Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут молекулярної біології та генетики

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ПРОТЕКТОРНІ ВЛАСТИВОСТІ БАКТЕРІЙ РОДУ PSEUDOMONAS ЗА УМОВ КЛОНАЛЬНОГО МІКРОРОЗМНОЖЕННЯ ТА ТОВАРНОГО ВИРОБНИЦТВА КАРТОПЛІ (Solanum tuberosum L.)

Ковальчук Марія Вікторівна

КИЇВ - 2005

Анотація

Ковальчук М.В. Протекторні властивості бактерій роду Pseudomonas за умов клонального мікророзмноження та товарного виробництва картоплі (Solanum tuberosum L.). - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2005.

У роботі викладено результати досліджень з розробки біотехнологічних прийомів захисту рослинного матеріалу картоплі (Solanum tuberosum L.) від фітопатогенної мікрофлори у процесі клонального мікророзмноження рослинного матеріалу та товарного виробництва. Виділено ізоляти з комплексом біологічних характеристик, необхідних для фітопротектора. Встановлено високу здатність штамів Pseudomonas sp. ІМБГ 163 і Pseudomonas sp. ІМБГ 287 колонізувати рослину, конкурентоздатність у змішаних бактеріальних консорціумах за умов колонізації кореневої системи рослини, досліджено детермінанти, які можуть бути причетними до супресії патогенної мікрофлори.

Мікробіологічними та молекулярними методами встановлено локалізацію бактерій при інтродукції в модельні рослини і рослини картоплі за умов клонального мікророзмноження. Показано доцільність застосування бактерій Pseudomonas sp. ІМБГ 163 та Pseudomonas sp. ІМБГ 287 для праймування рослин картоплі на різних етапах клонального мікророзмноження та захисту в процесі товарного виробництва.

Ключові слова: Pseudomonas, Solanum tuberosum L., протекторні ефекти, клональне мікророзмноження.

Аннотация

Ковальчук М.В. Протекторные свойства бактерий рода Pseudomonas при клональном микроразмножении и товарном производстве картофеля (Solanum tuberosum L.). - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. - Інститут молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2005.

В диссертации изложены результаты исследований по разработке биотехнологических приемов защиты растительного материала картофеля от фитопатогенной микрофлоры в процессе клонального микроразмножения растительного материала и товарного производства клубней картофеля. Несмотря на ряд недостатков, свойственных биопрепаратам, действенным компонентом которых являются живые клетки микроорганизмов, интерес к ним как альтернативе пестицидов возрастает. Преодолеть недостатки таких препаратов можно следующими путями: совершенствованием формул биопрепаратов, поиском новых перспективных штаммов микроорганизмов, а так же разработкой новых способов применения бактерий, при которых максимально реализовывались бы их протекторные свойства.

Для поиска бактерий с протекторными свойствами был проведен скрининг среди природных бактериальных изолятов, выделенных из ризосферы растений, а также среди коллекционных штаммов института. Выделены изоляты с комплексом биологических характеристик, необходимых для фитопротектора. По результатам хемотаксономического анализа, фенотипическим признакам, наличием специфического ПЦР-ампликона фрагмента гена 16S рРНК бактерии были отнесены к роду Pseudomonas.

Учитывая возможность использования бактерий как компонентов биопрепаратов в открытых системах, для безопасности были изучены некоторые генетические характеристики. После лабораторного культивирования в штаммах отсутствовали плазмиды. Единственный интегрон был обнаружен у штамма Pseudomonas sp. ИМБГ 287.

Исследованы детерминанты, которые могут быть причастны к супрессии патогенной микрофлоры. Сравнительный анализ антимикробной активности у дикого типа и инсерционного Tn5-мутанта по синтезу сидерофоров у штамма Pseudomonas sp. ИМБГ 287 показал полную зависимость угнетения тестовых культур бактерий от синтеза сидерофоров.

У штаммов Pseudomonas sp. ИМБГ 163 и Pseudomonas sp. ИМБГ 287 выявлена высокая способность колонизировать экторизу растений. Изучена конкурентноспособность исследуемых бактерий в смешанных бактериальных консорциумах при колонизации корневой системы растений. Доля штамма Pseudomonas sp. ИМБГ 163 в таких консорциумах при 2-х недельном сроке вегетации пшеницы составляла в ризосфере не менее 50 %.

Штаммы маркированы репортерными gus- и lux-генами, и микробиологическими, цитологическими и молекулярными методами установлено локализацию и численность интродуцируемых бактерий в модельных растениях и растениях картофеля при клональном микроразмножении. Продемонстрировано статистически достоверное положительное влияние бактеризации штаммом Pseudomonas sp. ИМБГ 163 на отдельные морфометрические параметры пшеницы и картофеля в гнотобиотических условиях.

Изучена возможность использования отдельных видов бактерий рода Pseudomonas как субъектов технологии “Дуал” в производстве биопрепаратов для защиты растений. Исследование штаммов этих бактерий на способность угнетать рост фитопатогенных бактерий выявило у них антагонистические свойства по отношению к штаммам P. syringae pv. syringae, P. syringae pv. atrofaciens, Erwinia carotovora subsp. atroceptica, Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli. Антагонистические свойства и продукция сигнальных молекул класса ацилгомосеринлактонов у псевдомонад при совместном культивировании с компонентом технологии “Дуал” Paenibacillus sp. ИМБГ 156 сохранялись без изменений.

