Використання поліморфізму ДНК для оцінювання генетичних ресурсів м’ясної худоби

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія аграрних наук України

Інститут розведення і генетики тварин

УДК 591.151:636.2.082

03.00.15 - генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Використання поліморфізму ДНК для оцінювання генетичних ресурсів м'ясної худоби

Шкавро Наталя Миколаївна

с. Чубинське Київської області - 2011

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті тваринництва Національної академії аграрних наук України

Науковий керівник:

кандидат сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник Щербак Олена Валентинівна, Харківська зооветеринарна академія, декан біотехнологічного факультету

Офіційні опоненти:

доктор сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник Ковтун Світлана Іванівна, Інститут розведення і генетики тварин Національної академії аграрних наук України, заступник директора з наукової роботи

кандидат сільськогосподарських наук Метлицька Олена Іванівна, Інститут свинарства ім. О.В. Квасницького Національної академії аграрних наук України, завідувач лабораторії селекції відділу розведення і генетики

Захист відбудеться "21" квітня 2011 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 27.355.01 Інституту розведення і генетики тварин Національної академії аграрних наук України за адресою: 08321, Київська область, Бориспільський район, с. Чубинське, вул. Погребняка, 1.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту розведення і генетики тварин Національної академії аграрних наук України за адресою: 08321, Київська область, Бориспільський район, с. Чубинське, вул. Погребняка, 1.

Автореферат розісланий "18" березня 2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Ю.В. Мільченко

Анотації

Шкавро Н.М. Використання поліморфізму ДНК для оцінювання генетичних ресурсів м'ясної худоби. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут розведення і генетики тварин НААН, с. Чубинське Київської обл., 2011. генетичний рогатий худоба

Дисертаційна робота присвячена питанням розробки та застосування комплексного підходу до оцінювання генетичних ресурсів аборигенних та малочисельних порід великої рогатої худоби в Україні шляхом дослідження високополіморфних мікросателітних маркерів ДНК для паспортизації та ідентифікації тварин, і специфічних ДНК-систем контамінаційного контролю біоматеріалу при створенні кріоколекції ДНК племінних тварин для збереження та використання їх генетичного потенціалу з метою підвищення ефективності селекційної роботи.

Проаналізовано та встановлено специфіку генофонду племінного ядра трьох стад великої рогатої худоби м'ясних порід за 10-ма мікросателітними локусами ДНК, розраховано основні популяційно-генетичні характеристики (Н, Е, РІС) та філогенетичні взаємовідносини. Вивчено особливості розподілу алельних варіантів генів та генотипів, виявлено унікальні алельні варіанти мікросателітних локусів ДНК порід шароле та сірої української, які є високоінформативними породоспецифічними маркерами. Розроблено та запропоновано мультиплексну ПЛР-тест-систему з одночасного виявлення в біоматеріалі великої рогатої худоби контамінантів вірусної та бактеріальної природи (Chlamydophila spp. та Bovine herpesvirus 1 type) для підвищення ефективності біотехнології відтворення сільськогосподарських тварин.

Ключові слова: велика рогата худоба, ДНК-маркери, молекулярно-генетичний поліморфізм, мікросателітні локуси ДНК, полімеразна ланцюгова реакція, алель, генотип, мультиплексна ПЛР-тест-система, збереження генофонду.

Шкавро Н.Н. Использование полиморфизма ДНК для оценивания генетических ресурсов мясного скота. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт разведения и генетики животных НААН, с. Чубинское Киевской обл., 2011.

Диссертационная работа посвящена вопросам разработки и использования комплексного похода к оцениванию генетических ресурсов аборигенных и малочисленных пород крупного рогатого скота на Украине путем исследования высокополиморфных микросателлитных маркеров ДНК для паспортизации и идентификации животных, и специфических ДНК-систем контаминационного контроля биоматериала при создании криоколлекции ДНК племенных животных для сохранения и использования их генетического потенциала с целью повышения эффективности селекционной работы.

Исследования проведены в ведущих хозяйствах - племзаводах и племрепродукторах по разведению племенного крупного рогатого скота породы шароле, серой украинской и светлой аквитанской пород.

Изучен полиморфизм 10-ти микросателлитных маркеров ДНК, которые рекомендованы ISAG для паспортизации и дифференциации Bovine. Анализ распределения частот аллелей и генотипов показал, что в группах изученных животных наиболее полиморфным является локус TGLA227 (87,5 % гетерозиготных генотипов), а наиболее консервативным - локус ЕТН 10 (57,7 % гомозиготных особей). Для серой украинской и светлой аквитанской пород отмечено преобладание гетерозиготных генотипов, а для породы шароле по трем микросателлитам - TGLA126, ETH10 и ETH225 - преобладание гомозигот. Установлены филогенетические связи между исследованными породами, найдены уникальные аллельные варианты микросателлитных локусов ДНК пород шароле и серой украинской, которые могут выступать в качестве высокоинформативных породоспецифических маркеров.

