Теоретичне та експериментальне обгрунтування контролю геному клітин при вірусних інфекціях тварин та в процесі розробки засобів їх специфічної профілактики

41,40 0,3

7,1 0,03

Таким чином, виявлено, що чотири штами ентеровірусів свиней, які спричиняють синдром СМЕДІ, викликали достовірно пошкодження геному клітин в системі in vitro.

Виявлення дії сумісного впливу рота- та коронавірусу свиней на хромосомний аппарат соматичних клітин.

Встановлений вплив вірусів трансмісивного гастроентериту і ротавірусної хвороби свиней в умовах перебігу цих захворювань в господарствах у вигляді моноінфекцій (вірусних), так і при їх асоційованому перебігу, а також при застосуванні живих вакцин та при одночасному інфікуванні культури клітин обома патогенами (таблиця 4). Застосовані культуральні вакцини: проти ТГС із штаму “П1439/81” і проти РВХС із штаму “К”. Використана культура клітин ПТП, яка була чутлива як до коронавірусу, так і до ротавірусу свиней. Їх інфекційна активність становила в культурі клітин ПТП: 4,0 х 10-7 БУО/смі для штаму “П1439/81” вірусу ТГС; та 6,5 ± 0,15 lg ТЦД50/смі для культурального штаму “К” ротавірусу свиней. При цьому частота метафаз з пошкодженими хромосомами достовірно збільшилась у 6,5 раза в порівнянні з контролем (Р<0,001).

Таблиця 4

Мутагенний вплив рота- та коронавірусів свиней на хромосомний

аппарат лімфоцитів, Mm, %

Штами вірусів	Об'єкт дії вірусів	Кількість клітин з абераціями хромосом
Коронавірус ТГС (епізоотичний штам)	Хворі 5-7-денні поросята з господарства	Контроль	10,5 ± 0,2
		Дослід	35,9 ± 0,3
	Інфіковані поросята-гнотобіоти з біопроби	Контроль	6,75 ± 0,17
		Дослід	37,1 ± 0,3
Ротавірус свиней (епізоотичний штам)	Хворі поросята-відлученці	Контроль	10,5 ± 0,2
		Дослід	37,4 ± 0,3
	Інфіковані поросята-гнотобіоти з біопроби	Контроль	6,75 ± 0,2
		Дослід	39,08 ± 0,4
Сумісна дія епізоотичних штамів ВТГС+РВ	Хворі тижневі поросята з господарства	Контроль	12,9 ± 0,3
		Дослід	58,1 ± 0,2
Вакцинний культуральний штам “К” ротавірусу свиней	Супоросні свиноматки з господарства	Контроль	8,47 ± 0,1
		Дослід	32,6 ± 0,1
Вакцинний культуральний штам “П1439/81” коронавірусу свиней	Супоросні свиноматки господарства	Контроль	7,1 ± 0,4
		Дослід	22,2 ± 0,2
Сумісне застосування вакцинних культуральних штамів “К” (РВ) + ”П1439/81 (ВТГС)	Супоросні свиноматки з господарства	Контроль	9,3 ± 0,1
		Дослід	36,5 ± 0,2

Примітка: -п=5, метафазних пластинок хромосом - по n=200; Р<0,05

З'являлась значна кількість клітин з багаточисельними тяжкими пошкодженнями хромосом типу фрагментації, пульверизації, а також з'являлись клітини з К-мітозами, що були відсутні в контролі. Проведення дослідів із паралельним інфікуванням культури клітин цими вірусами, але при зниженні дози інфікування в 10 разів виявило, що і за таких умов 25-30 % метафазних пластинок хромосом були із структурними абераціями хромосом типу розривів. Таким чином, зниження інфікуючої дози вірусів не зняло ефект їх мутагенної дії при сумісному інфікуванні чутливих клітин (Р>0,05) .

При асоційованому перебігу ТГС та РВХС (із господарств Вірменії: свинокомплексів №1 та №2, свинорепродуктора Баграмянського району та Советошинської свинофабрики) від хворих свиней відібрана кров. Із отриманої культури лімфоцитів досліджені метафазні пластинки хромосом. Виявили, що сумісна дія збудників хвороб вплинула на стабільність геному соматичних клітин свиней, призвівши до аберацій хромосом, серед яких значну частину займали розриви. Частота ушкодження хромосом клітин наведена в таблиці 4. Для порівняння наведені дані, отримані при інфікуванні тварин моноваріантами збудників. Перебіг асоційованої інфекції ТГС та РВХС у свиней в господарстві спричиняло значні пошкодження хромосом соматичних клітин свиней, які з'являлись раніше (на півгодини) і перевищували їх кількість майже у 1,5 рази, ніж при перебігу моноінфекцій, що спостерігалось і при дослідах in vitro (у 1,1-1,.6 рази).

Таким чином, інфікування свиней двома РНК-вмісними вірусами, збудниками гастроентеритів, призводить до мутагенної дії на спадковий апарат їх клітин, у тому числі при застосуванні живих вірусних вакцин, що слід враховувати як у дослідженнях з патогенезу хвороб, так і при створенні нешкідливих для геному профілактичних засобів.

Виявлення мутагенної дії вірусу класичної чуми свиней. Оскільки існують дані щодо негативної дії вірусу КЧС на плід свиней в пренатальний період, ми дослідили вплив цього патогену на стан спадкового апарату соматичних клітин цих тварин (in vivo та in vitro).

Виявили, що інактивована вакцина із лапінізованого штаму “К” суттєво не підвищувала пошкодження хромосом порівняно з контролем, а жива вакцина із штаму „ЛК-ВНДІВВіМ” спричиняла аберації хромосом лімфоцитів 3-5- місячних підсвинків (структурні пошкодження). Серед аберацій хромосом при дії вірусу КЧС переважали розриви (до 17,1 ± 0,2 %). Аномальні мітози виявили у 1,2 - 6,0 % клітин. Мутагенна дія вірусу КЧС на хромосомний апарат клітин свиней представлена в таблиці 5. Наведені результати свідчать про те, що живі вакцини проти КЧС проявляли мутагенний вплив на спадковий апарат лімфоцитів свиней (Р<0,01). Крім того, цей ефект залежав від кратності введення антигену. Підсумовуючи результати досліджень, прийшли до висновку, що патогенні РНК-вмісні віруси свиней (ротавірус, ентеровіруси, які спричиняють синдромСМЕДІ, вірус класичної чуми свиней) проявляли значну генотоксичну дію різною мірою. Основні ушкодження хромосом - це розриви з утворенням фрагментів, підвищенням кількості “гепів”, виникнення патологічних мітозів (до 6 %). Комплексна дія двох патогенів сприяє більш значному пошкодженню спадкового апарату соматичних клітин свиней, ніж дія одного вірусу. Таким чином, важливо враховувати мутагенний вплив вірусів тварин на спадковий аппарат їх клітин у племінних господарствах, при проведенні профілактичних заходів, а також при утриманні тварин у екологічно неблагополучних зонах.

