Отримання трансгенних рослин яблуні шляхом генетичної трансформації за допомогою Agrobacterium tumefaciens

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

УДК 634.11:575.113

ОТРИМАННЯ ТРАНСГЕННИХ РОСЛИН ЯБЛУНІ ШЛЯХОМ ГЕНЕТИЧНОЇ ТРАНСФОРМАЦІЇ ЗА ДОПОМОГОЮ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КОРХОВИЙ Віталій Іванович

КИЇВ - 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті садівництва УААН та Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України Блюм Ярослав Борисович, Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, завідувач відділу геноміки та біотехнології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Галкін Анатолій Павлович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу біоінженерії

кандидат біологічних наук Митрофанова Ірина Вячеславівна, Нікітський ботанічний сад - Національний науковий центр УААН, старший науковий співробітник відділу біотехнології і біохімії

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться 22.09.2005 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

Автореферат розісланий 19.08.2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.А. Кравець

АНОТАЦІЇ

Корховий В.І. Отримання трансгенних рослин яблуні шляхом генетичної трансформації за допомогою Agrobacterium tumefaciens. - Рукопис. яблуня сорт трансгенний генетичний

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2005.

Дисертація присвячена розв'язанню питань, пов'язаних з введенням в культуру in vitro, мікроклонального розмноження, регенерації, трансформації за допомогою Agrobacterium tumefaciens сортового матеріалу яблуні. Модифіковано схеми введення, мікророзмноження, вкорінення in vitro для промислових сортів яблуні, регенерантного клону яблуні сорту Флоріна (RF1) і двох клонових підщеп яблуні, цінних для садівництва. Оптимізовано склад поживних середовищ та умови культивування, які сприяють ефективній регенерації (від 85 до 100%) адвентивних пагонів з листових експлантів для 4 сортів яблуні та 1 вегетативно розмножуваної підщепи. В результаті проведених досліджень отримано ряд ліній яблуні сорту Флоріна з генами pat та rolB, що забезпечують стійкість до фіосфінотріцину (ген pat) та більш ефективне укорінення (ген rolB). Встановлено, що здатність до вкорінення трансгенних ліній яблуні сорту Флоріна залежить від кількісті копій гену rolB на геном і пропорційно зростає у залежності від цього показника у порівнянні з нетрансгенним контролем та з вегетативно розмножуваною підщепою ММ106.

Ключові слова: яблуня, Malus domestica Borkh., культура in vitro, мікроклональне розмноження, адвентивний органогенез, генетична трансформація, Agrobacterium tumefaciens, ген nptII, ген gus, ген pat, ген rolB, стійкість до фосфінотрицину, ризогенез.

Корховой В.И. Получение трансгенных растений яблони путем генетической трансформации с помощью Agrobacterium tumefaciens. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена изучению вопросов, связанных с введением в культуру in vitro, микроразмножения, регенерации, трансформации с помощью Agrobacterium tumefaciens сортового материала яблони. Модифицированы схемы введения, микроразмножения, укоренения in vitro для промышленных сортов яблони, регенерантного клона яблони сорта Флорина (RF1) и двух клоновых подвоев ябони, перспективных для садоводства. Использование для введения в культуру in vitro этиолированных побегов имело решающее значение - процент стерильных эксплантов был самым высоким, проблема выделения фенольных соединений была сведена к минимуму, время, необходимое для адаптации к условиям in vitro и появление первых адвентивных побегов были самыми короткими в сравнении с другими применяемыми методиками. При микроразмножении различных сортов и клоновых подвоев яблони наблюдали разницу в оптимальном соотношении фитогормонов. Эффективность розмножения большинства сортов хорошо кореллирует с концентрацией экзогенного цитокинина, однако при повышении концентрации БАП до 1,5-2,0 мг/л наблюдали резкое увеличение витрифицированных побегов. Для большинства исследуемых сортов яблони оптимум концентрации БАП находился в пределах 0,5-1,5 мг/л а для клоновых подвоев в пределах 0,5-1,0 мг/л. При изучении процессов органогенеза с листовых эксплантов сортов Флорина, Нэзалежнисть и Фальстаф наивысшую еффективность регенерации получили на средах с 5 мг/л БАП и 1,0 мг/л НОК.

В опытах по трансформации положительные результаты были получены при использовании листовых експлантов, взятых с побегов 3-3,5 недельного возраста. Способ кокультивации с Agrobacterium tumefaciens, зависел от штамма последней и в значительной степени влиял на еффективность трансформации. При использовании І и ІІ способов кокультивации получили эффективность трансформации 2,3% (штамм А281) и 0,9% (штамм ЕНА105) тогда как применение ІІІ способа, в случае штамма С58С1, позволило поднять еффективность до 7,9%. В результате проведенных исследований было получено 11 трансгенных линий яблони сорта Флорина, 9 из которых содержат разное количество копий гена rolB. Одной из наиболее характерных особенностей полученных клонов является то, что они имеют повышенную способность к укоренению по сравнению с нетрансгенным контролем и клоновым подвоем яблони ММ106. Трансгенная природа полученных линий подтверждена при помощи ПЛР и гибридизации по Саузерну.

В полевых условиях полученные трансгенные растения адекватно прореагировали на окучивание нижней части побега почвой - наблюдали образование дополнительных корней. Некоторые линии были привиты на клоновый подвой 54-118 и через некоторое время место прививки также было закрыто почвой. При выкопке саженцев обнаружили, что на привое (т.е. трансгенной линии) образовались дополнительные корешки.

Ключевые слова: яблоня, Malus domestica Borkh., культура in vitro, микроразмножение, регенерация, трансформация, Agrobacterium tumefaciens, ген gus, ген nptII, ген rolB, ген pat, устойчивость к фосфинотрицину, ризогенез.

Korkhovy V.I. Obtaining of transgenic apple by Agobacterium-mediated transformation. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of a Ph.D. (Biology) for the speciality 03.00.15 - genetic. - Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.

The thesis is devoted to establishment of micropropagation, regeneration and Agobacterium-mediated transformation different cultivars of apple. The schemes of introduction, micropropagation and rooting in vitro for industrial cultivars of apple, regenerat clon RF1 and the two clonal rootstocks were modifyed. The composition of nutrient medium and cultural conditions for effective regeneration (from 85 to 100%) of regenerated shoots from leaf explants of 4 cultivars of apple and clonal rootstock were optimised. 11 transgenic lines apple cv.`Florina' were obtained after transformation experiments with Agobacterium-mediated. Transgenic lines with different copies of gene rolB in its genome have hight rooting ability compared with untransformed control and clonal rootstock MM106. Polymerase chain reaction and by Southern blot analysis showed the presence of nptII, rolB, gus, pat genes in the obtained clones.

