається з 4 підрозділів, в яких наведено аналіз наукової літератури, що стосується питань впливу біологічно активних речовин, зокрема, інсуліну, кортикостероїдів, естрогену на повноцінне дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів in vitro та відтворювальну функцію корів.

Загальна методика та основні методи досліджень. Для досліджень використовували ооцит-кумулюсні комплекси, отримані з яєчників клінічно здорових телиць і корів чорно-рябої породи. Ооцити з яєчників отримали шляхом відсмоктування фолікулярної рідини шприцом з антральних фолікулів діаметром 2-8 мм. Відібрані після морфологічної оцінки ооцит-кумулюсні комплекси тричі промивали в середовищі ТСМ-199 з додаванням 1%-ої естральної сироватки та 20-30 од/мл гепарину “Biochemi”. В одноразові мікрочашки переносили по 5 ооцит-кумулюсних комплексів, до яких додавали 200 мкл культурального середовища, що складалося з середовища ТСМ-199 або ДМ-335 (“Gibco”, Англія), 20% від об'єму середовища попередньо інактивованої естральної або фетальної сироватки, фолікулостимулюючого гормону (“Sigma”, 0,012 мг/мл), пеніциліну (80 мкг/мл) і стрептоміцину (50 мкг/мл), пірувату натрію (“Sigma” 0,87 мг/мл) і лактату кальцію (“Sigma” 120 мкл/мл ) та досліджуваних компонентів, залежно від варіанту досліду.

Культивували ооцити протягом 24-х годин в термостаті при 38С в атмосфері повітря, що містило 5-7% СО₂. Оцінювали якість ооцитів візуально за морфологічними ознаками до і після 24-х годин культивування за допомогою мікроскопа МБС-9.

Для забезпечення повноцінного дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів в умовах in vitro використовували такі біологічно активні речовини: синтетичний аналог простагландину F2-естрофан у кількості 0,5 мкг/мл, клітини гранульози фолікулів у кількості 3Ч10⁶ клітин/мл, цитозоль епітеліальних клітин яйцепроводів у кількості 5, 10, 20, 40 мкг/мл, гранульози фолікулів у кількості 5, 10, 20, 30, 40 мкг/мл і епідидимісів у кількості 6 та 10 мкг/мл. Цитозоль клітин отримували під час гомогенізації клітин у середовищі ТСМ-199 у співвідношенні 1:1 з наступним їх центрифугуванням при 20 тис об/хв протягом 45 хвилин.

До культурального середовища під час інкубації ооцитів додавали гормони: 17-естрадіол у кількості 1; 4; 7; 10 мкг/мл, прогестерон - 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 мкг/мл та їхні ліпосомальні емульсії (1 мкг/мл естрадіолу та 0,1 мкг/мл прогестерону), інсулін у кількості 0,025; 0,05; 0,075; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 ІО/мл, гідрокортизон - 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 5,0; 10; 50 мкг/мл, кортикотропін - 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 3,5; 4,0; 5,0 мкг/мл, преднізолон - 0,2; 0,4; 0,5; 0,6; 1,0; 2,0; 8,0 мкг/мл. Про вплив гормонів на синтез білка в ооцит-кумулюсних комплексах аналізували за ступенем включення [2-¹⁴С]аланіну в білки при їхній інкубації. Радіоактивність синтезованих білків визначали на рідинному сцинтиляційному лічильнику LKB (Швеція), використовуючи сцинтиляційну рідину ЖС-9. Інтенсивність включення радіоактивної мітки виражали в тис імп/хв на 1 мг білка.

Після встановлення оптимальної кількості гормонів під час дослідження їхнього впливу на розвиток ооцитів при додаванні до інкубаційного середовища досліджували комплексну дію на ооцит-кумулюсні комплекси. У дослідженнях використовували комплекс гормонів: інсулін 0,2 ІО/мл і естрадіол 4 мкг/мл; інсулін 0,1 ІО/мл і естрадіол 1,0 мкг/мл; естрадіол 1 мкг/мл і преднізолон 0,2 мкг/мл; естрадіол 4 мкг/мл і преднізолон 0,4 мкг/мл; інсулін 0,1 ІО/мл, естрадіол 1 мкг/мл, преднізолон 0,2 мкг/мл; інсулін 0,2 ІО/мл, естрадіол 4 мкг/мл, преднізолон 0,4 мкг/мл.

