Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина

Курсовая работа

По дисциплине: «Ветеринарная микробиология»

По теме: «Методы культивации бактерий. Питательные среды. Оборудование и приборы лаборатории»

Выполнила: студентка

Сенина Анастасия Андреевна

Преподаватель:

Долгова Екатерина Анатольевна

Москва

Оглавление

• 1. Культивирование
• 2. Смешанные и чистые культуры микроорганизмов. Накопительные культуры. Способы получения чистых культур
• 3. Выделение чистых культур аэробов
• 4. Культивирование и выделение чистых культур анаэробных бактерий
• 5. Выделение и культивирование строгих анаэробов и микроаэрофильных бактерий
• 6. Культивирование других микроорганизмов
• 7. Питательные среды в микробиологии
• 7.1 Жидкие питательные среды
• 7.2 Твердые питательные среды
• 8. Приборы и оборудование
• Литература


1. Культивирование

Культивирование, то есть выращивание микроорганизмов в лаборатории, применяется для изучения их свойств и для получения биомассы. Бактерии, грибы, актиномицеты, спирохеты и некоторые простейшие культивируются на питательных средах. Хламидии, риккетсии, вирусы и некоторые простейшие способны размножаться только в организме животного или в живых клетках.

Различают два основных способа культивирования микроорганизмов - периодическое и непрерывное.

При периодическом культивировании клетки помещают в закрытый сосуд определенного объема, содержащий питательную среду, и задают начальные условия. Постепенно увеличивается плотность популяции, снижается концентрация питательных веществ и накапливаются продукты обмена, т.е. условия существования микроорганизмов изменяются. Периодическую культуру обычно рассматривают как замкнутую систему, переживающую разные фазы развития. Каждая фаза характеризуется определенными физиологическими параметрами. Лаг-фаза - это фаза «привыкания» клеток к среде, при этом происходит увеличение количества ДНК и РНК и индукция синтеза соответствующих ферментов. Лаг-фаза удлиняется, если брать старый посевной материал и переносить клетки в совершенно новую по составу среду. Лаг-фаза сокращается (или может совсем отсутствовать), если активные молодые клетки перенести в свежую среду того же состава и той же температуры. На средах, содержащих смесь субстратов, наблюдается диауксия, при которой после исчерпания одного субстрата культура переходит во вторую лаг-фазу для подготовки к потреблению другого субстрата. В экспоненциальной (логарифмической) фазе клетки растут и делятся с максимальной скоростью, их рост не ограничен. Обычно такие клетки используют в биохимических и физиологических исследованиях. По мере исчерпания субстратов и накопления продуктов обмена скорость роста снижается (фаза замедления роста) и культура переходит в стационарную фазу, в течение которой процессы деления и отмирания клеток в популяции находятся в динамическом равновесии. Для бактерий эта фаза достигается при концентрации в среднем 10⁹ клеток/мл, для водорослей и простейших - 10⁶ клеток/мл. Когда исчерпание питательных веществ и накопление продуктов метаболизма преодолеют некие пороговые концентрации, начинается фаза отмирания и число клеток в популяции постепенно снижается.

Непрерывное (проточное) культивирование позволяет зафиксировать культуру в какой-то определенной фазе (обычно экспоненциальной). При этом состав среды и условия роста остаются постоянными. Этого добиваются постоянным прибавлением новой питательной среды в сосуд для выращивания и одновременным удалением такого же количества среды с клетками. Простейшая схема организации протока представлена на рис. 45. Подача свежей среды и удаление части суспензии (проток) происходит с той же скоростью, с какой растет культура. В этом случае устанавливается динамическое равновесие.

Некоторые микроорганизмы способны к пребыванию в особом физиологическом состоянии, при котором живые клетки не дают колоний на пригодных для них лабораторных средах, но под микроскопом наблюдаются как живые. Такое некультивируемое состояние (некультивируемая форма) присуще ряду микроорганизмов в природных местообитаниях, например, возбудителям сальмонеллеза и холеры, находящимся вне организма человека. Механизм перехода в некультивируемую форму и обратно не изучен, но есть данные о том, что этот процесс запрограммирован в геноме микроорганизмов и запускается недостатком питательных веществ в природных эконишах. В природных образцах такие микроорганизмы изучают путем прямого наблюдения и с помощью методов молекулярного анализа состава нуклеиновых кислот образца.

Для культивирования микроорганизмов необходимы определенные условия: температура, аэробные или анаэробные условия.

Температура должна быть оптимальной для данного вида. Большинство патогенных бактерий размножаются при 37°С. Однако для некоторых видов оптимальной является более низкая температура, что связано с особенностями их экологии. Так, для палочки чумы, естественным местом обитания которой являются грызуны в период зимней спячки, оптимум температуры составляет 28°С, как и для лептоспир, для палочки ботулизма - 28°С-35°С.

Кроме оптимальной температуры, для культивирования микроорганизмов, в зависимости от вида, необходима аэробность или анаэробность среды.

