Експериментальне обґрунтування та удосконалення методів трансплантації і кріоконсервації ембріонів великої рогатої худоби

Зміни концентрації естрадіолу-17 у плазмі крові телиць обох груп характеризувалися вірогідним зменшенням на 3-й день та значним зростанням (на 16,4-51,5 %; p<0,05) на 7-й день статевого циклу. Однак, на 3-й день статевого циклу концентрація естрадіолу-17 у плазмі крові телиць дослідної групи нижча на 65,2 % (р<0,05), а на 7-й день циклу -- на 26,5 % (р<0,05), порівняно з тваринами контрольної групи.

Суттєві розбіжності спостерігалися і за гістологічними показниками тканин статевих органів телиць-реципієнтів у динаміці перебігу статевого циклу. Так, на третій день статевого циклу у телиць дослідної групи кількість маткових залоз на 25,3 % (р<0,05), висота епітелію ендометрію -- на 8,2 % більша, порівняно з тваринами контрольної групи.

Дослідженнями тканин яєчників на 3-й день статевого циклу встановлено зростання вмісту вільних SН-груп у телиць дослідної групи на 40,7 % (р0,05), концентрації глікогену -- 29,6 % (р0,05), каротину -- на 52,3 % (р0,05), порівняно з тваринами контрольної групи. Вміст фосфору РНК у яєчниках реципієнтів дослідної групи також був на 22,8 % вищим, ніж у контролі.

Таку ж відмінність виявили на 7-й день статевого циклу. Зокрема, вміст вільних сульфгідрильних груп, глікогену, каротину та фосфору РНК в яєчниках дослідних телиць був, відповідно на 32,6, 31,9, 51,3 і 35,8 % (р<0,05) більший, ніж у тварин контрольної групи. Аналогічними були результати біохімічних досліджень стінки матки піддослідних тварин.

Таким чином, під впливом інґєкції БАР проходить інтенсифікація обмінних процесів у статевих органах телиць-реципієнтів, яка проявляється підвищенням рівня окремих біохімічних показників стінки матки і яєчників, а також гістологічних показників ендометрію та гормонального профілю крові. Синергізм компонентів комплексу БАР проявляється у тому, що поєднання вододисперсної форми вітамінів А, D3, E з імуномодулюючим препаратом та Гн-РГ гормоном за рахунок ДМСО швидко скеровує їх в органи-мішені і проявляє стимулюючу дію на яєчники та матку телиць-реципієнтів. Формування жовтого тіла в яєчниках телиць та інтенсивні обмінні процеси в матці під впливом ін'єкції БАР забезпечили високий рівень приживлення трансплантованих ембріонів.

Дослідження з посилення ембріонально-маткового сигналу трансплантацією деконсервованих ембріонів з бластомерами дегенерованих бластоцист встановлено вищу приживлюваність ембріонів на 12,9 %. Очевидно, пересадження ембріонів з бластомерами бластоцист збільшує масу ембріонів, а відповідно і лютеотропний сигнал і стимулюють виділення імуносупресорів материнським організмом (Кауфольд М. зі співавт., 1990). Це підтверджується зміною концентрації стероїдних гормонів у плазмі крові піддослідних тварин у динаміці з 7-го по 17-й дні синхронізованого статевого циклу. Так, якщо на 7-й день статевого циклу або в день трансплантації ембріонів рівень прогестерону в крові тварин контрольної і дослідної груп був майже однаковим, то на 13-й день циклу концентрація гормону у дослідних реципієнтів була вищою на 25,3 % (p<0,05), ніж у телиць контрольної групи. Така ж тенденція збереглася і на 17-й день статевого циклу -- концентрація прогестерону в крові тварин дослідної групи була вищою на 28,3 % (p<0,05), порівняно з контрольними реципієнтами.

Збільшення критичної маси ембріона за рахунок введення трофобластичних клітин посилює лютеотропний сигнал в ендометрії, який стимулює виділення жовтим тілом яєчника прогестерону. При цьому концентрація естрадіолу знижується: на 13-й день статевого циклу на 14,9 % (p<0,05), а на 17-й день -- на 9,5 %.

Аналізуючи результати електрофорезу білків ендометрію телиць-реципієнтів, слід відзначити, що у тварин контрольної і дослідної груп на 13-й і 17-й дні синхронізованого статевого циклу виявлено білки з молекулярною масою 45-50 кДа, що приблизно відповідає білку - маркеру альбуміну курячого яйця, та 66-70 кДа -- альбуміну сироватки крові бугая. Наявність вказаних білків свідчить про характерні зміни в ендометрії при нідації ембріона та початку його імплантації, що відповідає вказаній стадії розвитку зародка і узгоджується з даними Дж. Батлера зі співавт. (1982).

Крім того, на електрофореграмах виявлено значно більші кількості вказаних білків у тварин дослідної групи. Це, очевидно, пов'язано з тим, що під впливом збільшення критичної маси ембріона через посилення лютеотропного сигналу матки зростає концентрація прогестерону, який стимулює проліферативні процеси в ендометрії з виділенням білків із вказаною молекулярною масою. Роль цих білків до кінця не з'ясована, але існують гіпотези про їх імунодепресивні властивості (Mansouri-Attia N. Et al., 2009).

Дослідженнями ефективності застосування седативних препаратів та міорелаксантів встановлено найнижчий рівень приживлення ембріонів при використанні сакральної епідуральної анестезії -- 35,0 %, а найвищий -- при комбінації парасакральної блокади тазового нервового сплетіння з препаратом “Седазин” (56,3 %).

Високий рівень приживлення ембріонів спостерігався і при комплексному застосуванні парасакральної блокади з матковим релаксантом “Ханегіф” -- 55,0 %. Використання інших комбінацій препаратів було менш успішним і становило у тварин 1, 2 і 4 дослідних груп 50,0, 52,6 та 47,4 %, однак, вище, відповідно, на 15,0, 17,6 і 12,4 %, ніж у телиць-реципієнтів контрольної групи.