Исследована возможность праймирования растений картофеля на разных этапах клонального микроразмножения полезными бактериями для улучшения выживания растений в условиях ex vitro. Для выбора оптимальных сроков праймирования изучена способность бактерий поддерживаться в растениях в течение нескольких циклов клонального микроразмножения. Встановлена сортоспецифичность растений в отношении колонизации бактериями в течение нескольких циклов. Определены оптимальные варианты инокулянтов бактерий и сроки их применения.

Показано положительное влияние биопраймирующих агентов Pseudomonas sp. ИМБГ 287 и Pseudomonas sp. ИМБГ 163 на выход полноценной рассады картофеля, адаптированной к условиям ex vitro. Применение указанных штаммов в условиях масштабирования размножения картофеля позволяет сохранить до 90 % рассады при перенесении ее в условия ex vitro в сравнении с контролем, где рассада гибнет стопроцентно.

Показана возможность использования вышеуказанных бактерий в составе лабораторных прототипов биопрепаратов для размножения семенного материала картофеля из мини-клубней, а также для производства и защиты товарного картофеля от почвенной инфекции. Определены пути повышения эффективности использования полезных бактерий на примере штаммов Pseudomonas sp. ИМБГ 287 и Pseudomonas sp. ИМБГ 163 для защиты растений от комплексной почвенной инфекции. Суть их состоит в подборе оптимальных условий для формирования системных взаимосвязей растения и бактерии.

В результате исследований разработаны оригинальные биотехнологические приемы адаптации растительного материала картофеля, полученного при клональном микроразмножении, к условиям ex vitro.

Ключевые слова: Pseudomonas, Solanum tuberosum L., протекторные эффекты, клональное микроразмножение.

Summary

Kovalchuk M.V. The protective capability of the Pseudomonas genus bacteria within the clonal micropropagation and commodity production of potato (Solanum tuberosum L.). - Manuscript.

Thesis for Сandidate's degree in Biological Sciences by speciality 03.00.20 - Biotechnology. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.

This manuscript is devoted to a working out of biotechnological methods of protection plant material against phytopathogenic microorganisms by means of biopriming within micropropagation and commodity production of potato. A set of strains of the genus Pseudomonas was examined in vitro in respect of inhibition of some phytopathogenic bacteria. Biocontrol activities against strains of Pseudomonas syringae pv. syringae, P. syringae pv. atrofaciens, Erwinia carotovora subsp. atroceptica, Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli were analyzed. It was shown, that strains Pseudomonas sp. IMBG 287 and Pseudomonas sp. IMBG 163 colonized root zones and changed structure of the rhizosphere microbial community. In the case of co-cultivating pseudomonads with a component of the “Dual” technology, Paenibacillus sp., their both biocontrol activities and signalling molecules production were not changing. The positive effects of Pseudomonas sp. IMBG 287 and Pseudomonas sp. IMBG 163 on priming the micropropagated plantlets, minitubers, and seed tubers were determined.

Key words: Pseudomonas, Solanum tuberosum L., biocontrol effects, micropropagation.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Зростаюче техногенне навантаження на навколишнє середовище примушує нас створювати якісно нові, біологічні, технології захисту рослин від шкідників та стресорів. Одним із інструментів підвищення продуктивності рослинництва та отримання екологічно чистої продукції є використання мікроорганізмів, які позитивно впливають на розвиток рослин та їхній імунітет. Використання бактерій у рослинництві як альтернативи агрохімікатам потребує подальшого вивчення механізмів, які лежать в основі взаємодії бактерій з рослинами та створення нових біопрепаратів на основі мікроорганізмів із комплексом корисних для рослини властивостей.

Однією з важливих умов ефективності біоконтролю патогенних мікроорганізмів за допомогою бактерій є їх конкурентність у природних умовах. Проте здатність до конкуренції з ендемною мікробіотою та до активної колонізації кореневої системи залишається лімітуючим фактором застосування біопрепаратів для захисту рослин від ґрунтових патогенів, які створюються на основі живих клітин. Для збереження активності бактерій у препаратах створюються спеціальні формули, виробництво яких вимагає великих затрат. Наприклад, у деяких країнах застосовується технологія отримання альгінатних кульок, в яких депонуються корисні бактерії, що значно поліпшує конкурентоспроможність та життєздатність бактерій (Russo et al., 2005). Паралельно із вдосконаленням мікробіологічних препаратів ведеться пошук ефективних та відносно дешевих шляхів біозахисту рослин. Подальша стратегія у цьому напрямку пов'язана із створенням таких системних взаємозв'язків рослини та корисної бактерії, які могли б максимально сприяти реалізації протекторних можливостей бактерій, що складають основу біопрепаратів.

Утворення системних взаємозв'язків рослини і корисної бактерії забезпечує передумови для захисту рослин і виробництва екологічно чистої рослинної продукції на всіх етапах її вирощування. Останнім часом у значних обсягах використовується розмноження та оздоровлення рослин в умовах in vitro. Обсяги виробництва оздоровленої розсади картоплі тільки в окремих технологічних центрах сягають мільйонів рослин на рік. Такі технології потребують розробки екологічно безпечних способів захисту рослин від патогенної мікрофлори при адаптації в умови ex vitro.

