Трансплантация эмбрионов

Оператор рукой в одноразовой полиэтиленовой перчатке берет приготовленный для пересадки катетер с эмбрионом, надевает сверху на головную часть катетера и руку защитный полиэтиленовый чехол и, введя руку.с инструментом во влагалище кобылы, разъединяет защитный чехол и вводит инструмент в цервикальный канал. Нажав на наружный конец, прокалывает катетером второй защитный санитарный чехол.

Введя катетер в тело матки кобылы-реципиента на глубину 2-5 см, разворачивает инструмент прорезью шайбы и выходным отверстием вниз и выталкивает содержимое пайеты в матку, вдвинув полностью стилет в катетер. Инструмент извлекают из влагалища вместе с рукой, освобождают и выводят кобылу из станка...После пересадки кобылу-реципиента водят 5-7 минут.

Приживляемость. эмбрионов у кобыл-реципиентов учитывается по результатам ректального исследования на 40-45 день после трансплантации.

Приготовление растворов

Для извлечения, хранения и пересадки эмбрионов лошадей применяют следующие растворы:

1. Промывной раствор применяют для извлечения и непродолжительного хранения (до 1 часа) эмбрионов.На промывание одной кобылы-донора расходуют 2-2,5 л раствора. Для этого берут среду Дюльбекко и добавляют санирующий препарат согласно наставлению по применению. Раствор перед употреблением подогревают до температуры 36...37°С.

2. Ополаскивающий раствор используют для санации матки кобылы-донора после извлечения эмбриона. Для его приготовления в стерильный физраствор вводят санирующие препараты широкого спектра действия (ГАМП и полигон из расчета 300 или 600 мкг/см³).

3. Пересадочный раствор предназначен для пересадки эмбрионов и кратковременного их культивирования при 37°С. Для этого в 4 см промывного раствора вводят 4 см желтка куриного яйца. После перемешивания раствор готов к употреблению.

Трансплантация эмбрионов овец и коз

Отбор маток в доноры эмбрионов

В доноры эмбрионов отбирают животных с рекордной продуктивностью, проверенных по качеству потомства, разведение которых планируется в селекционных программах. Оптимальным для донора является возраст 3-4 года.

В качестве доноров используют маток без послеродовых осложнений и нарушений воспроизводительных органов. Обязательным условием является наличие нормального полового цикла и заводской упитанности. За 1,5-2 месяца до начала обработки на полиовуляцию проводят отбивку молодняка от маток.

Нормы кормления в это время, а также в период получения эмбрионов увеличивают на 0,2-0,3 к.е. или на 2,5-3,5 МДж по сравнению с нормами кормления маток первой половины суягноста или сукозности.

В летний период доноров пасут на высокоурожайных пастбищах. При снижении качества пастбищ обязательно подкармливать маток концентрированными кормами в объеме 0,2-0,4 и- и силосом - по 1,2-2 кг на голову в сутки.

При использовании овец и коз в качестве доноров в зимний период их рацион должен состоять из высококачественных сена, силоса и концентратов. Рацион должен быть сбалансирован по минеральным веществам и витаминам.

Обработка животных для вызывания полиовуляции

Для полиовуляции целесообразно отбирать овей и коз в спонтанную охоту. Охоту выявляют с помощью пробника. Для вызывания полиовуляции применяют сывороточные (ГСЖК) или гипофизарные (ФСГ) гонадотропины. Сроки обработок маток на полиовуляциго представлены в таблице

Режимы обработок овец и коз на полиовуляцию

Препараты	Дозы	Способ введения	Дни цикла	Число инъекций
			овцы	козы
ГСЖК	1000-2000 ИЕ	внутримышечно	11-12	14-18	однократно
ФСГ	18-24 мг	внутримышечно	с 11 по 14	с 13 по 16	дважды в день

Для вызывания полиовуляции ФСГ вводят животным в убывающих дозах. Для стимуляции охоты вводят простагландины через 1-2 дня после начала обработок гонадотропинами. Энзапрост вводят овцам в дозе 8-15 мг, козам - 4-10 мг; клопростенол или его аналоги (эстрофан, анипрост) вводят овцам в дозе 150-250 мкг, козам - 100-250мкг. Примерная схема обработок представлена в таблице.

Таблица

Примерная схема обработок овец и коз на полиовуляцню

Дни обработок	Время обработок в течение суток, час	1-я схема	2-я схема
		ФСГ, мг	ПГF-2, мкг	ФСГ, мг	ПГF-2, мкг
1	8	4		1500
	20	4
2	8	3
	20	3
3	8	2	250		250
	20	2
4	8	2
	20	2
5	вечер	выявление охоты и осеменение	выявление охоты и осеменение
6	утро	осеменение	осеменение
12	извлечение эмбрионов

В зимний период для повышения оплодотворяемости ооцитов и выживаемости эмбрионов каждые десять дней проводят обработку доноров препаратами витаминов А и Е в дозах 7500 ИЕ и 50 мг, соответственно.

Охоту у овец и коз определяют с помощью пробников. Осеменение доноров проводят сразу после выявления охоты и повторяют через 8 часов. При продолжении охоты на следующий день осеменение повторяют.

Более высокие результаты по оплодотворяемости у овец и коз получают при введении семени с помощью лалароскопа через голодную ямку в маточный рога несколько сантиметров выше истмуса. Операцию проводят под местной анестезией. Осеменение доноров лапароскопическим методом является гарантией высокой оплодотворяемости ооцитов у овец. У коз этот способ осеменения еще более эффективен.

Извлечение эмбрионов

Извлечение эмбрионов у овец и коз можно проводить на 3-4 день цикла (раннее извлечение) или на 5-7 день.

На 3-4 день эмбрионы овец и коз извлекают из яйцеводов на 8-16-клеточной стадии развития. Раннее извлечение повышает количество жизнеспособных эмбрионов при возможном рассасывании желтых тел на 4-6 дни цикла. При извлечении эмбрионов на 5-7 день цикла они находятся в матке на стадиях морул или бластоцист.