Застосування досліджуваних препаратів викликало зміни вмісту окремих біохімічних показників крові телиць-реципієнтів. Нижчий рівень глюкози спостерігався у крові реципієнтів 2 і 3 дослідних, відповідно, на 18,3 і 16,1 %, а у 4 і 5 дослідних груп -- на 29,8 і 24,4 % (р<0,05), порівняно з тваринами контрольної групи (табл. 8). Це вказує на те, що поєднання сакральної і парасакральної анестезії з матковим релаксантом “Ханегіф” та седативним препаратом “Седазин” запобігають виникненню і розвитку стресу, викликаного проведенням маніпуляцій з підготовки реципієнтів та трансплантації ембріонів.

Таблиця 8

Біохімічні показники крові телиць-реципієнтів при застосуванні різних міорелаксантів та седативних засобів, Mm, n=10

Примітки. 1) К -- контрольна і 1, 2, 3, 4, 5 Д -- дослідні групи; 2) СЕА -- сакральна епідуральна анестезія; ПСБ -- парасакральна блокада; Х -- ханегіф; С -- седазин.

Одержані результати підтверджуються і дослідженнями кортизолу, концентрація якого була нижчою у крові тварин дослідних груп: 2-ї на 15,6 % (р<0,05), 3-ї -- на 17,9 % (р<0,01), 4-ї -- на 45,5 % (р<0,01) і 5-ї -- на 43,7 % (р<0,001).

Вміст загального холестеролу у телиць 2 і 3 дослідних груп був, відповідно, на 25,4 і 21,6 % більший (р<0,05), порівняно з тваринами контрольної групи. Це свідчить про те, що під впливом міорелаксанту “Ханегіф” знижується моторика матки і, як наслідок, пригнічується активність простагландинів -- антагоністів прогестерону, попередником якого є холестерол.

У крові реципієнтів 4 і 5 дослідних груп рівень загального холестеролу зростає не так виражено -- всього на 8,5 та 13,6 % порівняно з контролем. Очевидно, що седативний препарат “Седазин” та епідуральна анестезія, викликаючи пригнічення організму та органів тазової порожнини, повністю не знімають тонусу матки. Синергічна дія сакральної і парасакральної анестезії у поєднанні з міорелаксантом “Ханегіф” та седативним препаратом “Седазин” проявляється зростанням активності каталази у крові телиць-реципієнтв (2, 3, 4 і 5 дослідних груп відповідно на 13,2 % (р<0,05), 8,2 %, 26,1 % (р<0,05) і 28,3 % (р<0,01) порівняно з тваринами контрольної групи.

Оскільки стрес викликає значну активацію перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ), застосування досліджуваних нейролептиків і міорелаксантів у поєднанні з блокадою тазового нервового сплетіння (яке є загальноприйнятим у ембріотрансплантації) дозволяє запобігти розвитку стресових явищ і знизити утворення продуктів ПОЛ. Так, у крові телиць 2, 3, 4, і 5 дослідних груп вміст ТБК-активних продуктів був вірогідно нижчий, відповідно на 15,4, 18,5, 24,6 і 27,7 % (р<0,01), порівняно з тваринами контрольної групи. Аналогічно, вміст гідроперекисів ліпідів у крові реципієнтів 2 і 3 дослідних груп менший, відповідно, на 20,5 і 19,4 % (р<0,05), а 3 і 4 дослідних груп -- на 31,9 і 30,4 % (р<0,01), ніж у тварин контрольної групи.

Застосування маткового релаксанту “Ханегіф” у поєднанні з двома видами анестезії значно підвищує ефективність трансплантації ембріонів і є економічно обґрунтованим. Комбінація сакральної епідуральної та парасакральної анестезії з нейролептиком “Седазин” також підвищує приживлення ембріонів та за рахунок останнього виключає трудові затрати, пов'язані з фіксацією тварин.

Використання розроблених нами чинників (ін'єкція БАР, корекція мінерального живлення, підсадження бластомерів дегенерованих бластоцист) у телиць-реципієнтів підвищує приживлюваність in vitro отриманих ембріонів на 9,1-17,4 % і наближує її до рівня приживлення нативних ембріонів (табл. 9).

Таблиця 9 Приживлення in vitro отриманих ембріонів та концентрація стероїдних гормонів плазми крові телиць-реципієнтів при використанні БАР

Концентрація стероїдних гормонів у крові телиць-реципієнтів на 7-й день синхронізованого статевого циклу підтверджує позитивну дію досліджуваних БАР на органи розмноження, що виражається у підвищенні приживлюваності ембріонів, отриманих in vitro. Так, рівень прогестерону у крові телиць 1 і 2 дослідних груп вищий відповідно на 54,9 % (p<0,01) та 29,9 % (p<0,05), ніж у тварин контрольної групи. У 1 дослідній групі підвищення концентрації прогестерону викликається введенням сурфагону у складі комплексу БАР, який стимулює виділення лютеїнізуючого гормону, котрий у свою чергу посилює секрецію прогестерону і знижує рівень естрадіолу на 20,3 % (p<0,05).

Зростання рівня прогестерону у крові тварин 2 дослідної групи, очевидно, пов'язане з додатковим синтезом стероїдних гормонів під впливом вітамінів та мікроелементів, що поступали в організм реципієнтів з преміксом.

Таким чином, приживлюваність трансплантованих ембріонів, одержаних in vitro, при застосуванні комплексу БАР, згодовуванні вітамінно-мінерального преміксу, введенні бластомерів дегенерованих ембріонів підвищується аналогічно, як при пересадці нативних та деконсервованих ембріонів.