На другому етапі проведено дослід на статевозрілих телицях 16-20-місячного віку, стимуляцію статевої охоти в яких викликали шляхом уведення комплексних гормонально-вітамінних препаратів, що містять інсулін і преднізолон. Фолікуло- і оогенез у досліджуваних телиць викликали шляхом внутрішньом'язового введення їм гормонально-вітамінного препарату “Овоген“. В одній дозі цього препарату (10 мл) містилось: гонадотропін - 1000-1200 ІО, естрадіол дипропіонат - 0,75 мг, тестостерон пропіонат - 7,5 мг, вітаміни А - 7,5 тис ІО, D₃ - 10 тис ІО, Е - 5,0 мг. Тварин, після синхронізації статевого циклу естрофаном в дозі 500 мкг, розділили на дві дослідні та контрольну групи по три голови у кожній. У лютеїнову фазу статевого циклу телицям усіх груп підшкірно вводили гормонально-вітамінні препарати у складі ліпосом. Телицям контрольної групи внутрішньом'язово вводили лише гормонально-вітамінний препарат “Овоген“. Телицям першої дослідної групи підшкірно вводили гормонально-вітамінний препарат “Овоген“, до якого додавали Б-інсулін SC пролонгованої дії в дозі 100 ІО/гол. Телицям другої дослідної групи підшкірно вводили гормонально-вітамінний препарат “Овоген“, до якого додавали преднізолон у дозі 50 мг/гол. Через 48 годин після цього тваринам внутрішньом'язово вводили естрофан у дозі 2 мл на голову. Тварин забивали на 7-й день статевого циклу. Для досліджень відбирали зразки ендометрію, яєчників, печінки, наднирників, які охолоджували до температури 2С. У стерильному боксі проводили морфологічну та морфометричну оцінку отриманих яєчників, з фолікулів аспірували ооцити та культивували їх протягом 24-х годин за вищезгаданою методикою. У біохімічних дослідженнях також використовували виділені з клітин досліджувальних тканин ядра і мітохондрії, в яких визначали вміст РНК та ДНК (Цанев Р.Г., Марков Г.Г., 1960). У сироватці крові визначали вміст загального білка за допомогою рефрактометра МРФ-22, співвідношення окремих білкових фракцій методом електрофорезу. Статистичну обробку одержаних цифрових даних проводили за допомогою оцінки вірогідності порівнювальних показників з обчисленням критерію Ст'юдента.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив інсуліну на дозрівання ооцитів корів in vitro. Культивування ооцит-кумулюсних комплексів проводили в середовищі, що містило інсулін у кількості 0,025; 0,05; 0.075; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 ІО/мл. З'ясовано, що додавання до культурального середовища інсуліну в низьких концентраціях (0,025 ІО/мл) незначно впливало на рівень мейотичного дозрівання ооцитів та вміст в них РНК і ДНК, тоді як більш високі дози гормону (0,2, 0,3 ІО/мл) підвищують вихід повноцінних ооцитів (відповідно 76% і 82% ооцитів 1-ї катерогії, проти 64% в контролі) та викликають в ОКК інтенсивний поділ і наростання клітин кумулюсу, що вказує на дозрівання ооцитів до метафази ІІ та їхню здатність до запліднення та подальшого розвитку (Лобачова І.В., 1997).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.1. Результати дозрівання ОКК після 24-х годин культивування у середовищі, доповненому інсуліном.

Вміст РНК і ДНК в цих ооцитах теж був вищий, ніж у контролі. Підвищення концентрації інсуліну в культуральному середовищі до 0,4 ІО/мл приводило до зменшення виходу дозрілих ооцитів 1-ї категорії до 53,3%, а ооцитів 2-ї категорії до 33% проти 64% і 20% у контролі.

У результаті досліджень встановлено, що додавання інсуліну до культурального середовища у дозах 0,2 і 0,3 ІО/мл позитивно впливає на дозрівання ОКК, що зумовлено стимулюючим впливом гормону на мітотичні процеси в ооцитах (Peluso I.I. et аl., 1987).