Для того, чтобы изучить морфологию, культуральные, биохимические и другие свойства микробов, необходимо получить чистую культуру. Обычно культурой микробов называют скопление их на питательной среде в виде помутнения, придонного (пристеночного) роста или пленки на поверхности жидкой среды или колоний на плотной среде. Отдельная колония образуется из одной микробной клетки. Чистая культура - это культура микробов одного вида, полученная из одной колонии. В лабораториях для различных исследований применяют определенные известные штаммы микробов. Штамм - это чистая культура микробов, полученная из определенного источника, в определенное время, обладающая известными свойствами. Как правило, штаммы микробов обозначают определенным номером. Например, штамм Staphylococcus aureus 209P применяется для определения активности пенициллина.

2. Смешанные и чистые культуры микроорганизмов. Накопительные культуры. Способы получения чистых культур

Из-за малых размеров микроорганизмов работа в лаборатории проводится не с одной особью, а с популяцией организмов, или культурой. Культура микроорганизмов, состоящая из клеток одного вида, носит название чистой культуры. Если число видов два или больше, то говорят о смешанной культуре. Для определения систематического положения, физиолого-биохимических свойств и особенностей развития микроорганизмов необходимо получить чистую культуру. Для этого клетки данного вида нужно отделить от клеток других видов и впоследствии исключить возможность попадания посторонних микроорганизмов. При выделении чистой культуры из природных местообитаний, где микроорганизмы в большинстве случаев растут в виде смешанных популяций, на первом этапе обычно пользуются предложенным С.Н. Виноградским методом получения накопительных культур, в которых преобладают организмы определенной группы. Накопление желаемых микроорганизмов происходит за счет создания элективных условий культивирования, благоприятных для данной группы. Для этого нужно учитывать физиолого-биохимические особенности выделяемой культуры. Избирательного подавления роста определенных групп микроорганизмов можно достичь внесением в среду антибиотиков. Преобладать будет та группа микроорганизмов, для которой созданные исследователем условия культивирования наиболее приемлемы. Другие организмы, также присутствующие в пробе, в этих условиях не размножаются, либо характеризуются незначительным ростом. Например, для получения накопительной культуры азотфиксирующих микроорганизмов следует приготовить среду без связанных форм азота. Для замедления развития грамположительных бактерий можно добавить пенициллин, а мицелиальных грибов - нистатин или гризеофульвин. Для накопления спорообразующих микробов часто используют кратковременное прогревание пробы при высокой температуре (10 мин при 80^оС), когда вегетативные клетки погибают, а эндоспоры сохраняют свою жизнеспособность. Необходимо учитывать, что элективные условия - не всегда наилучшие (оптимальные) для роста выделяемой группы, однако сопутствующие микроорганизмы переносят их еще хуже. О получении накопительной культуры судят по характерной микроскопической картине, внешним изменениям среды, появлению определенных продуктов метаболизма. Чистую культуру в дальнейшем можно получить из единичной клетки или из отдельной колонии. Клетку извлекают микропипеткой или микропетлей под микроскопическим контролем и переносят в сосуд со средой. Другим способом является изготовление серии препаратов «висячая капля» из сильно разведенной суспензии. Препараты просматривают под микроскопом и выбирают те, где присутствует одна клетка. Затем их помещают во влажную камеру и микроскопируют вновь через сутки. Капли, в которых произошло размножение клеток, переносят в питательную среду. Чаще используют метод выделения чистой культуры из отдельной колонии, разработанный в лаборатории Р.Коха. Каплю накопительной культуры или ее разведения распределяют по поверхности или в глубине твердой питательной среды, добиваясь разобщения отдельных клеток. Каждая такая клетка впоследствии размножается, образуя колонию из клеток одного вида. Ее снимают петлей и переносят в сосуд с питательной средой. Признаком чистоты культуры является однородность колоний при пересевах и морфологическая однородность клеток при просмотре микроскопических препаратов.

3. Выделение чистых культур аэробов

Процесс занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:

1-й день - микроскопия мазка из исследуемого материала, окрашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева. Затем посев материала на поверхность застывшего питательного агара для получения изолированных колоний. Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют оставшуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на третьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наименьшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изолированные колонии.

Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на одной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из первого сектора во второй и таким же образом последовательно в третий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после суточного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.

2-й день - изучение колоний, выросших на чашках, описание их. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными или непрозрачными, они имеют различные размеры, округлые правильные или неправильные очертания, выпуклую или плоскую форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или волнистые, изрезанные края. Они могут быть бесцветными или иметь белый, золотистый, красный, желтый цвет. На основании изучения этих характеристик выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отбирают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью проверки однородности микробов в колонии. Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным питательным агаром.

3-й день - проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка. При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным.

Для идентификации выделенных бактерий изучаются культуральные признаки, то есть характер роста на жидких и плотных питательных средах. Например, стрептококки на сахарном бульоне образуют придонный и пристеночный осадок, на кровяном агаре - мелкие, точечные колонии; холерный вибрион образует пленку на поверхности щелочной пептонной воды, а на щелочном агаре - прозрачные колонии; палочка чумы на питательном агаре образует колонии в виде «кружевных платочков» с плотным центром и тонкими волнистыми краями, а в жидкой питательной среде - пленку на поверхности, а затем - нити, отходящие от нее в виде «сталактитов».

4. Культивирование и выделение чистых культур анаэробных бактерий

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и биологических методов.