Извлечение эмбрионов у овец и коз проводят хирургическим методом. Перед извлечением маток выдерживают на голодной диете в течение 12 часов. Извлечение эмбрионов осуществляют под общей или местной анестезией. Для анестезии применяют полинаркон-5, комбелен, рампунь, новокаин.

Животное фиксируют на операционном столе в дорсальном положении, на оперируемом участке удаляют шерстный покров, проводят асептическую обработку операционного поля и накладывают стерильную салфетку. По белой линии живота, как можно ближе к вымени, делают разрез длиной 5-6 см. Осторожно извлекают рога матки с яичниками и располагают их на салфетке. При визуальном осмотре на яичниках подсчитывают число желтых тел и определяют стадию их развития, а затем приступают к извлечению эмбрионов.

При извлечении на 3-4 день цикла в яйцевод вводят тонкий катетер и закрепляют его при помощи зажима или лигатуры. Через прокол стенки матки на расстоянии 1 см от бифуркации вводят катетер Фоллея (с наружным диаметром 2 мм), надувают воздухом баллончик, фиксируя катетер в роге матки. В качестве среды для извлечения применяется фосфатно-солевой буфер (среда Дюльбекко) с добавлением 2% фатальной сыворотки. Сначала промывают яйцевод, вводя через катетер 3-6 см среды. Затем промывают матку, вводя среду Дюльбекко (10-25 см³) через иглу, вставленную в верхушку рога. На промывание одного рога матки используют 100-140 см среды. Промывную жидкость, извлеченную из матки через катетер Фоллея, переносят в фильтр для эмбрионов. Аналогично промывают второй рог матки донора. При извлечении эмбрионов на 5-7 день ограничиваются только промыванием матки.

Оценку, криоконсервирование и хранение эмбрионов проводят по методикам, применяемым при работе с эмбрионами крупного рогатого скота.

После операции извлечения эмбрионов матку и яичники животного обмывают гепаринизированным физраствором или высокомолекулярным декстрином для профилактики образования спаек, на операционную рану накладывают швы и вводят в брюшную полость антибиотики. Оперированных животных в течение 5-6 дней содержат в отдельных станках под постоянным наблюдением.

Овец и коз в качестве доноров используют не более 3 раз в один сезон, после чего их осеменяют для получения потомства.

Пересадка эмбрионов

При пересадке, необходимо соблюдать синхронность стадии цикла реципиента и стадии развития эмбриона. В отличие от эмбрионов овец эмбрионы коз менее чувствительны к асинхронности охоты (до 24 часов) между донором и реципиентом.

На практике синхронизация охоты донора и реципиента достигается либо путем выбора животных с соответствующими циклами, если работа ведется в крупных, либо синхронизацией охоты, если количество реципиентов ограничено. Синхронизацию охоты проводят однократными или двукратными обработками простагландинами согласно наставлению по их применению.

Пересадку проводят хирургическим методом через разрез по белой линии живота или в области голодной ямки. Ранние эмбрионы (до 16 бластомеров) пересаживают непосредственно в яйцеводы. Эмбрионы вводят стеклянной или пластиковой пипеткой через бахромку в яйцевод на глубину 3-4 см. Эмбрионы на более поздней стадии развития пересаживают в полость рога матки на расстоянии 2-3 см от истмуса. Тупой иглой (пипеткой) делают прокол стенки матки и помещают эмбрион на расстоянии 2-5 см от места прокола.

Методы хранения спермы

Для длительного хранения спермы производителей применяют метод глубокого замораживания в жидком азоте (до температуры -196°С). Метод длительного хранения спермы требует соблюдения следующих условий:

- точного выполнения этапов технологии замораживания спермы;

- непрерывного поддержания температуры -196°С в течение всего срока хранения спермы. Оттаивание и повторное замораживание, а также колебания температуры во время хранения замороженной спермы не допускаются.

Сперма производителей хранится в спермобанке. Сроки хранения замороженной спермы определяются целями ее использования.

Длительное хранение замороженной спермы производителей в жидком азоте осуществляется в специальных хранилищах или в стационарных емкостях.

В стационарных емкостях сперму хранят в тубах или пластмассовых стаканах, погруженных в жидкий азот. На тубах и стаканах должна быть нанесена информация с указанием даты взятия спермы, клички быка и количества доз.

Для перевозки спермы и хранения ее на пунктах искусственного осеменения а жидком азоте применяют сосуды Дьюара.

Замораживание спермы быков в полипропиленовых соломинках

Таблица

ЛГЖ среда

Компоненты	Количество
Лактоза, г	11,5
Полиген, г	0,03-0,06
Глицерин, см3	5,0
Желток куриных яиц, см3	20
Вода дистиллированная, см3	100

Для приготовления среды сухие заготовки вносят в стерильную колбу, добавляют необходимый объем прокипяченной дистиллированной воды (70...80°С), растворяют, охлаждают до 30...32°С и добавляют санирующий препарат, а затем глицерин и желток.

Технологическую обработку спермы (расфасовку, укупорку и раскладку в штативы) проводят при комнатной температуре.

В зависимости от подвижности и концентрации сперматозоидов сперму быка разбавляют в 20-50 и более раз (приложение 9) с таким расчетом, чтобы в одной дозе разбавленной спермы было не менее 15 млн, сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением.

После предварительной оценки сперму переливают в градуированный смеситель емкостью 100-200 см³ и измеряют объем. Разбавитель, подогретый до температуры 25...30°С, небольшими порциями вводят по стенке в емкость со спермой и осторожно перемешивают после добавления каждой порции.

Разбавленную сперму расфасовывают в стерильные полипропиленовые соломинки емкостью 0,25 см³.