Вплив кортикостероїдних гормонів на дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів in vitro. У результаті додавання 3, 5 та 10 мкг/мл гідрокортизону в культуральне середовище морфологічні показники ОКК покращуються, в них зростає вміст загальної РНК (відповідно до 0,358; 0,495 і 0,414 мкг проти 0,334 мкг у контролі) при незначному зниженні вмісту ДНК. Концентрація гідрокортизону в культуральному середовищі в межах 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 мкг/мл позитивно впливає на якість ОКК. Особливо виражений цей вплив під час уведення гідрокортизону в дозі 2,0 мкг/мл. Після культивування усі ОКК належать до 1-ї категорії, вони відзначаються світлою, рівномірно гранульованою ооплазмою та інтенсивним розростанням клітин кумулюсу. Найбільше підвищення концентрації нуклеїнових кислот у досліджуваних ОКК простежувалось під час додавання гідрокортизону до середовища в дозі 2,0 мкг/мл.

При додаванні до культурального середовища високих доз кортикотропіну (3,0; 4,0; 5,0 мкг/мл) збільшується вихід ооцитів з ознаками дегенерації, яке характеризується зниженням якості ооплазми та розрихленням кумулюсу з його відділенням від ооциту. При додаванні до середовища кортикотропіну в кількості 0,25; 0,5; 1,0 і 2,0 мкг/мл теж відзначається відсутність позитивного впливу на якість ОКК під час їхнього дозрівання.

Зі всіх досліджуваних гормональних препаратів найбільший ефект на дозрівання ооцитів виявився при додаванні до культурального середовища преднізолону.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.2. Результати дозрівання ОКК після 24-х годин культивування у середовищі, доповненому преднізолоном.

Проведені дослідження показали, що низькі концентрації (0,2; 0,4; 0,5; 0,6; 1,0 мкг/мл) преднізолону при додаванні його до культурального середовища позитивно впливають на дозрівання ооцитів та функціональний стан клітин кумулюсу. Так, після 24-х годин культивування в контролі 67,5% ОКК були віднесені до 1-ї категорії, 25% - до 2-ї, 2,5% - до 3-ї, 5% - до 4-ї, тоді як у результаті введення преднізолону в культуральне середовище в дозі 0,5 і 0,6 мкг/мл всі ОКК були віднесені до 1-ї категорії, у них простежується щільний, багатошаровий кумулюс. Вміст нуклеїнових кислот в ОКК збільшується також при менших дозах преднізолону в середовищі. Збільшення дози преднізолону до 1,0 мкг/мл, поряд із покращенням морфологічних ознак ОКК, приводить до збільшення вмісту в ОКК РНК і ДНК, а вищі його концентрації (2,0 і 8,0 мкг/мл) викликають збільшення кількості дегенерованих ооцитів і зниження компактності кумулюсного шару. Загалом результати досліджень показали, що введення преднізолону в культуральне середовище в дозі 0,2 та 0,4 мкг/мл викликає найінтенсивніший ріст клітин кумулюсу та забезпечує повноцінне дозрівання ОКК до метафази ІІ.

Вплив комплексу різних гормональних препаратів на розвиток ооцит-кумулюсних комплексів in vitro. Проведені дослідження показали, що під час культивування ОКК у середовищі, яке містило 0,1 ІО/мл інсуліну і 1,0 мкг/мл естрадіолу (табл. 1), після культивування 50% ОКК належать до 1-ї, 40% - до 2-ї, 10% - до 3-ї категорії, тоді як у контролі 45% ОКК були 1-ї категорії, 17,5% - 2-ї, 25% - 3-ї та 10% - 4-ї.

Дещо кращі результати були отримані під час культивування ооцитів у середовищі з більшим вмістом гормонів. Так, порівняно з контролем найвищі морфологічні показники після 24-х годин культивування були виявлені в ОКК при додаванні до культурального середовища інсуліну у дозі 0,2 ІО/мл і естрадіолу у дозі 4,0 мкг/мл: 70% ОКК належать до 1-ї, 30% - до 2-ї категорії. Унаслідок цього в ОКК збільшується вміст РНК і ДНК, проте під час уведення гормонів у вищих дозах вміст ДНК в ОКК збільшувався більшою мірою.

Проведені дослідження показали, що додавання до культурального середовища естрадіолу і преднізолону в дозі 1 мкг/мл і 0,2 мкг/мл відповідно викликає найбільш виражене підвищення якості ооцит-кумулюсних комплексів, що проявляється у підвищенні якості і кількості клітин кумулюсу та гомогенності ооплазми ооцитів.

