Клональне мікророзмноження і оздоровлення лаванди in vitro

Основні етапи клонального мікророзмноження лаванди на основі культури ізольованих меристем in vitro. У процесі досліджень вивчали особливості морфогенезу ізольованих апікальних меристем лаванди в культурі in vitro, визначали вплив ендо- та екзогенних факторів і підбирали оптимальні умови для розвитку експлантів на чотирьох етапах клонального мікророзмноження: ізолювання експланту, введення і ініціація його розвитку в умовах in vitro; власне мікророзмноження; укорінення мікропагонів; адаптація мікророслин до умов in vivo.

Ізолювання експланту, введення і ініціація його розвитку в умовах in vitro. Стерилізація рослинного матеріалу. Методику стерилізації рослинного матеріалу було обрано з врахуванням літературних даних (Єгорова, 2002). Стерилізацію експлантів проводили послідовним витримуванням фрагментів пагонів у 70 %-ному етанолі 40 секунд, 50 %-ному розчині препарату "Брадофен" 12 хвилин, і тричі промивали в автоклавованій дистильованій воді. Дослідження показали, що такий спосіб стерилізації забезпечував вихід стерильних меристем на рівні 100,0 %, приживлюваність меристем складала 96-100 %.

Підбір складу і консистенції живильного середовища для росту ізольованих меристем лаванди. На етапі введення меристем лаванди в культуру in vitro підбір оптимальної концентрації гормонів проводили на основі живильного середовища МС, що містило 0,7 % агару. В результаті досліджень встановлено, що ізольовані меристеми лаванди характеризуються високою регенераційною здатністю - частота регенерації пагонів складала 85-100 % на всіх варіантах живильного середовища. Оптимальним визначено живильне середовище, доповнене кінетином (1,0 мг/л) і ГК (1,0 мг/л) - МС 5, на якому частота регенерації складала 100 %, розвивався основний пагін висотою 19,33-42,98 мм з 5-8 парами листків і 3,03-7,81 шт. додаткових пагонів.

З метою визначення оптимальної консистенції живильного середовища для культивування апікальних меристем лаванди були випробувані тверді середовища з вмістом агару 0,7 %, та рідкі без додавання агару, які доповнювали кінетином або кінетином і ГК. У всіх варіантах досліду виявлено перевагу твердих середовищ. Зниження частоти регенерації на рідких середовищах, у порівнянні з твердими, було незначним у сортів лаванди - у сорту Синєва на 2,5-5,0 %, у сорту Степова на 10 %, тоді як у селекційних зразків різниця за цим показником склала 22,5-35,0 % у зразку 337-9 і 30,0-57,5 % у зразку 310-17. При культивуванні меристем на рідких середовищах спостерігалося достовірне зменшення висоти основного пагона, частоти множинного пагоноутворення, кількості додаткових пагонів, спостерігалося формування мікропагонів з морфологічними змінами і висока частота вітрифікації пагонів - 62,9-71,0 % у всіх досліджуваних генотипів.

Морфогенез і регенерація рослин лаванди в культурі in vitro. Дослідження показали, що направленість регенераційних процесів у досліджуваних сортів та зразків була подібною, однак, виявлено достатньо чіткий поділ їх за інтенсивністю розвитку меристем в умовах in vitro. Найбільш раннім розвитком характеризувалися меристеми сорту Степова. Приживлюваність і збільшення меристем у розмірах були помітними вже на 3-4 добу культивування, на 6-8 добу відбувалося формування і розкриття першої пари листків, а через 1-3 доби спостерігали початок розвитку основного пагону. Проліферацію множинних пагонів відмічали на 12-14 добу культивування. У сорту Синєва окремі етапи морфогенезу наставали в середньому на 2-6 діб пізніше. Меристеми зразка 337-9 розвивалися майже одночасно з сортом Степова, але закладання додаткових пагонів затримувалося на 4-8 діб. Найбільш повільно розвивалися меристеми зразка 310-17, у яких окремі етапи морфогенезу наставали на 2-8 діб пізніше, ніж у сорту Степова. Слід зазначити, що у лаванди на першому етапі клонального мікророзмноження множинне пагоноутворення відбувалося, в основному, за рахунок формування адвентивних пагонів, тоді як кількість бічних пагонів, що розвивалися з пазушних бруньок, складала лише 9,1-17,7 % від загальної кількості додаткових пагонів на один експлант.