Физические методы. Основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:

1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;

2) посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред;

3) механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы;

4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индифферентным газом.

В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10--15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см.

В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьинокислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта -- Тароцци, которая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов.

Посев микроорганизмов в глубину плотных сред производят по способу Виньяль -- Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3--6 мм. Один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль -- Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде.

Удаление воздуха производят путем его механического откачивания из специальных приборов -- анаэростатов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.

Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, углекислым газом) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.

Химические методы. Основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия NaHSO₃.

Биологические методы. Основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засевают аэроб, например, часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают анаэроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того, как весь кислород в пространстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3--4 сут). В целях сокращения воздушного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.

Комбинированные методы. Основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.

5. Выделение и культивирование строгих анаэробов и микроаэрофильных бактерий

Метод Цейсслера применяется для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого производят посев на среду Китт-Тароцци, прогревают 20 мин при 80 °C (для уничтожения вегетативной формы), заливают среду вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч в термостате. Затем производят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования интересующие колонии изучаются -- их пересеивают на среду Китт-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Фортнера -- посевы производят на чашку Петри с утолщенным слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. Одну половину засевают культуру аэробных бактерий, на другую -- анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробной микрофлоры, а затем (после поглощения кислорода) -- рост аэробной резко прекращается и начинается рост анаэробной.

Метод Вейнберга используется для получения чистых культур облигатных анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, переносят в сахарный бульон. Затем одноразовой пастеровской пипеткой материал переносят в узкие пробирки с сахарным мясо-пептонным агаром, погружая пипетку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают, что позволяет фиксировать бактериальный материал в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют в термостате, а затем изучают выросшие колонии. При обнаружении интересующей колонии на её месте делают распил, материал быстро отбирают и засеивают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

6. Культивирование других микроорганизмов

Культивирование микоплазм

Микоплазмы культивируются на питательных средах с добавлением сыворотки и углеводов. Поскольку микоплазмы лишены клеточной стенки, они растут только в изотонических или гипертонических средах. На плотных питательных средах в течение нескольких суток образуются очень мелкие колонии, напоминающие яичницу-глазунью - с выпуклым центром и плоской полупрозрачной периферией. Микоплазмы можно выращивать также на курином эмбрионе или культуре клеток.

Культивирование риккетсий и хламидий

Риккетсии и хламидий - облигатные внутриклеточные паразиты. Для их культивирования используют культуры клеток, куриный эмбрион и заражение животных.

Культивирование грибов

Для культивирования грибов применяют плотные и жидкие питательные среды: чаще всего среду Сабуро, а также среды, содержащие пивное сусло. Грибы растут медленнее, чем бактерии, они образуют видимый рост в течение нескольких суток. Температура культивирования ниже, чем у бактерий - 22-30°С.

Культивирование спирохет и простейших

Среди спирохет наиболее легко выращивать лептоспиры, питательной средой для которых может служить вода с примесью сыворотки крови кролика. Боррелии и трепонемы культивируют в анаэробных условиях на более сложных питательных средах, содержащих сыворотку, кусочки тканей животных.

Среди простейших культивируются на питательных средах дизентерийная амеба, лямблии, трихомонады, лейшмании, трипаносомы, балантидии.Токсоплазмы культивируют в куриных эмбрионах и культурах тканей. Методы культивирования малярийных плазмодиев разрабатываются.

7. Питательные среды в микробиологии

Для культивирования микроорганизмов используются различные по составу питательные среды, в которых должны содержаться все вещества, необходимые для роста. Потребности микроорганизмов в питательных веществах чрезвычайно разнообразны и определяются особенностями их метаболизма. Поэтому универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех микроорганизмов, не существует.

В широком смысле слова питательная среда должна соответствовать следующим требованиям:

· включать доступный для клетки источник энергии. Для одних организмов (фототрофов) таким источником служит свет, для других - органический (хемоорганотрофы) или неорганический (хемолитотрофы) субстрат.

· содержать все необходимые компоненты для реализации конструктивных процессов в клетке. Причем синтетические способности микроорганизмов могут варьировать от использования углекислого газа в качестве единственного источника углерода (автотрофы) до потребности в более восстановленных соединениях углерода - кислотах, спиртах, углеводах и др. (гетеротрофы).

В узком смысле слова любая искусственная питательная среда должна соответствовать следующим требованиям:

· содержать все необходимые для роста питательные вещества в легко усвояемой форме;

· иметь оптимальную влажность, оптимальную вязкость, оптимальную рН, (оптимальные - для конкретного микроорганизма), быть изотоничной, сбалансированной с высокой буферной емкостью и, по возможности, прозрачной.

Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения микроорганизмов, их культивирования и сохранения в лабораторных или промышленных условиях.

Выбор состава питательной среды зависит в значительной степени от целей эксперимента либо промышленного процесса.

Существует следующая классификация питательных сред:

По составу питательные среды делятся на натуральные, синтетические и полусинтетические. Также они могут классифицироваться как среды определенного и неопределенного состава.