Розрахунком економічної ефективності обґрунтовано доцільність застосування досліджуваних чинників для збільшення виходу морфологічно якісних ембріонів від корів-донорів та підвищення приживлення трансплантованих ембріонів у телиць-реципієнтів. Зокрема, при застосуванні комплексу ліпосома-ФСГ для індукції поліовуляції у корів-донорів собівартість ембріона зменшується на 52,0 грн або 13,9 %, а при використанні комплексу БАР зі спермою бугаїв при осіменінні донорів -- відповідно, на 48,3 грн або 12,8 %.

Застосування мембраностабілізуючих речовин (холестерол, лінолева кислота, інсолвіт) при надшвидкому заморожуванні знизило собівартість приживленого ембріона, відповідно, на 8,7, 11,5 і 30,0 %, що у грошовому еквіваленті становить 122,0, 162 і 480 грн.

Згодовування телицям-реципієнтам дефіцитних мікроелементів знизило собівартість приживленого ембріона на 14,2-18,8 %, а ін'єкція комплексу БАР -- на 24,7 %, або 347 грн.

Найбільший економічний ефект отримано при застосуванні міорелаксантів та седативних препаратів телицям-реципієнтам. Використання сакральної епідуральної анестезії або парасакральної блокади тазового нервового сплетіння у поєднанні з міорелаксантом “Ханегіф” та седативним препаратом “Седазин” знизило собівартість приживленого ембріона на 24,1-36,2 %. Найнижча собівартість приживленого ембріона становила 1100,0 грн.

Ін'єкція БАР, корекція мінерального живлення, підсадження бластомерів дегенерованих бластоцист при трансплантації ембріонів, отриманих in vitro, знизили собівартість приживленого ембріона, відповідно, на 25,4, 28,9 і 19,3 %.

Висновки

У дисертації теоретично і експериментально обґрунтовано, розроблено та удосконалено основні технологічні елементи трансплантації ембріонів: добір корів-донорів і телиць-реципієнтів, стимуляцію поліовуляції і штучне осіменіння донорів, нехірургічну трансплантацію ембріонів реципієнтам та надшвидкий метод кріоконсервування ембріонів.

1. Внутрішньошкірне введення стероїдних гормонів (прогестерону, естрадіолу-дипропіонату і фолікуліну) є важливим діагностичним тестом для виявлення патології яєчників у корів і телиць з метою підвищення ефективності відбору потенційних донорів і реципієнтів. Результати внутрішньошкірних проб (потовщення шкіри, гіперемія, свербіння) відповідають окремим патологіям яєчників і корелюють з концентрацією стероїдних гормонів у крові піддослідних корів і телиць. При персистентному жовтому тілі спостерігається високий рівень прогестерону (7,6±1,2 нг/мл) на фоні низького рівня естрогенів. Лютеїнові кісти супроводжуються аналогічними співвідношеннями досліджуваних гормонів, однак, концентрація прогестерону вища на 60,5-82,4 %, естрадіолу -- на 47,8-52,4 % та естрону -- у 2-2,2 раза.

2. Дворазова ін'єкція препаратів ФСГ (Фолікотропін, ФСГ-п, ФСГ-супер) у складі ліпосомальної емульсії викликає множинну овуляцію у корів-донорів та забезпечує плавне проходження інволюційних процесів у статевих органах, що виражається в одержанні стабільних результатів ембріопродукції (понад чотири доброякісних ембріони) протягом усього періоду використання постійних донорів. Зменшення дози «Фолікотропіну» на 20,0 % і 30,0 % у складі ліпосомальної емульсії знижує кількість доброякісних ембріонів у корів-донорів відповідно на 60,0 % (p<0,01) та у 2 рази (p<0,001). Аналогічно зменшення дози «ФСГ-супер» у складі ліпосомальної емульсії знижує показники ембріопродукції у корів-донорів. Комплекс ліпосома-ФСГ проявляє поліовулюючу дію як при максимальній (50 мг), так і при мінімальній (32 мг) дозах ФСГ-п.

3. Встановлено суттєві відмінності фізіологічних і біохімічних показників нативної сперми залежно від сезону року. Виявлено істотну позитивну кореляцію у зимовий період між концентрацією сперміїв і вмістом гемоглобіну у крові (r=0,68), між активністю сперміїв і кількістю еритроцитів (r=0,74), відмічено зворотний зв'язок між концентрацією сперміїв і вмістом фруктози у спермі. Еякуляти бугаїв з високою активністю окисних ферментів (СДГ і ЦО) характеризуються високою запліднювальною здатністю суперовульованих корів-донорів.

4. Додавання комплексу біологічно активних речовин (унітіол, інозин, естрофан, глутатіон L-цистеїн) до деконсервованої сперми бугаїв-плідників продовжує її життєздатність на одну годину при зростанні активності майже удвічі (p<0,01). За умов інкубації in vitro збільшується абсолютний показник виживання сперміїв на 2 одиниці (p<0,05), кількість живих сперміїв (p<0,05) та зменшується відсоток їх патологічних форм (p<0,01).

5. Введення комплексу БАР у статеві шляхи корів із спермою бугаїв підвищує відсоток запліднення від першого осіменіння на 11,8 %, кількість позитивних осіменінь на 11,1 %, зменшує індекс осіменіння з 1,8 до 1,5, а кількість спермодоз на одне осіменіння з 3,2 до 2,5. Встановлено вірогідне (p<0,05) зростання вмісту загального холестеролу, вільних сульфгідрильних груп, імуноглобулінів та концентрації прогестерону у дослідних корів.

6. Осіменіння корів-донорів спермою бугаїв-плідників з комплексом БАР підвищує кількість доброякісних ембріонів на 15,5-19,0 %, у тому числі відмінної якості -- на 13,3-17,2 %, зменшує частку незапліднених яйцеклітин на 30-40 % за однакової кількості дегенерованих ембріонів.