Поряд із загальними особливостями морфогенезу меристем лаванди в культурі in vitro виялено значні відмінності між досліджуваними генотипами за кількісними показниками основних біометричних параметрів мікророслин (табл. 1).

Таблиця 1. Вплив генотипу на розвиток меристемних рослин лаванди на першому етапі клонального мікророзмноження (середовище МС 5, 50 діб культивування)

Виявлені відмінності в рості основного та додаткових пагонів на першому етапі клонального мікророзмноження зумовлювали різні коефіцієнти розмноження: у сорту Синєва - 1:12,42, у сорту Степова - 1:10,06, у зразку 337-9-1:8,55, у зразку 310-17-1:7,18.

Вплив розміщення меристем на пагоні донорної рослини на регенераційні процеси в умовах in vitro. Проведене дослідження не виявило суттєвої різниці в регенераційній здатності апікальних меристем лаванди, виділених з верхівкових і пазушних бруньок пагону. У всіх генотипів лаванди спостерігалася висока частота регенерації - 90,0-100,0 %, і частота формування множинних пагонів - 68,8-100,0 % при культивуванні меристем, що були виділені як з верхівкових, так і з пазушних бруньок пагону. На підставі виявлених нами особливостей регенераційних процесів апікальних меристем лаванди можна говорити про доцільність використання верхівкових і пазушних бруньок для клонального мікророзмноження, що значно збільшує кількість експлантів з однієї донорної рослини.

Вплив строку введення меристем на їх розвиток в культурі in vitro. Апікальні меристеми лаванди вводили в культуру in vitro в чотири строки, які відповідали окремим фенофазам: у квітні - у фазу весняного відростання, в третій декаді червня - першій декаді липня - у фазу бутонізації-початку цвітіння, в жовтні - у фазу осіннього відростання, в січні - в період спокою. У всі строки введення в культуру in vitro меристеми виявилися здатними регенерувати рослини з високою частотою - 90,0-100,0 %, і утворювати адвентивні пагони з частотою 85,0-100,0 %. Поряд з цим установлено, що оптимальним строком для введення меристем є фази весняного і осіннього відростання пагонів (місяці квітень і жовтень), коли регенерували рослини з нормальними морфологічними ознаками, формувалися найвищі основні пагони і найбільша кількість додаткових пагонів.

Власне мікророзмноження. Вплив складу живильного середовища та генотипу на розвиток мікропагонів лаванди. На етапі власне мікророзмноження лаванди як експланти використовували мікроживці, які одержували при розділенні основного пагону меристемних рослин на фрагменти довжиною 4-8 мм з однією парою листків та відокремленні додаткових пагонів довжиною 4-8 мм з однією парою розгорнутих листків. Найбільш оптимальний розвиток мікропагонів відбувався на живильному середовищі МС 5. Відмічено загальну закономірність регенерації мікророслин всіх генотипів лаванди: на другому етапі клонального мікророзмноження відбувався інтенсивний ріст основних пагонів з пазушних бруньок мікроживця, тоді як активність проліферації додаткових пагонів була невисокою. Частота утворення додаткових пагонів коливалася в широких межах - від 33,1 % до 94,8 %. В середньому утворювалося 2-4 додаткових пагони, причому формувалися переважно бічні пагони з бруньок нижніх вузлів основних пагонів, а кількість адвентивних пагонів не перевищувала 4,1-7,9 % від їх загальної кількості. Для одержання максимальної кількості мериклонів при подальшому субкультивуванні поєднували мікроживцювання основних пагонів та відділення додаткових пагонів. Генотипічні особливості сортів та зразків обумовлювали різну інтенсивність ростових процесів і, як наслідок, різні коефіцієнти розмноження: у сорту Синєва - 1:11,12, у сорту Степова - 10,42, у зразку 337-9-1:11,83, у зразку 310-17-1:6,72.