Кey words: apple, Malus domestica Borkh., in vitro culture, micropropagation, regeneration and Agobacterium-mediated transformation, Agrobacterium tumefaciens, gus gene, nptII gene, pat gene, rolB gene, rooting ability.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Незважаючи на значні досягнення у розробці методів генетичної трансформації яблуні протягом останніх 15 років, в значній мірі залишаються не вирішеними такі питання, як перенесення конкретних генів в сортові рослини з метою покращення їх цінних характеристик. Значний інтерес складає проблема стійкості яблуні до гербіцидів тотальної дії та створення сортів, які б мали високу ефективність вкорінення і стриману силу росту. Стійкість будь-яких сортів плодових до гербіцидів підвищує технологічність їх вирощування, особливо в умовах розсадника. Серед гербіцидів, які використовуються у садівництві, найбільшого розповсюдження набули сполуки, в яких діючими речовинами є гліфосат та глюфосинат. Так, зокрема, фосфінотріцин (глюфосинат) є одним з малотоксичних гербіцидів широкого спектру дії. Стійкість до цього гербіциду забезпечує ген pat, внаслідок експресії котрого у трансгенній рослині фосфінотріцин швидко розкладається фісфінотріцинацетилтрансферазою, втрачаючи свою токсичну дію, і не накопичується в обробленій рослині. З іншого боку, вирішення проблеми ефективного вкорінення і формування кореневої системи за допомогою методів генетичної інженерії передбачає використання генів бактеріального походження, а саме з Ri-плазміди Agrobacterium rhizogenes, означених в літературі як rol гени (rolА, rolВ, rolС, rolD). Серед цих генів особливе місце займає ген rolВ, який підвищує чутливість до ауксину (Delbarre et al., 1994), або ж змінює шляхи проникнення ауксинів (Maurel et al., 1994), що призводить до зростання ефективності вкорінення рослин. Трансгенні лінії (з геном rolВ) вегетативно розмножуваних підщеп яблуні мають у 2,3-2,5 рази вищу ефективність вкорінення в порівнянні з нетрансгенним контролем (Welander and Zhu, 2000; Sedira et al., 2001; Pawlicki-Jullian et al., 2002). Автори повідомляють також про стриману силу росту деяких трансгенних клонів, що містять ген rolВ у порівнянні з контролем. Аналогічні результати отримано і для трансгенних підщеп груші (Zhu et al., 2003). На трав'янистих рослинах також показано, що експресія гену rolВ викликає зміни генеративних органів отриманих клонів - гетеростилію, збільшені розміри маточки та квітколожа (Schmulling et al., 1988). Безумовно, вищеназвані характеристики були б бажаними і для сортових рослин яблуні. Однак, на сьогодні відсутні публікації про трансформацію сортів яблуні геном rolB. Таким чином, розробка прийомів отримання трансгенних рослин яблуні зі стійкістю до гербіцидів та високою ефективністю вкорінення є актуальною на сьогодні.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводились в лабораторії біотехнології плодових та ягідних культур (1993-1998 рр.), лабораторії біотехнології і оздоровлення садивного матеріалу (1998-2001 рр.), генетико-цитологічній лабораторії (2001-2004 рр.) Інституту садівництва УААН у відповідності з тематичним планом „Розробити науково-обгрунтовані технології вирощування, зберігання та використання плодів, ягід та садивного матеріалу на основі створення високопродуктивних сортів, сучасних технічних засобів та оптимізованих нормативів ресурсного забезпечення садівничих господарств різних форм власності” № ДР 0101U007539. Крім того, протягом 2001-2003 рр. робота виконувалась в тісній співпраці та постійними консультаціями з співробітниками відділу клітинної біології та біотехнології Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України відповідно до бюджетної теми „3'ясування ролі цитоскелетних структур клітини у відповіді рослин на вплив абіотичних факторів та розробка біотехнологічних підходів для регуляції функціонування цитоскелету” № ДР 0101U000395, а з кінця 2003 року за бюджетною темою відділу геноміки та біотехнології „Розробка нових підходів до створення трансгенних ліній технічних і кормових культур та наукове обґрунтування їх безпечного використання в практичних цілях” № ДР 0101U4109 цього ж Інституту.

Мета і задачі дослідження. Основною метою досліджень було встановлення можливості ефективного перенесення генів, які кодують господарсько-цінні ознаки, в геном сортових рослин яблуні (Malus domestica Borkh.). В зв'язку з цим, необхідно було вирішити наступні основні задачі:

1. Розробити прийоми і методи введення в культуру in vitro та мікроклонального розмноження перспективних для сучасного садівництва сортів яблуні.

2. Розробити методи адвентивного органогенезу з листових експлантів яблуні.

3. Розробити прийоми генетичної трансформації за допомогою A. tumefaciens листових експлантів яблуні (інокуляція і кокультивація) та селекції канаміцин-стійких калусних клонів.

4. Отримати трансгенні лінії яблуні з генами pat і rolB та регенерувати адвентивні пагони яблуні з відселектованих калусних клонів.

5. Провести молекулярно-біологічний аналіз отриманих клонів яблуні для підтвердження їх трансгенної природи.

6. Дослідити вплив гену rolВ на вкорінення в культурі in vitro отриманих клонів яблуні.

7. Визначити вплив різних концентрацій фосфінотріцину на розвиток трансгенної (ген pat) лінії яблуні сорту Флоріна в культурі in vitro.

8. Дослідити вплив гену rolВ на вкорінення отриманих клонів яблуні в умовах відкритого грунту.

Об'єктом дослідження були представники різних сортів яблуні (Malus domestica Borkh., родина Rosaceaе), та їх трансгенні лінії, які містили у своєму геномі одну або кілька копій генів nptII, pat, rolВ та gus.

Предметом дослідження було отримання трансгенних ліній вищезгаданого виду рослин з родини Rosaceae, які містили б гени, що кодують господарсько-цінні ознаки, а саме pat - стійкості до гербіциду фосфінотріцину, та rolВ, який впливає на підвищення чутливості до ауксинів, що призводить до підвищення ефективності вкорінення.