Разработан молекулярно-генетический поход оценки качества биоматериала на уровне ДНК путем создания системы праймеров для одновременного выявления в биоматериале крупного рогатого скота геномов контаминантов вирусной и бактериальной природы (Chlamydophila spp. и Bovine herpesvirus 1 type). Предложен алгоритм создания криоколлекции ДНК для сохранения генетических ресурсов крупного рогатого скота с маркировкой образцов с помощью микросателлитов и проведения обязательного контаминационного контроля для предотвращения репродуктивных потерь.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, ДНК-маркеры, молекулярно-генетический полиморфизм, микросателлитные локусы ДНК, полимеразная цепная реакция, аллель, генотип, мультиплексная ПЦР-тест-система, сохранение генофонда.

Shkavro N. DNA polymorphism application for beef cattle genetic resources estimation. - Manuscript.

Thesis for the candidate degree of the agricultural sciences by specialty 03.00.15 - genetics. - Institute of Animal Breeding and Genetics NААS, Chubinsky village, Kyiv region, 2011.

This thesis is dedicated to development and using genetic resources estimation methods for aboriginal and small in number cattle breeds in Ukraine by complex of highpolymorphic microsatellite DNA-markers, for animal certification and identification, and specific DNA-systems of biomaterial contamination control to create breeding animals DNA criocollection for preservation and application cattle genetic potential to increase selection efficiency.

The nucleous stock genofond's specificity of three beef cattle herds is analyzed and established by polymorphic DNA microsatellite loci; basic genetic-population characteristics (Н, Е, РІС) and phylogenetic relationship were calculated. Distribution of genes and genotypes specific's allelic variants were studied, unique allelic variants of DNA microsatellite loci of charolais and grey Ukrainian cattle breeds were identified, these allelic variants would use as highinformatic breedspecific markers. The multiplex PCR-test-system for simultaneous detecting viral and bacterial contaminants (Chlamydophila spp. and Bovine herpesvirus 1 type) in cattle biomaterials was developed and recommended to use to increase the efficiency of agricultural animals' reproduction biotechnology.

Key words: cattle, DNA-markers, molecular-genetic polymorphism, microsatellites DNA loci, polymerase chain reaction, allele, genotype, multiplex PCR-test-system, genetic resources conservation.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Необхідність виконання практичних та фундаментальних наукових пошуків у галузі сільського господарства зумовлена потребою в розробці й формуванні надійних механізмів збереження та управління генетичним біорізноманіттям унікальних аборигенних і цінних у продуктивному та економічному значенні порід тварин, зокрема великої рогатої худоби. Передусім, це стосується генетичної унікальності, різноманітності та своєрідності вітчизняних генофондних ресурсів, оскільки вони ще залишаються до кінця не розкритими (Буркат В.П., 2003; Dekkers J., 2004; Подоба Б.Є., 2006; Зубець М.В., 2007; Асланян М.М., Конюхов Б.С., 2006; Марзанов Н.С., Саморуков Ю.В., 2006; Мельник Ю.Ф., 2002).

За таких умов головна проблема скотарства щодо удосконалення продуктивних якостей і підвищення темпів генетичного прогресу тварин має вирішуватися на основі розробки сучасних молекулярно-генетичних методів із поглибленим вивченням специфіки геному та широким упровадженням ДНК-технологій, оскільки генофондні ресурси є генетико-біологічною основою всього тваринництва (Глазко В.І., 2001; Williams J.L., 2005; Ернст Л.К., 2004).

Для більшості європейських країн практичне вирішення цієї проблеми пов'язано зі створенням кріобанків гамет, ембріонів та ДНК тварин. Слід зазначити, що втілення заходів щодо збереження генетичного біорізноманіття порід при створенні таких кріобанків спрямоване на використання інформації генетичного поліморфізму мікросателітних послідовностей ДНК для ефективної ідентифікації тварин (Глазко В.І., 2003; Hirano T., Ma R.Z., 1996; Witek-Zawada B., 2006; Зиновьева Н.А., 2005; Столповский Ю.А., 1997) та встановлення породної належності біоматеріалу після його довготривалого зберігання. Саме тому, на всіх етапах процесу відтворення цінних генотипів сільськогосподарських тварин необхідно виключити ймовірність контамінації біологічного матеріалу інфекційними агентами, а саме чужорідною ДНК, передавання та збереження патологічних властивостей, зокрема тих, що призводять до абортів, народження нежиттєздатного або слабкого потомства, розвитку неплідності (Ернст Л.К., 2006; Глазко В.І., 1994). Вищезазначеним питанням у вітчизняній науці не приділялося достатньо уваги, їх генетична природа й досі ще не чітко визначена, а деякі положення залишаються спірними.