Вплив кількості пасажів на розвиток меристемних рослин і коефіцієнт розмноження лаванди. Вивчення особливостей розвитку меристемних рослин лаванди протягом десяти пасажів показало, що вони характеризуються високою регенераційною здатністю протягом всього терміну культивування in vitro. Частота регенерації у сортів Синєва, Степова і зразка 337-9 залишалася стабільно високою до 10-го пасажу і складала 80,0-100,0 %. Найнижчою регенераційною здатністю відрізнявся зразок 310-17, у якого, починаючи з 5-го пасажу, частота регенерації пагонів знижувалася до 72,5-47,5 %. При цьому у досліджуваних генотипів не спостерігалося різких коливань коефіцієнта розмноження в різних пасажах, і цей показник зберігався на стабільному рівні у сорту Синєва і зразку 337-9 до 8-го пасажу (1:7,77-12,45 і 1:7,60-11,85 відповідно), у сорту Степова до 7-го пасажу (1:6,19-11,81), у зразку 310-17 - до 6-го пасажу (1:6,14-8,37). Таким чином, при клональному мікророзмноженні лаванди доцільно проводити 6-8 пасажів залежно від генотипу. В середньому за рік можна провести етап введення, чотири пасажі на етапі власне мікророзмноження, етапи укорінення мікропагонів і адаптації до умов in vivo. Сумарний вихід саджанців з однієї меристеми за рік складав: у сорту Синєва - 208 тис. шт., у сорту Степова - 119 тис. шт., у зразку 337-9-149 тис. шт., у зразку 310-17-23 тис. шт. Одержані дані показують високу ефективність методу клонального мікророзмноження на основі культури меристем in vitrо, що особливо важливо для одержання великої кількості посадкового матеріалу в стислі строки при обмеженій кількості маточних рослин нових сортів для швидкого впровадження їх у виробництво та розмноженні унікального селекційного матеріалу.

Укорінення мікропагонів в умовах in vitro. Найбільш ефективним для індукції коренеутворення у мікропагонів лаванди визначено живильне середовище ЅМС, доповнене ІМК та ІОК в концентрації по 0,5 мг/л - МС 18, на якому частота укорінення становила 100,0 % у сортів Синєва, Степова і у зразку 337-9, та 85,0 % у зразку 310-17. Кількість коренів і їх довжина відрізнялися у генотипів, що досліджувалися: у сорту Синєва формувалося 4,13 шт. коренів довжиною 29,14 мм, у сорту Степова регенерувало найбільше коренів - 6,28 шт. довжиною 20,73 мм, у зразку 337-9 утворювалося 4,53 шт. коренів найбільшої довжини - 32,51 мм, у зразку 310-17 формувалося 2,52 шт. коренів довжиною 25,14 мм. В наших дослідженнях випробовували також ефективність рістрегулюючих препаратів емістиму С та етамону для стимулювання коренеутворення у мікропагонів лаванди в умовах in vitro. Показано, що при включенні до складу живильних середовищ емістиму С в розведенні 10^-6 та етамону в концентрації 0,001 % частота укорінення мікропагонів складала 90,0-100,0 %.

Адаптація мікророслин до умов in vivo. Для адаптації відбирали мікророслини лаванди з добре розвиненою кореневою системою і висаджували в горщечки об'ємом 200 мл зі стерильним субстратом різного складу. Горщечки з рослинами розміщували під плівковим укриттям і культивували при температурі 18-20 єС і постійному зволоженні. Найвища приживлюваність мікророслин всіх генотипів - 95,0-100,0 % була забезпечена на субстраті торф: перліт: ґрунт: пісок у співвідношенні 2:1:1:1. Визначено, що для адаптації меристемних рослин лаванди до умов in vivo достатньо періоду 14 днів, за які формується 2-3 пари листків. Після періоду адаптації плівкове укриття знімали і рослини культивували в звичайних умовах ще 46 днів. Меристемні рослини лаванди мали типові для сортів та зразків морфологічні ознаки: форму куща, листків, суцвіття, забарвлення квіток. У жодному випадку у мериклонів не було відмічено морфологічних відхилень від норми.