7. Введення мембраностабілізуючих речовин (інсолвіт, лінолева кислота, лінолеат та олеат холестеролу) у вітрифікаційні середовища для заморожування ембріонів мишей та великої рогатої худоби надшвидким методом значно знижує кількість морфологічно пошкоджених репродуктивних клітин після їх деконсервування, що зумовлює їх краще збереження (до 90 %) при дії низьких температур та підвищує приживлюваність трансплантованих ембріонів корів на 7,2-17,0 %.

8. Компенсація дефіцитних мікроелементів у раціонах (Купрум, Цинк, Селен, Кобальт, Йод) телицям-реципієнтам вірогідно збільшує їх концентрацію у крові та шерсті (p<0,05-0,01), підвищує активність глутатіонпероксидази, супероксиддисмутази, лужної фосфатази (p<0,05), які є інтегральними показниками позитивної дії, відповідно, Селену, Купруму та Цинку, а також підвищує приживлюваність трансплантованих ембріонів на 8,3-12,7 %.

9. Внутрішньом'язова ін'єкція БАР (сурфагон, інсолвіт, імукор, ДМСО) телицям-реципієнтам в 0-й день статевого циклу посилює інтенсивність обмінних процесів у статевих органах телиць, що проявляється вірогідним зростанням окремих біохімічних (глікоген, вільні сульфгідрильні групи, каротин) та гістологічних (кількість маткових залоз, висота епітелію маткових залоз та ендометрію) показників яєчників і матки (p<0,05-0,001). Збільшує кількість тварин з функціонуючим жовтим тілом на 22,5 %, підвищує приживлення трансплантованих ембріонів на 15,6 %.

10. При трансплантації деконсервованих ембріонів з додатковим введенням бластомерів дегенерованих бластоцист посилюється ембріонально-матковий сигнал, що підтверджується збільшенням кількості білків ендометрію з молекулярною масою 45-50 кДа та 66-70 кДа, вірогідним зростанням концентрації прогестерону в крові (p<0,05) та підвищенням рівня приживлення у телиць-реципієнтів на 12,9 %.

11. Комплексні застосування телицям-реципієнтам сакральної епідуральної та парасакральної анестезії у поєднанні з міорелаксантом “Ханегіф” та нейролептиком “Седазин” нормалізує в крові інтенсивність перекисного окиснення ліпідів та вірогідно знижує вміст основних продуктів ПОЛ: ТБК-активних продуктів і гідроперекисів ліпідів (р<0,05 - 0,01). Також знижується концентрація в крові кортизолу (р<0,05 - 0,001), вміст глюкози (р<0,05), як основних інтегральних показників стресу, що сприяє підвищенню приживлюваності трансплантованих ембріонів на 12,4-21,3 %.

12. Застосування телицям-реципієнтам біологічно активних речовин (ін'єкція сурфагону, інсолвіту, імукору, димексиду), згодовування вітамінно-мінерального преміксу; трансплантація з ембріонами додаткових бластомерів) підвищує приживлюваність деконсервованих ембріонів, одержаних in vitro, на 9,1-18,9 %. Це підтверджується вірогідним підвищенням концентрації прогестерону (p<0,05-0,01), що свідчить про посилення лютеотропної дії.

Пропозиції виробництву

1. При доборі корів та телиць для використання їх як потенційних донорів і реципієнтів доцільно проводити алергічні проби на стероїдні гормони. Для цього внутрішньошкірно, у верхній третині шиї, одноразово, окремо вводити: 1 % розчин прогестерону, 0,1 % розчин естрадіолу-дипропіонату і 0,05 % розчин естрону (фолікуліну) по 0,02 мл. Через 25 хвилин клінічно обстежити місцеву реакцію на введення гормонів. Слід відбирати тварин з позитивною реакцією на прогестерон і негативною на естрадіол та фолікулін, що відповідає наявності жовтого тіла в яєчнику. (Патент на корисну модель №41798 від 10.06.2009).

2. Для отримання стабільних результатів ембріопродуктивності та зменшення стресових навантажень на корів-донорів індукувати множинну овуляцію фолікулостимулюючими гормонами (Фолікотропін, ФСГ-п, ФСГ-супер) у складі ліпосомальної емульсії (тривіт -- 4 мл, лецитин -- 1 мл, твін -- 0,2 мл, ДМСО -- до 10 % концентрації) дворазовою ін'єкцією на 8-й і 10-й дні синхронізованого статевого циклу. При осіменінні донорів з метою підвищення заплідненості, збільшення кількості та якості ембріонів необхідно до розмороженої сперми бугаїв додавати комплекс БАР (естрофан -- 12,5 мкг/мл, інозин -- 0,05 мг/мл, унітіол -- 1 мг/мл, глутатіон -- 0,5 мМ, L-цистеїн -- 0,5 мМ). (Патент на корисну модель №46282 від 10.12.2009).

3. Для забезпечення високого і стабільного рівня приживлення трансплантованих ембріонів в умовах Західної біогеохімічної провінції необхідно проводити балансування раціонів телиць-реципієнтів за дефіцитними мікроелементами (Купрум, Цинк, Йод, Кобальт, Манган, Селен). Мікроелементи у вигляді солей доцільно включати в комбікорми у дозах (мг): цинку сульфат -- 490-690, мангану сульфат -- 110-290, купруму сульфат -- 120-140, кобальту хлорид -- 16-17, натрію селеніт -- 2-3, калію йодид -- 1-2 і згодовувати впродовж 45 днів перед трансплантацією ембріонів.