При додаванні естрадіолу і преднізолону в цих дозах після 24-х годин культивування 68% ОКК віднесли до 1-ї, 24% - до 2-ї, 4% - до 3-ї і 4-ї категорій. При культивуванні ОКК у середовищі, яке містило 4 мкг/мл естрадіолу і 0,4 мкг/мл преднізолону, після 24-х годин культивування 70% ОКК були 1-ї категорії, 15% - 2-ї, 5% - 3-ї і 10% - 4-ї, тоді як у контролі 45% ооцитів віднесли до 1-ї категорії, 17,5% - до 2-ї. Додавання естрадіолу і преднізолону до культурального середовища приводить до підвищення вмісту нуклеїнових кислот в ОКК. Так, при додаванні до середовища естрадіолу в дозі 1 мкг/мл і преднізолону в дозі 0,2 мкг/мл вміст РНК збільшується з 0,180 до 0,255 мкг на 1 ОКК, а при збільшенні доз гормонів до 4 мкг/мл та 0,4 мкг/мл відповідно вміст РНК збільшується до 0,302 мкг на 1 ОКК. Водночас у ОКК значно зростає також і вміст ДНК.

Таблиця 1 Вплив комплексу гормональних препаратів на морфологічні показники ооцит-кумулюсних комплексів та вміст у них РНК і ДНК після 24-х годин культивування

Примітка. У цій та наступних таблицях: * - Р0,05; ** - Р0,01; *** - Р0,001 - вірогідна різниця між показниками дослідних груп і контролем.

Додавання до культурального середовища інсуліну, естрадіолу і преднізолону позитивно впливає на розвиток ОКК. При цьому найкращі результати одержані при додаванні до культурального середовища інсуліну в дозі 0,1 ІО/мл, естрадіолу - 1 мкг/мл та преднізолону - 0,2 мкг/мл: 90% ОКК віднесли до 1-ї категорії, 10% - до 2-ї, у всіх ОКК простежується гомогенна ооплазма, клітини кумулюсу чітко контуровані без ознак пікнозу та дегенерації.

У результаті узагальнення даних проведених досліджень на ооцит-кумулюсних комплексах in vitro, можна зробити висновок, що одночасне додавання до культурального середовища інсуліну, естрадіолу і преднізолону стимулює обмінні процеси в клітинах, активує мейотичні процеси в ооцитах та викликає збільшення кількості повноцінно дозрілих in vitro ооцитів, придатних до запліднення, про що свідчить збільшення в них вмісту РНК і ДНК. Одержані результати були передумовою для дослідження впливу комплексу вказаних гормонів на якість ооцитів у статевих органах корів і телиць in vivo.

Вплив інсуліну та преднізолону в складі комплексних гормонально-вітамінних препаратів (ГВП) на біосинтетичні процеси в клітинах тканин статевозрілих телиць. Проведені дослідження показали, що парентеральне введення статевозрілим телицям Б-інсуліну SC пролонгованої дії і преднізолону у складі ГВП з метою стимуляції статевої охоти приводить до збільшення ваги яєчників з 5,37 г у тварин контрольної групи до 8,1 г у тварин 1-ї дослідної групи, яким уводили ГВП, що містив інсулін, та до 9,4 г (Р0,05) у тварин 2-ї групи, яким уводили ГВП, що містив преднізолон. Збільшення ваги яєчників у телиць під час уведення ГВП з інсуліном та преднізолоном в основному зумовлено збільшенням кількості фолікулів та жовтих тіл. При цьому спостерігається також зростання кількості овульованих фолікулів. Так, у тварин контрольної групи в яєчниках овулювали 4 фолікули, в тварин 1-ї дослідної групи, яким уводили інсулін у складі ГВП, виявлено 6, в тварин 2-ї дослідної групи, яким уводили преднізолон у складі ГВП - овулювало 8 фолікулів. Такі ж розбіжності виявлені в кількості жовтих тіл в яєчниках телиць дослідних груп порівняно до телиць контрольної групи.

Для оцінки якості ооцит-кумулюсних комплексів з яєчників телиць контрольної групи отримано 6 ОКК, з яєчників тварин 1-ї дослідної групи - 7 ОКК, і з яєчників телиць 2-ї дослідної групи - 12 ОКК, які були оцінені за морфологічними ознаками. Всі ОКК були високої якості, з оптично однорідною ооплазмою та щільно і рівномірно прилягаючими клітинами кумулюсу. Проте в ОКК, отриманих від телиць 2-ї групи, виявлено в 6-7 разів більше розростання клітин кумулюсу порівнянно з ОКК, одержаних з яєчників контрольних телиць, що свідчить про підвищення мейозстимулюючого впливу кумулюсу на інтенсивність дозрівання ооцитів до метафази ІІ під впливом ГВП з преднізолоном (Лобченко В.А., 1991; Кузнєцов В.Є., 1999).