Таким чином, в результаті досліджень вивчено особливості морфогенезу ізольованих меристем лаванди (рис. 1) та розроблено всі етапи технології клонального мікророзмноження цієї культури.

а) б) в) г)

Рис. 1. Морфогенез ізольованих меристем лаванди на чотирьох етапах клонального мікророзмноження: а - ізолювання експланту, введення і ініціація його розвитку в умовах in vitro; б - власне мікророзмноження; в - укорінення мікропагонів; г - адаптація мікророслин до умов in vivo

Біотехнологічні прийоми одержання оздоровленого посадкового матеріалу лаванди. Відбір і тестування рослин-донорів на наявність вірусної інфекції. У зв'язку з тим, що первинним і найбільш економічним способом одержання здорового посадкового матеріалу є відбір і розмноження безвірусних рослин, для проведення досліджень нами було відібрано рослини без зовнішніх симптомів вірусного ураження, які вирощували в умовах закритого ґрунту. Однак при проведенні біотесту було виявлено симптоми вірусного ураження на рослинах-індикаторах: Chenopodium amaranticolor, Gomphrena globosa і Petunia hybrida. Для ідентифікації вірусів у відібраних рослинах лаванди застосовували метод ІФА в непрямій і сендвіч модифікаціях. Дані аналізу показали, що дослідні зразки містять антигени INSV (Impatiens necrotic spot virus, Tospovirus - вірус некротичної плямистості бальзаміну). Одержані результати ІФА і біотесту узгоджуються з науковими даними (Pundt et al., 1992), в яких показано, що петунія є рослиною-індикатором для виявлення ураження рослин вірусом INSV.

Прийоми оздоровлення рослин лаванди в умовах in vitro. В наших дослідженнях проводилося порівняльне вивчення ефективності прийомів оздоровлення культури апікальних меристем, термотерапії in vitro і хемотерапії на модельній системі лаванда-INSV.

Культура апікальних меристем. Визначальна роль в процесі оздоровлення відводиться розміру меристеми, від якого залежить звільнення рослин від вірусу, здатність до регенерації та генетична стабільність потомства. Нами вивчались регенераційні процеси меристем лаванди розміром 0,2 мм без примордіальних листків, 0,7 мм з однією парою примордіїв і 1,0 мм з двома парами примордіальних листків. Встановлено, що морфогенетичні потенції ізольованих меристем не залежали від розміру експланту і наявності в нього примордіальних листків. При оздоровленні рослин лаванди методом культури апікальних меристем як експланти доцільно використовувати меристеми розміром 0,2 мм, що володіють високою регенераційною здатністю - 87,5-100,0 %, яка суттєво не відрізнялася при культивуванні меристем більших розмірів.

Термотерапія. Основним завданням при постановці експерименту з термотерапії in vitro лаванди було визначити температурний режим, при якому зберігається життєздатність верхівкових бруньок, забезпечується найбільший приріст мікропагонів і відбувається елімінація вірусів. Дослідження проводили на сортах лаванди Синєва і Степова, як дослідний матеріал використовували мікропагони (неукорінені рослини) і мікророслини другого пасажу. Аналіз життєздатності рослин лаванди в період термотерапії показав, що цей показник залежить від експозиції термообробки, генотипу і типу досліджуваного матеріалу (рис. 2). Встановлено, що оптимальною експозицією термообробки рослин лаванди в умовах in vitro є 10 діб, протягом яких зберігається життєздатність пагонів на рівні 57,1-100,0 %. Кращим рослинним матеріалом для проведення термотерапії лаванди in vitro є мікророслини. Життєздатність верхівкових бруньок мікророслин при підвищеній температурі у сорту Синєва складала 100,0 %, що на 33,3 % більше ніж мікропагонів. Термотолерантність рослин сорту Степова була нижчою у порівнянні з сортом Синєва - життєздатність мікророслин складала 66,7 %, мікропагонів - 57,1 %. Приріст пагонів дослідних рослин достовірно не відрізнявся від контрольних, а також між мікропагонами і мікророслинами одного генотипу, і становив у сорту Синєва 11,43-12,08 мм, у сорту Степова - 19,67-25,25 мм. З метою зменшення ризику потрапляння вірусних часточок у відрослі протягом термотерапії частини пагонів для субкультивування використовували не весь приріст, а лише верхівкові бруньки висотою 3-5 мм, тобто верхівки пагонів у 2-7 разів менші, ніж довжина приросту.