Спрямована зміна патогенних властивостей РНК- вмісних вірусів свиней.

Інактивація вірусу класичної чуми свиней. Розробка інактивованої вакцини проти КЧС призвела до пошуків цілеспрямованих способів змін властивостей вірусу КЧС, в тому числі і вибору його інактиванту. З цією метою випробувані такі хімічні речовини як формалін, -пропіолактон, хлороформ та фізичний фактор - ультразвук. Формалін випробувано із вмістом формальдегіду в кінцевих концентраціях 0,03 %; 0,02 %; 0,01 %, в-пропіолактон - в концентраціях 0,05 %; 0,1 %; 0,15 %, хлороформ - в: 0,01 %; 0,1 %; 1,0 %; 10,0 %. На вірус КЧС діяли ультразвуком протягом 5 і 10 хвилин при 44 кГц, силою струму 0,55 А. Ступінь інактивації вірусу досліджували за температурною реакцією тварин, яким ввели оброблений відповідним інактивантом вірус. Після цього тварин заразили вірулентним штамом вірусу КЧС "Ши-Минь". Результати представлені в таблиці 6. Виявлення вірусу КЧС в дослідному матеріалі контролювали титруванням з використанням методу імунофлуоресценції (рис.7). Виявили неповну інактивацію при застосуванні досліджуваних речовин і способів обробок вірусу, за виключенням використання хлороформу (0,01 %). При використанні вірусу, обробленого 0,01 %-м розчином хлороформу, не виявили в МФА специфічного світіння, яке характерне для вірусу КЧС ні в одному з розведень (10-1 до 10-4). Негативні результати отримані також у РНГА з антитільним діагностикумом. Після контрольного інфікування вірулентним штамом тварини залишились клінічно здоровими. Таким чином, можемо зробити висновок про інактивацію вірусу КЧС. У підсвинків групи № 2, де тваринам вводили вірус, оброблений 0,1 %-м розчином хлороформу, всі вони були клінічно здоровими, але у деяких з них короткочасно підвищувалась температура тіла на 0,1 - 0,8°С. В групах № 3 та № 4, де підсвинкам вводили вірус, оброблений 1,0 %-м та 10 %-м розчином хлороформу, при контрольному зараженні всі тварини захворіли з ознаками: втратою апетиту і рухливості, набряку слизової оболонки верхніх дихальних шляхів, кон'юнктивіту, діареєю, з другої доби у них підвищувалась температура тіла до 41,9 ° С, надалі розвивалась лейкопенія (2-4,35 тис. клітин/ммі). Вони загинули на 4-10-й день після введення вірулентного вірусу. Таким чином, доведено, шо обробка вірусу підвищеними концентраціями хлороформу 1-10 % не захищала тварин від контрольного зараження вірулентним штамом “Ши-Минь" (що за припущенням було повґязано з пошкодженням вірусу вказаними концентраціями хлороформу). Визначення імуногенності вакцинних штамів вірусу КЧС, оброблених різною концентрацією хлороформу проводили на 3-5-місячних підсвинках, у яких були відсутні антитіла до вірусу КЧС. Щеплення здійснювали внутрішньом'язово в дозі 3,0 смі двократно з інтервалом у 30 днів. За тваринами проводили клінічні спостереження та термометрію. Контрольне інфікування вірулентним штамом “Ши-Минь” (по 1 смі кожній тварині внутрішньом'язово), на 14-й день після другої імунізації підсвинків, виявило захист тварин, щеплених вакциною, обробленою 0,01 % хлороформу (підсвинки залишились здоровими протягом всього терміну спостереження). Невакциновані тварини загинули на 5-6 добу після введення вірулентного вірусу. Таким чином, в якості інактиванта вірусу КЧС, який створював імунний захист у свиней, можна використовувати 0,01% хлороформ. Аналогічні результати отримані і з лапінізованим штамом "К" вірусу КЧС, обробленим 0,01 % хлороформом на кролях (по 4 кролі в групі, яким введено внутрішньовенно оброблений вірус по 1,0 смі). За результатами титрації вірусовмісної рідини та температурною реакцією тварин, після контрольного зараження, підтвердили інактивацію вірусу КЧС обробкою 0,01 % хлороформом. Досліди проводили у п'ятикратній повторності.

Зміна морфологічної структури ротавірусу свиней. При захворюванні поросят на ротавірусну хворобу, методом електронної мікроскопії встановлено, що частина ротавірусних часток, виділених у просвіт кишечнику, утворювала масивні скупчення, включені в цистернах ендоплазматичної сітки, які представлені окремо або зв'язані з більш масивними фрагментами клітин. Такі конгломерати часто заважали ідентифікації ротавірусу при діагностичних дослідженнях. Для усунення цих конгломератів нами був досліджений вплив ультразвуку (потужністю 500 Вт при частоті 22 кГц протягом 10-120 секунд) на дезагрегацію ротавірусу в неочищених вірусутримуючих суспензіях патологічного матеріалу. Короткочасна соніфікація (10-20 секунд) не спричиняла помітного порушення конгломератів, проте при цьому зростала кількість ротавіріонів із пошкодженою структурою. Найбільш чутливим виявився зовнішній капсид вірусу, що представлено на рис.8. З продовженням терміну соніфікації дезагрегація конгломератів поліпшувалась, але суспензія вміщувала практично однокапсидні часточки вірусу.

Таким чином, для пошкоджень капсиду вірусу або для отримання фрагментів його зовнішнього капсиду обробка ультразвуком (згаданих параметрів) - процедура доцільна. Однак, для поліпшення якості препаратів при проведенні діагностичних досліджень (з використанням методу електронної мікроскопії ) - вона малопридатна.

Спрямована зміна інфекційної активності рота-, коронавірусу свиней застосуванням калусної культури кореня женьшеню. У практиці біотехнологічних виробництв, особливо при виготовленні біопрепаратів (вакцин, діагностикумів, специфічних гіперімунних сироваток та ін.), є необхідність у високоімуногенних атенуйованих вірусних штамах. Іноді у процесі їх адаптації та інших процедурах, у вірусів знижується інфекційна активність, що негативно впливає на якість сировини, з якої отримують вакцини та інші біопрепарати. Її підвищення досягають застосуванням специфічних відомих прийомів та підходів, кожен з яких має свої недоліки. Досягнення змін інфеційної активності вірусів необхідні і при розробці антивірусних препаратів. Нашою метою була зміна інфекційних властивостей штамів вірусів тварин із застосуванням екологічно безпечної рослинної сировини. З іншого боку - знайти нові підходи до інгібіції вірусної активності, що важливо при розробці лікувально-профілактичних засобів.