4. Для підвищення приживлюваності нативних, деконсервованих та in vitro одержаних ембріонів під час індукованої статевої охоти телицям-реципієнтам доцільно ін'єктувати комплекс БАР, який включає: синтетичний аналог Гн-РГ (сурфагон) -- 5 мл, вододисперсний препарат вітамінів А, D3, E (інсолвіт) -- 5 мл, імуностимулятор (імукор) -- 1 г, ДМСО -- 10% від загальної кількості розчину, а перед нехірургічною пересадкою телицям-реципієнтам проводити парасакральну анестезію (150 мл 0,7 % розчину новокаїну) у комбінації з седативним препаратом «Седазин» (0,1 мл на 100 кг маси) чи матковим релаксантом «Ханегіф» (10-20 мл), або сакральну епідуральну анестезію (5 мл 2% розчину новокаїну) в поєднанні з матковим релаксантом «Ханегіф» (10-20 мл).

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Довідник з репродуктивної біотехнології великої рогатої худоби /В. П. Буркат, В. В. Влізло, Р. Й. Кравців, С. Г. Шаловило, М. М. Шаран, М. Д. Пасіцький, А. В. Мадіч, А. А. Гамота, Л. В. Мадісон, В. В. Мадісон, І. М. Яремчук, В. О. Дудчак/ Львів: Нові перспективи, 2004. -- 150 с. (Дисертант висвітлив розділи з добору корів-донорів і реципієнтів, індукції суперовуляції, надшвидкого методу кріоконсервації та трансплантації ембріонів ВРХ).

Статті у наукових фахових виданнях

2. Шаран М. М. Добір корів-донорів ембріонів шляхом визначення функції яєчників шкірною алергічною реакцією /М. М. Шаран // Біологія тварин. -- 2007. -- Т 9, № 1-2. -- С. 257-262.

3. Шаран М. М. Добір телиць-реципієнтів за алергічним методом визначення функції яєчників /М. М. Шаран // Наук.-тех. бюл. Ін-ту тваринництва УААН. -- Харків, 2008. -- № 96. -- С. 454 -459.

4. Шаран М. М. Ефективність застосування фолікотропіну у складі ліпосомальної емульсії для індукції поліовуляції у корів-донорів при багаторазовому їх використанні /М. М. Шаран // Наук. вісник Львівського нац. універ. вет. медицини та біотехнологій ім. С. З. Ґжицького. -- 2008. --Т. 10, № 2 (37), ч. 1. -- С. 407-411.

5. Шаран М. М. Застосування комплексу біологічно активних речовин для підвищення приживлення ембріонів у телиць-реципієнтів /М. М. Шаран // Наук.-тех.бюл. Ін-ту біології тварин УААН і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. -- Львів, 2008. -- Вип. 9, № 4. -- С. 202-208.

6. Шаран М. М. Застосування ліпосомальної емульсії для введення гонадотропіну при індукції поліовуляції у корів-донорів /М. М. Шаран // Наук.-тех. бюл. Ін-ту тваринництва УААН. -- Харків, 2008. -- № 97. -- С. 157-161.

7. Шаран М. М. Підвищення заплідненості у корів застосуванням біологічно активних речовин із спермою бугаїв /М. М. Шаран // Сільський господар. -- 2009. -- № 1-2. -- С. 12-15.

8. Шаран М. М. Застосування седативних препаратів та міорелаксантів при трансплантації ембріонів /М. М. Шаран // Сільський господар. -- 2009. -- № 3-4 -- С. 29-32.

9. Шаран М. М. Стабілізація мембран ембріонів при кріоконсервуванні надшвидким методом /М. М. Шаран // Біологія тварин. -- 2009. -- Т. 11, № 1-2. -- С. 348-355.

10. Шаран М. М. Посилення ембріонально-маткового сигналу у телиць-реципієнтів з використанням БАР /Шаран М. М. // Наук. вісник Львівського нац. універ. вет. медицини та біотехнологій ім. С. З. Ґжицького. -- 2009. -- Т. 11, № 2 (41), ч. 3. -- С. 247-251.

11. Шаран М. М. Застосування лінолевої кислоти у середовищі для надшвидкого заморожування ембріонів тварин /М. М. Шаран // Наук.-тех.бюл. Ін-ту біології тварин УААН і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. -- Львів, 2009. -- Вип. 10, № 3. -- С. 287-292.

12. Шаран М. М. Кріопротекторні властивості холестеролу при надшвидкому заморожуванні ембріонів /М. М. Шаран // Наук. вісник Львівського нац. універ. вет. медицини та біотехнологій ім. С. З. Ґжицького. -- 2009. -- Т. 11, № 3 (42), ч. 2. -- С 190-194.

13. Шаран М. М. Вплив біологічно активних речовин на функціональний стан репродуктивних органів і приживлення ембріонів у реципієнтів /М. М. Шаран, С. Г. Шаловило, М. Д. Пасіцький // Наук.-тех.бюл. Ін-ту біології тварин УААН. -- Львів, 2004. -- Вип. 5, № 3. -- С. 218-222. (Дисертант обґрунтував програму досліджень, провів трансплантацію ембріонів та визначення стероїдних гормонів, підготував текст до друку).

14. Шаловило С. Г. Перспективи застосування нових біотехнологічних методів відтворення у племінному скотарстві /С. Г. Шаловило, М. М. Шаран, М. Д. Пасіцький // Наук. вісник Львівської нац. акад. вет. медицини ім. С. З. Ґжицького. -- 2007. -- Т. 9, № 2 (33), ч. 3. -- С. 94-98. (Дисертант висвітлив перспективи застосування трансплантації, кріоконсервації та одержання in vitro ембріонів).

15. Використання білих мишей як біологічної моделі в проведенні експериментальних досліджень для тестування гормональних препаратів /О. Б. Андрушко, М. М. Шаран, С. Б. Корнят, А. Р. Корбецький, Ю. Р. Балабан, В. О. Дудчак, З. С. Топурко // Біологія тварин. -- 2007. -- Т. 9, № 1-2. -- С. 269-274. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, проведенні експериментів, сформулював висновки, відредагував статтю).