На каждой соломинке делают надписи маркировочной машиной, указывающие наименование предприятия, кличку и инвентарный номер быка, а также дату взятия спермы, номер серии.

Для автоматического наполнения соломинок спермой и укупорки используют машину М6-МУ2-С. В цилиндр (мензурку) наливают разбавленную сперму, а специальное устройство наполняют стерильными стеклянными или металлическими шариками для укупорки. Соломинки укупоривают с обоих концов: один шарик служит в качестве пробки-поршня, другой - герметизирующей пробкой.

После наполнения соломинок между спермой и одним из шариков остается воздушный пузырек длиной 8-18 мм. Чтобы воспрепятствовать попаданию жидкого азота внутрь соломинок во время замораживания и хранения, пузырек перемещают в середину соломинки путем энергичного встряхивания.

Соломинки устанавливают на штативы с помощью счетных реек. На счетную рейку накладывают штатив и легким движением ладони быстро заполняют соломинками. После этого штатив с соломинками снимают с рейки и помешают в холодильник.

Штативы выдерживают в холодильнике 3-4 часа при 2...4°С.

Замораживают сперму в стационарном хранилище типа КВ-6202 или ХБ-0,5 в газообразном азоте при температуре -150± 20°С, на щите из нержавеющего металла толщиной 1,5-2 мм. Одновременно замораживают до 750 спермодоз. Цикл замораживания продолжается 7минут.

Уровень жидкого азота при замораживании с обдувом необходимо поддерживать на расстоянии 6-8 см до щита замораживающего устройства. При замораживании спермы без обдува щит замораживающего устройства должен касаться поверхности жидкого азота. При этом штативы с соломинками располагают в один ряд. Изменение температуры спермы и испаряющегося газообразного азота контролируют самопишущим потенциометром КСП-4 с подключенными медно-константановыми термопарами.

После замораживания соломинки со спермой помещают в пластмассовые стаканы или тубы, предварительно наполненные жидким азотом. Для сбора соломинок используют специальный собиратель с деревянной рукояткой. Его металлическую часть охлаждают в жидком азоте, затем вставляют в штатив, осторожно проводят вдоль него, в результате чего все соломинки ссыпаются в собиратель. После этого соломинки поворачивают и перекладывают в пластмассовые стаканы для хранения в стационарном хранилище.

Хранят замороженную сперму в стационарных хранилищах типа КВ-6202, ХБ-0.5 или ХБ-0,2 в пластмассовых стаканах, полностью погруженных в жидкий азот. Канистры с поднимателем стаканов заранее должны быть помещены в хранилище.

Замораживание спермы быка в облицованных гранулах

В качестве разбавителя используют среды №1 и 2 (табл-12.2 и 12.3), Процесс разбавления спермы осуществляют по таблице (приложение 10) с помощью специального устройства.

Устройство состоит из эластичной полиэтиленовой емкости для разбавителя, соединенной эластичной трубкой с патрубками цилиндра-дозатора. Верхний конец дозатора герметически закрыт соразмерным его объему эластичным колпаком из полиэтиленовой пленки. Соединительная трубка по обе стороны от дозатора пережимается пружинными зажимами.

Таблица

Среда №1

Компоненты	Количество
11% раствор лактозы или сахарозы, см3	63
Полиген, г	0,03-0,06
Глицерин, см3	7,0
Желток куриных яиц, см3	30

Таблица

Среда №2

Компоненты	Количество
Лактоза или сахароза, г	6,0
Натрий лимоннокислый трехзамещенный пятиводный, г	1,4
Полиген, г	0,03-0,06
Глицерин, см3	5,0
Вода дистиллированная, см3	100

Емкость для разбавителя представляет собой пакет из полиэтиленовой пленки толщиной 120-150 микрон, к которому герметически подсоединен отрезок полиэтиленовой трубки диаметром 4-6 мм и длиной 20-25 мм. В качестве емкости может быть использован одноразовый спермоприемник.

Дозатор изготавливают из мерного цилиндра, в нижнюю часть которого вваривают два небольших стеклянных патрубка для соединения с трубками.

В качестве колпака применяют пакет из полиэтиленовой пленки, который фиксируют резиновым кольцом на открытой цилиндрической части дозатора.

Перед работой емкость для разбавления стерилизуют ультрафиолетовым облучением, а дозатор с колпаком и соединительными трубками - путем автоклавирования при 0,5 атм. в течение 30 минут. При этом свободные концы трубок закрывают чехлами из пергаментной бумаги.

Для разбавленияспермы используют два устройства, которые заполняют средами №1 и 2. Устройство со средой №1 размещают в термостате при температуре 35°С, устройство со средой №2 используют в условиях комнатной температуры (18...22°С).

Непосредственно после взятия сперму разбавляют средой №1 в соотношении 1:1 и выдерживают при комнатной температуре (18-.22°С) в течение 5-10 минут, до окончания оценки эякулята. Затем дополнительно ее разбавляют средой №2, имеющей комнатную температуру, до требуемой концентрации сперматозоидов в дозе.

Для расфасовки спермы используют тонкостенную полимерную трубку диаметром 3,8-4 мм, с толщиной стенки 120 мкм. Перед работой трубку стерилизуют ультрафиолетовым облучением (лампа ПРК-2) в течение 25 минут. Поступает трубка в готовых бобинах, которые вкладывают в автомат ПРЖ.

Для фиксации направления трубки во время расфасовки спермы используют направляющую рейку, один конец которой крепят к автомату ЛРЖ, а противоположный подводят к кассете с трубкой под углом 5-10⁰ к горизонтальной плоскости. Трубку протягивают по желобу металлической рейки к автомату ПРЖ, на свободный конец надевают жесткое прижимное кольцо, после чего трубку муфты спермоприемника соединяют с трубкой и выдавливают в нее разбавленный эякулят. Герметичность соединения муфты с трубкой обеспечивается жестким прижимным полимерным кольцом.