Для цього застосували калусну культуру кореня женьшеню, вирощену in vitro, з якої отримали настій, за визначеною нами технологією. В якості моделі РНК-вмісних вірусів застосували адаптовані до культур клітин СНЕВ та ПТП вірус трансмісивного гастроентериту свиней (вакцинний штам “П1439/81” 80-го пасажу та референтний штам “Пурдю-115” 45-го і 80-85 пасажів) та ротавірус свиней (культуральний штам “К”, 70-85 пасажів). Вплив настою на зміну інфекційної активності вірусів досліджували, застосовуючи його в різних варіантах. Дослідним шляхом виявили оптимальний варіант для проведення досліджень в культурах клітин СНЕВ та ПТП. Встановили, що обробка настоєм калусної культури кореня женьшеню, застосована в різних дозах призводить до різних ефектів - підвищення інфекційної активності коронавірусу свиней ( Р<0,001 порівняно з контролем більше, ніж на один логарифм) та її інгібіції. Відмітили зниження інфекційної активності вірусу ТГС: у штаму “Пурдю-115” - в межах 2,69 - 3,31 lg ТЦД 50/смі (Р<0,05), у штаму “П1439/81” -в межах 1,4-2,7 lg ТЦД 50/смі (Р<0,01) та ротавірусу свиней культурального штаму “К” - в межах 1,1-1,5 lg ТЦД 50/смі. Таким чином, застосування настою калусної культури кореня женьшеню змінювало інфекційні властивості вірусів.

Зміна мутагенних властивостей РНК-вмісних вірусів свиней. Встановлена нами мутагенна дія РНК-вмісних вірусів тварин родин Reoviridae, Pestiviridae, Picornaviridae, Coronaviridae призвела до пошуків речовин (і способів їх застосування), які мають антимутагенну або протективну дію. З цією метою ми дослідили можливість створення препаратів з антимутагенною дією на базі рослинної сировини (Rosmarinum officinalis L., (Lamiaceae), Angelica silvestris L., (Apiaceae), Brassica oleracea L.: Broccoli, (Brassicaceae), Hyppophae rhamnoides, (Elaeagnaceae), Panax radix, (Araliaceae). Робочу суміш (водні препарати) випробували in vitro при різних методах застосування: за 2 години до інфікування вірусом, одночасно з інфікуванням вірусом та через 1 годину після інфікування культур клітин вірусом. Результати наведені в таблиці 7. Моделлю слугував вірус ТГС штам “П1439/81” з титром 4,0 х10-7 БУО/смі в культурі клітин ПТП, який призводив до аберацій хромосом у 38,1 % клітин, (у контролі - 9,8 %), (Р<0,001). Застосування рослинних препаратів за 2 години до інфікування вірусом і подальшою її присутністю в підтримуючому середовищі протягом 4-х діб зменшило кількість клітин з абераціями хромосом (з 38,09 % до 28,7 %), що становило 24,7 % від кількості аберантних клітин (Р<0,025). Кількість гетероплоїдних клітин значно зменшилась (з 14,3 % до 5,4 %), відсутнім стало злиття хроматид. При внесенні робочої суміші паралельно з вірусом, кількість клітин з абераціями хромосом теж зменшилась (з 38,09 % до 32,4 %) Р< 0,05, але менше, ніж при застосуванні суміші рослинних препаратів до інфікування вірусом. Використання рослинних препаратів через 1 годину після інфікування вірусом, зменшило кількість клітин з абераціями хромосом з 38,09 % до 34,9 % (що склало 8,4 % від кількості клітин з абераціями хромосом) (Р< 0,01). Цей показник виявився суттєво нижчим, ніж при застосуванні

Таблиця 7

Частота хромосомних аберацій в культурі клітин ПТП, інфікованої вірусом ТГС, при застосуванні лікарських рослин , % , М ± m, n=по 200

№ п/п	групи	Варіанти досліду	Кількість клітин з абераціями хромосом	Кількість клітин з абераціями хромосом	Р
				Застосування суміші водних препаратів ЛР, см3
				0,01	0,03	0,05	0,07	0,1 435
1	Контроль-1	+НЛР як в п.5	9,8 ± 0,2	9,6 ±0,2	9,0 ±0,2	8,7±0,2	8,2±0,2	7,8±0,2	Р<0,1
2	Контроль-2	+НЛР за 2 год, як в п.5	9,8 ±0,2	9,6±0,2	8,9±0,4	8,4±0,2	8,0 ±0,2	7,5±0,2	Р<0,1
3	Контроль-3	+НЛР через 1 год, як в п.6	9,8 ±0,2	9,8±0,2	9,4±0,4	8,8 ±0,2	8,1±0,2	7,9±0,2	Р<0,1
4	ВТГС	+НЛР одночасно	38,09±0,3	38±0,3	37,3±0,3	36,8±0,3	35,9±0,3	32,4± 0,3	Р<0,05
5	ВТГС	+НЛР за 2 год	38,09±0,3	37,5±0,3	36,9±0,2	35,2±0,3	33,8±0,3	28,7±0,3	Р<0,02
6	ВТГС	+НЛР через 1 год	38,09±0,3	38±0,3	37,5±0,3	37,0±0,3	36,3±0,3	34,9± 0,3	Р<0,01

Примітки: ЛР -лікарські рослини; НЛР - суміш настоїв лікарських рослин; контроль- незаражена вірусом КК ПТП

рослинних препаратів двома іншими методами.

Таким чином, в системі in vitro виявлена можливість зміни генотоксичної дії, викликаної коронавірусом ТГС штаму “П1439/81”, при використанні водних препаратів рослин.

Зміна властивостей збудника ротавірусної хвороби шляхом адаптації в культурах клітин. Розробка і створення вакцин проти вірусних хвороб вимагає наявності вакцинного атенуйованого штаму збудника, позбавленого вірулентних властивостей. Одними із вимог до вакцин є те, що вони мають бути безпечними для тварин і імуногенними. При розробці вакцини проти ротавірусної хвороби, нами було здійснено атенуацію ротавірусу свиней штаму “К” у перещеплюваних культурах клітин, з обовґязковим контролем вірусу на реверсибельність. На перших етапах збудник важко адаптовувався до культур клітин. Для культивування збудника були визначені оптимальні культури клітин - ПТП та СНЕВ (серед використаних культур клітин свиней СНЕВ, ПТП, РК-15, ПСП, КЩС). Ротавірус був нами адаптований до них (протягом 80 і вище пасажів), що використано при виробництві вакцини. Протягом процесу адаптації досліджені зміни інфекційних, мутагенних та імуногенних властивостей вірусу, враховуючи які була розроблена та створена вакцина проти ротавірусної хвороби свиней із штаму “К”. Вона виявилась високоімуногенною і захищала тварин від контрольного зараження вірулентним штамом. При встановленні імуногенних властивостей було досліджено розвиток створеної поствакцинальної відповіді у тварин на застосування вакцини різними методами її введення (внутрішньом'язове, пероральне, внутрішньошкірне) за показниками гуморальної імунної відповіді. Вакцину вводили супоросним свиноматкам двократно з інтервалом у два тижні - за 30 і 15 днів до опоросу. Всі методи введення вакцини були ефективними. Вакцинація супоросних свиноматок суттєво впливала на створення поствакцинального імунітету як у свиноматок, так і у їх поросят, у яких через 2 місяці після вакцинації рівень противірусних антитіл в крові становив 12,5 ± 0,17 0,1 log2. Напружений поствакцинальний імунітет зберігався до 12 місяців після другої імунізації. Вакцинація свиноматок вакциною із культурального штаму “К” захищала народжених поросят від вірулентного збудника.