Після 24-годинного культивування ОКК, отриманих з яєчників досліджуваних телиць після забою, найбільшу кількість повноцінних ооцитів порівняно з контролем, отримали з яєчників телиць 1-ї і 2-ї дослідних груп, яким уводили ГВП, що містив інсулін і преднізолон.

Результати морфологічних досліджень до певної міри узгоджуються з результатами визначення вмісту нуклеїнових кислот в ОКК. Так, вміст РНК в ОКК, отриманих з яєчників тварин, яким уводили ГВП, що містив інсулін, був вищим в 1,2 раза (Р0,05), а вміст ДНК - в 1,1 раза (Р0,05), порівняно з контролем. Вміст нуклеїнових кислот в ОКК, отриманих з яєчників тварин 2-ї дослідної групи порівняно з телицями контрольної групи також підвищувався.

Отже, одержані дані показали, що для ОКК, отриманих з яєчників телиць після парентерального введення їм ГВП, що містив інсулін або преднізолон, та ооцитам після їхнього дозрівання in vitro в середовищі з інсуліном і преднізолоном, характерні морфологічні особливості якісних ооцитів дозрілих до метафази ІІ.

Після введення телицям ГВП, що містив інсулін і преднізолон, у клітинах ендометрію телиць обох дослідних груп у 1,5 раза підвищується вміст ядерного попередника цитоплазматичної рибосомальної РНК (фракція рН 7) (Р0,05) порівняно до його вмісту в ендометрії контрольних тварин. Про підвищення інтенсивності мітотичних процесів у клітинах ендометрію телиць, яким уводили ГВП з преднізолоном, показує також вірогідне зростання вмісту в них ядерної ДНК. Крім того, в ядрах клітин ендометрію телиць, яким уводили інсулін і преднізолон, вірогідно зростає вміст “залишкової” РНК, у мітохондріях збільшувався вміст нуклеїнових кислот (Р0,05 і Р0,01).

Одержані результати показують, що інсулін і особливо преднізолон під час уведення їх телицям у складі ГВП викликають активацію процесів реплікації і транскрипції в матриксі генома, що пов'язано з регуляцією інсуліном фосфорилювання ядерних білків та впливу преднізолону на стероїдну активацію геному (Геворкян Э.С., 2001).

Стимулююча дія інсуліну і преднізолону на синтетичні процеси в ендометрії проявляється також в активізації функції яєчника, зокрема, функції клітин теки і гранульози, що підтверджують морфометричні дослідження. Концентрація попередника цитоплазматичної рибосомальної РНК, що міститься у фракції рН 7 у клітинах яєчників телиць (табл. 2), під час уведення їм інсуліну зростає в 1,4 раза, під час уведення преднізолону - в 1,8 раза (Р0,01). Водночас, у клітинах яєчників дослідних телиць обох груп простежується збільшення вмісту “залишкової” РНК (Р0,05 і Р0,01). Збільшення вмісту мітохондріальних нуклеїнових кислот у клітинах яєчника телиць дослідних груп вказує на посилення синтезу білків у цих клітинних органелах, які відіграють ключову роль в окисненні енергетичних субстратів. Під час уведення телицям ГВП з інсуліном у клітинах яєчника спостерігається вірогідне зростання вмісту мітохондріальної РНК (Р0,05), а під час ін'єкції ГВП з преднізолоном - вмісту ДНК (Р0,05) і РНК (Р0,05).

Інсулін і преднізолон під час уведення їх у складі ГВП посилюють обмінні процеси також у печінці. Так, в ядрах клітин печінки тварин 1-ї та 2-ї дослідних груп вірогідно зростає вміст “залишкової” РНК (Р0,05 та Р0,001).

Про регуляторний вплив цих гормонів на ядерний матрикс геному вказує інтенсифікація реплікації ядерної ДНК у гепатоцитах: концентрація ДНК у клітинах печінки телиць 1-ї і 2-ї дослідних груп значно вища (Р0,05; Р0,01), ніж у телиць контрольної групи.

Відповідний вплив має ГВП, що містить інсулін, а особливо преднізолон, під час уведення його телицям на синтетичні і енергетичні процеси в наднирниках, на що вказує вірогідне збільшення вмісту ядерної ДНК, мітохондріальної і рибосомальної РНК в клітинах наднирників (Р0,05).