Рис. 2. Життєздатність пагонів лаванди сортів Синєва (а) і Степова (б) в умовах термотерапії in vitro

Верхівкові бруньки ізолювали відразу після зняття температурного стресу і культивували на живильному середовищі МС 5. Приживлюваність бруньок склала 100 %. Одержані мікропагони субкультивували на середовище МС 18 для укорінення, а потім мікророслини переводили в звичайні умови культивування згідно з розробленою технологією клонального мікророзмноження.

Хемотерапія. Альтернативним біотехнологічним підходом для одержання безвірусних рослин є хемотерапія у поєднанні з культурою апікальних меристем in vitro, при якому блокування репродукції вірусу досягається введенням до складу живильного середовища віроцидів. У наших дослідженнях випробовували ефективність застосування віразолу для звільнення рослин лаванди від INSV. Віразол додавали до складу живильного середовища МС 5 в концентраціях 5,0, 10,0, 20,0 і 30,0 мг/л. В культуру in vitro вводили меристеми лаванди сорту Синєва розміром 0,7 мм. В результаті досліджень виявлено інгібуючий вплив препарату на процеси диференціації, росту і розвитку мікророслин лаванди (табл. 2). У результаті регресійного аналізу встановлено лінійну залежність висоти основного пагону і кількості додаткових пагонів від концентрації віразолу в живильному середовищі (рівняння регресії у=-0,4653х+17,171, і у=-0,2248х+6,3128 відповідно). Виявлено тісний негативний кореляційний зв'язок між концентрацією віразолу і висотою основного пагону (r=-0,96), та кількістю додаткових пагонів (r=-0,99). Сублетальною визначена концентрація віразолу 20,0 мг/л, оскільки у варіанті з концентрацією препарату 30,0 мг/л спостерігається значне пригнічення росту основного пагону та відсутність додаткових пагонів, а також загибель регенерантів на 30-40-й день культивування. Субкультивування мікророслин проводили через 30 і 120 днів після початку хемотерапії. Для мікророзмноження використовували середовище МС 5, а для укорінення - МС 18.

Таблиця 2. Вплив віразолу на розвиток меристемних рослин лаванди сорту Синєва (30 днів культивування)

Примітка. Різниця між дослідними і контрольними варіантами достовірна при ***Р=0,001.

На всіх подальших етапах культивування регенераційні процеси у мікророслин, які піддавали впливу віразолу, суттєво не відрізнялися від контрольних.

Тестування рослин-регенерантів лаванди на наявність вірусної інфекції і визначення ефективності прийомів оздоровлення. Детекцію антигенів INSV у рослинах-регенерантах після терапії проводили методом непрямого ІФА. В результаті аналізу встановлено, що звільнення рослин лаванди від вірусу INSV залежало від застосованого біотехнологічного прийому, генотипу та концентрації вірусного антигену у вихідних рослинах (табл. 3).