16. Шаран М. М. Біологічні показники деконсервованої сперми бугаїв при інкубації з окремими біологічно активними речовинами /М. М. Шаран, І. М. Яремчук // Наук.-тех.бюл. Ін-ту біології тварин УААН і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок.-- Львів, 2008. -- Вип. 9, № 3. -- С. 231-237. (Дисертант розробив програму досліджень, брав участь у проведенні експериментів, сформулював висновки, відредагував статтю).

17. Шаран М. М. Взаємозв'язок біохімічних показників крові і сперми бугаїв-плідників з якістю спермопродукції /М. М. Шаран, І. М. Яремчук, С. Г. Шаловило // Наук. вісник Львівського нац. універ. вет. медицини та біотехнологій ім. С. З. Ґжицького. -- 2008. -- Т. 10, № 3 (38), ч. 2. -- С. 263-268. (Дисертант обґрунтував програму досліджень, виконав експеримент з комплексом БАР, проаналізував результати, підготував статтю до друку).

18. Шаран М. М. Ефективність застосування комплексу ліпосома-ФСГ для індукції множинної овуляції у корів-донорів /М. М. Шаран, С. Г. Шаловило // Сільський господар. -- 2008. -- № 7-8. -- С. 7-8. (Дисертант теоретично обґрунтував дослідження, виконав експериментальну частину роботи, підготував текст до друку).

19. Шаран М. М. Кріозахисна ефективність вододисперсної форми жиророзчинних вітамінів при додаванні їх у середовища для надшвидкого заморожування ембріонів тварин /М. М. Шаран, І. М. Яремчук // Біологія тварин. -- 2008. -- Т. 10, № 1-2. -- С. 328-333. (Дисертант обґрунтував програму досліджень, виконав дослід на ембріонах корів, підготував текст до друку).

20. Шаран М. М. Заплідненість та якість ембріонів у корів-донорів при застосуванні біологічно активних речовин із спермою бугаїв /М. М. Шаран, І. М. Яремчук // Наук.-тех.бюл. Ін-ту біології тварин УААН і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. -- Львів, 2009. -- Вип. 10, № 1-2. -- С. 370-375. (Дисертант теоретично обґрунтував програму досліджень, проаналізував результати, підготував статтю до друку).

21. Шаран М. М. Підвищення приживленості ембріонів, одержаних in vitro, застосуванням біологічно активних речовин /М. М. Шаран, О. Є. Гузєватий, С. Г. Шаловило // Наук. вісник Львівського нац. універ. вет. медицини та біотехнологій ім. С. З. Ґжицького. -- 2009. -- Т. 11, № 2 (41), ч. 2. -- С. 327-331. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, трансплантації ембріонів, сформулював висновки, підготував статтю).

22. Шаловило С. Г. Вплив аналогів гонадоліберину на вихід повноцінних ембріонів /С. Г. Шаловило, М. М. Шаран, М. Д. Пасіцький // Вісник аграрної науки. -- 1999. -- № 3. -- С. 44-46. (Дисертант провів підготовку донорів, вимивання ембріонів, сформулював висновки, підготував статтю).

23. Шавкун В. Ю. Регуляція гормональної функції жовтого тіла у телиць-реципієнтів /В. Ю. Шавкун, С. Г. Шаловило, М. М. Шаран // Зб. “Розведення і генетика тварин”. -- 1999. -- № 30. -- С. 108-112. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, визначенні функції яєчників, підготував статтю).

24. Шаран М. М. Вплив багаторазового використання корів-донорів на функціональний стан репродуктивних органів та вихід ембріонів /М. М. Шаран, І. М. Яремчук, З. В. Татомир // Наук.-тех.бюл. Ін-ту землеробства і біології тварин УААН. -- 1999. -- Вип. 1 (3). -- С. 236-238. (Дисертант теоретично обґрунтував програму досліджень, проаналізував результати, підготував статтю до друку).

25. Шаловило С. Г. Ембріопродуктивність корів-донорів залежно від віку і породи /С. Г. Шаловило, М. М. Шаран, М. Д. Пасіцький // Тваринництво України. -- 2001. -- № 1. -- С. 13-15. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, проведенні експериментів, підготовці статті).

26. Взаємозв'язок між запліднюючою здатністю сперми бугаїв-плідників та ембріопродуктивністю корів-донорів /В. О. Дудчак, С. Г. Шаловило, М. М. Шаран, М. Д. Пасіцький // Наук.-тех.бюл. Ін-ту біології тварин УААН. -- 2001. -- Вип. 1-2. -- С. 255-258. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, вимиванні та оцінці ембріонів, відредагував статтю).

27. Дудчак В. О. Запліднення яйцеклітин та якість ембріонів у корів-донорів під впливом гонадотропін рилізинг-гормону при осіменінні спермою з різною активністю окисних ферментів /В. О. Дудчак, М. М. Шаран,С. Г. Шаловило // Наук.вісник Львівської нац. акад. вет. медицини ім. С. З. Ґжицького. -- 2005. -- Т. 7, № 2, ч. 1. -- С. 25-28. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, проведенні експериментів, редагуванні статті).

Патенти

28. Пат. 62361 А Україна, МПК А 61 D 19/04. Спосіб підвищення якості деконсервованих ембріонів заморожених надшвидким методом /І. М. Яремчук, С. Г. Шаловило, М. М. Шаран, М. Д. Пасіцький; заявник і патентовласник Ін-т біології тварин УААН. -- 2003032130 заяв. 11.03.03; опубл. 15.12.2003. Бюл. № 12 (Дисертант брав участь у підготовці методики, узагальнення результатів експериментів, редагуванні тексту).

29. Пат. 41798 Україна, МПК А 01 К 67/02 А 61 К 31/07. Спосіб відбору корів-донорів і телиць-реципієнтів /М. М. Шаран, С. Г. Шаловило, О. Б. Андрушко; заявник і патентовласник Ін-т біології тварин УААН. -- u 2008 14844; заяв. 23.12.08; опубл. 10.06.2009. Бюл. № 11 (Дисертант підготував методику, узагальнення результатів експериментів, відредагував текст).