Методи дослідження. Стерильні листкові експланти отримували шляхом введення досліджуваних сортів в культуру in vitro та їх мікроклонального розмноження. Адвентивний органогенез отримували з листкових експлантів на агаризованих середовищах з різним співвідношенням та концентрацією фітогормонів. Трансгенні лінії перспективного для садівництва України сорту яблуні Флоріна отримали за допомогою методу генетичної трансформації при використанні Agrobacterium tumefaciens. Наявність і копійність перенесених генів підтвердили, використовуючи полімеразну ланцюгову реакцію та гібридизацію за Саузерном. Експресію цих генів встановили за допомогою культуральних методів - культивування в присутності високих концентрацій канаміцину, фосфінотріцину та вкоріненням за схемою, яка виключала індукцію ризогенезу за допомогою ауксинів.

Наукова новизна отриманих результатів. При розробці схеми мікроклонального розмноження сортових рослин яблуні та вегетативно розмножуваних підщеп зарубіжної та вітчизняної селекції вдосконалено методику введення яблуні в культуру in vitro. Оптимізовано склад поживних середовищ і умови культивування, які сприяли ефективній регенерації адвентивних пагонів з листкових експлантів для сортів яблуні та вегетативно розмножуваної підщепи. Вдосконалено методику генетичної трансформації яблуні за допомогою Agrobacterium tumefaciens, внаслідок чого досягнуто рівня ефективності трансформації до 7,9%. Вперше отримано лінії перспективного сорту яблуні Флоріна, в геномі яких містяться гени pat та rolВ. Встановлено ефективну експресію гену pat у трансгенних ліній яблуні, яка забезпечувала високу стійкість до підвищених концентрацій фосфінотріцину. Трансгенні лінії, які містять в своєму геномі ген rolВ, відзначаються високою здатністю до вкорінення як в умовах in vitro так і in vivo без додаткових обробок ауксинами. В подальшому трансгенні лінії з геном rolВ будуть досліджені на предмет впливу цього гену на генеративні органи - гетеростилію, розміри квітколожа та маточки.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені методи введення в культуру in vitro, мікроклонального розмноження, адвентивного органогенезу, трансформації за допомогою агробактерії можуть бути використані як базові для роботи з іншими сортами та клоновими підщепами яблуні. Модифікований метод генетичної трансформації сорту яблуні Флоріна може бути використаний для переносу інших господарсько-цінних генів. Отримані трансгенні рослини можуть служити донорами генів pat та rolВ для отримання нових сортів яблуні методами класичної селекції. Трансгенна лінія з геном pat може бути використана для інтенсифікації технології вирощування саджанців в розсаднику за рахунок використання глюфосинат-вмісних гербіцидів для боротьби з бур'янами. Лінії яблуні з підвищеною ефективністю вкорінення внаслідок трансформації геном rolВ можуть бути придатними до розмноження в маточнику - так як розмножують вегетативні підщепи, що дасть змогу в значній мірі спростити розмноження даного сорту яблуні і знизити собівартість саджанців.

Особистий внесок здобувача заключається в участі в розробці напрямку і завдань досліджень, проведенні всіх основних експериментів і дослідів, їх обробці та інтерпретації, аналізі літератури, підготовці та написанні наукових звітів та статей. Спільно з науковим керівником проведено вибір об'єктів і напрямку досліджень, розроблено структуру дисертаційної роботи. Викладені у дисертації ідеї, наукові висновки та положення сформульовані автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідалися на: науково-практичній конференції, присвяченій 25-річчю від дня утворення Краснокутської дослідної станції садівництва (Красний Кут, Україна, 1993), Міжнародному симпозіумі „Plant biotechnology and genetic engineering” (Київ, 1994), науковій конференції (в рамках СНД) „Интенсификация садоводства на склонах” (Нальчик, Кабардино-Балкарія, 1994), науково-практичній конференції “Промислова біотехнологія клонального мікророзмноження плодових і винограду в культурі in vitro” (Херсон, 1994), міжнародній конференції „Tasks and perspectives of orchard plant breeding” (Бабтай, Литва, 1995), міжнародній науково-практичній конференції “Наслідки наукових пошуків молодих вчених-аграрників в умовах реформування АПК” (Чабани, Україна, 1996), VII міжнародній конференції „Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда” (Москва, Росія, 1997), IX-му міжнародному конгресі “Plant Tissue and Cell Culture” (Єрусалим, Ізраїль, 1998), міжнародній науково-практичній конференції „Садоводство и виноградарство XXI века” (Краснодар, Росія, 1999), міжнародному симпозіумі „Fruit Breeding and Genetics” (Дрезден, Німеччина, 1999), міжнародній науковій конференції “Genetic Variability and Control Problems in Breeding of Horticultural Plants” (Бабтай, Литва, 2001), конференції молодих вчених України “Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні” (Київ, Україна, 2002), міжнародному симпозіумі “Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources” (Ялта, 2002), міжнародній науково-методичній конференції “Роль сортов и новых технологий в интенсивном садоводстве” (Орел, Росія, 2003), міжнародній конференції “Application of biotechnology in breeding cultivars suitable for sustainable fruit production” (Скерневіце, Польща, 2005).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 21 наукова робота, з них 6 статей у фахових виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 139 сторінках тексту і складається з вступу, 4 розділів, висновків, 17 таблиць, 23 рисунків. Список використаних літературних джерел містить 217 найменувань, у тому числі 197 - іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Проаналізовано літературні дані стосовно розвитку уявлень про особливості культивування в умовах in vitro різних сортів яблуні, закономірності трансформації конкретних сортів та клонових підщеп яблуні. На основі аналізу обгрунтовано важливість проведення досліджень по трансформації яблуні генами, які кодують господарсько-цінні ознаки.