На сьогодні залишаються актуальними дослідження із вдосконалення технологій біопрепаратів для захисту рослин від пробірки до насіння, пошуку нових перспективних штамів бактерій, що могли б скласти основу нових біопрепаратів, та шляхів їхнього застосування. Розвиток нових молекулярних підходів для вивчення бактерій дозволяє проводити такі дослідження ефективніше та створювати більш якісні препарати для захисту рослин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Виконана робота відповідає основному планові науково-дослідних робіт відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за бюджетними темами № 2.2.4.23 “Вивчення підходів до створення асоціації господарсько цінних рослин з ендофітними бактеріями” (№ державної реєстрації 0199U000725, 1999-2002 рр.) та № 2.2.4.23 “Роль ендемних ендофітних популяцій бактерій у розвитку рослин, що розмножуються клонуванням” (№ державної реєстрації 0202U00667, 2003-2006 рр.).

Мета та завдання дослідження. Метою дослідження було вивчення особливостей протекторної дії деяких видів бактерій роду Pseudomonas при їхній інтродукції у вищі рослини та застосування їх для створення біотехнологічних прийомів захисту рослин картоплі (Solanum tuberosum L.) від комплексної грунтової інфекції на різних етапах технологічного ланцюга отримання насіннєвого матеріалу та товарної продукції.

Відповідно до мети поставлено такі завдання:

1. Виділити штами бактерій - потенційних біопротекторів та вивчити їхні окремі таксономічні та генетичні характеристики.

2. Дослідити властивості бактерій Pseudomonas sp. ІМБГ 163 та Pseudomonas sp. ІМБГ 287, які визначають асоціативну взаємодію з рослинами та біопротекторну дію. Охарактеризувати бактерії як суб'єкти технологій отримання біопрепаратів.

3. Розробити на основі виділених бактеріальних штамів біотехнологічні прийоми захисту рослинного матеріалу картоплі від фітопатогенної мікрофлори у процесі клонального мікророзмноження рослинного матеріалу та товарного виробництва.

Об'єкт дослідження - біотехнологічні основи захисту рослин від комплексної ґрунтової інфекції у виробничих ланцюгах отримання насіннєвого матеріалу та товарної продукції картоплі за допомогою корисних ризосферних мікроорганізмів.

Предмет дослідження - характеристики бактерій Pseudomonas як біоагентів захисної системи від патогенної мікробіоти та адаптаційної системи при переході з умов вирощування in vitro в умови ex vitro; характеристики штамів як суб'єктів технології для отримання біопрепаратів.

Методи дослідження - мікробіологічні, біохімічні, цитологічні та молекулярні методи для ідентифікації бактерій, методи визначення антимікробної активності бактерій, маркування бактерій репортерними генами з метою моніторингу у відкритій системі, визначення сигнальних молекул бактерій класу ацилгомосеринлактонів, методи ідентифікації окремих ділянок бактеріальної ДНК з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для детекції бактерій у рослинах та виявлення інтегронів у бактерій, прийоми клонального мікророзмноження, статистичні методи аналізу.

Наукова новизна отриманих результатів. Теоретично обгрунтовано стратегію використання бактерій Pseudomonas sp. ІМБГ 163 та Pseudomonas sp. ІМБГ 287 як біоагентів для захисту та адаптації рослинного матеріалу до умов ex vitro шляхом праймування рослин, що проходять етап мікророзмноження. Запропоновано новий підхід застосування корисних бактерій як біопротекторів рослини від фітопатогенної мікрофлори, суть якого полягає в підборі умов для створення системних взаємозв'язків рослини та бактерії з подальшим перенесенням у довкілля асоціації з такими елементами, які є взаємозахищеними.

Вперше охарактеризовано штами бактерій Pseudomonas sp. ІМБГ 163 та Pseudomonas sp. ІМБГ 287 як біологічні об'єкти, які мають здатність колонізувати рослини, бути конкурентноздатними в угрупованнях бактерій, що знаходяться в ризосфері рослини та позитивно впливати на ростові характеристики рослин. Показано, що штами Pseudomonas sp. ІМБГ 163 та Pseudomonas sp. ІМБГ 287 є джерелами біологічно активних речовин, які впливають на патогенну мікрофлору.

Вперше показано можливість використання бактерій Pseudomonas sp. ІМБГ 163 та Pseudomonas sp. ІМБГ 287 як біоагентів у захисті від патогенної мікробіоти та адаптації культурних рослин при подоланні трансплантаційного стресу в умовах ex vitro у біотехнологічному ланцюзі отримання оздоровленого насіннєвого матеріалу S. tuberozum L.