Таким чином, проведені нами цілеспрямовані зміни інфекційних, імуногенних, мутагенних властивостей ротавірусу свиней дали можливість використати культуральний штам “К” при розробці та створенні технології виготовлення вакцини проти ротавірусної хвороби свиней. Вакцина захищала тварин від інфікування вірулентним штамом ротавірусу.

ВИСНОВКИ

1. У дисертаційній роботі подано теоретичне та експериментальне обгрунтування необхідності контролю геному клітин при вірусних інфекціях, спричинених патогенними РНК-вмісними вірусами тварин (із родин Сoronaviridae, Retroviridae, Reoviridae, Picornaviridae, Flaviviridae) та в процесі розробки засобів специфічної їх профілактики, що базувалось на дослідженнях біологічних аспектів взаємодії вірусів і чутливих систем на генетичному, клітинному та організменному рівнях.

2. Епізоотичні та вакцинні штами РНК-вмісних вірусів свиней - ротавірусу, вірусу класичної чуми, ентеровірусів (спричиняючих патологію відтворення із синдромом СМЕДІ) викликали мутації хромосом соматичних клітин свиней в системах in vitro та in vivo.

3. Вірулентний штам ротавірусу свиней мав мутагенну дію, виявлену в соматичних клітинах цих тварин в системі in vivo (лімфоцитах). Вона найбільш виражена у поросят-гнотобіотів, викликаючи аберації хромосом у 39,08 % випадків (в контролі - 6,75 %, Р<0,001). Штам “К” ротавірусу свиней із живої вакцини проти ротавірусної хвороби пошкоджував хромосомний апарат лімфоцитів поросних свиноматок при їх імунізації у 32, 6 % випадків (в контролі - 8,47%) (Р<0,01).

4. В процесі адаптації збудника ротавірусної хвороби свиней до культури клітин ПТП протягом 80 послідовних пасажів спостерігали зменшення генотоксичної дії вірусу (із 19-го пасажу), яка все ще залишалась на значному рівні (31,3 %) в порівнянні з контролем (11,3 %, Р<0,01).

5. Вірус класичної чуми свиней вакцинних штамів “ЛК-ВНДІВВіМ” та лапінізованого “К” проявляв мутагенну дію в лімфоцитах імунізованих 3-5 - місячних підсвинків. Пятиразове введення цих антигенів підвищувало частоту аберацій їх хромосом достовірно вище порівняно із двократним застосуванням вакцин (Р<0,01).

6. Серед чотирьох штамів ентеровірусів (“PS 34”-SMEDI C; “02 b”- SMEDI D; “PS 37”-SMEDI E; “PS 27”-SMEDI A), причетних до патології відтворення свиней із синдромом СМЕДІ, найбільший мутагенний ефект в культурі клітин ПТП притаманний штаму “PS 27”, який викликав появу в 43,39 % клітин аберації хромосом (контроль -11,3 %, Р<0,01).

7. Комплексна (сумісна) дія збудників трансмісивного гастроентериту і ротавірусної хвороби свиней іn vitro та in vivo викликала достовірно вищу частоту виникнення аберацій хромосом, ніж окремо один із названих патогенів (Р<0,05).

8. Досліджено та спрямовано змінено інфекційні та імуногенні властивості ротавірусу, вірусу класичної чуми, вірусу трансмісивного гастроентериту свиней з використанням чутливих біологічних систем, хімічних сполук природнього та синтетичного походження, та дією ультразвуку, що використано для створення засобів специфічної профілактики, зокрема вакцин проти ротавірусної хвороби та класичної чуми свиней.

9. Хлороформ у кінцевій концентрації 0,01% інактивував вірус класичної чуми свиней із збереженням імуногенних властивостей, що використано нами при виготовленні інактивованої вакцини проти цієї хвороби.

10. Ультразвук (потужністю 500 Вт при частоті 22 кГц протягом 10-20 секунд і більше) викликав пошкодження зовнішнього капсиду ротавірусу свиней, інтенсивність якого збільшувалась з підвищенням терміну соніфікації, що виявлено методом електронної мікроскопії.

11. Застосування різних доз настою калусної культури кореню женьшеню викликало in vitro зміну інфекційної активності ротавірусу та коронавірусу свиней від інгібіції до її підвищення. На основі цього явища розроблені способи зміни інфекційної активності вірусів та отримані патенти України на винаходи (№ 950525507, № 95125530).

12. Патогені РНК-вмісні віруси, збудники гастроентеритів у свиней (рота- та коронавірус), викликали в чутливій мішені (ентероциті кишечника поросят), ще до їх адсорбції на клітинній мембрані, пошкодження мікроворсинок.

13. Збудник ротавірусної хвороби свиней в процесі адаптації до перещеплюваної культури клітин тестикул поросят протягом 85 пасажів, (при розробці вакцини), мав гетерогенну популяцію (за S-ознакою), структура якої змінювалась. Але в ній зберігалась незмінна складова, яка під агаровим покриттям утворювала бляшки діаметром 1,0 мм. Присутність цієї стабільної мікропопуляції не впливала на зміну інфекційної активності вірусу і не залежала від неї.

14. Суміш водних препаратів лікарських рослин (Rosmarinum officinalis L., Angelica silvestris L., Brassica oleracea L.(Broccoli), Hyppophae rhamnoides, Panax radix) зменшувала в системі in vitro (перещеплюваній культурі клітин ПТП) мутагенний ефект, викликаний коронавірусом трансмісивного гастроентериту свиней. Він варіював від дози і способу їх застосування (Р<0,01). Для виявлення антимутагенної дії запропонована тест-система (патент України на винахід № 95073164 від 15.07.97).

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

Рекомендуються використовувати у ветеринарній медицині та в біопромисловості розроблені та запропоновані:

Вірусвакцину ліофілізовану із штаму “К” проти ротавірусної хвороби свиней для парентерального застосування - ТУУ 19024865 -1993.

Настанову по застосуванню вірусвакцини ліофілізованої із штаму “К” проти ротавірусної хвороби свиней для парентерального застосування, затвердженої 2.12.1993 р. Головним управлінням ветеринарної медицини Мінсільхозпрод України.

Інструкцію по виготовленню і контролю вірусвакцини ліофілізованої із штаму “К” проти ротавірусної хвороби свиней для парентерального застосування, затвердженої 1.07.1993 р.