Таблиця 3. Ефективність біотехнологічних прийомів оздоровлення рослин лаванди

Найбільш ефективними для звільнення рослин сорту Синєва від INSV виявилися методи культури апікальних меристем розміром 0,2 мм та хемотерапії з концентрацією віразолу 20,0 мг/л, при застосуванні яких одержано 80 % безвірусних рослин. У сорту Степова вільними від вірусу INSV були всі рослини-регенеранти. На нашу думку, це можна пояснити тим, що у вихідної рослини сорту Степова концентрація антигену була нижчою, ніж у сорту Синєва, тому швидкість накопичення вірусних антигенів була меншою; рослини сорту Степова характеризуються більшою інтенсивністю росту як інтактних рослин, так і рослин в культурі in vitro та при їх термотерапії порівняно з сортом Синєва, що, можливо, сприяє збільшенню ділянки апексу пагону, вільної від вірусу. Порівняльний аналіз прийомів терапії з врахуванням виходу безвірусних рослин, матеріальних і трудових затрат, дії абіотичних факторів на рослини-регенеранти показує, що найбільш ефективним методом оздоровлення рослин лаванди від INSV є культура апікальних меристем розміром 0,2 мм. Підібрані режими термотерапії in vitro і хемотерапії можуть бути застосовані для оздоровлення лаванди, ураженої вірусами, від яких неможливо звільнитися методом культури апікальних меристем.

Розмноження оздоровлених рослин лаванди методом зеленого живцювання. Безвірусні рослини, одержані методом клонального мікророзмноження на основі культури апікальних меристем або в поєднанні з термо- чи хемотерапією, відносять до категорії оригінальний посадковий матеріал і використовують для закладки маточників в умовах закритого ґрунту, які утримують при суворій ізоляції від можливих джерел вторинного інфікування вірусами. Для масового виробництва елітних саджанців можна застосувати метод клонального мікророзмноження або традиційні методи розмноження. В наших дослідженнях застосовували метод зеленого живцювання; вивчали особливості укорінення зелених живців лаванди, заготовлених з однорічних меристемних рослин, які обробляли стимуляторами коренеутворення: водними розчинами ІМК (25,0 мг/л), ІОК (100,0 мг/л) і ростовими пудрами Chryzotop, Chryzotek, Rhizopon A. Встановлено, що зелені живці з меристемних рослин лаванди володіють високою ризогенною здатністю: їх укорінюваність досягала 82,81-98,43 % і достовірно не відрізнялася в контрольних і дослідних варіантах. Разом з тим, спостерігався стимулюючий вплив обробки ІМК на довжину коренів у обох сортів, а ІОК - у сорту Степова. Сорт Степова виявився більш чутливим до обробки ІМК та ІОК, дія яких також сприяла збільшенню сирої маси коренів у саджанців. клональне мікророзмноження оздоровлення лаванда

Економічна ефективність вирощування оздоровленого посадкового матеріалу лаванди. Розрахунки виробничих витрат на вирощування саджанців лаванди показали, що даний показник залежав як від методу одержання посадкового матеріалу, так і від генотипу. Найменше виробничих витрат необхідно для одержання 1 тис. шт. саджанців за технологією клонального мікророзмноження: у сорту Синєва - 1100,02 грн., у сорту Степова - 1206,91 грн., у зразку 337-9-1215,08 грн., у зразку 310-17-1995,30 грн. При застосуванні прийомів оздоровлення виробничі витрати на вирощування 1 тис. шт. саджанців складали: при застосуванні культури апікальних меристем розміром 0,2 мм - у сорту Синєва 1702,60 грн., у сорту Степова 1289,05 грн.; термотерапії in vitro - у сорту Синєва 1825,97 грн., у сорту Степова 1441,70 грн.; хемотерапії - у сорту Синєва 2638,77 грн.

Розмноження оригінальних рослин для створення маточника супереліти і одержання елітного посадкового матеріалу доцільно проводити методом зеленого живцювання в умовах закритого ґрунту. Елітні саджанці підлягають реалізації спеціалізованим господарствам для закладки маточників еліти і виробництва репродукційного посадкового матеріалу або для закладки промислових плантацій. При одержанні оригінальних рослин за технологією клонального мікророзмноження прибуток на 1 тис. шт. елітних саджанців, прибуток на 1 га розсадника і рівень рентабельності складають відповідно у сорту Синєва - 72,12 грн., 345,83 тис. грн. і 45,7 %, у сорту Степова - 51,06 грн., 239,47 тис. грн. і 51,6 %; при оздоровленні маточних рослин методом культури меристем розміром 0,2 мм - у сорту Синєва - 106,86 грн., 525,75 тис. грн. і 43,9 %, у сорту Степова - 84,83 грн., 397,85 тис. грн. і 62,8 % (табл. 4).