Для исключения обратного попадания спермы из трубки в спермоприемник заполненную трубку перекручивают в месте соединения с муфтой и зажимают большим и указательным пальцами.

Заполненную спермой трубку подводят к сварочному узлу автомата ПРЖ, который автоматически разделяет ее на спермодозы объемом 0,25-0,33 см³ с одновременной герметизацией каждой дозы путем термической сварки. При наличии специальной приставки к автомату на каждую дозу наносится маркировка.

Спермодозы собирают в приемный бункер автомата, откуда их переносят в маркированные алюминиевые тубы диаметром 40 мм, которые закрывают поролоновыми пробками.

Заполненные тубы ввинчивают в обоймы устройства для эквилибрапии и замораживания спермы (ЭКЗ). Устройство помещают в холодильник (2...5°С), где сперма выдерживается в течение 4-6 часов при постоянном вращении обойм со скоростью 2-10 об/мин.

После выдержки заполненные тубами обоймы снимают с устройства для эквилибрации, крепят к ним стержни-держатели и погружают а жидкий азот на максимальную глубину, следя за тем, чтобы он не попадал внутрь туб через верхний край. Замораживание спермы длится 8-10 минут, после чего обойму с тубами полностью погружают в жидкий азот и оставляют до проверки качества спермы.

Тубы с качественной спермой закрывают поролоновыми пробками, отсоединяют от обоймы и переносят в хранилище для дальнейшего хранения, а обоймы используют многократно для выдержки и замораживания спермы.

Замораживание спермы быка в гранулах на поверхности твердой двуокиси углерода (сухого льда) или фторопластовой пластины

Для разбавления спермы быка применяют синтетическую ЛГЖ среду

ЛГЖ среда

Компоненты	Количество
Лактоза, г	11,5
Полиген, г	0,03-0,06
Глицерин, см3	5,0
Желток куриных яиц, см3	20
Вода дистиллированная, см3	100

Разбавление спермы быка проводится так же, как и при замораживании спермы в полипропиленовых соломинках.

При замораживании спермы быков в гранулах на фторопластовой пластине, охлажденной жидким азотом, необходимо иметь следующее оборудование:

- прямоугольную или цилиндрической формы теплоизолированную емкость размером примерно 30х40х30 см или широко-гордый цилиндрической формы сосуд Дьюара; фторопластовые пластины размерами 20х20х2 ем, 25х12,5х1,2 см или 25х25х2см с лунками на 0,2 см³;

- держатель пластины;

- контейнеры для сбора гранул;

- лопатки для съема гранул с пластины;

- канистры емкостью 100-200 см³ для хранения гранул в сосудах с жидким азотом;

- воронки для осыпания гранул в тубы или канистры, корнцанги и пинцеты;

- пластмассовые баллончики-капельницы или шприцы на 25-30 см.

Пластину с лунками опускают в жидкий азот и охлаждают в течение нескольких минут, до прекращения кипения азота. Охлажденную пластину держателем поднимают к верхнему краю сосуда, после испарения жидкого азота поверхность пластины протирают марлевым тампоном, а затем посредством градуированных пипеток, шприца или разливочной машины разливают сперму в лунки- Пластина в это время имеет температуру -160...170°С. Температуру пластины в процессе замораживания контролируют термопарой. Через несколько секунд после того, как в последней лунке сперма затвердеет, пластину опускают ближе к жидкому азоту и сперму замораживают на расстоянии 5-10 см от его поверхности в течение 1-2 минут. После этого пластину с гранулами погружают на 1 минуту в жидкий азот, где происходит дальнейшее охлаждение гранул до -19б°С и отделение их от пластины. Затем пластину поднимают из жидкого азота до верхнего уровня сосуда, собирают пластмассовым шпателем гранулы в охлажденную тубу или канистру и переносят в жидкий азот на хранение.

Для замораживания спермы быков в гранулах на поверхности твердой двуокиси углерода (сухом льду) блоки сухого льда распиливают на пластины толщиной 4-5 см и специальным прессом из нержавеющей стали делают лунки объемом 0,2 см³. Из шприца или пипетки сперму накапывают объемом 0,1-0,2 см³ непосредственно в лунки. После замораживания образовавшиеся гранулы ссыпают в тубы или стаканы.

Замораживание спермы барана

Методика ВНИИплем.

Для разбавления, замораживания и хранения спермы баранов-производителей применяется тлицерино-желточно-углеводно-

ГЖУК-трнис-буферная среда

Компоненты	Количество
Лактоза, г	8,4
Декстрин кукурузный, г	5,0
Ксилит, г	0,26
Трис-(оксиметил)-аминометан, г	0,105
Динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилон Б, хелатон - 3), г	0,135
Полиген, г	0,03-0,06
Глицерин, см3	6,0
Желток свежего куриного яйца, см3 или	20
сухой желток, г (ОСТ 49-181-81)	4,0
Вода дистиллированная, см3	100

Свежеприготовленная среда по физико-химическим и биологическим свойствам должна соответствовать требованиям и нормам, указанным в таблице 12-6.

Таблица 12.6

Требования к ГЖУК-трис-буферной среде

Показатели	Характеристика
Внешний вид	Однородная жидкость без осадка и механических примесей
Цвет и запах	Желто-серый, без запаха
Осмотическое давление среды без глицерина при температуре 00С, атм.	10+-0,5
pH при температуре 200С	6,8+-0,1
Стерильность	При посеве на питательные среды не должно быть роста микробов в течение 10 суток
Подвижность сперматозоидов после оттаивания, балл	4,0
Показатель абсолютной выживаемости сперматозоидов после разбавления ГЖУК-трис-буферной средой
не замороженная сперма	430
замороженно-оттаянная сперма	280
Количество сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением в дозе (не менее), млн.	60
Объем дозы, см3	0,2

Вещества, входящие в состав среды, обеспечивают изотоничность, оптимальный рН, буферность, стерильность. Среда повышает физиологическую резистентность сперматозоидов, устойчивость к холодовому шоку, предохраняет сперматозоиды от агглютинации, обладает криозащитными свойствами, повышает жизнеспособность сперматозоидов при охлаждении до температуры -196°С.