Матеріали та методи досліджень. Об'єктами досліджень було обрано кілька сортів яблуні (Malus domestica Borkh.) як вітчизняної так і зарубіжної селекції: Аскольда, Катерина, Фальстаф, Радогость, Теремок, Айдаред, Голден Делішес, Мекінтош, Спартан, Флоріна, регенерантний клон Флоріни RF1 та вегетативно розмножувані підщепи яблуні ММ106 і 5-34. Для трансформації використовували слідуючі штами Agrobacterium tumefaciens: А281 з бінарним вектором рТіВо542/ pPCV730 (далі А281), що містить ген неоміцинфосфотрансферази ІІ (nptII) був наданий для досліджень М.І.Стрижовим (Філіал Інституту біоорганічної хімії РАН, м. Пущино); ЕНА105 - нопаліновий тип з вектором рІВ16.1 (далі ЕНА105), що містить селективний маркерний ген nptII і pat ген, наданий д-ром I. Broer (Ростоцький університет, м. Росток, Німеччина); штам С58С1 з бінарним вектором pCMB-B:GUS (далі С58С1), який містить ген неоміцинфосфотрансферази (nptII) і тандемно розміщені гени глюкоринідази (gus) та rolB був люб'язно наданий для роботи д-ром C. Maurel (CNRS, Gif/Yvette, Франція).

Як методичну основу для введення яблуні в культуру in vitro використовували роботи Zimmerman (1985). Здерев'яні живці (І-й спосіб) стерилізували розчином AgNO_3, промивали, занурювали в етиловий спирт і пропалювали в полум'ї спиртівки. Пагони з однією брунькою переносили в пробірки з середовищем для культивування (1/2 макросолей Мурасіге і Скуга (МС), 1,5% сахарози, 100 мг/л мезо-інозітолу, 500 мг/л гідролізату казеїну, 0,5 мг/л 6-бензиламінопурину (БАП), 0,1 мг/л індолилмасляної кислоти (ІМК), 0,7% бактоагару (Difco)). Згідно ІІ-го способу виділяли меристеми з етиольованих пагонів, простерилізованих розчином діациду. Розміщували на середовищі, з деякими відмінностями від вищенаведеного: 2% сахарози, 0,3 мг/л БАП, 0,05 мг/л ІМК, 1,0 мг/л гібереліну. Мікророзмноження проводили згідно Jones et al. (1979).

Досліди по регенерації виконували згідно Welander (1988), використовуючи чотири-п'ять верхніх листків. Застосовували середовища з різною концентрацією макро-МС або N6. В якості регуляторів: цитокініни - (БАП) - 1-20 мг/л чи тідіазурон - 0,2-5,0 мг/л; нафтилоцтова кислота (НОК) - 0-1,5 мг/л в якості ауксину. Додавали 200 мг/л мезо-інозітолу, 50 мг/л гідролізату казеїну і вітаміни у відповідності з Бартіш і ін. (1994), сахароза - 20 г/л, агар (Difco Bacto) - 7 г/л.

Досліди по трансформації яблуні проводили згідно методу James (1989), модифікованим стосовно умов експериментів. Застосовували три різні способи кокультивації: І - кокультивація експлантів яблуні в суспензії нічної культури агробактерії, ІІ - нічна культура агробактерії була доочищена перед кокультивацією, ІІІ - кокультивація очищеної суспензії агробактерії з листковими експлантами на твердому середовищі протягом двох діб.

Для проведення молекулярно-біологічних аналізів виділяли ДНК, використовуючи методику розроблену Дороховим і Клоке (1997).

Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) проводили в ампліфікаторі "Autogene II". Для ампліфікації фрагментів генів були використані праймери фірми „Pharmacia”: для гену nptII: праймер 1 (5'-ATGATTGAACAAGATGGATTG-3') та параймер 2 (5'-GAAGAACTCGTCAAGAAGCCGA-3'); для гену rolB: праймер 1 (5'-ATGGATCCCAAATTGCTATTCCTTCCACGA-3') та праймер 2 (5'-TTA GGCTTCTTTCTTCAGGTTTACTGCAGC-3'); для гену gus: праймер 1 (5'-CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG-3') та праймер 2 (5'-CCCGGCAATAACATACGGCGTG-3'). Для виявлення можливої контамінації використовували праймери для ампліфікації фрагменту бактеріального гену virD1: virD1-1(5'-ATGTCGCAAGGCAGTAAGCCCA-3'); virD1-2 (5'-GAGTCTTTCAGCATGGAGCA A-3'). Продукти реакції фракціонували в 1% агарозному гелі.

Додатково проводили гібридизацію за Саузерном (Southern, 1975). Детекцію проводили за допомогою CDP-Star^® з фірмового набору за рекомендаціями виробника (“Boehringer Mannheim”, ФРН). Фільтри експонували на Chemiluminescent Detection Film (“Boehringer Mannheim”, ФРН) на протязі 3 год. при кімнатній температурі і проявляли.

Введення в культуру in vitro і мікроклональне розмноження яблуні. При введенні в культуру спостерігали значні коливання сроків адаптації до стерильних умов у різних сортів. Так, зокрема, при використанні першого способу потрібно було від 9 до 15 місяців, щоб отримати проліферацію .

Сортова розмаїтість яблуні по здатності до введення в культуру in vitro незначна, однак процент стерильних пагонів був досить низьким. Однією з причин цього явища може бути особливість морфології будови бруньок, які в яблуні надзвичайно щільно прилягають до стебла, що, в свою чергу, робить неможливою ефективну стерилізацію. Загальновідомий і той факт, що більшість комерційних сортів яблуні нестійкі до різноманітних грибних та бактеріальних захворювань. При перенесенні експлантів в умови in vitro і проростанні бруньок спори різноманітних грибів та бактерій потрапляли на поживне середовище, що призводило до контамінації і загибелі нововведених експлантів.

В подальшому застосування першого методу введення в культуру in vitro виявилося неприйнятним через надзвичайно високу інфікованість вихідного матеріалу. Для подолання цієї проблеми використовували меристеми з активно ростучих пагонів. Однак, виділення великої кількості фенольних сполук нововведеними меристемами зробило неможливим використання даного методу і спонукало до використання активно ростучих етиольованих пагонів. Як можна бачити з даних, представлених в табл. 2 саме застосування другого способу введення в значній мірі призвело до покращення всіх основних параметрів. Отже, використання етиольованих пагонів є найбільш ефективним методом введення в культуру in vitro яблуні - відсоток стерильних експлантів був найвищим, виділення фенольних сполук в поживне середовище було мінімальним, час, потрібний для адаптації до умов in vitro та з'явлення перших адвентивних пагонів був найкоротшим в порівнянні з вищезазначеними методами.