Таблиця 4. Економічна ефективність виробництва елітного посадкового матеріалу лаванди в розрахунку на 1 тис. шт. саджанців

Узагальнення результатів досліджень. В результаті проведених досліджень і аналізу літературних даних з питань клонального мікророзмноження і біотехнологічних прийомів оздоровлення рослин розроблено технологію клонального мікророзмноження лаванди (табл. 5) та біотехнологічну схему одержання оздоровленого посадкового матеріалу лаванди (рис. 3). Включення в систему насінництва лаванди технології клонального мікророзмноження дозволить інтенсивно розмножувати цінні сорти і унікальні селекційні зразки, прискорити впровадження нових сортів у виробництво. Застосування прийомів оздоровлення для створення безвірусних маточників дасть змогу одержувати якісний чистосортний посадковий матеріал, що сприятиме збільшенню продуктивності, строку експлуатації промислових плантацій і, як наслідок, підвищенню економічної ефективності вирощування лаванди.

Таблиця 5. Біотехнологічна схема клонального мікророзмноження рослин лаванди

Рис. 3. Біотехнологічна схема одержання оздоровленого посадкового матеріалу лаванди

1. Вивчено особливості морфогенезу в культурі ізольованих апікальних меристем Lavandula angustifolia Mill. сортів Синєва, Степова та перспективних селекційних зразків 337-9 і 310-17. На основі результатів досліджень розроблено технологію клонального мікророзмноження і прийоми оздоровлення рослин лаванди.

2. Встановлено, що оптимальним для індукції морфогенезу in vitro ізольованих меристем лаванди є агаризоване живильне середовище МС, доповнене кінетином (1,0 мг/л) і ГК (1,0 мг/л), на якому частота регенерації досягала 90,0-100,0 % і відбувалося множинне пагоноутворення.

3. Показано ступінь впливу генотипу, строку відбору експланту і розміщення меристем на пагоні донорної рослини на регенераційні процеси у лаванди в умовах in vitro. Морфогенетичні потенції ізольованих меристем детерміновані генотипом, що виявляється у значних відмінностях між досліджуваними сортами і селекційними зразками за кількісними показниками основних біометричних параметрів і, як наслідок, у різних коефіцієнтах розмноження: у сорту Синєва - 1:12,45, у сорту Степова - 1:10,06, у зразку 337-9-1:8,55, у зразку 310-17-1:7,18. Найкращим строком відбору експлантів є квітень та жовтень. Не виявлено залежності регенераційних процесів від розміщення меристем на пагоні донорної рослини.

4. Визначено, що на етапі власне мікророзмноження для лаванди оптимальним, як і на першому етапі, є живильне середовище МС, доповнене кінетином (1,0 мг/л) і ГК (1,0 мг/л), причому коефіцієнт розмноження залежить від генотипу і кількості пасажів. Коефіцієнт розмноження зберігався на стабільному рівні у сорту Синєва і зразку 337-9 до 8-го пасажу (1У7,77-12,45 і 1У7,60-11,85 відповідно), у сорту Степова до 7-го пасажу (1У6,19-11,81), у зразку 310-17 до 6-го пасажу (1У6,14-8,37).

5. Підібрано склад регуляторів росту для укорінення мікропагонів лаванди, які включали до живильного середовища Ѕ МСУ ІМК (0,5 мг/л) і ІОК (0,5 мг/л), або емістим С в розведенні 10^-6, або етамон в концентрації 0,001 %. На даних середовищах частота ризогенезу становила 85,0-100,0 %. Оптимальним для переводу меристемних рослин в умови in vivo визначено субстрат торф: перліт: ґрунт: пісок у співвідношенні 2: 1: 1: 1.