Натуральными называют среды, которые состоят из продуктов растительного или животного происхождения, имеющих неопределенный химический состав. Примерами питательных сред такого типа являются среды, представляющие собой смесь продуктов распада белков (казеина, мышц млекопитающих), образующихся при их гидролизе. К питательным средам неопределенного состава можно отнести и среды, полученные на основе растительного сырья: картофельный агар, томатный агар, отвары злаков, дрожжей, пивное сусло, настои сена и соломы и др. Основное назначение таких питательных сред - выделение, культивирование, получение биомассы и поддержание культур микроорганизмов.

К числу сред неопределенного состава относят и среды полусинтетические. В такую среду вносят известные соединения как явно необходимые; а также добавляют небольшое количество дрожжевого или кукурузного экстракта (или любого другого природного продукта) для обеспечения неизвестных потребностей роста. Такие среды часто используются в случае промышленного культивирования биологических объектов для получения продуктов метаболизма, например, для получения аминокислот, антибиотиков, витаминов и т.д.

Синтетические среды - это среды определенного состава, представленные чистыми химическими соединениями, взятыми в точно указанных концентрациях и соотношениях отдельных элементов. Обязательными компонентами таких сред являются неорганические соединения (соли) и углерод- и азотсодержащие вещества (типичными представителями являются глюкоза и (NH4)2SO4. Часто к таким средам добавляют буферные растворы и хелатирующие соединения. Основное назначение таких питательных сред - изучение особенностей физиологии и метаболизма микроорганизмов, выделение генетических рекомбинантов и т.д. культивирование микроаэрофильный бактерия микробиология

По назначению среды разделяют на основные, элективные (селективные) и дифференциально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это питательный бульон и питательный агар. Такие среды служат основой для приготовления более сложных питательных сред.

Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного или целой физиологической группы микроорганизмов. Например, для выделения стафилоккоков в среду может быть добавлен хлористый натрий в концентрации 7,5%. При этой концентрации рост других бактерий подавляется. Элективные среды применяются на первом этапе выделения чистой культуры бактерий, т.е. при получении накопительной культуры.

Дифференциально-диагностические среды применяются для быстрой идентификации близкородственных видов микроорганизмов, для определения видовой принадлежности, в клинической бактериологии и др. В состав дифференциально-диагностической среды входят: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химический субстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроорганизма; в) цветной индикатор, изменение окраски которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма. Например, среда Эндо позволяет отличить клоны, сбраживающие лактозу от клонов, не обладающих этим свойством.

Типы питательных сред по консистенции

Питательные среды бывают жидкие и твердые. Главное преимущество жидких сред заключается в возможно равномерном распределении в них зародышей; этим дается возможность всегда работать с точно отмеренным количеством бактерий, что особенно важно при опытах с впрыскиванием последних животным для изучения силы болезнетворного действия микрофитов. Разводка микроорганизма в жидкой среде, введенная в полое предметное стекло, дает нам возможность изучить непосредственно под микроскопом рост и деление клеток, образование микрофитом различных сочетаний, появление в нем спор и их прорастание. Бульонные культуры патогенных бактерий, освобожденные соответственной фильтрацией от живых зародышей, представляют чистые растворы продуктов вещественного обмена микроорганизмов, различного рода бактерийные яды (токсины), знакомство с которыми имеет первенствующее значение для уразумения сущности заразных болезней. Разводки в молоке, пептонной воде и др. дают нам ценные указания для биологической характеристики многих микроорганизмов, для отличия их друг от друга. Жидкими средами можно пользоваться, однако, лишь тогда, когда в распоряжении имеется уже чистая разводка того или другого микроорганизма; разъединение же зародышей, вылавливание одного из них из той смеси различнейших видов бактерий, которая встречается в окружающей нас природе, возможно лишь при помощи плотного субстрата, консистенция которого препятствует смешиванию между собой различных микроорганизмов, растущих здесь совершенно особняком и на надлежащем друг от друга расстоянии. Неожиданно быстрое развитие, достигнутое бактериологией в последние 10 - 15 лет, главным образом обязано введению Р. Кохом в бактериологическую технику твердых прозрачных субстратов. Питательные среды до посева исследуемого микроорганизма должны быть тщательно обеспложены, с целью устранения случайно поселившихся в них посторонних бактерий.