Підбір оптимального середовища для мікроклонального розмноження пагонів яблуні не спричинив особливих ускладнень, оскільки ні по сольовому, ні по кількісному та якісному складу регуляторів росту оптимальне для розмноження середовище не відрізнялось від базового для більшості рослин середовища МС (Murashige, Skoog, 1962). Однак, слід зазначити, що серед різних сортів і клонових підщеп ми спостерігали різницю в оптимальному співвідношенні фітогормонів та в ефективності розмноження.

Досить цікаво те, що регенерантний клон сорту Флоріна (отриманий в результаті адвентивного органогенезу з листкових експлантів культивованих in vitro пагонів) мав суттєво більший потенціал розмноження в контрольованих умовах, ніж вихідний клон. Так, якщо середній коефіцієнт розмноження пагонів сорту Аскольда не перевищував 4,0, то у Флоріни він сягав 6,5 пагонів на експлант. Слід також відмітити, що ефективність розмноження більшості сортів яблуні добре корелює з концентрацією цитокініну у середовищі. Однак при підвищенні концентрації БАП до 1,5-2,0 мг/л спостерігали різке збільшення частки вітрифікованих пагонів. Якість мікропагонів в цілому також погіршувалась. Зважаючи на вищесказане було зроблено висновок, що для більшості досліджуваних сортових рослин яблуні оптимум концентрації БАП лежить в межах 0,5-1,5 мг/л, а для вегетативно розмножуваних підщеп в межах 0,5-1,0 мг/л.

Лише при застосуванні двостадійного методу вкорінення вдалося отримати високий вихід вкорінених пагонів. Показовими є результати визначення впливу тривалості періоду індукції ризогенезу на середню кількість корінців на пагін. Цей показник важливий для визначення ефективності вкорінення, оскільки кількість корінців на пагоні добре співвідноситься (дані не наведені) з ефективністю адаптації до умов навколишнього середовища. В результаті проведених експериментів було встановлено, що найбільшу середню кількість коренів на пагін яблуні сорту Айдаред було отримано після індукції ризогенезу на середовищі з 4,0 мг/л ІМК протягом 4-5 діб. Як для сорту Флоріна, так і для його регенерантного клону RF1, даний показник залежав від концентрації ауксину і періоду індукції в значно меншій мірію перенесення листових експлантів на регенераційне середовище. Загалом процес утворення регенерантів тривав не більше 6-8 тижнів (в залежності від сорту), тому результати експериментів визначали на 60-65 добу культивування. Як правило, з однієї точки регенерував один пагін, однак іноді їх було декілька.

При вивченні впливу різних концентрацій НОК при фіксованій концентрації БАП (5 мг/л) на ефективність органогенезу з листових експлантів яблуні найвищий рівень регенерації спостерігали при концентрації НОК 1,5 мг/л для експлантів сорту Айдаред і 1 мг/л для сортів Флоріна, Незалежність та Фальстаф. Слід також зазначити, що в досить широкому діапазоні концентрацій цього ауксину (0,05-1,0 мг/л) суттєвої різниці в ефективності регенерації для сорту Фальстаф не спостерігали. Окрім цього, як і в сорту Фальстаф, так і у вегетативно розмножуваної підщепи ММ106 середня кількість пагонів на експлант, здатний до регенерації, була значно вищою при концентрації 0,5 мг/л НОК. Для сорту Незалежність такого оптимуму не спостерігали. Крім цього, довжина пагону у сорту Фальстаф на середовищах з низькою концентрацією НОК була більшою, ніж на середовищах з вищою. Можливо, низька концентрація НОК сприяє елонгації регенеруючих пагонів. У раніше опублікованих роботах про зв'язок даного явища з сортовими особливостями даного генотипу не повідомлялось.

Генетична трансформація яблуні за допомогою Agrobacterium tumefaciens. Вік есплантів, концентрація селективного агенту, спосіб кокультивації з Agrobacterium tumefaciens, штам останньої в значній мірі впливають на ефективність трансформації. Трансгенні лінії яблуні сорту Флоріна було отримано лише на листкових експлантах, взятих з мікророзмножених пагонів 3-3,5 тижневого віку. В той же час, на молодших експлантах випадки регенерації були епізодичними, тоді як експланти, старші 3,5 тижневого віку, виділяли велику кількість фенолів, що призводило до їх швидкої елімінації. Застосування низьких концентрацій селективного антибіотику канаміцину - до 50 мг/л - виявилось неефективним на агаризованих середовищах через неможливість відбору трансформованих пагонів. Використання в якості гелюючого агенту фітагелю дозволило підняти порогову концентрацію канаміцину до 100 мг/л та селектувати трансгенні лінії з генами nptII, rolB, gus.

Для регенерації в попередніх дослідах по трансформації використовували середовище з макросолями по N6, зважаючи на те, що відсоток прямої регенерації на ньому (без проміжної стадії калусогенезу) був найвищим в порівнянні з іншими середовищами. При трансформації плодових це має вирішальне значення, так як збереження сортових характеристик - надзвичайно важливий фактор в практичному садівництві, адже середовища, на яких процеси регенерації проходять через проміжну стадію калусогенезу зумовлюють виникнення сомаклональних варіантів, що може в значній мірі вплинути на небажану зміну сортових характеристик сортового матеріалу. Незважаючи на значну кількість адвентивних пагонів, які було отримано на цьому середовищі (при концентрації канаміцину 70 мг/л і вище), ми не отримали жодного трансгенного пагону.

У залежності від штаму агробактерії було застосовано різні способи кокультивації. Так, зокрема, для штамів А281 та ЕНА105 застосовували І та ІІ способи - експланти занурювали у відповідно підготовлену суспензію агробактерії на 5-30 хв. З іншого боку, застосування ІІІ способу кокультивації - нанесення суспензії агробактерії на експланти, розташовані на твердому середовищі, - був неприйнятним для вищезгаданих штамів через неможливість швидко та ефективно позбутися їх після кокультивації. У більшості випадків спостерігали заростання експлантів агробактерією навіть після 14-16 тижнів культивування на середовищі з клафораном. Проте, як видно з табл. 5, саме ІІІ спосіб виявився найоптимальнішим для штаму С58С1 - ефективність трансформації сягнула 7,9%, тоді як при використанні І і ІІ способів отримали ефективність трансформації 2,3% (штам А281) та 0,9% (штам ЕНА105).