Для приготовления ГЖУК-трис-буферной среды в чистую, стерильную колбу согласно прописи вносят лактозу, декстрин, ксилит, трилон Б и трис-(оксиметил)-аминометан. Компоненты среды тщательно перемешивают и заливают горячей дистиллированной водой в необходимом объеме. Для растворения компонентов колбу помещают в водяную баню при температуре 100°С и постоянно перемешивают. После полного растворения компонентов колбу плотно закрывают фольгой или полиэтиленовой пленкой и стерилизуют кипячением в водяной бане в течение 30 минут. Затем среду охлаждают до 40°С, вносят в нее санирующий препарат в соответствии с наставлением по его применению, желток куриного яйца и глицерин. Приготовленная таким образом среда должна быть стерильной и использоваться в течение 4 часов при температуре хранения 24...28°С.

Для разбавления и замораживания используют свежую сперму баранов с подвижностьюне ниже 8 баллов и концентрацией не менее 2,5 млрд. сперматозоидов в 1 см³. Сперму разбавляют средой в соотношении 1:3 при концентрации сперматозоидов 2,4-4,0 млрд/см³ и 1:4 при концентрации свыше 4 млрд/см³.

Сперму производителей разбавляют средой одномоментно при температуре среды 26°С, осторожно разливают во флаконы или полиэтиленовые капельницы, закрывают пробками и помещают на 2,5 часа в холодильник с температурой 2...4°С.

Сперму замораживают в виде гранул на поверхности сухого льда или на охлажденной до -80...90°С фторопластовой пластине.

При замораживании на поверхности сухого льда сперму каплями по 0,2 см³ наносят в лунки с помощью стерильных градуированных пипеток или шприца. Через 5 минут после замораживания спермы гранулы ссыпают в емкость с жидким азотом, а затем собирают в тубы, которые переносят в хранилище.

Замораживание спермы на фторопластовой пластине проводят следующим образом. Предварительно пластину промывают дистиллированной водой, сушат и обеззараживают 96° спиртом. После этого её опускают в жидкий азот и выдерживают до прекращения кипения азота, затем поднимают и устанавливают с помощью штатива на уровне 5-10 см выше верхнего края щирокогорлого сосуда или ванны с теплоизолированными стенками. Поверхность пластины после испарения жидкого азота из лунок протирают сухим стерильным ватным тампоном, выдерживают 5-6 минут, а затем опускают и устанавливают на уровне верхнего края ванны с азотом, В лунки раскапывают стерильными пипетками или шприцем по 0,2 см спермы. Сразу после замораживания спермы пластину устанавливают на расстоянии 1,5-2,0 см от поверхности жидкого азота на 3 минуты и затем погружают на 1 минуту в жидкий азот, где происходит окончательное охлаждение гранул до -196°С и отделение их от пластины. После этого пластину вынимают из жидкого азота, гранулы собирают в емкости для хранения. На упаковку наносят номер серии, дату взятия спермы, номер и породу барана, количество гранул (доз).

Методика ВИЖа.

Для разбавления и замораживания спермы барана используются синтетические среды № 1, № 2 и № 3 (табл. 12.7).

Таблица 12.7

Состав синтетических сред

Компоненты	Среда №1	Среда №2	Среда №3
Сахароза, г	9,6	9,6	9,84
Комплексонат Na2Ca ЭДТА, г	0,66	0,66	0,84
Комплексонат Na2Zn ЭДТА, г	0,20	0,20	-
Комплексонат Na2Mg ЭДТА, г	0,20	0,20	-
ДТБК (ди-трет-бутил-крезол), г	-	-	0,05
Поилген, г	0,03-0,06	0,03-0,06	0,03-0,06
Глицерин, см3	5,0	5,0	5,0
Желток куриных яиц, см3	18,0	9,0	10,0
Липосомы	-	9,0	-
Вода дистиллированная, см3	100	100	100

Для замораживания используют сперму барана с подвижностью не ниже 8 баллов и концентрацией сперматозоидов не менее 2,5 млрд/см. После оценки сперму выдерживают при комнатной температуре 15 минут, (но не более 30 минут), разбавляют средой одномоментно в соотношении 1:2 при концентрации сперматозоидов 2,5-3 млрд/см³ и 1:3 при концентрации сперматозоидов 3 млрд/см и выше, среду с температурой 30°С добавляют в сперму по стенке спермоприемника. Одна доза оттаянной спермы должна содержать 60-80 млн. сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением.

Разбавленную сперму охлаждают в течение не более трех часов до 2...4°С. При этом должны быть приняты меры против холодового удара: закрытые флаконы либо полиэтиленовые капельницы с разбавленной спермой погружают по 3-4 штуки в стакан с 50 см³ воды, имеющей температуру 20...25°С, и помещают в холодильник. После выдержки разбавленной спермы в холодильнике перед замораживанием флаконы (капельницы) погружают в ледяную баню, а затем сперму раскапывают в лунки фторопластовой пластины.

Замораживание спермы на поверхности фторопластовой пластины проводят следующим образом:

- пластину предварительно тщательно промывают, ополаскивают дистиллированной водой, сушат и обеззараживают 96° этиловым спиртом;

- пластину погружают в жидкий азот и выдерживают до прекращения кипения азота, затем поднимают;

- после испарения азота из лунок поверхность пластины протирают сухим стерильным марлевым тампоном;

- пластину выдерживают при комнатной температуре 4-5 минут, а затем накапывают сперму в лунки по 0,2 см' с помощью градуированной стерильной пипетки, шприца, капельницы или разливочной машины.