30. Пат. 46282 Україна, МПК А 01 К 15/00. Спосіб індукції поліовуляції у корів-донорів /М. М. Шаран, С. Г. Шаловило, О. Б. Андрушко; u 2009 07633; заяв. 20.07.09; опубл. 10.12.2009. Бюл. №23. (Дисертант підготував методику, узагальнення результатів експериментів, відредагував текст).

Статті у науково-популярних журналах

31. Шаловило С. Г. Диспансеризація корів-донорів -- важливий захід підвищення ефективності трансплантації ембріонів /С. Г. Шаловило, М. М. Шаран, М. Д. Пасіцький // Ветеринарна медицина України. -- 1998. -- № 3. -- С. 17. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, проведенні експериментів, сформулював висновки, підготував статтю).

32. Біотехнологія відтворення у скотарстві /С. Г. Шаловило, А. В. Мадіч, М. М. Шаран, М. Й. Бец // Сільські обрії. -- 1997. -- № 10-12. -- С. 35. (Дисертант висвітлив можливості застосування трансплантації і кріоконсервації ембріонів у скотарстві).

Статті на конференціях

33. Шаран М. М. Застосування комплексу ліпосома-ФСГ для індукції множинної овуляції у корів-донорів /М. М. Шаран // Матеріали Міжнар. наук.-практ. конф. «Новітні технології скотарства у ХХІ столітті» -- Миколаїв, 2008. --С.199-203.

34. Шаран М. М. Застосування комплексу ФСГ-ліпосома для індукції поліовуляції у корів-донорів при багаторазовому їх використанні /М. М. Шаран // Материалы ХІІ Межд. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства» -- Горки, 2009. -- С. 27-32.

35. Shalowylo S. The influence of the biological active substances in grafting of dekoncervated embryos. /S. Shalowylo, M. Sharan, M. Pasitsky, W. Dudchak // 1-st Polish-Ukrainian Scientific Cоnference “Animal Sciences in the XXI century”. -- Krakоw, 2001. -- Р. 197-201. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, сформулював висновки, відредагував статтю).

36. Љaran M. Induction of superovulation in cows-donors with use of FSH with liposomal emulsion /M. Љaran, A. Korbetskyy, M. Samek // VIII Kabrtovy dieticke dny. -- Brno, 2009. -- P. 66-70. (Дисертант обґрунтував програму досліджень, проаналізував результати, підготував статтю до друку).

37. Шаран Н. М. Эмбриопродуктивность коров-доноров при использовании биологически активных веществ со спермой быков /Н. М. Шаран, И. М. Яремчук, С. Г. Шаловило // Современные проблемы ветеринарного обеспечения репродуктивного здоровья животных -- Воронеж: Истоки, 2009. -- С. 384-388. (Дисертант теоретично обґрунтував програму досліджень, проаналізував результати, підготував статтю до друку).

38. Яремчук И. М. Усовершенствование среды для размораживания эмбрионов крупного рогатого скота /И. М. Яремчук, С. Г. Шаловило, Н. М. Шаран // Сб.науч.трудов «Зоотехническая наука Беларуси». -- Гродно, 2004. -- С. 170-173. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, проведенні експериментів, редагуванні статті).

Методичні рекомендації

39. Шаран М. М. Підвищення ефективності штучного осіменіння корів і телиць. Методичні рекомендації. Львів, 2009. -- Тираж 150 -- 38 с.

40. Шаран М. М. Застосування трансплантації ембріонів у молочному і м'ясному скотарстві. Методичні рекомендації. Львів, 2009. -- Тираж 200 -- 60 с.

Анотації

Шаран М. М. Експериментальне обґрунтування та удосконалення методів трансплантації і кріоконсервації ембріонів великої рогатої худоби - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 -- біотехнологія. -- Інститут біології тварин НААН України. --- Львів, 2010.

У дисертаційній роботі на основі теоретичних узагальнень розроблено і удосконалено основні методи технології трансплантації ембріонів великої рогатої худоби: добір корів-донорів і реципієнтів, стимуляцію поліовуляції і штучне осіменіння донорів, кріоконсервацію ембріонів і їх приживлюваність після пересадки реципієнтам.

Досліджено алергічну реакцію на введення стероїдних гормонів, що дозволило удосконалити добір корів-донорів і реципієнтів. Розроблено спосіб гормональної стимуляції суперовуляції пролонгацією дії препаратів ФСГ з використанням ліпосом, який дає можливість одержувати стабільні результати ембріопродукції (понад чотири доброякісних ембріони) протягом усього періоду використання постійних донорів.

Для збільшення кількості ембріонів, придатних для трансплантації, розроблено спосіб підвищення ембріопродуктивності у корів-донорів застосуванням комплексу БАР (естрофан, інозин, унітіол, глутатіон, L-цистеїн) із спермою бугаїв.

На основі вивчення кріопротекторних властивостей мембраностабілізуючих речовин (інсолвіт, лінолева кислота, холестерол) удосконалено надшвидкий метод кріоконсервування ембріонів, який забезпечує краще збереження (до 90 %) за дії низьких температур та підвищує їх приживлюваність на 7,2-17,0 %.

Досліджено залежність функціонування статевих органів телиць-реципієнтів і приживлення трансплантованих ембріонів від мінерального живлення в умовах Західної біогеохімічної провінції та розроблено способи його корекції.

Вивчено вплив біологічно активних речовин, фармацевтичних засобів та біотехнологічних прийомів на підвищення приживлюваності трансплантованих ембріонів у телиць-реципієнтів і, зокрема, одержаних in vitro.

Ключові слова: велика рогата худоба, ембріон, трансплантація, кріоконсервація, приживлюваність, біологічно активні речовини.