Переважна більшість дослідників застосовує двостадійний метод селекції після кокультивації з Agrobacterium tumefaciens. Причому на другій стадії концентрацію селектуючого агенту зменшують до мінімуму, зважаючи на токсичність канаміцину і на той факт, що культивування протягом перших 2-4 тижнів на високих концентраціях є достатнім для відбору трансформованих клітин. Однак наші спостереження щодо сорту яблуні Флоріна дозволяють зробити деяке коригування цих уявлень. Застосування загальноприйнятої схеми селекції не було ефективним - досить значний відсоток регенерації (біля 30%) на середовищі з 70 мг/л канаміцину після 4-х перших тижнів селекції був неефективним в тому сенсі, що всі регенеранти не були трансгенними. В подальшому при пересадках на середовище для мікророзмноження з 100 мг/л канаміцину всі отримані регенеранти через три тижні знебарвлювались та елімінували. В зв'язку з цим концентрацію канаміцину дещо збільшили на першому пасажі - до 80 мг/л. Крім того, другий пасаж провели через два тижні після початку селекції, причому концентрацію канаміцину не зменшили, а збільшили до 100 мг/л. При такій схемі перші адвентивні пагони з'явились через 4 тижні, причому вони теж були нетрасгенні, а вже після шести тижнів культивування (тобто після 4-х тижнів культивування на середовищі з 100 мг/л канаміцину) з'явились перші трансгенні пагони.

Аналіз отриманих клонів за допомогою молекулярно-біологічних методів. Отримані на селективних середовищах регенерантні лінії було спочатку проаналізовано за допомогою ПЛР

У ДНК всіх відібраних ліній були знайдені фрагменти, які відповідають розрахованій довжині фрагментів генів nptII, rolB та gus.Для підтвердження того, що ампліфікація фрагментів відбулась саме з перенесених генів, а не з вектора агробактерії, яка могла б існувати в латентному стані в регенерованій рослині, було проведено додатковий ПЛР аналіз з праймерами до агробактеріального гену virD, який знаходиться за межами Т-ДНК і не переноситься в рослинний геном при трансформації. У цих дослідах ампліфікований фрагмент довжиною 437 п.о. було виявлено лише у позитивного контролю (сумарна ДНК з A. tumefaciens) при його відсутності у всіх зразках ДНК ліній, регенерованих після трансформації.

Стабільну інтеграцію перенесених Т-ДНК було підтверджено за допомогою гібридизації по Саузерну.

Після гібридизації за Саузерном геномної ДНК трансгенних ліній яблуні було виявлено від однієї до трьох зон, які гібридизувались до фрагменту nptII гену (рис. 3а). У негативному контролі фрагменти, гомологічні до цього гену, були відсутні. Слід зазначити, що у більшості ліній було виявлено лише одну зону гібридизації з фрагментом до nptII гену (рис. 3а). В той же час лінії RF4, RF8 мали дві, та лінія RF10 - три зони гібридизації з фрагментом до nptII гену. Всі зони гібридизації мали розмір, більший ніж довжина Т-ДНК у векторі, слугуючи додатковим підтвердженням того, що візуалізовані фрагменти nptII були вирізані саме з рослинного геному, а не з векторної плазміди. Підсумовуючи, можна сказати, що у цих випадках відбувся перенос однієї, двох чи трьох копій Т-ДНК, що містив nptII ген, відповідно.

Додатково було проведено гібридизацію за Саузерном геномної ДНК трансгенних ліній з метою підтвердження інтеграції rolB гену в рослинні геноми. В Т-ДНК плазміди pCMB-B:GUS rolB ген з обох боків фланкований сайтами рестрикції для ендонуклеази HindIII. Тобто, після обробки як векторної плазміди так і трансгенних рослин цим ферментом має вирізатись фрагмент довжиною близько 2000 п.о., який і буде гібридизуватись з пробою до rolB гену. Як і очікувалось, після гібридизації рослинної ДНК, обробленої HindIII, з пробою до rolB гену було виявлено лише одну зону гібридизації довжиною близько 2000 п.о. в усіх лініях, трансформованих pCMB-B:GUS вектором. Однак інтенсивність гібридизаційних зон була різною. Лінії RF4, RF8 i RF10 характеризувались більш інтенсивними зонами гібридизації (рис. 3Б). Оскільки дані лінії містять дві і більше копій nptII гену і відповідно кількох копій Т-ДНК, то можна припустити, що такий більш інтенсивний сигнал для rolB гену був викликаний також відповідно більшим числом копій rolB гену у рослинних геномах. У негативному контролі фрагменти, гомологічні до цього гену, були відсутні.

Тестування трансгенних клонів на ефективність розмноження та вкорінення експлантів на середовищах у присутності селективного агенту. Зважаючи на спонтанний ризогенез деяких трансгенних (з геном rolB) ліній на середовищах для мікророзмноження провели дослідження по вкоріненню цих ліній без попередньої індукції екзогенними ауксинами. Всі трансгенні пагони (з rolB геном), вкорінювалися з ефективністю 100%.контрольні нетрансгенні пагони зовсім не вкорінювались, а пагони підщепи ММ106 (контроль) - лише у 47% випадків

Слід зазначити, що ефективність ризогенезу трансгенних ліній була неоднаковою. Як видно з даних табл. 6, процеси ризогенезу проходили більш ефективно у клонів №№ 4, 8. Співставляючи ці дані з результатами гібридизації за Саузерном, можна відмітити, що саме ці клони містять збільшену кількість копій як nptII так і rolB генів, що може свідчити про їх вищий рівень експресії. У той же час на лінії №10 спостерігали більш помірну ефективність ризогенезу в порівнянні з лініями №№ 4 і 8. Це, в свою чергу, залежить від конкретного генетичного оточення, а саме - в геномі лінії № 10 окрім вищезазначених генів знаходиться також ген gus.