Практичне значення отриманих результатів. Запропоновано модифікацію схеми процесу отримання насіннєвого матеріалу S. tuberosum L. введенням стадії біопраймування бактеріями Pseudomonas sp. ІМБГ 163 та Pseudomonas sp. ІМБГ 287, що дає змогу пристосувати рослини, отримані в умовах клонального мікророзмноження, до умов ex vitro. Розроблено нову схему отримання препаративних форм відповідних штамів бактерій, умови та терміни бактеризації рослинного матеріалу. Рекомендовано використання Pseudomonas sp. ІМБГ 163 та Pseudomonas sp. ІМБГ 287 у препаративній формі для розсади та товарного виробництва картоплі.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи авторкою проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Дисертанткою разом із керівником розроблено програму проведення експериментів та підібрано методи вирішення поставлених завдань. Огляд літератури, написання тексту дисертації, обробку й аналіз отриманих результатів виконано безпосередньо здобувачем. Основний обсяг експериментальної роботи виконано за безпосередньої участі здобувача. Дисертанткою особисто виділено з довкілля, марковані репортерними генами бактерії - потенційні біопротектори, вивчено деякі їхні біологічні особливості як у монокультурі, так і в лабораторному прототипі біопрепарату та в асоціації з рослиною. За безпосередньої участі здобувача підібрано оптимальний склад інокулянтів для введення бактерій у рослину на різних етапах отримання насіннєвого матеріалу картоплі. У дисертаційну роботу внесено частину опублікованих матеріалів, які містять результати, отримані здобувачем особисто і в співавторстві. Препаративні форми бактерій напрацьовано за технологією “Дуал”, розробленою в ІМБГ НАНУ (Козировська, Негруцька, 2001). Експерименти з мікроклонального розмноження виконано у співробітництві з О.В. Подоліч (Інститут агроекології та біотехнології УААН). Досліди з вивчення впливу праймування псевдомонадними бактеріями на адаптацію культурних рослин до умов ex vitro проводили разом із співробітниками лабораторії мікроклонального розмноження Інституту картоплярства УААН І.І. Костюком та В. Б. Рязанцевим. Одержані результати обговорено та надруковано в спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися на міжнародній конференції “Природні екосистеми Карпатських гір в умовах інтенсивного антропогенного навантаження“ (Ужгород, Україна, 2001), на Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, Україна, 2004), на міжнародному форумі “Основи молекулярно-генетичного оздоровлення людини і довкілля” (Київ, Україна, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 експериментальних статей у фахових виданнях та тези 2 доповідей на науково-практичних конференціях і з'їздах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, експериментальної частини, яка має два розділи, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків та списку використаних джерел, що охоплює 170 найменувань. Дисертацію викладено на 127 сторінках машинописного тексту. Фактичний матеріал дисертації подано у вигляді 21 рисунка та 18 таблиць.

2. Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. У роботі використано штами природних ізолятів бактерій Pseudomonas. sp. ІМБГ 163, 168, 287, 288, 294, штами Paenibacillus sp. ІМБГ 156, Klebsiella oxytoca ІМБГ 26, Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli IMBG 296, а також бактерії Pantoea agglomerans 1а, Erwinia carotovora subsp. atroceptica IMB 9027, типові штами Pseudomonas fluorescens ІМB 17 та Pseudomonas putida ІМB 1934 із колекції Інституту мікробіології та вірусології імені Д. К. Заболотного НАН України. Штами Agrobacterium tumefaciens NTL4, A. tumefaciens NT1 (NTL4) та A. tumefaciens NT1 (pTIC58ДaccR) люб'язно надані д-ром Л. Халда-Алія (Ун-т Міссісіпі, США), а штам P. аureofaciens H16 - д-ром К. М. Злотніковим (РФ). Для маркування штамів бактерій використовували плазміди pNAPSLux (Ap^R) та pCAM120 (Ap^R, Km^R). У дослідженнях використано сорти картоплі селекції Інституту картоплярства УААН та з колекції Інституту агроекології та біотехнології УААН.

Для вирощування бактерій застосовано середовища Lurea-Bertani та M9 (Міллер, 1976), King B (King et al., 1954) та синтетичні середовища на основі фосфатного буфера з додаванням джерел вуглецю та азоту.

У дослідах використовували такі реактиви: X-Gal (5-бромо-4-хлоро-3-індоліл-в-піранозид) та X-GlсА (5-бромо-4-хлоро-3-індоліл-в-D-глюкуронід) виробництва фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (ФРН), ферменти рестрикції ДНК, ДНК-полімераза та інші реактиви для ПЛР фірми “MBI Fermentas” (Литва). Праймери для детекції псевдомонадних бактерій та виявлення інтегронів у бактеріальних ДНК були синтезовані фірмою „Синтол” (РФ). Для буферів і середовищ використано солі виробництва фірми “Merck” (ФРН) кваліфікації “pro analysi”. Решта реактивів були вітчизняного виробництва і мали кваліфікацію “осч“ та “хч“.

Ідентифікацію штамів проводили за визначниками бактерій Бергі (1986), роботами Стейнера та співавт. (1966), Смирнова та Кіпріянової (1990). Мікробіологічну чистоту і морфологічну характеристику культури контролювали мікроскопічними методами та висівами розведень на селективних середовищах. Життєздатність бактеріальних клітин у лабораторних прототипах біопрепаратів при тривалому зберіганні визначали, підраховуючи колонії після висіву розведень на чашки із агаровим середовищем (Аристовська та ін., 1962).

Оцінку антагоністичної активності бактерій визначали за затримкою росту тест-культур на твердих середовищах і представляли в міліметрах.

Виділення плазмідної та хромосомної ДНК бактерій, рестрикційний аналіз, гель-електрофорез ДНК, кон'югацію здійснювали за стандартними методиками (Sambrook et al., 1989). ДНК із тканин картоплі отримували за допомогою набору “МоВio” (США).

Детекцію бактерій роду Pseudomonas проводили за допомогою ПЛР з використанням праймерів, описаних Йогансеном та ін. (Johnsen et al., 1999). Інтегрони в бактеріях виявляли ПЛР з використанням праймерів, розроблених Холмесом та ін. (Holmes et al., 2003).

Вміст сигнальних молекул класу ацилгомосеринлактонів у бактеріальних штамів визначали за допомогою біосенсорного штаму Agrobacterium tumefaciens NTL4, здатного гідролізувати X-Gal лише в присутності екзогенного аутоіндуктора аГСЛ, а також A. tumefaciens NT1 (pTIC58ДaccR) та A. tumefaciens NT1 (NTL4) як позитивного і негативного контролів (Cha et al., 1998).

Маркування бактерій репортерними генами lux та gusA проводили за допомогою кон'югації (Wilson et al., 1995; Kovalchuk et al., 2003).