Хлороформ - ад'ювант вакцину проти чуми свиней із лапінізованого вірусу - ТУУ 15-15/3-1993.

Настанову по застосуванню хлороформ - ад'ювант вакцини проти чуми свиней із лапінізованого вірусу, затвердженої Головним управлінням ветеринарної медицини Мінсільхозпрод України 25.01.1993 р.

Інструкцію по виготовленню і контролю хлороформ - ад'ювант вакцини проти чуми свиней із лапінізованого вірусу, № 15-15/3 ,затвердженої Головним управлінням ветеринарної медицини Мінсільхозпрод України 25.01.1993 р..

Спосіб інактивації вірусів (Деклараційний патент України № 95052507 від 15.07.97).

Спосіб підвищення інфекційної активності вірусної сировини для виробництва біологічних препаратів (Деклараційний патент України № 95125530 від 4.03.97).

Спосіб отримання експрес-моделі випробування антимутагенних препаратів при вірусних пошкодженнях геномів клітин свиней (Деклараційний патент України № 95073164 від 15.07.97).

10. Спосiб очищення основи для приготування поживних середовищ (.Деклараційний патент України № 96030913 від 04.11.97).

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Клестова З.С., Собко А.І. Проблемы неинфекционной патологии воспроизводства животных // Вісник аграрної науки . - 1994. - № 4. - С.75 - 82. (Дисертант проаналізувала ряд причин виникнення патологій відтворення у тварин, неінфекційної природи, серед яких патології, повґязані із порушеннями генетичного апарату клітин).

Клестова З.С., Собко А.І. Изменение состава популяции возбудителя ротавирусной болезни свиней в процессе его культивирования // Микробиологический журнал. - 1994. - №5. - С.80 - 81. (Дисертант дослідила зміни популяції ротавірусу свиней за S-ознакою в процесі його адаптування до культур клітин).

Klestova Z. The influence of swine fever virus on the chromosome apparatus of porcine cells // Proceeding of “ Third ESVV symposium on pestivirus infections”.- (ID-DLO), Lelystad.-1996. - P.46 - 47.

Клестова З.С. Пошкодження хромосом клітин свиней під дією інфекційних агентів // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького. - Львів. - 1997. - С.183 - 184.

Клестова З.С. Здоровґя продуктивних тварин як реалізація їх генетичного статусу // Ветеринарна медицина України. - 1998. - №5. - С.34 - 35.

Клестова З.С. Пошук нових композицій з антимутагенною дією // Наук. Вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького. - Львів, 2000.-т.2. - №2. - ч.4. - С.81 - 83.

Клестова З.С. Нові проблеми сучасного свинарства // Ветеринарна медицина України.-2000. - №8. - С. 27 - 28.

Клестова З.С. Проблеми травлення у свиней при вірусних захворюваннях // Вісник Полтавського державного с/г інституту. - 2000. - №5. - С.43 - 44.

Клестова З.С. Воздействие ротавируса на хромосомы клеток свиней // Бюлетень інституту сільськогосподарської мікробіології. - Чернігів, 2000. - №7. - С.58 - 59.

Клестова З.С., Балацький В.Н., Голубець Р.А. Виявлення мутацій у великої рогатої худоби, позитивно реагуючих в РІД на лейкоз // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2001. - 36. - С.143 - 146. (Дисертант визначила науковий напрям і мету досліджень, для їх вирішення розробила завдання та схеми проведення дослідів, приймала участь в узагальненні і аналізі отриманих результатів, сформулювала висновки).

Клестова З.С., Риженко В.В. Поліпшення екологічної ситуації в тваринництві нетрадиційними методами біотехнології // Науковий вісник Ужгородського університету. - 2001. - № 9. - С.108 - 109. (Дисертант провела досліди, що засвідчили можливість зміни епізоотичної та екологічної ситуації при застосуванні біотехнологічних методів рослинництва у ветеринарній медицині з одночасною можливістю збереження природних ресурсів цінної лікарської рослини-женьшеню).

Клестова З.С., Тацька В.Н. Екологічні аспекти інфекційного мутагенезу ентеровірусної етіології у патології геному свиней // Ветеринарна медицина. Міжвідомчий тематичний науковий збірник. - Харків,ІЕКВМ, 2002. - Вип. 80. - С.293 - 295. (Дисертант виявила пошкодження генетичного апарату клітин свиней ентеровірусами, які спричинюють патологію органів відтворення, змінила інфекційну активність штамів вірусів та проаналізувала екологічні аспекти вірусного мутагенезу, сформувала висновки).

Клестова З.С. Розвиток біотехнології у тваринництві // Ветеринарна біотехнологія. Бюл. Інституту ветеринарної медицини. - Київ, 2002. - № 1. - С.86 - 95.

Клестова З.С., Макаренко О.С., Безименний М.В., Самородов Є.Л. Перспективні напрямки розвитку ветеринарної науки: біо - та інформаційні технології // Наукові праці Полтавської державної аграрної академії . - Полтава, 2002. - т.2, (21). - С.190 - 192. (Дисертант проаналізувала необхідність та запропонувала обговорення питання застосування сучасних інформаційних технологій (геоінформаційних систем та методу нейронних мереж) для розвитку ветеринарної медицини).

Клестова З.С. Зміна популяцій ротавірусу та його дія на геном клітин свиней| // Ветеринарна медицина. Міжвідомчий тематичний науковий збірник. -Харків,ІЕКВМ, 2003. - Вип. 82. - С.282 - 284.

Клестова З.С. Роль исследований генетической резистентности животных к инфекционным заболеваниям в ветеринарной биотехнологии // Ветеринарна біотехнологія. Бюллетень інституту ветеринарної медицини. - Київ, 2003. - №3. - С.49 -64.

Клестова З.С. Гуморальный иммунный ответ у свиней при оценке биологических свойств ротавируса // Ветеринарна біотехнологія. Бюллетень інституту ветеринарної медицини - Київ, 2003. - №3. - С.64 - 71.

Клестова З.С., Тацька В.Н. Дія вірусів на генетичний аппарат клітин свиней // Біологія тварин. - 2003. - т.5, №1-2. - С.257 - 263. (Дисертант рекультивувала в культурі клітин чотири штами представників родини Picornaviridaе, причетних до синдрому СМЕДІ, після їх дворічного зберігання в умовах низьких температур, адаптувала до чутливих перещеплюваних культур клітин протягом 14-19 пасажів, визначила їх інфекційну та мутагенну активність у системі in vitro, проаналізувала результати та сформувала висновки).

Клестова З.С. Биологические аспекты существования вирусной компоненты паразитоценозов в стадах свиней // Збірник наукових праць Луганського Національного аграрного унівеситету. - Ветеринарні науки. - 2003. - № 31/43. - С.271 - 276.