Таблиця 2 Вміст нуклеїнових кислот у клітинах яєчника статевозрілих телиць після введення ГВП, що містить інсулін і преднізолон (мкг РНК і ДНК/г сирої тканини; Мm, n=3)

Загалом, одержані в цьому досліді результати вказують на стимулюючий вплив ГВП, до складу якого входили інсулін і преднізолон під час уведення їх телицям, на активацію фосфорилювання ядерних білків та стероїдної активації матрикса геному, що підвищує синтез нуклеїнових кислот в репродуктивних органах, печінці та наднирниках і дозволяє пояснити стимулюючий вплив комплексних гормонально-вітамінних препаратів на стимуляцію охоти у телиць і їхню репродуктивну здатність.

ВИСНОВКИ

Вивчено вплив низки природних і синтетичних гормонів при додаванні їх до культурального середовища на морфологічні показники ооцитів та вміст у них нуклеїнових кислот і білків з метою забезпечення оптимальних умов дозрівання яйцеклітин in vitro; на основі одержаних результатів розроблено гормонально-вітамінні препарати пролонгованої дії, що містять інсулін і преднізолон, для стимуляції естрального циклу у корів і телиць.

При додаванні до культурального середовища клітин гранульози або низьких доз цитозолю клітин гранульози фолікулів яєчників корів (5 і 10 мкг білка/мл) підвищується повноцінність культивованих ооцитів та вміст РНК у них, тоді як при додаванні цитозолю клітин гранульози у високих дозах (вище 20 мкг/мл) якість ооцитів знижується внаслідок дегенерації ооплазми та відділення кумулюсу, що зумовлено, високою стероїдогенною активністю клітин та продукцією клітинами теки інгібуючих факторів.

Вплив цитозолю клітин яйцепроводів та епідидимісу при додаванні їх у культуральне середовище на дозрівання ооцитів залежить від дози: низькі дози білків цитозолю клітин слизової оболонки яйцепроводу (5 мкг/мл) та епідидимісу (6 мкг/мл) стимулюють дозрівання ооцитів при культивуванні (вихід повноцінних ОКК становить відповідно 62% проти 50% та 80% проти 60% у контролі), тоді як високі дози порушують цей процес, що приводить до відділення та дегенерації клітин кумулюсу.

Додавання до культурального середовища 0,5 мкг/мл синтетичного аналога простагландина F_2б-естрофану не впливає на дозрівання ооцитів.

Доповнення середовища культивування естрадіолом дозозалежно впливає на здатність ОКК до повноцінного дозрівання та подальшого розвитку: під час додавання до культурального середовища естрадіолу в кількості 1 і 4 мкг/мл вона вища, ніж у дозі 7 і 10 мкг/мл.

Здатність ооцитів корів до повноцінного дозрівання in vitro підвищується під час додавання до культурального середовища інсуліну. Додавання до інкубаційного середовища інсуліну в дозі 0,2 і 0,3 ІО/мл стимулює процеси мейотичного до зрівання і проліферацію клітин кумулюсу в ОКК, про що свідчить збільшення кількості повноцінних ОКК після 24-х годин культивування з 64% у контролі до 76 і 82% відповідно.

У процесі культивування ОКК у середовищі з гідрокортизоном (5 мкг/мл) вихід повноцінних ооцитів становив 87% проти 77% у контролі, тоді як кортикотропін викликає зменшення якісних ооцитів до 40% проти 70% у контролі.

Найбільший стимулюючий ефект на дозрівання ооцитів in vitro та синтез нуклеїнових кислот в ОКК викликає преднізолон: при додаванні його до культурального середовища в дозі 0,2 і 0,4 мкг/мл вихід ОКК зростає відповідно з 67,5% до 86,6 і 90% в порівнянні з контролем.

При додаванні до культурального середовища комплексу гормональних препаратів - інсулін+естрадіол, естрадіол+преднізолон, інсулін+естрадіол+преднізолон - вихід повноцінних ооцитів підвищується внаслідок активації геному, що приводить до збільшення вмісту нуклеїнових кислот і проліферації клітин кумулюсу (Р0,05).

Уведення телицям інсуліну та преднізолону у вигляді ліпосом у складі гормонально-вітамінного препарату з метою стимуляції естрального циклу приводить до активації овуляторних процесів, до зростання маси яєчників (Р0,01) внаслідок збільшення кількості преовуляторних фолікулів та жовтих тіл.