7.1 Жидкие питательные среды

Мясопептон-бульон. 500 г мяса, освобожденного от жира, костей, сухожилий и апоневрозов и пропущенного через мясорубку, обливают литром дистиллированной воды, после чего смесь оставляется для полного выщелачивания в прохладном месте. Через сутки получившийся настой пропускают через несколько слоев марли, сильно выжимая при всём этом задерживаемое марлей мясо, до получения 1 литра мясной воды; к последней прибавляют 10 г пептона и 5 г поваренной соли и затем жидкость кипятят с ³/₄ часа на голом огне до полного свертывания всех нерастворимых белков, после чего она охлаждается и фильтруется. Полученный кислый бульон (свежее мясо обладает кислой реакцией) нейтрализуется едким натром до слабощелочной реакции, кипятится затем ровно 5 минут и в горячем виде отфильтровывается. Разливают готовый бульон в колбочки, пастеровские ballons-pipettes или в пробирки и стерилизуют нагреванием в коховском текучепаровом аппарате в течение 2 часов или в папиновом котле (при 115°) в течение 15 минут. Вместо мяса для приготовления мясопептон-бульона пользуются также готовым мясным экстрактом Либиха, что значительно упрощает дело. На 1 литр воды берут 30 г пептона, 5 г виноградного или тростникового сахара и столько же экстракта. Жидкость подвергается продолжительному кипячению и после полного охлаждения пропускается через толстый слой животного угля, насыпанного в обыкновенный фильтр из шведской бумаги. Этим путем удается получить прозрачный и неокрашенный субстрат. - Мясопептон-бульон употребляется или сам по себе, как прекрасная среда для питания и размножения многих сапрофитов и болезнетворных микроорганизмов, или как исходный материал для приготовления твердых субстратов. В бульонных разводках обращают внимание, остается ли жидкость в главной своей массе чистой, или она помутнела. Неподвижные бактерии, размножаясь в бульоне, опускаются на дно пробирки в виде облачка, хлопьев или порошковидного осадка; обладающие же самостоятельным движением вызывают равномерное помутнение жидкости, осаждаясь лишь впоследствии. Образование пленки на поверхности бульона позволяет в грубых чертах судить о степени потребности засеянного микроорганизма в кислороде. Прибавлением к бульону 6-8% глицерина получается среда, весьма благоприятная для бугорчатых палочек, разрастающихся здесь на поверхности в виде толстых, складчатых пленок; особенно пригоден для этой цели бульон (с глицерином), приготовленный из телячьих легких.

Пептонная вода. Многие микроорганизмы вырабатывают из белковых веществ ароматические основания - главным образом индол, отчасти также фенол, скатол и тирозин; другие (холерный вибрион) одновременно с индолом вырабатывают также и азотистые продукты. Индоловая реакция служит для отличия друг от друга некоторых бактерий. Она получается лишь при наличности в питательной среде пептонов; присутствие сахара вредит реакции, а потому для получения последней пользуются чистым раствором панкреатического пептона или, что проще, нейтрализованным раствором пептона (1%) и поваренной соли (0,5%) в воде.

Молоко весьма часто употребляется для испытания способности микроорганизма разлагать молочный сахар с выделением кислот (молочной, уксусной и др.), свертывающих молоко; одни микроорганизмы свертывают молоко, другие этой способностью не обладают. Молоко, даже только что выдоенное, весьма нередко содержит споры, упорно противостоящие высокой температуре, а потому обеспложивание его требует особенной тщательности. Нагревают его ¹/₄ часа в автоклаве при 120°; но так как вследствие карамелизации сахара при такой высокой температуре оно нередко буреет и вообще несколько изменяется в своих свойствах, то рациональнее стерилизовать молоко четыре дня подряд, по ¹/₂ часа, в коховском текучепаровом аппарате.

Молочную сыворотку предложил Petruschky для определения количества вырабатываемых бактериями свободных щелочей и кислот. Совершенно свежее молоко, разбавленное равным объемом воды, слегка нагревается, после чего к нему прибавляют разведенной соляной кислоты в количестве, достаточном для выпадения казеина, который затем отфильтровывается. Жидкость нейтрализуется содой, нагревается часа 2 в аппарате Коха и снова фильтруется от выпадающего при нагревании последнего остатка казеина. Получающаяся сыворотка должна быть строго нейтральной реакции и прозрачна как вода, лишь с легким желтовато-зеленым оттенком. По прибавлении к жидкости чувствительной лакмусовой настойки ее разливают в пробирки совершенно одинакового размера и стерилизуют 3 дня подряд при 100°.

Безбелковые питательные растворы. Пастер еще в 1858 г. показал, что дрожжевые грибки для своего роста не нуждаются в белковых веществах, заимствуя, подобно зеленым растениям, нужный им азот из аммиака. Предложенная Пастером безбелковая жидкость изменена была Мейером, Коном, Ушинским и К. Френкелем. Раствор последнего (0,5% поваренной соли, 0,2% двуфосфорнокислого калия, 0,6% молочнокислого аммония, 0,1% аспарагина) дает весьма благоприятные условия для роста многих гнилостных и патогенных бактерий. Особенное место между безбелковыми питательными средами занимает жидкость Капальди и Проскауера, представляющая одно из драгоценнейших средств для отличия друг от друга брюшнотифозной палочки и bac. coli communis, как известно, сходных между собою по морфологическому характеру, неспособностью окрашиваться по Грамму и одинаковому росту на желатине и агаре. Жидкость эта готовится растворением в 100 куб. см воды 0,2 аспарагина, 0,2 маннита, 0,02 хлористого кальция и 0,02 двукислого фосфорнокислого натрия. Она нейтрализуется щелочью и после прибавления к ней лакмуса стерилизуется. Тифозная палочка для удовлетворения потребности в азоте безусловно нуждается в белковых веществах, а потому и не растет в этой жидкости и не изменяет ее реакции; кишечная же палочка менее требовательна к питательным средам, нужный ей для питания азот она берет из амидных соединений (аспарагина, креатина, сукцинамида и др.) и даже из аммиачных солей некоторых органических и минеральных кислот, а потому, в противоположность тифозной палочке, хорошо размножается в питательных средах Капальди и Проскауера и благодаря разложению маннита сообщает ей через 20 часов резко кислую реакцию.