Клестова З.С., Голубець Р.А. Молекулярні механізми дії вірусу лейкозу великої рогатої худоби // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького. - Львів, 2003. - т.5 (№2). - ч.3. - С.90 - 94. (Дисертант обгрунтувала одне із припущень молекурярних механізмів дії вірусу лейкозу великої рогатої худоби на ділянки клітинного геному, проаналізувала результати інших авторів, обгрунтувала необхідність застосування методів ПЛР та RAPD-ПЛР, сформувала висновки).

Клестова З.С., Бойко А.Л. Застосування калусної культури кореня женьшеню для підвищення інфекційної активності вірусів // Вісник Київського Національного університету ім. Т.Г.Шевченко. - 2003. - вип.41.- С.154 - 156. (Дисертант досягла в системі in vitro підвищення інфекційної активності РНК-вмісних вірусів тварин при застосуванні певним, розробленим нею способом, настою калусної культури кореня женьшеню).

Клестова З.С., Купчинський Л.Г. Раннє виявлення збудників гастроентеритів свиней // Вісник Полтавської державної аграрної академії. - 2003. - №1 - 2(26-27). - С.47 - 49. (Дисертант провела виділення і культивування польових ізолятів вірусів, збудників гастроентеритів свиней, провела серологічне типування, підготовчу роботу до проведення електронномікроскопічних досліджень, сформувала висновки).

Клестова З.С. Дослідження біологічної дії женьшеню на віруси тварин.// Науковий вісник Ужгородського університету. - Серія біологія. - 2003. - № 12. - С.210 - 213.

Клестова З.С. Дослідження біологічних складових епізоотичного процесу // Аграрний вісник Причорномор”я. - Ветеринарні науки. - Одеса,2003. - вип.21. - С.36 - 38.

Клестова З.С. Коронавірусні інфекції //Ветеринарна біотехнологія. Бюллетень інституту ветеринарної медицини. - Київ, 2004. - №4. - С.88 - 100.

Клестова З.С. Сучасні біотехнологічні підходи у створенні нових засобів захисту тварин // Ветеринарна медицина. Міжвідомчий тематичний науковий збірник. - Харків.-ІЕКВМ, 2004. - Вип. 84. - С.338 - 341.

Клестова З.С. Конфликт интересов общества и науки при развитии современной биотехнологии и генетики // Ветеринарна біотехнологія.- Бюллетень інституту ветеринарної медицини. - Київ, 2004. - №5. - С.41 - 55.

Клестова З.С., Голубець Р.А. Аналіз поліморфних локусів ділянок ДНК соматичних клітин великої рогатої худоби на ранній стадії лейкозу // Ветеринарна біотехнологія. Бюллетень інституту ветеринарної медицини. - Київ, 2005. - 6. - С.3 - 11. (Дисертант приймала участь в аналізі ділянок ДНК, розташованих на 4 та 5 хромосомах лімфоцитів крові ВРХ (інфікованих вірусом лейкозу), в динаміці розвитку ранніх стадій інфекційного процесу, сформувала висновки) .

Клестова З.С. Особливості взаємодії вірусу, клітини та організму свиней при ротавірусній хворобі // Наук. Вісник Львівської академії вет. медицини ім. С.З. Гжицького. - 2005.-т.7. - №3 (26). - ч.1. - С.74 - 79.

Клестова З.С. Антимутагенний ефект комбінації рослинних препаратів // Ветеринарна біотехнологія. - Бюллетень інституту ветеринарної медицини.- Київ, 2005. - №7. - С.41-54.

Клестова З.С., Макаренко О.С., Риженко В.П., Риженко В.В. Патент України на винахід № 95125530 від 04.03.97, Спосіб підвищення інфекційної активності вірусної сировини для виробництва біологічних препаратів. (Диссертант особисто спланувала та провела дослідження по обробці РНК-вмісних вірусів тварин настоєм калусної культури кореня женьшеню, встановила дози та метод застосування настою).

Клестова З.С., Собко А.І., Риженко В.П. Патент України на винахід № 950525507 від 15.07.97, Спосіб інактивації вірусів. ( Диссертант особисто спланувала та провела дослідження по обробці РНК-вмісних вірусів тварин настоєм калусної культури кореня женьшеню, встановила інактивуючі дози, та метод застосування настою, визначала інфекційну активність вірусів).

Клестова З.С., Собко А.І.,Риженко В.П. Патент України на винахід № 95073164 від 15.07.97, Способ получения экспресс-модели испытания антимутагенных препаратов при вирусных повреждениях геномов клеток свиней. (Дисертант визначила модель досліджень взаємодії в системі вірус-клітина, придатну для тестування препаратів з протективною та антимутагенною дією )

Клестова З.С., Таїрова Т.М., Макаренко О.С. Патент України на винахід № 96030913 від 04.11.97, Способ очищення основи для приготування поживних середовищ. (Дисертант визначила необхідність покращення основи поживного середовища, яке застосовують у вірусології, провела тестування ряду замінників, а також варіантів основи при різних способах очищення).

Клестова З.С. Состояние генома клеток свиньи при ротавирусной инфекции// Материалы междунар.симпоз. "Молекулярн. генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов с/х животных". - Санкт-Петербург - Пушкин, Россия, 1994. - С.77-78.

Клестова З.С. Необхідність цитогенетичного моніторингу тварин // Матеріали Української конф. молодих вчених "Сучасні проблеми ветеринарної медицини. - Київ, 1994. - С.28 - 29.

Клестова З.С. Дія вірусів на генетичний апарат соматичних клітин свиней // Матеріали Всеукраїнської конф. з фізіології і біохімії тварин. - Львів, 1994.- С.72 - 73.

Собко А.І., Алексеенко И.П,.Вабишевич Ф.С, Клестова З.С., Макаренко А.В. Изучение распространения ротавирусной болезни свиней // Материалы международной науч. конф. “Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблемы”. - Харьков, 1995. - С.176 - 177.

Рыженко В.П., Клестова З.С., Шейна Е.В. Математическое моделирование инфекционного процесса и защитных реакций организма при классической чуме свиней // Материалы международной науч. конф. “Общая эпизоотология : иммунологические, экологические и методологические проблемы”. - Харьков, 1995. - С.234 -236.

Рыженко В.П , Собко А.И., Клестова З.С. , Гома М.А, Перспективы разработки нового поколения вакцин против КЧС // Материалы науч.-практич. конф. ВНИИВВиМ “Класическая чума свиней - неотолжные проблемы науки и практики” - Покров, 1995. -С.123 - 124.

Кlestova Z. Swine fever virus influence on chromosome apparatus of swine cells// Матеріали европейського симпозіуму “ Third ESVV symposium on pestivirus infections.” - (ID - DLO), Lelystad, The Netherlands, 1996. - P.84.

Клестова З.С. Воздействие вируса КЧС на хромосомный аппарат клеток свиней // Материалы конф. по биологии и культивированию вируса КЧС. - М.- Покров, 1996. - С.23.