Пробіркові рослини картоплі отримували в умовах in vitro на безгормональному середовищі Мурашіге та Скуге з модифікаціями (1966). Рослини in vitro культивували із застосуванням прийомів клонального мікророзмноження, описаних у роботах Бутенко (1983).

Наведені результати є середнім значенням дослідів, здійснених не менше як у трьох повторностях. Математичну обробку результатів досліджень проводили методами математичної статистики (Плохинский, 1980; Лакин, 1990) із застосуванням програми “Sigma Plot 6.0”. Вірогідність різниці оцінювали за допомогою критеріїв Стьюдента або Фішера при P=0,05.

Результати дослідження та їх обговорення.

Виділення з довкілля бактерій - потенційних біопротекторів рослин та дослідження їхніх окремих генетичних і технологічних характеристик. У процесі пошуку об'єктів, які відповідали б одночасно параметрам якісного біопротектора для рослин і суб'єкта біотехнології, ми зупинилися на бактеріях роду Pseudomonas. Серед природних ізолятів, отриманих з ризосфери та поверхні бульб картоплі, а також колекції бактерій відділу, було проведено пошук для виявлення здатності ізолятів виявляти антимікробну активність. Ізоляти, які в біотестові in vitro пригнічували ріст індикаторних культур (P. syringae pv. syringae IMBG 295, E. carotovora subsp. atroceptica IMB 9027, X. axonopodis pv. phaseoli IMBG 296), було охарактеризовано за допомогою ключових тестів (табл. 1).

Приналежність бактерій до роду Pseudomonas підтверджувалася також наявністю ПЛР-продукту, який утворювався в реакції за участі специфічних праймерів. У подальшій роботі рестрикційні фрагменти, утворені ендонуклеазою Sal1 з 445 п. н.-амплікону, використовували для моніторингу бактерій штаму Pseudomonas sp. ІМБГ 163 в рослинних тканинах.

Як суб'єкти біотехнології, які буде використано у відкритих системах, штами аналізували на наявність мобільних генетичних елементів (МГЕ), зокрема, плазмід та інтегронів. Оскільки плазміди в геномах досліджуваних бактерій не було виявлено, а інтегрони виявлено тільки у штаму Pseudomonas sp. IMБГ 287, штами охарактеризовано як бактерії з обмеженим метагеномом.

Таблиця 1. Антимікробна активність окремих бактерій роду Pseudomonas, визначена за діаметром зони пригнічення росту бактерій-індикаторів

* Фітопатогени: А - P. syringae subsp. syringae; B - P. syringae subsp. atrofaciens; C - Erwinia carotovora subsp. atroceptica; D - X. campestris subsp. phaseoli.

**Діаметр зон пригнічення росту бактерій-індикаторів (мм): (0) відсутні зони пригнічення росту; (1) до 10; (2) від 10 до 20; (3) від 20 до 30; (4) більше 30; (нв) не визначались.

Дослідження властивостей бактерій роду Pseudomonas, які визначають асоціативну взаємодію з рослинами та біопротекторну дію. У псевдомонадних бактерій, наведених у табл. 1, застосування середовища King B дало можливість виявити зелений флуоресцентний пігмент, який за функціональною характеристикою належить до сидерофорів, а за хімічною структурою - до змішаного типу сидерофорів - псевдобактинів. При опроміненні 1 - 2-добових чашок з культурами УФ-світлом з довжиною хвилі 360 нм спостерігали Стоксову компоненту випромінення пігментами штамів у ділянці 520 нм і більше. Пігмент, який синтезували вищезгадані штами Pseudomonas, виявив типові властивості сидерофорів: а) пігмент флуоресціював при освітленні УФ-світлом; б) його синтез повністю репресувався хлористим залізом у концентрації 100 мкг/мл. За характером антимікробної дії штами Pseudomonas sp. ІМБГ 163 та Pseudomonas sp. ІМБГ 287 виявляли відмінності. У штаму Pseudomonas sp. ІМБГ 287 середовище із хлористим залізом (100 мкг/мл) повністю репресувало синтез сидерофорів, що не спостерігали в іншого штаму. За допомогою транспозонного мутагенезу отримано мутанти за синтезом сидерофорів. Tn-5-мутанти Pseudomonas sp. ІМБГ 287, у яких на селективних середовищах синтез сидерофорів був відсутнім, також втрачали здатність проявляти Для контролю здатності штамів бактерій Pseudomonas sp. ІМБГ 163 та Pseudomonas sp. ІМБГ 287 колонізувати кореневу систему рослин бактерії марковано репортерними генами, а саме lux-генами бактерії Photobacterium leiognathi за допомогою плазміди pNAPSLux та геном gus A, що кодує бета-глюкуронідазу - фермент, який окислює безколірний субстрат X-Glc до продукту блакитного кольору.

Гістохімічним аналізом бета-глюкуронідазної активності в рослинних тканинах визначено, що бактерії Pseudomonas sp. ІМБГ 163, марковані gusA-геном, проникають всередину тканин пшениці через кореневі волоски, рухаючись далі до центра кореня і проникаючи у судини рослини. Виявлено, що ізоляти швидко колонізували кореневу систему контрольних рослин у стерильних умовах, що підтверджувалося мікробіологічними та мікроскопічними тестами.

Моніторинг бактерій Pseudomonas sp. ІМБГ 163, мічених gusA-геном, проводили у проростках пшениці в процесі вегетації після одного, двох і трьох тижнів від дня інокуляції насіння пшениці. При цьому можна було прослідкувати збільшення кількості бактеріальних клітин після двотижневого періоду і приблизне зменшення на ј КУО на третій тиждень після інокуляції.