6. При розробці біотехнологічних прийомів одержання оздоровленого посадкового матеріалу лаванди виявлено високу регенераційну здатність апікальних меристем розміром 0,2 мм - 87,5-100,0 %, що дозволяє застосовувати метод культури меристем для оздоровлення від вірусу INSV, ефективність якого досягає 80,0-100,0 %.

7. Підібрано режим термотерапії in vitro: температура 37±1⁰С, експозиція обробки - 10 діб, фотоперіод - 16 годин, і встановлено, що кращим рослинним матеріалом для проведення термотерапії є укорінені мікророслини другого пасажу. При цьому вихід безвірусних рослин складав 70,0-100,0 % і залежав від генотипу і концентрації вірусу в рослині.

8. Показано, що для проведення хемотерапії рослин лаванди, уражених вірусом INSV, як хімічний агент може служити віразол, сублетальна концентрація якого складала 20,0 мг/л. Ефективність оздоровлення становила 80,0 %.

9. Встановлено високу ризогенну здатність (82,81-98,43 %) зелених живців, заготовлених з меристемних рослин лаванди сортів Синєва і Степова. При цьому показано стимулюючу дію ІМК (25,0 мг/л) на довжину коренів у сортів Синєва і Степова, та ІОК (100,0 мг/л) на довжину і сиру масу коренів у сорту Степова.

10. Показано, що при одержанні оригінальних рослин методом клонального мікророзмноження прибуток від реалізації 1 тис. шт. елітних саджанців і рівень рентабельності їх виробництва складає відповідно: у сорту Синєва - 72,12 грн. і 45,7 %, у сорту Степова - 51,06 грн. і 51,6 %; при оздоровленні маточних рослин методом культури апікальних меристем розміром 0,2 мм - у сорту Синєва - 106,86 грн. і 43,9 %, у сорту Степова - 84,83 грн. і 62,8 % відповідно.

Практичні рекомендації:

1. Для прискореного розмноження нових сортів і перспективних генотипів рекомендується розмножувати рослини лаванди за розробленою нами технологією клонального мікророзмноження на основі культури апікальних меристем.

2. В системі насінництва лаванди виробництво оригінального посадкового матеріалу рекомендується здійснювати з застосуванням біотехнологічного прийому оздоровлення культури апікальних меристем розміром 0,2 мм.

3. Для масового одержання елітних саджанців доцільно застосовувати метод зеленого живцювання з обробкою живців ІМК (25,0 мг/л).

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Латушкіна Т.М., Бугаєнко Л.О., Єгорова Н.О. Клональне мікророзмноження деяких сортів лаванди (Lavandula angustifolia Mill.) методом культури ізольованих меристем in vitro // Научные труды ученых Крымского государственного аграрного университета. - Вып. 72. - Симферополь. - 2002. - С. 77-81.

2. Латушкіна Т.М. Клональне мікророзмноження лаванди in vitro // Вісник аграрної науки Причорномор'я. - Спеціальний випуск 3 (23). Том ІІ. - Миколаїв. - 2003. - С. 151-158.

3. Бугаенко Л.А., Латушкина Т.Н. Особенности укоренения лаванды в культуре in vitro // Научные труды ученых Крымского государственного агротехнологического университета. - Вып. 80. - Симферополь. - 2003. - С. 39-44.

4. Латушкина Т.Н., Бугаенко Л.А. Влияние эмистима С на рост побегов и ризогенез у лаванды в культуре in vitro // Научные труды ученых Крымского государственного агротехнологического университета. - Вып. 81. - Симферополь. - 2003. - С. 56-61.

5. Латушкина Т.Н., Бугаенко Л.А. Получение оздоровленного посадочного материала лаванды методом термотерапии in vitro // Научные труды ученых Крымского государственного агротехнологического университета. - Вып. 91. - Симферополь. - 2005. - С. 211-216.