Шаран Н.М. Экспериментальное обоснование и усовершенствование методов трансплантации и криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота -- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20 -- биотехнология. -- Институт биологии животных НААН Украины. -- Львов, 2010.

В диссертационной работе на основе теоретических обобщений разработаны и усовершенствованы основные методы технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота: отбор коров-доноров и реципиентов, стимуляция полиовуляции и искусственное осеменение доноров, криоконсервация эмбрионов и их приживаемость после пересадки реципиентам.

Исследована аллергическая реакция на введение стероидных гормонов, что позволило усовершенствовать отбор коров-доноров и реципиентов. Внутрикожное введение стероидных гормонов (прогестерона, эстрадиола-дипропионата и фоликулина) является важным диагностическим тестом для выявления патологии яичников у коров и телок с целью повышения эффективности отбора потенциальных доноров и реципиентов.

Разработан способ гормональной стимуляции суперовуляции пролонгацией действия препаратов ФСГ с использованием липосом, позволяющий получать стабильные результаты эмбриопродукции (свыше четырех доброкачественных эмбрионов) в течение всего периода использования постоянных доноров при меньших стрессовых нагрузках и трудовых затратах.

Для увеличения количества эмбрионов, пригодных для трансплантации, разработан способ повышения эмбриопродуктивности у коров-доноров применением комплекса биологически активных веществ (БАВ) (эстрофан, инозин, унитиол, глутатион, L-цистеин) со спермой быков. Осеменение коров-доноров спермой быков-производителей с комплексом БАВ повышает количество доброкачественных эмбрионов на 15,5-19,0 %, в том числе отличного качества -- на 13,3-17,2 %, уменьшает долю неоплодотворенных яйцеклеток на 30-40 % при равенстве дегенерованих эмбрионов.

На основе изучения криопротекторных свойств мембраностабилизирующих веществ (инсолвит, линолевая кислота, холестерол) усовершенствован сверхбыстрый метод криоконсервирования эмбрионов, который обеспечивает лучшее сохранение (до 90 %) при воздействии низких температур и повышает их приживаемость на 7,2-17,0 %.

Исследована зависимость функционирования половых органов телок-реципиентов и приживление трансплантированных эмбрионов от минерального питания в условиях Западной биогеохимической провинции и разработаны способы его коррекции. Компенсация дефицитных микроэлементов в рационах (Купрум, Цинк, Селен, Кобальт, Йод) телкам-реципиентам увеличивает концентрацию указанных микроэлементов в крови и шерсти (p<0,05-0,01), повышает активность глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы, щелочной фосфатазы (p<0,05), которые являются интегральными показателями положительного действия, соответственно, селена, меди и цинка, а также повышает приживаемость трансплантированных эмбрионов на 8,3-12,7 %.

Изучено влияние БАВ, фармацевтических препаратов и биотехнологических приемов на повышение приживаемости трансплантированных эмбрионов в телок-реципиентов и, в частности, полученных in vitro. Внутримышечная инъекция БАВ (сурфагон, инсолвит, имукор, ДМСО) телкам-реципиентам в 0-й день полового цикла усиливает интенсивность обменных процессов в половых органах телок, что проявляется увеличением количества животных с функционирующим желтым телом на 22,5 %, повышением приживления трансплантированных эмбрионов на 15,6 %.

Применение телкам-реципиентам БАВ (инъекция сурфагона, инсолвита, имукора, димексида), скармливание витаминно-минерального премикса; трансплантация с эмбрионами дополнительных бластомеров) повышает приживаемость деконсервованих эмбрионов, полученных in vitro, на 9,1-18,9 % .

Комплексные применения телкам-реципиентам сакральной эпидуральной и парасакральной анестезии в сочетании с миорелаксантом "Ханегиф" и нейролептиком "Седазин" нормализует в крови интенсивность перекисного окисления липидов, снижает концентрацию основных интегральных показателей стресса, способствует повышению трансплантированных эмбрионов на 12,4-21,3 %.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, эмбрион, трансплантация, криоконсервация, приживаемость, биологически активные вещества.

Sharan M. Experimental justification and improvement of methods of transplantation and cryopreservation of cattle embryos -- Manuscript.

Thesis for Doctor's degree in agricultural sciences, specialty 03.00.20 -- biotechnology. -- Institute of Animal Biology NAAN of Ukraine. -- L'viv, 2010.

On the basis of theoretical generalizations in the thesis were developed and improved the basic methods of embryo transplantation technology in cattle: the selection of cows-donors and recipients, inducing poliovulation and artificial insemination in donors, embryo cryopreservation and their implantation rate after transplantation to recipients.

Skin allergic reaction to the introduction of steroids, allowing us to improve the selection of cow-donors and recipients has been investigated. Also was developed the method of hormonal inducing of poliovulation by prolongation of FSH preparations action with liposomes which can get positive results of embryoproduction (over four good quality embryos) during the whole period of regular donors usage.

To increase the number of embryos suitable for transplantation developed a way to increase embryoproduction in cows-donors using complex of biologically active compounds or BAC (estrofan, inozyn, unitiol, glutathione, L-Cysteine) with bull semen at AI.

On the basis of cryoprotectoral properties and membrane stabilisating effect of substances (insolvit, linolenic acid, cholesterol) was improved the ultrafast method of embryo cryopreservation, which provides better recovery (90%) under the action of low temperatures and increases their implantation rate by 7,2-17,0% .

The dependence of genital function of heifer-recipients and implantation rate of transplanted embryos after mineral nutrition in conditions of Western biogeochemical region has been studied, and also developed ways to its correction.

Was explored the influence of biologically active compounds, pharmaceuticals and biotechnological techniques on improvement of implantation rate of transplanted embryos in heifer-recipients and, in particular, obtained in vitro.

Keywords: cattle, embryo transfer, cryopreservation, implantation rate, biologically active compounds.

Размещено на Allbest.ru