После затвердевания спермы пластину на 2 минуты фиксируют на расстоянии 3-5 см над поверхностью жидкого азота, а затем погружают в жидкий азот на 1 минуту, где происходит дальнейшее охлаждение гранул до -196°С и отделение их от пластины. После этого пластину вынимают из жидкого азота и собирают гранулы в емкости для хранения спермы и переносят в сосуды Дьюара. На емкости наносят номер серии, дату взятия спермы, номер и породу барана, количество гранул (доз).

Для замораживания спермы барана на поверхности твердой двуокиси углерода охлажденную сперму раскапывают по 0,2 см³ в лунки на поверхности сухого льда. Через 5 минут после начала замораживания гранулы собирают и упаковывают для хранения (как описано выше).

Замороженную сперму барана хранят в хранилищах в закрывающихся канистрах сосудов Дьюара, заполненных жидким азотом.

Замораживание спермы козла

1. Для замораживания используют эякуляты, имеющие объем не менее 0,7 см³, концентрацию сперматозоидов не менее 2,4 млрд/см'', подвижность не менее 7 баллов.

2. Сперму разбавляют сахарозо-желточно-глицериновой средой с кальций-натриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты в соотношении 1:2 (табл. 12.8).

Таблица 12.8

Синтетическим кредадля замораживания спермы козла

Компоненты	Количество
Сахароза, г	10,0
Комплексонат Na2Ca ЭДТА, мг	200,0
Полиген, г	0,03-0,06
Глицерин, см3	7,0
Желток куриного яйца, см3	20
Дистиллированная вода, см3	100

3. После разбавления сперму выдерживают 3-4 часа при 2...5°С и затем замораживают в виде гранул на поверхности фторопластовой пластины. Фторопластовую пластину предварительно охлаждают а жидком азоте до прекращения кипения, затем поднимают, так, чтобы она находилась в парах азота. Дают ей в течение 4-5 минут нагреться до температуры -80°С. Поверхность пластины протирают марлевым тампоном, удаляя накопившийся иней, и накапывают в лунки по 0,2 см³ разбавленной и охлажденной спермы. Как только гранулы затвердеют, пластину опускают и закрепляют на высоте 3-5 см от поверхности жидкого азота и выдерживают в таком положении 2 минуты, а затем погружают в жидкий азот. После полного охлаждения пластину вынимают и собирают гранулы замороженной спермы в емкости для хранения.

Замораживание спермы хряка

1. Разбавление спермы хряка проводят в одной из синтетических сред для замораживания спермы хряка (технология ВИЖа) (табл. 12.9,12.10).

2. Среда должна иметь температуру 25...27°С или такую же температуру, как и сперма непосредственно перед разбавлением. Разбавляют сперму в соотношении 1:1, медленно добавляя среду и осторожно перемешивая, а затем помещают в холодильник на 4-6 часов.

3. Замораживание спермы хряка проводят одним из способов:

первый способ

Замораживание спермы проводят на фторопластовых пластинах, помещенных в теплоизолированную ванну, в которой поддерживается определенный уровень жидкого азота.

Уровень жидкого азота устанавливают на высоте нижней поверхности фторопластовых пластин, которые кладут на специальные выступы морозильной камеры после предварительного охлаждения в жидком азоте. Для достижения температуры -500.-.120°С пластины выдерживают в морозильной камере 1 минуту, затем в лунки фторопластовой пластины раскапывают по 0,25 см³ разбавленной спермы. После заполнения лунок пластину переносят в ванну с жидким азотом и охлаждают до прекращения кипения азота. Гранулы замороженной спермы снимают с поверхности пластины с помощью специальной лопаточки.

Таблица 12.9

Синтетическая среда для замораживания спермы хряка

Компоненты	Количество
Сахароза, г	60
Глюкоза медицинская безводная, г	16
Триаммоний цитрат, г	5
Трилон Б, хелатон - 3, г	8
Оксид кальция, г	0,6
Оксид магния, г	0,4
Гидроксид натрия, г	0,3
Гидроксид калия, г	0,1
Полиген, г	0,3-0,6
Глицерин, см3	40
Желток куриных яиц, см3	50
Вода дистиллированная, см3	1000

Таблица

Компоненты	Количество
Лактоза, г	84
Глюкоза медицинская безводная, г	6
Трилон Б, хелатон - 3, г	4
Триаммоний цитрат, г	2
Трис-(оксиметил)-аминометан, г	0,6
Полиген, г	0,3-0,6
Глицерин, см3	50
Желток куриных яиц, см3	50
Вода дистиллированная, см3	1000

второй способ

Замораживание спермы хряка проводят в модернизированном морозильном агрегате Н.П. Юшенко. Устройство представляет собой теплоизолированную камеру для жидкого азота, в которой установлена вращающаяся на оси шестигранная призма, гранями которой являются фторопластовые пластины с лунками.

В каждую лунку накапывают 0,25 см разбавленной спермы. После заполнения лунок пластину выдерживают две-три минуты в горизонтальном положении, затем призму поворачивают на 60°. После того, как пластина с гранулами пройдет через жидкий азот, гранулы замороженной спермы помещают в контейнер и переносят в жидкий азот на хранение.

Для разлива спермы используют аппарат А.Д. Шилова или специальный дозатор.

4. На контейнер со спермой крепят бирку с номером хряка, датой замораживания, серией и другими необходимыми данными.

5. Замороженная сперма хряка по билогическим и санитарным показателям должна соответствовать требованиям, указанным в таблице (ОСТ 10-19-203-99).