Кlestova Z. Interrelation between the chromosome damages of swine cells by infection agents influence // Матеріали европейської конф. “First European cytogenetics conference”. - Athens ,Greece,1997. - P.22 - 27.

Клестова З.С. Повреждения хромосом клеток свиней инфекционными агентами // Материалы конф. “Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных”. - Владимир, Россия, 1997. - C.133.

Makarenko A.S., Кlestova Z. Modeling and control of the infection processes in industrial cattlebreeding // Матеріали міжнародного семінару “IFAC International FEDEration of Automatic Control. Mathematical and control application in agriculture and horticulture”.- Pergamon press .- Hannover, Germany, 1997. - P.213 - 217.

Makarenko A.S., Кlestova Z. The influence of environmental changes of management processes and practice of cattlebreeding in Ukraine // Матеріали міжнародної конф. “15th International Conference of WACRA-EUROPE environmental management in States with Coastal Problems: Through research, education and leadership to sustainable development. - Riga , Latvia. - 1998. - Part 1. - P.16.

Клестова З.С. Повреждение хромосом клеток свиней инфекционными агентами // Матеріали II Міжнародної конф. “Біоресурси та віруси”. - Київ, 1998. - С.25.

Клестова З.С. Нетрадиционные методы изменения инфекционной активности вирусов-возбудителей заболеваний животных // Материалы 7-й международной науч.-практ. конф. ” Нетрадиционное растиниеводство, экология и здоровье”. - Алушта, 1998.-С.773 - 774.

Клестова З.С. Відбір штамів вірусів для виробництва вакцин // Збірник матеріалів II Міжнародної конф.“Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях” . - м.Одеса, Київ: Аграрна наука, 1998. - С.104 - 105.

Кlestova Z. Medical Plant in biotechnological production of animal vaccines // Матеріали европейської конф. ”Phytosfere'99 / Highlights in European Plant Biotechnology research and technology transfer ”. - Rome , Italy. - 1999. - P.24.

Кlestova Z. Farming today, farming tomorrow // Европейська брошура “Plant biotechnology”. - 2000. - Printed by EPBN and EU Commission. - P.4.

Клестова З.С. Состояние хромосом клеток животных при вирусной агрессии// Актуальне проблемы патологи свиней, крупного и мелкого рогатого скота. - Владимир, Россия, 2002. - С.137 - 141.

Кlestova Z., R.A. Golubetz ., V.N. Balatsky . Leucosis virus influence on animal cells genome // Матеріали европейської конф. “European Human Genetics Conference”. - Strasbourg, France, 2002. - Р. 0136.

Кlestova Z., V.N. Balatsky R.A., Golubetz. Leucosis virus influence on animal's cell genome // Матеріали европейської конф. “4th European Cytogenetics conference. “, опубл. в журналі “ Elsevier”.- Bologna, Italy, 2003. - http:// web.feccbologna.it\ 8_21.htm.- 1р.

Кlestova Z. Vaccine Production Biotechnology and Biological Safety // Матеріали міжнародного семінару “Internаtional Workshop on Biotechnology commercialization and security “- Tashkent, Uzbekistan, 2003. - P. 47 - 48.

Кlestova Z., V.P. Rushenko. Impact of Biotechnologically produced Plant Products on Infective Intensity of animal viruses // Матеріали міжнародного семінару “Internаtional Workshop on Biotechnology commercialization and security “. - Tashkent, Uzbekistan, 2003. - P. 48.

Кlestova Z.,. Golubetz R.A ,. Balatsky V.N . The Use of New Molecular and Genetic Methods in the Study of Mechanisms of Bovine Leucosis virus action // Матеріали міжнародного семінару “Internаtional Workshop on Biotechnology commercialization and security “- Tashkent, Uzbekistan, 2003. - P.50.

Клестова З.С. Сучасні біотехнології та біобезпека // Матеріали наук.-практ. семінару “Проблеми отримання та використання генетично модифікованих і клонованих організмів”. - м. Біла Церква, 2004. - С. 26 - 31.

Клестова З.С. , Голубець Р.А. Аналіз поліморфних локусів ділянок ДНК соматичних клітин великої рогатої худоби на ранній стадії лейкозу // Матеріали міжнародної конф. “Біоресурси та віруси”.- Київ, 2004. - С.131.

Клестова З.С. Вірусні вакцини та біобезпека // Матеріали Х з'їзду Товариства мікробіологів України. - м.Одеса, 2004. - С. 361.

Кlestova Z. Impact of Biotechnology Produced Plant Products on Inspective Intencity of Animal Viruses // Матеріали европейської конф: The 2nd EPSO Conference. “Interactions in Plant Biology, cells, plant and communities.” - P.084. Session “Interaction between organisms - Pathogens/Symbionts”.- Ischia (Naples), Italy, 2004. - P. 178. http://www.epsoweb.org/catalog/conf2004.htm

Методичні вказівки з виявлення, обліку аберацій хромосом клітин свиней при вірусних інфекціях / Клестова З.С., Собко А.І., Прискока В.А. - Київ, 2005. - 24 с.

Собко А.І., Прискока В.А., Сидоров І.В., Кирилов В.І., Сергеєв С.С., Клестова З.С. НТД: “Хлороформ-адґьювант вакцина проти чуми свиней із лапінізованого вірусу“.- Київ,1992, - Технічні Умови України (ТУУ 15-15/3.), Настанова по застосуванню…, Інструкція по виготовленню…

Тацька В.Н., Прискока В.А., Клестова З.С., Собко Ю.А., Гапусенко В.Ю., НТД: “ Вірусвакцина ліофілізована із штаму “К” проти ротавірусної хвороби свиней для парентерального застосування”.- Київ, 1993. - Технічні Умови України (ТУУ 19024865), Настанова по застосуванню…, Інструкція по виготовленню...

АНОТАЦІЇ

Клестова З.С.Теоретичне та експериментальне обгрунтування контролю геному клітин при вірусних інфекціях тварин та в процесі розробки засобів їх специфічної профілактики. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія. - Національний аграрний університет, Київ, 2006.

Дисертація присвячена питанням виявлення впливу патогенних РНК-вмісних вірусів тварин (представників родин Reoviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Flaviviridae) на геном інфікованих клітин; виявленні особливостей їх взаємодії з чутливими біологічними системами (клітинами і організмами тварин); використанні цих особливостей для індикації та спрямованої зміни біологічних властивостей збудників при розробці та створенні нових засобів специфічної профілактики вірусних хвороб тварин.

Встановлено наявність і циркулію серед тварин промислових господарств вищеперелічених патогенів, здійснено їх виділення, ідентифікацію та адаптацію в біологічних чутливих системах культивування (за визначеними оптимальними способами і умовами). Виявлено пошкодження мікроворсинок ентероцитів кишечника поросят під дією рота- та коронавірусу свиней до їх адсорбції на клітинній мембрані.