Здатність пагонів укорінюватись в присутності канаміцину є загальноприйнятим і надійним індикатором трансформації. Проведені тести виявили високу стійкість регенерованих пагонів до значних концентрацій канаміцину (штами А281 та С58С1) та фосфінотріцину (штам ЕНА105). Трансформовані пагони вкорінювались з різним ступенем ефективності на середовищі, яке містило 100 мг/л канаміцину, що можна пояснити, виходячи з результатів молекулярно-біологічних аналізів. Так, найкращі результати при вкоріненні спостерігали для клону № 10, який містив також найбільше число копій гену nptII, що забезпечило йому найкращу адаптивність до канаміцину. В той же час, лінії №№ 4 та 8 характеризувались менш інтенсивним ризогенезом, а лінії з однією копією nptII гену утворювали у більшості випадків лише значну кількість калусу з 1-2 корінцями на пагін

Польові дослідження трансгенних клонів. Отримані лінії було висаджено у відкритий грунт. Трансгенні рослини (з геном rolB) аналізували на предмет утворення додаткового коріння вище умовної кореневої шийки після обгортання основи рослин землею у відкритому грунті. Було відмічено появу адвентивних коренів через 5 місяців вегетації на всіх трансгенних рослинах. В той же час не спостерігали жодного випадку адвентивного ризогенезу на стеблах контрольних кореневласних нетрансформованих рослин. В експериментах по обгортанню трансгенних пагонів, прищеплених на підщепі 54-118, також спостерігали утворення адвентивних коренів вище місця щеплення, тобто на стеблі трансгенних рослин, які містили rolB ген.

ВИСНОВКИ

В результаті проведених досліджень розроблені методи введення культуру in vitro, мікроклонального розмноження, регенерації рослин з листкових експлантів різних сортів яблуні. Внаслідок оптимізації методу трансформації з використанням Agrobacterium tumefaciens отримано 11 трансгенних ліній яблуні сорту Флоріна - з них 9 містять різну кількість функціонального гену rolB, який підвищує здатність до вкорінення та маркерні гени nptII та gus; одна - функціональний ген pat, який забезпечує стійкість до фосфінотріцину та маркерний ген nptII, одна - маркерний ген nptII. Отримані лінії, які містять гени rolB та pat, можуть бути використані в подальшому в фундаментальних, прикладних дослідженнях та практичному садівництві.

1. З використанням меристеми активно ростучих етиольованих пагонів яблуні розроблено схему введення в кульутуру in vitro та відпрацьовано схеми мікророзмноження для 5 промислових сортів яблуні, регенерантного клону сорту Флоріна і двох клонових підщеп яблуні.

2. Для забезпечення ефективної регенерації адвентивних пагонів яблуні оптимізовано склад поживних середовищ та умови культивування in vitro 4 сортів яблуні та 1 вегетативно розмножуваної підщепи, що дозволило досягти рівня регенерації пагонів від 85% до 100%.

3. Встановлено, що ефективність генетичної трансформації яблуні значною мірою залежить від штаму Agrobacterium tumefaciens. При використанні суспензії агробактеріального штаму С58С1 для кокультивації з листковими експлантами 3-3,5 тижневого віку на твердому середовищі протягом 2 діб досягнуто ефективності трансформації 7,9%.

4. На основі розроблених методичних прийомів здійснено трансформацію яблуні сорту Флоріна і отримано трансгенну лінію, що містить ген pat, який забезпечує стійкість отриманої лінії до селективних концентрацій фосфінотріцину в середовищі для мікророзмноження.

5. Вперше отримано трансгенні лінії яблуні сорту Флоріна з геном rolB в геномі, які характеризуються підвищеною здатністю до вкорінення в порівнянні з нетрансгенним контролем та з вегетативно розмножуваною підщепою ММ106.

6. Генетичну модифікацію отриманих клонів встановлено за допомогою полімеразної ланцюгової реакції з використанням пар праймерів, комплементарних до нуклеотидних послідовностей маркерних генів gus та nptII і гену rolB. Гібридизація за Саузерном також підтвердила наявність в ДНК отриманих трансгенних ліній яблуні нуклеотидні послідовності, характерні для генів nptII та rolB.

7. Порівняльний аналіз трансгенних клонів яблуні сорту Флоріна (ген rolB) на канаміцин-вмісному середовищі (100 мг/л) дозволив встановити кореляцію між рівнем ризогенезу та кількістю копій nptII гену в рослинному геномі.

8. Результати досліджень по вирощуванню отриманих трансгенних клонів в умовах in vivo показали високу здатність цих рослин утворювати додаткове коріння при підгортанні нижньої частини пагону грунтом. Додаткове коріння сприятиме покращенню фізіологічних показників мінерального живлення та підвищенню якірності рослин.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Бартиш И.В., Корховой В.И., Меркулов С.М., Копань В.П. Оптимизация методов культивирования in vitro различных сортов и клоновых подвоев яблони (Malus domestica Borkh) // Физиология и биохимия культурных растений. - 1994. - Т.26, №6. - С. 587-594. (Здобувачем проведено дослідження по оптимізації введення, мікророзмноження, вкорінення та адаптації до умов in vivo 6 сортів та 2 клонових підщеп яблуні, зроблено узагальненнярезультатів та сформульовані висновки).

Бартиш И.В., Корховой В.И. Состав культуральной среды и эффективность образования побегов in vitro из листовых побегов яблони // Физиология растений. - 1997. - Т.44, №3. - С. 440-444. (Здобувач разом зі співавтором розробив схему постановки досліду та безпосередньо виконував експерементальну частину роботи. Встановив особисто склад поживних середовищ, оптимальні співвідношення та концентрації фітогормонів для використовуваних сортів, також здійснював збір, аналіз та узагальнення отриманих результатів їх інтерпретацію).

Бартиш И.В., Светлова Н.Б., Корховой В.И. Зависимость эффективности адвентивного органогенеза из листовых эксплантов яблони от концентрации экзогенных регуляторов роста и солевого состава среды // Физиология и биохимия культурных растений. - 1997. - Т.29, №5. - С. 351-355. (Здобувач безпосередньо виконував роботу з органогенезу, проліферації, вкорінення та адаптації отриманих регенерантних клонів, прийняв участь в аналізі результатів та їх інтерпретації).

Корховой В.И., Радчук В.В., Долгов С.В., Бартиш В.И. Генетическая трансформация клона RF1 яблони сорта Флорина с помощью Agrobacterium tumefaciens // Доповіді Національної академії наук України. - 2000. - № 2. - С. 186-190. (Здобувачем здійснено досліди по трансформації, отриманню трансгенної лінії яблуні сорту Флоріна з геном неоміцинфосфотрансферази (nptII) та проведено її молекулярно-біологічний аналіз).