Таблица

Биологические и санитарные показатели замороженной спермы у хряка

Показатели	Характеристика после
	разбавления	замораживания
Внешний вид	Однородная жидкость без посторонних примесей
Цвет	Молочно-белый
Подвижность сперматозоидов, баллы, не ниже	7,0	3,5
Выживаемость при 16...200С хранения:
абсолютная выживаемость, не менее	700	-
выживаемость, час, не менее	120	-
Выживаемость при 38+-0,50С хранения:
абсолютная выживаемость, не менее	-	10
выживаемость, час, не менее	-	4
Количество сперматозоидов с интактной акросомой, %, не менее	85	50
Общее количество непатогенных микробных тел в см3, не более	1000	1000
Коли-литр	0,1	0,1
Патогенные и условно-патогенные бактерии и грибы	Не допускаются

Замораживание спермы жеребца

1. Сперму жеребцов-производителей замораживают в соответствии с требованиями стандарта (ГОСТ-24168 «Сперма жеребцов замороженная») в алюминиевых пакетах или в виде гранул.

Сперму жеребцов разбавляют синтетической ЛХЦЖ средой в соотношении 1:3, с подвижностью сперматозоидов не ниже 6 баллов и концентрацией 150 млн/см³

Состав ЛХЦЖ среды для замораживании спермы жеребца

Компоненты	Количество
Лактоза, г	11,0
Натрий двууглекислый, мг	8
Натрий лимоннокислый трехзамещенный, мг	89
Двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилон Б, хелатон - 3), мг	100
Полиген, г	0,03-0,06
Глицерин, см3	3,5
Желток курных яиц, см3	1,6-2,0
Вода дистиллированная свежекипяченая и остуженная до 300С, см3	100

Разбавленную сперму выдерживают в холодильнике 2 часа и замораживают на поверхности сухого льда или в алюминиевых пакетах в парах жидкого азота.

Для замораживания спермы применяют широкогорлые сосуды Дьюара или стационарные хранилища и замораживающее устройство, позволяющее держать сперму на заданном расстоянии (20 мм) над поверхностью жидкого азота. Замораживающее устройство состоит из пенопластового поплавка, съемного держателя (металлическое сито), в который помещают емкости (пакеты) со спермой, металлического кольца (испарителя), предназначенного для увеличения интенсивности испарения азота.

Стандартная методика замораживания спермы жеребца

После оценки по подвижности и концентрации сперму разбавляют средой ЛХЦЖ с глицерином в соотношении 1:3. Разбавленную сперму выдерживают (в холодильнике или термосе со льдом) в течение 2 часов при температуре 2...4°С, после чего замораживают в виде гранул на поверхности сухого льда либо в алюминиевых пакетах в парах жидкого азота.

При замораживании в виде гранул сперму наносят каплями при помощи стерильной пипетки или шприца по 0,2 см в лунки на поверхности сухого льда. Через 5 минут после замораживания гранулы собирают и упаковывают в алюминиевые тубы по 125-130 гранул (одна доза - 25 см³) и помещают на хранение в жидкий азот.

При замораживании над поверхностью жидкого азота сперму разливают по 20-25 см³ в охлажденные алюминиевые пакеты. Для изготовления пакета у стандартной тубы (алюминий марки А-7) отрезают торцовую часть с пробкой и один конец полученной таким образом трубки закатывают дважды. Заполненный спермой пакет закрывают, дважды закатывая другой конец трубки. При заполнении пакета спермой необходимо следить за тем, чтобы в нем не оставался воздух, иначе при оттаивании неизбежны его разрывы.

После выдержки в течение 2 часов при 2...4°С заполненные спермой пакеты помещают в замораживающее устройство, переносят в контейнер с жидким азотом и закрывают крышкой. После 5 минут выдержки в контейнере пакеты с замороженной спермой переносят в жидкий азот на хранение.

На алюминиевых пакетах, предназначенных для хранения, указывают кличку жеребца, породу, дату замораживания, серию и фамилию исполнителя.

Замораживание спермы жеребца в малых объемах (5-6 см³) с предварительным центрифугированием.

Концентрация сперматозоидов в свежеполученной сперме должна быть не ниже 200 млн/см³. Эякулят помещают в бактерицидную камеру при температуре 25...30°С и выдерживают в течение 1 часа.

После инкубации сперму центрифугируют а течение 10-15 минут при 1500 об/мин. После центрифугировании удаляют 50-60% плазмы так, чтобы в оставшейся части спермы концентрация сперматозоидов составляла 500-600 млн/см³ и разбавляют средой ЛХЦЖ без глицерина в соотношении 1:3.

Разбавленную сперму разливают в большие пакеты, плотно закрывают, чтобы обеспечить анаэробные условия, и помещают в камеру при температуре 14...16°С на 1 час. Затем пакеты со спермой переносят в холодильную камеру с температурой 2...4°С на 1 час.

После этого сперму сливают в охлажденную мензурку и вводят глицерин из такого расчета, чтобы конечная его концентрация составляла 2,3 съемных процента. Сперму вторично расфасовывают в алюминиевые пакеты по 5-6 см, укладывают в ледяную баню при температуре 0°С и выдерживают 25-30 минут. Затем, вытерев насухо стерильным полотенцем, пакеты помещают в замораживающее устройство и замораживают так же. как и по стандартной методике.

Замораживание спермы жеребца в малых объемах (5 см³ с применением диализа).

Свежеполученную сперму фильтруют, измеряют объем и переносят в диализатор. В качестве мембраны используют сидратцеллюлозную пленку ОБ-20 или пленку типа "купрофан". Пленку закрепляют резиновым кольцом на цилиндре так, чтобы она свисала мешочком, образуя внутреннюю камеру, куда помещается свежевзятая сперма. Камеру со спермой опускают в сосуд с диализным раствором, в качестве которого используют среду ЛХЦЖ в соотношении 1:4. Желток вводят непосредственно в сперму в количестве 3 см³ или 2 г на 100 мл, предварительно растворив в равном объеме 11 % раствора лактозы.

Диализ длится 4 часа, из них 2 часа при комнатной температуре (18...20°С) и 2 часа при температуре 2...4°С. В течение этого времени диализатор необходимо периодически встряхивать, чтобы диффузия веществ шла быстрее. Затем сперму из диализатора разливают по 5 см³ в подготовленные алюминиевые пакеты и замораживают по стандартной методике.