Куриные яйца в сыром виде представляют питательную среду, состоящую из живого белка. Свежие яйца тщательно очищаются снаружи мылом, обмываются обеспложенной водой и обтираются обеспложенной ватой. В одном из полюсов яйца прокаленной иглой делается точечное отверстие, через которое глубоко вводится на платиновой проволоке заразный материал. Отверстие закрывается каплей растопленного сургуча.

Водянистая влага глаза имеет важное значение для изучения под микроскопом хода развития микроорганизмов. Для получения ее вынимают глаз только что убитого животного, прижигают роговицу раскаленной стеклянной палочкой, прокаливают прижженное место острием стерилизованной пастеровской пипетки, в которую при легком давлении на глазное яблоко и поступает humor aqueus. Вынимают пипетку и запаивают кончик ее на пламени. Жидкость сохраняется до востребования.

7.2 Твердые питательные среды

Твердые питательные среды распадаются на прозрачные (мясопептон-желатина, мясопептон-агар, кровяная сыворотка и др.) и непрозрачные (картофель, рис, хлебная мезга и пр.).

Прозрачные питательные среды

Мясопептонная желатина. К бульону, приготовленному вышеописанным способом, прибавляют листовой, лучшего качества желатины в количестве 5% зимой и 10-12% в теплое время года. При постоянном помешивании жидкость нагревается до полного растворения желатины, после чего прибавлением щелочи придают ей нейтральную или слабощелочную реакцию (продажная желатина обладает кислой реакцией). Жидкость кипятится ¹/₄ часа, вновь становясь нередко слабокисловатой, почему новым добавлением щелочи восстановляют ее прежнюю реакцию. Для лучшего просветления жидкости ее предварительно охлаждают до 40-50° С, прибавляют тщательно взбитый с водой яичный белок и снова подвергают ее сильному кипячению в течение 20 минут; при всём этом белок, свертываясь в виде плотных комков, захватывает мельчайшие частицы, вызывающие мутноватость желатины. Остается профильтровать желатину. Для отделения плотных комков яичного белка ее пропускают предварительно через несколько слоев марли, после чего она подвергается фильтрации через смоченный кипятком складчатый фильтр из шведской бумаги. Стеклянная воронка с фильтром помещается в другую плантамуровскую воронку, в которой между двойными станками находятся горячая вода, благодаря чему фильтрование, совершающееся при высокой температуре, происходит довольно быстро и желатина не застывает на фильтре. Процеженная желатина должна быть совершенно прозрачна, слегка лишь окрашена и нейтральной или слабощелочной реакции; она разливается в пробирки и обеспложивается три дня подряд по 20 мин. в коховском аппарате. Продолжительное, в течение нескольких часов, кипячение желатины с целью ее стерилизации не допускается, так как она теряет при всём этом способность застывать.

Мясопептон-агар. Агар представляет собой растительный студень, добываемый из растущих в Ост-Индии и Японии различного рода водорослей; он распускается лишь при температуре, близкой к точке кипения воды, и снова застывает уже при 40° С; благодаря своей тягучести он даже в 40° С растворе фильтруется с большим трудом, почему при приготовлении из агара питательной среды его размягчают в автоклаве при 120° или подвергают его кипячению в течение нескольких часов. К слабощелочному мясопептон-бульону прибавляют 1,5-2% агара, колбу с жидкостью ставят на час в автоклав при 120°, после чего при пользовании плантамуровской воронкой агар довольно легко проходит через фильтр. Предварительная перед фильтрацией нейтрализация жидкости не нужна, так как агар сам по себе имеет нейтральную реакцию. Профильтрованный мясопептон-агар, разлитый в пробирки, обеспложивается в один сеанс нагреванием в автоклаве при 120° в течение ¹/₂ часа. Если в распоряжении не имеется автоклава, то поступают следующим образом: кипятят в чугунном эмалированном котелке 20,0 агара с 3-4 литрами воды в течение 2-3 часов; к остающейся жидкости прибавляют литр бульона и снова кипятят до получения одного литра; этим путем точно так же получается хорошо фильтрующийся агар (Н. Шульц).

К агару, а равно и к желатине, для той или другой специальной цели прибавляют часто различные другие вещества. Так, прибавление виноградного сахара (1-2%), индиготина (0,5-1%), муравьинокислого натра (0,25-0,5%) необходимо для питания и размножения анаэробных бактерий, нуждающихся, как известно, в восстановляющих, легко отдающих свой кислород веществах. Прибавлением к агару глицерина (6-8%) получается плотная питательная среда, весьма пригодная для роста бугорчатой палочки. Агар с 1-2% виноградного сахара представляет лучший субстрат для испытания ферментативной способности бактерий: будучи засеян вызывающим брожение микроорганизмом, сахарный агар (при 37°) уже через 1-2 часа обнаруживает несколько пузырей газа, количество которых через сутки увеличивается настолько, что агар расщепляется на несколько отстоящих друг от друга на 1-3 см участков. Прекрасную питательную среду для роста многих патогенных бактерий, особенно различного рода вибрионов, представляет мясопептонный агар или желатина с прибавлением к ним алкалиальбумината, приготовляемого по способу Дейке: 3000,0 телятины дигерируются в течение суток с 1200 куб. см 3% раствора KHO; жидкость фильтруется и к прозрачному, окрашенному в темно-бурый цвет, фильтрату прибавляется соляная кислота до выпадения альбуминатов; последние отфильтровываются, размешиваются в небольшом количестве воды и подщелачиваются. Жидкость выпаривается, высушивается в порошок, который в количестве 2,5% прибавляется к мясопептонной желатине или агару.