Уведення телицям преднізолону в складі гормонально-вітамінного препарату з метою пролонгованого впливу на функцію статевих органів під час стимуляції статевої охоти викликає підвищення синтезу РНК і ДНК в ядрах (Р0,05; Р0,01) і мітохондріях (Р0,05; Р0,01) клітин ендометрію і яєчників.

Пропозиції виробництву

Для повонцінного дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів корів доцільно додавати до культурального середовища інсулін у дозі 0,2 - 0,3 ІО/мл, преднізолон у дозі 0,2 - 0,4 мкг/мл, а також комплекс гормонів: естрадіол (1,0 мкг/мл) + преднізолон (0,2 мкг/мл), інсулін (0,1 ІО/мл) + естрадіол (1 мкг/мл) + преднізолон (0,2 мкг/мл).

З метою стимуляції оогенезу і овуляції у статевозрілих телиць рекомендуємо підшкірно або внутрішньом'язово вводити їм гормонально-вітамінний препарат “Овоген”, до складу якого входить преднізолон.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Штапенко О.В. Вплив естрадіолу, прогестерону, преднізолону на стан ооцит-кумулюсних комплексів // Наук. вісн. нац. аграрного ун-ту. - Київ, 2000. - Вип. 22. - С. 166-169.

2. Штапенко О.В. Вплив біологічно активних речовин на ооцит-кумулюсні комплекси // Вісник Полтавського с.-г. ін-ту. - 2001. - № 2-3. - С. 18-20.

3. Штапенко О.В. Роль кортикостероїдних гормонів у процесах дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів in vitro // Науково-техн. бюлетень Інституту біології тварин. - 2003. - Вип. 5, № 1-2. - С. 179-181.

4. Морфологічні дослідження яєчників статевозрілих телиць при введенні інсуліну та солу-медролу / Штапенко О.В., Гевкан І.І., Чорненький Т.Я., Воробець Л.В. // Наук. вісн. нац. аграрного ун-ту. - Київ, 1999. - Вип. 16. - С. 201-204. (Дисертант брала участь у плануванні та проведенні експерименту, провела статистичне опрацювання та аналіз отриманих результатів і написання статті).

5. Штапенко О.В., Розгоні І.І. Вплив інсуліну і преднізолону на рівень нуклеїнових кислот в тканинах телиць // Наук. вісн. Львів. держ. акад. вет. мед. ім. С.З.Гжицького. - 2000. - Т.1, № 2. - С. 267-271. (Дисертант визначала вміст нуклеїнових кислот у тканинах, провела статистичне опрацювання та аналіз отриманих результатів і написання статті).

6. Штапенко О.В., Розгоні І.І. Нуклеїнові кислоти і білки в репродуктивних органах телиць під впливом гормонально вітамінних препаратів // Науково-техн. бюлетень Інституту біології тварин. - 2002. - Вип. 4, № 1. - С. 159-163. (Дисертант провела експериментальні дослідження, визначала вміст нуклеїнових кислот і білків у репродуктивних органах, підготувала матеріал роботи до друку).

7. Вплив інсуліну і естрадіолу на дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів яєчників корів in vitro / О.В. Штапенко, І.І. Гевкан, Т.Я. Чорненький, І.І. Розгоні // Тези доп. міжнар. конф. “Біологічні основи живлення сільськогосподарських тварин”. - Львів, 1998. - С. 25-26. (Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні тез доповіді).

АНОТАЦІЇ

Штапенко О.В. Регуляція дозрівання ооцитів та відтворювальної функції корів при дії гормонів in vitro та in vivo. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. Інститут біології тварин УААН, Львів, 2004.

Вивчено вплив ряду гормонів та інших біологічно активних речовин на морфологічну характеристику ооцит-кумулюсних комплексів, їхню здатність до мейотичного дозрівання під час культивування in vitro. З'ясовано, що додавання до культурального середовища інсуліну, естрадіолу, преднізолону сприяє повноцінному дозріванню ооцитів, стимулює перебіг обмінних процесів у ядерному і цитоплазматичному апараті, проліферацію клітин кумулюсу. Вивчено динаміку дозрівання ооцитів в умовах in vitro під час культивування їх у середовищі з гідрокортизоном, кортикотропіном та преднізолоном та при додаванні до культурального середовища комплексу гормональних препаратів: інсуліну і естрадіолу; естрадіолу і преднізолону; інсуліну, естрадіолу і преднізолону. На основі одержаних результатів розроблено комплексні гормонально-вітамінні препарати, що містять інсулін і преднізолон, які вводять телицям підшкірно в складі ліпосомальних емульсій з метою забезпечення їх пролонгованої дії при стимуляції статевої охоти у корів in vivo.