Перед осеменением сгущенную с помощью центрифугирования или диализа сперму необходимо разбавить. Для этого к 5-6 см спермы добавляют молоко до 20-25 см³. Полученное от клинически здоровых, благополучных по инфекционным болезням кобыл молоко процеживают, доводят до кипения и охлаждают. Температура спермы после разбавления должна быть 37°С.

Оттаивание и разбавление криокоисервированной спермы проводят непосредственно перед осеменением.

3.Замороженная сперма после оттаивания должна соответствовать требованиям и нормам, указанным в таблице Использование замороженной спермы жеребца для искусственного осеменения кобыл разрешается не ранее, чем через 30 дней после замораживания и при наличии сертификата, подтверждающего ее качество.

Таблица

Показатели качества спермы жеребца после оттаивания

Показатель	Характеристика
Внешний вид, цвет, запах	Однородная жидкость светло-серого цвета, без хлопьев, крови и гноя
Концентрация сперматозоидов, млн./см3, не менее	35
Концентрация сперматозоидов с аномальной морфологией, %, не более	20
Подвижность сперматозоидов, баллов, не ниже	2,5
Абсолютная выживаемость сперматозоидов при2...40С, не менее	130
Выживаемость, час, не менее	96
Коэффициент осмотической (физиологической) резистентности, не ниже	0,8
Общее количество бактерий в 1 см3, не более	500
Коли-литр, менее	0,9
Патогенные и условно-патогенные микроорганизмы	Не допускается

Оценка качества спермы ( общие показатели)

Каждый полученный эякулят предварительно оценивают визуально, устанавливая при этом, нет ли в сперме примеси гноя, крови, мочи или хлопьев (наличие последних указывает на воспалительный процесс в придаточных половых железах). Сперма с такими примесями к использованию не допускается.

После предварительной оценки измеряют объем эякулята и определяют концентрацию и подвижность сперматозоидов.

Объем эякулята быка и барана измеряют посредством смесителя, градуированного спермоприемника, пробирки или пипетки, а объем эякулята жеребцаи хряка - мензуркой.

Объем эякулята в одноразовом полиэтиленовом спермоприемнике можно определять взвешиванием на точных весах типа ВЛК-20, ВЛК-500 или Р-2-200, зная заранее стандартную массу отсоединенной части спермоприемника (1 г спермы соответствует 1 см³).

Для оценки спермы по подвижности применяют микроскоп с нагревательным столиком (столик Морозова или столик Пакенаса), который позволяет автоматически поддерживать температуру 38...40°С. Для оценки подвижности сперматозоидов на предметное стекло, лежащее на нагревательном столике, наносят каплю спермы и каплю 2,9% раствора цитрата натрия, смешивают, накрывают покровным стеклом и оценивают при увеличении микроскопа в 120-200 раз.

Для качественной оценки необходимо правильно настроить освещение поля зрения микроскопа (приложение 7).

Подвижность сперматозоидов определяют по 10-балльной шкале в нескольких полях зрения. Высшую оценку (10 баллов) получает сперма, в которой практически все (100%) сперматозоиды имеют прямолинейно-поступательное движение (ППД). При оценке 9 баллов примерно 9 сперматозоидов из каждых 10 (то есть 90%) имеют ППД и т.д. Другие виды движения сперматозоидов (манежное, колебательное) при оценке спермы по балльной системе не учитывают.

В зависимости от концентрации сперматозоидов неразбавленная сперма имеет следующие оценки: густая (Г), средняя (С) и редкая (Р).

Сперма густая. Густая сперма быка содержит сперматозоидов свыше 1 млрд/см³, барана - 2 млрд/ см, хряка - 0,2 млрд/ см³, жеребца - 0,25 млрд/ см³.

Сперма средняя. Средняя сперма быка содержит сперматозоидов от 0,7 до 1 млрд/см³, барана от 1 до 2 млрд/ см, хряка от 0,1 до 0,2 млрд/ см³, жеребца от 0,15 до 0,25 млрд/ см³.

Сперма редкая. Редкая сперма быка содержит сперматозоидов менее 0.7 млрд/ см, барана менее 1 млрд/ см³, хряка менее 0,1 млрд/ см, жеребцаменее 0,15 млрд/ см.

К использованию допускается сперма быков, баранов, хряков и.жеребцов с оценкой густая и средняя.

Густоту спермы и подвижность обозначают двумя знаками, Например, Г-9, что означает сперма густая, имеет 90% подвижных, с прямолинейно-поступательным движением сперматозоидов.

Концентрацию сперматозоидов определяют при помощи счетных камер, фотоэлектроколориметра и оптических стандартов (приложение 8).

При снижении качественных показателей спермы у отдельных производителей подсчитывают патологические формы сперматозоидов, определяют рН, физиологическую резистентность и интенсивность окислительно-восстановительных процессов по существующим методикам.

При хранении спермы при плюсовых температурах для биологического контроля оставляют от каждого разбавленного эякулята быка 0,5-1 см³, барана - до 0,5 см³, хряка - 10 см³, жеребца 3-5 см³ и исследуют в течение 3 дней. Результаты оценки записывают в лабораторный журнал.

Оттаивание и оценка спермы быка

Оттаивание и оценка спермы быка, замороженной в соломинках

трансплантация эмбрион донор сперма

Сперму в соломинках оттаивают в водяной бане при температуре 38...40°С в течение 10-11 секунд. Соломинку обтирают марлевой салфеткой и, держа за конец, встряхивают, чтобы воздушный пузырек опустился к пробке. Острыми ножницами отрезают пробку с одного конца соломинки, опускают во флакон или ампулу с 1 см³ 2,9% раствора натрия цитрата нейтрализованного, отрезают вто...