Алкалиальбуминат Дейке продается и в готовом виде. Из всех примесей к агару наибольшее значение имеет примесь крови; на такой среде Пфейферу удалось вырастить палочку инфлюэнцы. Берут из мякоти пальца, при обычных антисептических предосторожностях, несколько капель крови и размазывают их платиновой проволокой по поверхности косо застуженного агара; до употребления в дело пробирки ставятся на сутки в термостат (при 37°); пользуются лишь теми пробирками, которые после этой пробы не обнаружили никакого загрязнения. Как желатина, так и агар имеют свои достоинства и недостатки, и одна из этих сред не всегда может заменить другую. Агар употребляется главным образом для культивирования патогенных бактерий и вообще микроорганизмов, живущих при температуре тела (37°); желатиной, распускающейся уже при 25°, можно пользоваться, наоборот, лишь при комнатной температуре. На косо застывшем агаре в пробирках микроорганизмы сравнительно дольше сохраняют свою жизнеспособность, чем в желатине, так как вследствие выделения конденсационной воды собирающейся в нижней части пробирки агар в течение долгого времени предохранен от высыхания. Главный недостаток агара заключается в том, что, представляя собой тело, близко стоящее к углеводам, он не проявляет свойственной многим бактериям способности вырабатывать протеолитические, растворяющие белки ферменты; наоборот, желатина, как тело белковинное, пептонизируется и разжижается подобными бактериями, что имеет немаловажное значение для биологической их характеристики. Разжижение желатины некоторыми бактериями имеет и свои невыгодные стороны, препятствуя более или менее продолжительному наблюдению не разжижающих желатину бактерий, находящихся в исследуемом материале (воде, почве и т.п.) вместе с разжижающими микроорганизмами: последние заглушают собой рост первых. Вообще, при бактериологических исследованиях необходимо одновременно пользоваться обоими субстратами.

Весьма важную питательную среду для бактерий представляет кровяная сыворотка. Представляя собой прозрачный, плотный субстрат, приготовляемый из крови, она по составу своему лучше других сред удовлетворяет разнообразным требованиям, предъявляемым многими живущими в человеческом и животном организме болезнетворными микроорганизмами (палочкой дифтерита, туберкулеза и др.). Добывание крови для приготовления сыворотки и стерилизация последней связаны с немалыми затруднениями.

Рациональнее всего пользоваться способом Ру и Нокорда, при котором в момент взятия крови исключается попадание зародышей из воздуха, чем устраняется необходимость стерилизации субстрата. В яремную вену животного вкалывается при соблюдении антисептических предосторожностей троакар; вынув из него иглу, вставляют стеклянную трубку, нижним своим концом переходящую через ватную пробку в узкий, высокий, тщательно обеспложенный цилиндр, собирающий кровь. Последняя оставляется в прохладном месте на 48 часов; отстоявшаяся за это время совершенно прозрачная, янтарно-желтого цвета сыворотка снимается обеспложенными пипетками в обеспложенные пробирки; последние кладут затем в особый термостат, дно которого слегка наклонено, и сыворотка без предварительной стерилизации подвергается здесь в косом положении свертыванию в течение 30-60 минут при 68°.

Свертывание производится при косом положении пробирки с целью образования сывороткой по ее оплотнении широкой поверхности. Этот точный способ доступен лишь в лабораториях, имеющих в своем распоряжении какое-либо крупное животное (лучше всего лошадь), могущее дать время от времени большое количество крови (из 1-1,5 литров получается не больше 100-200 куб. см сыворотки). Обыкновенно приходится брать кровь на бойне и полученную через 2 дня сыворотку подвергать предварительно обеспложиванию по Тиндалю, нагреванием 8 дней подряд по 1 часу при 58°. Быстрое однократное обеспложивание сыворотки при высокой температуре невозможно: уже при темп., не превышающей 70°, она становится негодной, превращаясь в грязно-серую, мутную, непрозрачную массу. Если кровяная сыворотка не предназначена для немедленного употребления, то, по Кох-Кирхнеру, для ее стерилизации пользуются хлороформом, который, будучи прибавлен в количестве 1 куб. см на 100 куб. см сыворотки, в течение 2 месяцев вполне ее обеспложивает. Колбочки с содержимым во избежание испарения хлороформа тщательно закупориваются резиновыми пробками, которые заливаются парафином. В этом виде сыворотка сохраняется неограниченно долгое время. При необходимости пользования ею резиновые пробки заменяются обеспложенными ватными пробками, и колбочки ставятся на несколько дней в термостат для испарения хлороформа; сыворотка, разлитая затем в обеспложенные пробирки, подвергается обычным путем свертыванию. Баранья или телячья кровяная сыворотка, смешанная, по Лёффлеру, в отношении 3: 1 с телячьим бульоном, содержащим 1% пептона, 1% виноградного сахара и 0,5% поваренной соли, представляет лучшую питательную среду для дифтерийной палочки; размазав на поверхности этого субстрата подозрительную пленку, снятую с зева, можно в случае дифтерита уже нередко через 6 часов поставить диагностику, а следовательно, своевременно приступить к лечению противодифтерийной сывороткой.