Визначено здатність бактерій Pseudomonas sp. ІМБГ 287 та Pseudomonas sp. ІМБГ 163 колонізувати картоплю. Моніторинг бактерій на поверхні рослин (корені, бульби й листя), отриманих з інокульованих бактеріями бульб, здійснювали протягом трьох місяців за ознакою експресії lux-гена. На листі бактерії зберігалися протягом 1,5 місяця, на коренях та бульбах - до 3 місяців. Таким чином, визначено, що картопля є вдало вибраним компонентом модельної системи.

Конкурентоздатність бактерій Pseudomonas sp. ІМБГ 163 та Pseudomonas sp. ІМБГ 287 досліджували в штучних бактеріальних консорціумах, які утворювалися в ризосфері інокульованих рослин. Модельні системи були утворені рослинами пшениці сорту Киянка або чорнобривцями (Tagetes patula L.) та бактеріальними асоціаціями, які включали штами Pseudomonas sp. ІМБГ 163, 288, Paenibacillus sp. ІМБГ 156, Klebsiella oxytoca ІМБГ 26, Pantoea agglomerans 1а.

Оскільки такі властивості бактерій, як експресія антимікробних речовин і здатність колонізувати ризосферу, у псевдомонадних бактерій пов'язують із міжклітинними комунікаційними системами, здатність до синтезу аутоіндукторів класу ацилгомосеринлактонів із довжиною жирнокислотного ланцюга 4-14 вуглецевих атомів в окремих штамів бактерій роду Pseudomonas визначали за діаметром блакитної зони гідролізованого біосенсорним штамом X-Gal (табл. 2).

Порівнюючи виявлені властивості у досліджених нами псевдомонадних бактерій, які, з нашої точки зору, мають вирішальну роль для захисту рослин від фітопатогенів, було вибрано два штами з контрастними характеристиками для створення лабораторних прототипів біопрепаратів, які наведено в табл. 3.

Бактерії Pseudomonas sp. ІМБГ 163 та Pseudomonas sp. ІМБГ 287 як суб'єкти технологій отримання біопрепаратів. Для подовження терміну зберігання живих клітин бактерій, що для виробничих процесів, досліджувалися варіанти формул, які могли б підтримувати життєздатність бактерій.

Таблиця 2. Синтез ацилгомосеринлактонів окремими штамами бактерій роду Pseudomonas

Позитивний контроль - A. tumefaciens NT1 (pTIC58ДaccR), негативний контроль - A. tumefaciens NT1 (NTL4). *Діаметр зон гідролізованого Х-Gal біосенсорним штамом (мм): (0) відсутні зони ; (1) до 10; (2) від 10 до 20; (3) від 20 до 30; (4) більше 30.

Як іммобілізувальний компонент застосовано природний мінерал цеоліт із розміром частинок 1-8 мкм. Вирощування бактерій на штучному середовищі з джерелом азотного живлення неорганічної природи та 10 %-м вмістом цеоліту дозволило зберігати бактерії життєздатними без істотного зменшення щільності клітин більше двох місяців при температурі 4-10 С.

Таблиця 3. Характеристики штамів бактерій Pseudomonas sp. ІМБГ 163 та ІМБГ287

Для отримання гельних препаративних форм інокулянтів, які мають переваги над рідкими, бактерії культивували за технологією “Дуал“, яка забезпечує препарат полісахаридним носієм. Динаміку виживання клітин у гельних зразках залежно від температури культивування подано в табл. 4.

Таблиця 4. Динаміка титру бактерій Pseudomonas sp. ІМБГ 287 та Pseudomonas sp. ІМБГ 163 у змішаних культурах з Paenibacillus sp. ІМБГ 156, одержаних за технологією “Дуал”

Застосування бактерій штамів Pseudomonas sp. ІМБГ 163 та Pseudomonas sp. ІМБГ 287 у технологічному процесі отримання насіннєвого матеріалу та товарної продукції картоплі. Оскільки в процесі отримання насіннєвого матеріалу використовується клональне мікророзмноження і виникає проблема адаптації його до умов ex vitro, було досліджено шляхи введення бактерій в рослинні тканини для надання стійкості рослинам до комплексної ґрунтової інфекції. Порівняно з вільноіснуючими бактеріями ендофітні бактерії утворюють більш стабільні асоціації з рослиною, тому ми дослідили штами в ендофітній стадії розвитку. Для цього експланти меристематичних зон паростків картоплі інокульовали бактеріями штамів Pseudomonas sp. ІМБГ 163 і Pseudomonas sp. ІМБГ 287. У двомісячних рослинах першого циклу клонального мікророзмноження сорту Загадка, отриманих з інокульованих експлантів, чисельність популяцій інтродукованих бактерій Pseudomonas sp. ІМБГ 163 сягала 10⁵ КУО/г (стебла) та 10⁷ КУО/г (корінь) у біологічних повторностях.

Присутність бактерій відслідковували у другому і третьому поколіннях рослин після клонального мікророзмноження. В результаті проведення мікробіологічного тестування сегментів листків і коріння з отриманих рослин-регенерантів картоплі в умовах in vitro, виявлено вплив генотипу рослини на можливість підтримувати інокульовані бактерії протягом кількох циклів розмноження. Бактерії підтримувалися як у рослинах першого вегетативного покоління, так і в отриманих після двох циклів клонального мікророзмноження у сортів Загадка та Нігру, при цьому кількість колонізованих рослин із кожним пасажем зменшувалася. У другому циклі колонізовані бактеріями рослини складали менше 50% від інокульованих.