Ключові слова: ооцит-кумулюсні комплекси, культивування, дозрівання, нуклеїнові кислоти, телиці, гормони, яєчники, культуральне середовище, кумулюсні клітини.

Штапенко О.В. Регуляция созревания ооцитов и воспроизводительной функции коров при действии гормонов in vitro и in vivo. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.04 - биохимия. Институт биологии животных УААН, Львов, 2004.

Диссертация посвящена изучению влияния некоторых гормонов и других биологически активных веществ на морфологическую характеристику ооцитов при их культивировании вне организма. Отмечено, что созревания ооцитов коров вне организма при добавлении в культуральную среду клеток цитолозя яйцепроводов и гранулёзы коров способствует их мейотическому созреванию. Результаты исследований показали, что добавления в культуральную среду эстрадиола в малых дозах положительно влияет на созревание ооцитов, тогда как высокие дозы вызывают дегенерированные процессы в них. Установлено, что добавления в культуральную среду инсулина способствует полноценному созреванию ооцит-кумулюсных комплексов, вызывает интенсивное деление и пролиферацию клеток кумулюса, а также повышение содержания РНК и ДНК. Использование цитозоля эпидидимиса и липосомальных емульсий эстрадиола и прогестерона при культивировании ооцитов вызывает нарушение созревания цитоплазмы ооцитов и дегенерацию клеток кумулюса.

Изучена динамика созревания ооцитов в условиях in vitro при добавлении в культуральную среду гидрокортизона, кортикотропина и преднизолона. Установлено, что наибольший выход полноценных яйцеклеток получен при добавлении в культуральную среду преднизолона, который стимулирует пролиферацию клеток кумулюса и повышает содержание в них общих РНК и ДНК.

Установлено положительное действие на мейотическое созревание ОКК при добавлении в инкубационную среду инсулина и эстрадиола; эстрадиола и преднизолона; инсулина, эстрадиола и преднизолона. На основании результатов исследования, влияния инсулина и преднизолона на созревание ооцит-кумулюсных комплексов in vitro при добавлении их в культуральную среду, разработаны комплексные гормональные препараты, в состав которых входят инсулин и преднизолон для стимуляции половой охоты у коров. Стимулирующее влияние гормонально-витаминных препаратов проявляется в усилении регенеративно-пролиферативных процессов в яичниках, что вызывает повышение их массы у коров вследствие увеличения количества фолликулов и желтых тел. Введение коровам инсулина и преднизолона при гормональной стимуляции половой охоты приводит к повышению концентрации нуклеиновых кислот в ядрах и митохондриях клеток репродуктивных органов, печени и особенно надпочечников.

Ключевые слова: ооцит-кумулюсные комплексы, культивирование, созревание, нуклеиновые кислоты, телки, яичник, гормоны, культуральная среда, кумулюсные клетки.

Shtapenko O.V. Regulation of oocytes maturation and cow's reproductive functions with hormonal action in vitro and in vivo. - Manuscript.

The thesis for gaining the scientific degree of the candidate of agricultural sciences by speciality 03.00.04 - biochemistry. Institute of animal biology of UAAN, Lviv, 2004.

The research is dedicated to investigate of the influence of some hormones and another biology active substances on morphological characterization of oocyte-cumulus complexes, their capability for meiotic maturation under their cultivation in vitro. It was established that insulin, estradiol, prednizolon in the cultivation system promotes the maturation quality of oocytes, stimulates the course of metabolism processes in nuclei and cytoplasm, proliferating of cumulus cells under in vitro cultivation. The dynamics of oocytes maturation in vitro with adding of hydrocortizon, corticotropin and prednizolon has been studied.

The process of the oocyte-cumulus complexes maturation attached to their cultivation in vitro in the modificated culture medium by using the combination of hormone preparations: insulin and estradiol; estradiol and prednizolon; estradiol, prednizolon and insulin has been studied.

In the base of conducted investigation the complex hormone-vitamin preparation has been elaborated with insulin and prednizolon addition to the liposomal emulsion for the deposition and prolonged action of this hormone preparation for stimulating the sexual cycle in heifers in vivo.

Key words : oocyte-cumulus complexes, cultivation, maturation, nycleic acids, hormones, ovaries, culture medium, cumulus cells.

Размещено на Allbest.ru