Виявлена мутагенна дія представників досліджуваних родин РНК-вмісних вірусів тварин на геном інфікованих соматичних клітин, яка підсилювалась сумісним впливом іншого вірусу.

Розроблена тест-система з виявлення антимутагенів та встановлена можливість змін мутагенної та інфекційної активності рота- і коронавірусів свиней шляхом застосування препаратів, отриманих з рослинної сировини.

Встановлено інактивуючу дію 0,01 % розчину хлороформу на вірус класичної чуми свиней, що використано при створенні вакцини.

Виявлено пошкодження зовнішнього капсиду ротавіріонів свиней ультразвуком (потужністю 500 Вт при частоті 22 кГц протягом 10-20 секунд).

Виявлена гетерогенність популяції ротавірусу свиней, за S-ознакою, та зміна її структури в процесі тривалої адаптації патогена до чутливої біологічної системи. Встановлено наявність стабільної мікропопуляції, яка не впливала на його інфекційну активність і не залежала від неї.

Розроблені, створені вакцини проти ротавірусної хвороби та класичної чуми свиней.

Ключові слова: інфекції, віруси, тварини, клітини, популяція, взаємодія, вакцини, хромосоми, аберації, антимутагени.

Клестова З.С.Теоретическое и экспериментальное обоснование контроля генома клеток при вирусных инфекциях животных и в процессе разработки средств их специфической профилактики. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени доктора ветеринарных наук по специальности 16.00.03 - ветеринарная микробиология и вирусология. - Национальный аграрный университет, Киев, 2006.

Диссертация посвящена вопросам установления влияния патогенных РНК-содержащих вирусов животных (представителей семейств Reoviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Flaviviridae) на геном инфицированных клеток; выявлении особенностей их взаимодействия с чувствительными биологическими системами (клетками и организмами животных); использовании этих особенностей для индикации и направленных изменений биологических свойств возбудителей при разработке и создании новых средств специфической профилактики вирусных болезней животных.

Установлено присутствие и циркуляция среди животных промышленных хозяйств вышеперечисленных патогенов; проведено их выделение, идентификация и адаптация в биологических чувствительных системах культивирования (при установленных оптимальных способах и условиях). Установлено повреждение микроворсинок энтероцитов кишечника поросят под воздействием рота- и коронавирусов свиней до их адсорбции на клеточной мембране.

Установлено мутагенное действие в условиях in vitro и in vivo представителей исследуемых РНК-содержащих вирусов животных, которые в разной мере вызывали повреждение генетического материала клеток в зависимости от штаммов (вакцинных и вирулентных) и семейств вирусов. Выявлено, что инактивированная вакцина против КЧС не вызывала изменений в структуре наследственного аппарата соматических клеток свиней, в отличие от живых вакцинных штаммов.

Установлено, что четыре референтные штамма энтеровирусов свиней (“PS 34”, “02 b”, “PS 37”, “PS 27”), причастных к патологии воспроизводства у свиней существенно повреждали хромосомы их клеток.

Выявлено, что основными типами повреждений хромосом при инфекционном мутагенезе под воздействием исследуемых патогенов являются двойные и одиночные разрывы хромосом с образованием фрагментов.Установлено, что совместное действие двух патогенных РНК-содержащих вирусов (при взаимодействии рота-, коронавируса свиней) в одном объекте приводит к усилению мутагенного действия, чем при инфицировании одним патогеном.

Разработана тест-система для выявления антимутагенов.

Установлено, что по окончании морфогенеза в клетке, популяции возбудителей гетерогенны по S - признаку. Выявлено изменение структуры популяции ротавируса свиней при их длительном взаимодействии с популяциями клеток хазяина (in vitro) в процессе адаптации патогена. Установлена стабильная микропопуляция, которая постоянно присутствует в каждом пассаже возбудителя, что позволило установить закономерности существования популяции вируса.

Биологические свойства патогенных РНК-содержащих вирусов животных изменены действием ультразвука, химических веществ (хлороформа, в-пропиолактоном, формальдегидом), растительными препаратами и адаптацией в чувствительных биологических системах.Установлено повреждающее внешний капсид ротавирионов действие ультразвука мощностью 500 Вт при частоте 22 кГц на протяжении 10-20 секунд. Увеличение времени сонификации приводило к разрушению внешнего капсида вируса с образованием фрагментов

Установлено инактивирующее действие хлороформа в концентрации 0,01 % на вирус классической чумы свиней, а также мутагенные свойства вакцинных и вирулентных штаммов возбудителя, что было использовано для разработки безопасной хлороформ-адъювант вакцины.

С учетом эпизоотических данных, установленных биологических свойств РНК-содержащих вирусов, выявленных биологических аспектов взаимодействия вирусов с клетками, их изменений в процессе адаптации к системам культивирования, а также мутагенных свойств вакцинных и вирулентных штаммов ротавируса свиней и пестивируса КЧС были разработаны и созданы “Вирусвакцина лиофилизованная из штамма “К” против ротавирусной болезни свиней для парентерального применения” и “Хлороформ-адъювант вакцина против чумы свиней из лапинизированного вируса”, применение которых предусмотрено для супоросных свиноматок.

Ключевые слова: инфекции, вирусы, животные, клетки, популяция, взаимодействие, вакцины, хромосомы, абберации, антимутагены.

Klestova Z.S. Theoretical and experimental substantiation of the cell genome's control in the course of animal viral infections and in the process of the development of means of their specific prophylaxis. - Manuscript. The thesis is submitted for the degree of Doctor of Veterinary Science, according to the specialization 16.00.03 - veterinary microbiology and virology. - National Agricultural University, Kyiv, 2006.

The thesis is devoted to the problems of revealing the influence of pathogenic animal RNA - viruses (members of the families Reoviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Flaviviridae) on the genome of infected cells: the determination of the features of their interaction with sensitive biological systems (animal cells and organisms); the use of these features for indication and directed alterations of biological properties of causative agents in the development and creation of new means of specific prophylaxis of viral diseases in animals.

The presence and circulation among animals at specialized farms and units of these pathogens was established; their isolation, identification and adaptation in biological sensitive systems of cultivation were carried out (according to the determined optimal methods and conditions). The damage of microvilli of intestinal enterocytes in piglets was revealed under the influence of swine rota- and coronavirus before their adsorption on cell membrane.

Mutagenic effect of members of five families of RNA - containing animal viruses was revealed. This effect was enhanced by combined influence of the pathogen on the genom of infected cells.

A test-system for the detection of antimutagens was developed and the possibility of viruses' mutagenic activity alterations by means of preparations produced from plant raw materials was investigated.

Inactivating effect of 0,01 % chloroform solution on the classical swine fever virus determined.

Damages of the structure of swine rotavirions were identified under the influence of ultrasound power of 500 W, frequency 22 kHz during 10-20 sec., which causes the damage of outer capsid of the virus.

...