Аналіз зразків ДНК, виділених із рослин, у яких бактерії штаму Pseudomonas sp. ІМБГ 163 не виявлялися мікробіологічним методом, показав, що у тотальній ДНК, яку виділено з рослин, і яка містить також ДНК бактерій, присутня ДНК бактерій Pseudomonas.

У наших дослідженнях встановлено, що інокулювати рослинний матеріал у процесі клонального мікророзмноження доцільно на останньому циклі перед перенесенням рослин в умови ex vitro.

При виробництві розсади і бульб оздоровленої картоплі особливо важливо підвищити приживлення живців від рослин, отриманих в умовах in vitro, та сформувати повноцінну розсаду, придатну для садіння в теплиці. На цьому етапі рослинний матеріал переходить в умови вирощування ex vitro, що супроводжується стресом для новоутворених рослин. При переведенні рослин в умови ex vitro потрібно знову відтворювати мікрофлору рослини та сенсибілізувати рослину шляхом праймування бактеріями відповідних штамів мікроорганізмів.

При відпрацюванні способів праймування в умовах масштабування процесу отримання розсади і бульб картоплі пробіркові рослини, що генеровані в умовах in vitro, розділяли за кількістю наявних вузлів і висаджували у досліджувані субстрати. У них вносили бактерії штамів Pseudomonas sp. ІМБГ 163 та Pseudomonas sp. ІМБГ 287 у формі лабораторних прототипів біопрепаратів, отриманих за технологією “Дуал”, в розрахунку 0,5-1 мл на 1 л поживного середовища, яке зволожувало субстрат до повного насичення. Еталоном слугували живці, оброблені сполуками срібла, а контролем - живці, оброблені водою. Протягом чотирьох тижнів розсаду вирощували в лабораторії у контрольованих умовах освітлення та зволоження, а далі дорощували в теплиці протягом ще чотирьох тижнів.

У результаті встановлено різницю між контрольними рослинами та праймованими за впливом бактерій штамів Pseudomonas sp. ІМБГ 163 і Pseudomonas sp. ІМБГ 287 на розвиток та вихід розсади. Зокрема, при застосуванні препаратів у дозі 0,5 мл/л розчину мінеральних солей приживлення живців від рослин картоплі, отриманих в умовах in vitro, становило для Pseudomonas sp. ІМБГ 163 92 %, для Pseudomonas sp. ІМБГ 287 - 94 %, для еталона - 91 %, а в контролі прижилося 25 % живців. Значну різницю спостерігали для лінійних та вагових морфометричних показників (табл. 5).

Таблиця 5. Порівняльна оцінка впливу хімічних та мікробіологічних препаратів на лінійні та вагові морфометричні параметри розсади, отриманої з розмноженої клонально картоплі сорту Світанок

Важливим показником у процесі одержання розсади з рослин оздоровленої картоплі, отриманих in vitro, є вихід повноцінної розсади (табл. 6).

Таблиця 6. Вплив праймування живців картоплі бактеріями штамів Pseudomonas sp. ІМБІГ 163 і 287 на вихід повноцінної касетної розсади оздоровленої картоплі

За допомогою розмноження рослин із міні-бульб, сформованих за умов in vitro, можна значно збільшити вихід якісного насіннєвого матеріалу картоплі, що було показано на міні-бульбах сортів Повінь та Серпанок, які після пророщування оброблялися бактеріями штаму Pseudomonas sp. ІМБГ 163 у формі лабораторного прототипу біопрепарату (табл. 7).

Таблиця 7. Вплив бактеризації штамом Pseudomonas sp. ІМБГ 163 на індивідуальну продуктивність і врожайність міні-бульб картоплі

Лабораторні прототипи біопрепаратів, які містять штами бактерій Pseudomonas sp. ІМБГ 163 і Pseudomonas sp. ІМБГ 287, досліджено при вирощуванні картоплі з насіннєвих бульб у відкритому грунті. Прототипи біопрепаратів використовували у співвідношенні 0,5 або 1 мл на 10 кг бульб з експозицією 24 години. Оскільки реакція на мікробіологічні препарати залежить від сорту, використовували чутливий та стійкий до мікробної інфекції сорти картоплі - Повінь і Світанок київський. Дані про вплив бактерій штаму Pseudomonas sp. ІМБГ 287 на врожайність сортів у залежності від експозиції та стійкість до хвороб.

Таблиця 8. Врожайність сортів картоплі залежно від часу експозиції бульб, оброблених бактеріальним протопрепаратом на основі штаму Pseudomonas sp. ІМБГ 287 перед садінням

*Варіанти: 1 - контроль; 2 - застосування протопрепарату перед садінням; 3 - застосування за 1 добу до садіння (експозиція 24 год).

Таким чином, аналізуючи результати впливу бактерій штамів Pseudomonas sp. ІМБГ 163 і Pseudomonas sp. ІМБГ 287 на рослини картоплі на етапах отримання насіннєвого матеріалу та товарного виробництва, нами виявлено важливість створення умов, за яких бактерії здатні формувати стійкі взаємозв'язки з рослиною і збільшити розміри своїх популяцій.