В некоторых специальных случаях, особенно для открытия гонококков, пользуются человеческой сывороткой, добывая кровь во время родов из последа. После перевязки и перерезки пуповины плацентарный ее конец, предварительно обмытый сулемой и стерилизованной водой, опускают в обезвоженную колбу, куда благодаря продолжающимся сокращениям матки выгоняется из пуповины небольшое количество крови. С целью воспользоваться кровяной сывороткой (которая, будучи раз свернута, более уже не разжижается) и для пластинчатых разводок, т.е. для изоляции бактерий, заражают жидкую обеспложенную, но несвернутую сыворотку прививным материалом и тщательно смешивают ее с 2% растопленным и остуженным до 42° С агаром; смесь разливается затем в чашки Петри, где она и застывает.

Непрозрачные питательные среды

Из непрозрачных питательных сред первое место занимает картофель. Он служит прекрасным субстратом для многих сапрофитов и патогенных бактерий, обнаруживающих на нем характерный типический рост; им пользуются также для сохранения разводок на продолжительный срок и для обнаружения микроорганизмом спорообразования. Крупные, так называемые салатные картофелины очищаются под струей воды от грязи, после чего кончиком картофельного ножа вырезают все подозрительные места (глазки), разрезают картофель на круглые пластинки, кладут их в маленькие двойные чашки и обеспложивают в коховском аппарате. Рациональнее еще пользоваться для разводок на картофеле широкими, в 2,5 см в диаметре, пробирками. Пробочным сверлом вырезают из крупного картофеля цилиндр, разрезают его по диагонали на два клина и вкладывают каждый из них в пробирку широким концом вниз. Для предохранения разводки от загрязнения конденсационной водой, выделяющейся из картофеля, практично пользоваться пробирками, имеющими недалеко от дна кольцеобразное сужение, на котором и покоится картофельный клин, вода же собирается на дно пробирки, ниже сужения. Перед опусканием картофеля в пробирку наливают в последнюю несколько капель воды для предохранения субстрата от высыхания.

Для пигментных бактерий пользуются, по Сойка и Кралю, питательной средой, приготовленной из разваренного в молоке риса: 100 г рисовой муки, тщательно растертой в ступке с 250 куб. см снятого молока, разваривают при постоянном помешивании в густую кашу и туго набивают последней цилиндрическую трубку. По охлаждении выдавливают рисовый цилиндр из трубки, разрезают его на несколько параллельных дисков, укладывают каждый из них в отдельную чашку, куда наливают еще несколько капель молока, и обеспложивают в течение ¹/₂ часа в коховском аппарате. На ярком фоне этой среды разноцветные пигментные бактерии выступают очень резко.

Хлебная мезга, обладая кислой реакцией, служит хорошей средой для плесневых грибов. Насыпают в эрленмейеровские колбы обыкновенный черный хлеб, высушенный и растертый в мелкий порошок, прибавляют воды до получения однообразной влажной каши и обезвоживают в паровом котле.

8. Приборы и оборудование

Основным оборудованием микробиологической лаборатории являются термостат, сушильный шкаф, автоклав и весы.

Термостат -- прибор для поддержания постоянства температуры -- применяют для выращивания культур микроорганизмов. Он представляет собой шкаф, в котором поддерживается в течение длительного времени определенная температура.

Сушильный шкаф используют для стерилизации сухим жаром посуды, инвентаря и т. д. Стерилизуемый материал предварительно заворачивают в бумагу и помещают в шкаф так, чтобы он не касался стенок. Стерилизацию проводят при температуре 160 °С в течение 2 ч. Простерилизованный материал вынимают после отключения и охлаждения шкафа.

Аппарат Коха применяют для стерилизации питательных сред. Он представляет собой металлический цилиндр с плоским дном и конусообразной крышкой, которая имеет отверстие Сушильный шкафдля выхода пара. Аппарат покрыт теплоизолирующим материалом. Сосуды с питательными средами ставят на подставку, находящуюся внутри аппарата.

Автоклав используют для стерилизации посуды и питательных сред паром под давлением. Это герметичный котел с двойными металлическими стенками и крышкой. Он снабжен манометром, предохранительными клапанами и краном для спуска воды и пара. Применяют для стерилизации питательных сред под давлением 0,5--1,0 МПа в течение 20--30 мин.

Весы в лаборатории необходимо иметь технические и аналитические. Технические имеют точность до 0,01 г; аналитические -- до 0,001 г.

Стерилизационные аппараты. Питательные среды, посуда, материалы, применяемые в микробиологической лаборатории, должны быть стерильными. Для стерилизации применяют нагревание до высоких температур паром (в автоклавах) или сухим жаром (в сушильных шкафах).

Кроме того используют центрифуги и мешалки, рН-метры для определения кислотности полуфабрикатов и др.

К посуде, используемой в микробиологической лаборатории, относятся пробирки, мерные цилиндры, колбы, чашки Петри и пр.