Korkhovy V.I., Radchuk V.V. Agrobacterium-mediated transformation of the apple cv. “Florina” with the rolB gene // Horticulture and Vegetable Growing. - 2001. - Vol. 20 (3). - P. 174-180. (Здобувач отримав трансгенні лінії яблуні сорту Флоріна, які містять гени gus, nptII та rolB. Автором здійснено основний об'єм робіт по трансформації та селекції трансгенних ліній, здійснено збір та аналіз отриманих результатів, їх узагальнення та сформульовано висновки).

Radchuk V.V, Korkhovoy V.I. The rolB gene promotes rooting in vitro and increases fresh root weight in vivo of transformed apple scion cultivar`Florina'// Plant Cell Tiss. Organ Cult. - 2005. - Vol. 81, №2, P. 203-212. (Здобувач розмножив отримані трансгенні лінії для наступного аналізу за допомогою гібридизації за Саузерном. Досліджено здатність утворення коріння як в умовах in vitro, так і в тепличних умовах. Автор здійснював постановку дослідів, збір та інтерпретацію отриманих результатів, їх узагальнення, та написання статті).

Копань В.П., Копань К.М., Болдижева Л.Д., Бартіш І.В., Меркулов С.М., Коломієць М.В., Корховий В.І., Середюк Б.Ю. Прискорення селекційного процесу плодових та ягідних культур // Тези доп. і вист. наук.-практ. конф. присвяч. 25-річчю від дня утвор. Краснокут. досл. ст. с-ва 13-15 липня 1993.- Краснокутськ (Харківськ. обл.). - 1993.- С. 24-25.

Корховой В.И., Бартиш И.В., Копань В.П. Методы микроклонального размножения некоторых сортов и клоновых подвоев яблони (Malus domestica Borkh) // Промислова біотехнологія клонального мікророзмноження плодових і винограду в культурі in vitro: Тези доповіді наук.-практ. конф., серпень 1994. - Херсон. - 1994. - С. 19-21.

Копань В.П., Копань К.Н., Болдыжева Л.Д., Бартиш И.В., Меркулов С.М., Середюк Б.Е., Корховой В.И., Радчук В.В. Основные требования к сортименту для горного садоводства и пути их решения // Интенсификация садоводства на склонах: Тез. докл. научн. конф. (в рамках СНГ) 29 ноября - 2 декабря 1994 г.- Нальчик. - 1994.- С.54-55.

Копань В.П., Копань К.М., Болдижева Л.Д., Бартіш І.В., Меркулов С.М., Середюк Б.Ю., Корховий В.І., Радчук В.В. Віддалена гібридизація, поліплоїдизація та генетична інженерія у створенні принципово нових сортів плодових і ягідних культур // Сучасні проблеми і перспективи розвитку садівництва: Тез н.-в. конф. присвяч. 25-річчю Поділ. досл. ст. ІС.- Вінниця. - 1994.- С. 21-22.

Свєтлова Н.В., Корховий В.І., Бартіш І.В. Вплив різних концентрацій БАП на регенерацію пагонів яблуні сортів Незалежність і Фальстаф. // Наслідки наукових пошуків молодих вчених-аграрників в умовах реформування АПК: Матер. міжн. наук.-практ. конф. - Чабани. - 1996. -Ч. І. - С.35.

Свєтлова Н.В., Корховий В.І. Вплив різних концентрацій БАП і сольового складу поживного середовища на регенерацію яблуні сорту Незалежність // Сад. - 1996. - №1. - С.23.

Корховой В.И., Бартиш И.В., Левенко Б.А. Генетическая трансформация клона RFІ яблони сорта Флорина с помощью Agrobacterium tumefaciens // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: Тезисы докл . VІІ Международной конф. 25-28 ноября 1997 г. - Москва. - 1997. - С.270-271.

Bartish I.V., Merkulov S.M., Korkhovoy V.I. Genetic transformation of apple and pear cultivars mediated by Agrobacterium tumefaciens, strain A281 // Plant Biotechnology and Genetic Engineering: International Symposium 3-6 October 1994. - Kiev. - 1994.- P. 41.

Bartish I.V., Korkhovoy V.I., Svetlova N.B. Developing of the methods of high-frequency adventitious organogenesis in vitro from leaf explants of some apple (Malus domestica Borkh.) cultivars // Tasks and perspectives of orchard plant breeding. (Collection of Scientific Articles). Lithuanian Institute of Horticulture. - Babtai. - 1995. - P. 107-115.

Korkhovoy V.I., Radchuk V.V., Bartish I.V., Levenko B.A. Genetic transformation of aplle cv. “Florina”// Plant Tissue and Cell Culture: Abstracts of IX International Congress 14-19 June 1999. - Jerusalem. - 1998. - P. 170.

Корховой В.И., Радчук В.В., Бартиш И.В., Долгов С.В. Генетическая трансформация клона яблони сорта Флорина с помощью Agrobacterium tumefaciens // Садоводство и виноградарство 21 века. Итоги и перспективы селекционных исследований: Матер. междунар. науч.-практич. конф. 7-9 сентября 1999 г. - Краснодар. - 1999. - Ч. 3.- С. 138-141.

Korkhovoy V.I., Radchuk V.V., Levenko B.A. Efficient Agrobacterium-mediated transformation and recovery of transgenic plants in apple // Fruit Breeding and Genetics: Abstracts of International Symposium 6-10 September 1999. - Dresden. - 1999. - Р. 42.

Korkhovoy V.I., Radchuk V.V. Interactions of the nptII and rolB genes in the transgenic apple plants //Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources: Abstracts of International Symposium 26-31 May 2002. - Yalta. - 2002. - P. 72-73.

Копань В.П., К.Н. Копань, А.Н.Ярещенко, Ю.Б.Козулина, С.И.Гребенюк, В.И.Корховой. Олигогенная селекция - путь целенаправленного решения селекционных програм в плодоводстве // Роль сортов и новых технологий в интенсивном садоводстве: Материалы международной научно-методической конференции 28-31 июля 2003 г. - Орел. - 2003. - С.167-169.

Korkhovy V.I., Radchuk V.V. The rolB gene influence on rooting ability of transgenic lines of apple cultivar “Florina” // Application of biotechnology in breeding cultivars suitable for sustainable fruit production: Abstracts of International Workshop 12-14 May 2005. - Skierniewice. - 2005. - P. 45.

Размещено на Allbest.ru