Максимального протекторного ефекту можна досягти, якщо проводити праймування рослинного матеріалу корисними бактеріями на стадії отримання розсади в біотехнологічному ланцюзі клонального мікророзмноження. Це виявляється у високій стійкості асоціації бактерія - рослина до комплексної ґрунтової інфекції. На користь такого підходу може свідчити важливість значення часу експозиції обробленого бактеріями матеріалу перед садінням для виявлення позитивної дії інтродукованих бактерій на господарські показники картоплі.

Висновки

Визначено особливості протекторної дії штамів бактерій Pseudomonas sp. ІМБГ 163 і Pseudomonas sp. ІМБГ 287 при їхній інтродукції у вищі рослини, що покладено в основу розробки біотехнологічних прийомів захисту картоплі (Solanum tuberozum L.) від комплексної ґрунтової інфекції на різних етапах технологічного ланцюга отримання насіннєвого матеріалу та товарної продукції.

1. Запропоновано новий підхід до застосування корисних бактерій як біопротекторів рослини від фітопатогенної мікрофлори, суть якого полягає у визначенні умов для створення системних взаємозв'язків рослини і корисної бактерії з подальшим перенесенням у довкілля системи „рослина - бактерія” з такими елементами системи, які є взаємозахищеними.

2. Введення бактерій штамів Pseudomonas sp. ІМБГ 163 і Pseudomonas sp. ІМБГ 287 у гнотобіотичні системи з рослинним компонентом S. tuberozum L. супроводжується зростанням розмірів популяцій бактерій в екторизі та ендоризі до значень 10⁶-10⁷ КУО/г сирої маси кореня, при яких бактерії збільшують масу живців.

3. Виявлено, що праймування рослинного матеріалу штамами бактерій Pseudomonas sp. ІМБГ 163 і Pseudomonas sp. ІМБГ 287 сприяє адаптації пробіркових рослин картоплі, отриманих за умов клонального мікророзмноження, до умов ex vitro. Підібрано оптимальні строки та умови праймування пробіркових рослин відповідними штамами.

4. Доведено, що застосування штамів Pseudomonas sp. ІМБГ 163 і Pseudomonas sp. ІМБГ 287 як агентів біопраймування за умов клонального мікророзмноження дозволяє зберегти до 90 % розсади картоплі при перенесенні її в умови ex vitro порівняно з контролем, де незахищена розсада гине стовідсотково.

5. Показано, що штами Pseudomonas sp. ІМБГ 163 і Pseudomonas sp. ІМБГ 287 є новими перспективними компонентами біопрепаратів для захисту чутливих до патогенної мікрофлори сортів картоплі у виробництві екологічно чистої товарної бульби.

бактерія рослина картопля мікрофлора

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Kovalchuk M.V., Negrutska V.V., Zaetz I.E., Pasechnic L.A., Gvozdyak R.I., Kozyrovska N.O. Ecologicaly-friendly crop production with microbial inoculants. II. Biocontrol capacity of bacterial isolates, candidates for inoculant development //Науковий вісник Ужгородського університету. Серія “Біологія”. - 2001. - № 9. - С. 82-84.

2. Kovalchuk M.V., Negrutska V.V., Kovtunovych G.L., Lar O.V., Korniichuk O.S., Rogutsky I.S., Alpatov A.P., Kozyrovska N.O., Kordium V.A. Modeling the pNARSLux transfer in the wheat rhizosphere under simulated microgravity // Космічна наука і технологія. Додаток. - 2003. - Т. 9, № 2. - С. 10-14.

3. Негруцька В.В., Ковальчук М.В., Козировська Н.О. Технологія “Дуал” для виробництва широкого спектрa біопрепаратів // Агроекол. журн. - 2003. - № 3. - С. 54-58.

4. Ковальчук М.В., Негруцька В.В., Козировська Н.О. Характеристика окремих псевдомонад як кандидатів для створення препаратів нового класу за технологією “Дуал” // Агроекол. журн. - 2004. - № 2. - С. 41-44.

5. Kovalchuk M.V., Negrutska V.V., Lytvynenko T.L., Kononuchenko O.V., Rymar S. E., Kozyrovska N. O. Colonization capacity and persistance on wheat roots of a biocontrol agent Pseudomonas sp. IMBG 163 // Біополімери і клітина. - 2004. - Т. 20, № 6. - С. 530-534.

6. Ковальчук М.В., Рязанцев В.Б., Костюк І.І., Козировська Н.О. Праймування корисними бактеріями в технологічному процесі клонального мікророзмноження картоплі // Вісн. аграрної науки. - 2005. - № 7. - С. 43-45.

7. Подоліч О.В., Ковальчук М.В., Литвиненко Т.Л., Кононученко О.В., Петюх Г.П., Козировська Н.О. Особливості колонізації in vitro рослин картоплі бактерією роду Pseudomonas sp. ІМБГ 163 // Агроекол. журн. - 2005. - № 2. - С. 61-64.

8. Kovalchuk M., Negrutska V., Lytvynenko T., Kononuchenko O., Kozyrovska N. Colonization capacity and maintenance of the plant-host of a biocontrol agent Pseudomonas sp. ІМБГ 163 // Установчий з'їзд Українського товариства клітинної біології (25-28 квітня). - Львів, 2004. - С. 103.

9. Ковальчук М.В., Рязанцев В.Б., Костюк І.І., Козировська Н.О. Біотехнологічні підходи до вирощування товарної і насіннєвої екологічно чистої картоплі // Основи молекулярно-генетичного оздоровлення людини і довкілля: Матеріали міжнародного форуму (Київ, 31 травня - 1 червня 2005).- Київ, 2005. - С. 96-100.

Размещено на Allbest.ru