Наразі в Україні не відпрацьована надійна і цілісна система ідентифікації та використання генетичних ресурсів порід великої рогатої худоби із застосуванням молекулярно-генетичних маркерів. Постає гостра необхідність впровадження сучасних методів ДНК-технологій для збереження та відтворення генетичного потенціалу унікальних, аборигенних і цінних в економічному відношенні тварин при створенні банку ДНК. Особливого значення набуває відбір найбільш типових представників цих порід з метою довгострокового зберігання їх біоматеріалу згідно обґрунтованих програм підтримки біорізноманітності.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках тематичного плану Харківського біотехнологічного центру УААН, лабораторії клітинної та молекулярної біології та лабораторії генетики Інституту тваринництва НААН: "Розробити та удосконалити ембріоінженерні методи отримання реконструйованих ембріонів і молекулярно-генетичні підходи для застосування у відтворенні та селекції сільськогосподарських тварин" (№ держреєстрації 0106U007896) та "Провести генетичний моніторинг малочисельних і зникаючих аборигенних та імпортованих порід: ВРХ -симентальської, айрширської та шаролезької; свиней - уельської та великої чорної; овець сокільської та створити інформаційно-технологічну базу по генофонду вищезазначених порід" (№ держреєстрації 0106U010671).

Мета і завдання дослідження. Мета даної роботи полягає у комплексному використанні ДНК-маркерів різних класів для оцінювання генетичних ресурсів великої рогатої худоби порід м'ясного напряму продуктивності.

Для досягнення даної мети були поставлені наступні завдання:

1. Визначити оптимальні методи ізоляції ДНК із різного біологічного матеріалу великої рогатої худоби (кров, сперма, зіскрібки слизових оболонок) шляхом порівняльного аналізу органічних та неорганічних методів екстракції ДНК.

2. Розробити молекулярно-генетичні засоби боротьби з контамінацією ДНК шляхом створення мультиплексної ПЛР-тест-системи за використання методів біоінформатики.

3. Проаналізувати генетичну структуру племінного ядра генофондних стад великої рогатої худоби породи шароле, сірої української та світлої аквітанської порід за поліморфними мікросателітними маркерами ДНК та визначити їх популяційно-генетичні характеристики.

4. Розробити алгоритм створення кріоколекції ДНК для збереження генетичних ресурсів аборигенних та малочисельних порід великої рогатої худоби.

Об'єкт дослідження - збереження генофонду аборигенних та малочисельних порід великої рогатої худоби в Україні.

Предмет дослідження - поліморфізм геному великої рогатої худоби за мікросателітними ДНК-маркерами, молекулярно-генетична специфіка контамінантів вірусної та бактеріальної природи.

Методи дослідження - молекулярно-генетичні (органічні та неорганічні методи ізоляції ДНК, спектрофотометричний та електрофоретичний методи визначення концентрації ДНК, ампліфікація фрагментів ДНК методом полімеразної ланцюгової реакції, метод капілярного електрофорезу ампліфікатів із лазерною детекцією та комп'ютерною реєстрацією результатів електрофоретичного розподілу, метод горизонтального електрофорезу в агарозному гелі); філогенетичний аналіз; статистичний аналіз; математичне моделювання; методи біоінформатики - пошук гомології за базами даних, множинне вирівнювання, підбір праймерів із визначенням їх термодинамічних характеристик за допомогою сучасного програмного забезпечення.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше для оцінки геному аборигенних та малочисельних порід великої рогатої худоби застосовано комплексний підхід із застосуванням панелі мікросателітних маркерів та ДНК-систем контамінаційного контролю. Проведено оптимізацію умов та удосконалення окремих етапів виділення ДНК із різного біоматеріалу великої рогатої худоби (кров, сперма, зіскрібки слизових оболонок), доведена доцільність використання методів органічної екстракції для довгострокового збереження ДНК. Отримано нові дані поліморфізму 10-ти мікросателітних локусів ДНК популяційної вибірки трьох порід великої рогатої худоби - шароле, сірої української та світлої аквітанської за допомогою техніки капілярного гель-електрофорезу. Виявлено унікальні алельні варіанти мікросателітних локусів ДНК великої рогатої худоби порід шароле та сірої української. Проведено оцінку генетичної диференціації між трьома дослідженими породами великої рогатої худоби із застосуванням ДНК-маркерів та сучасних статистико-математичних моделей. Розроблено молекулярно-генетичний підхід боротьби з контамінацією ДНК шляхом створення мультипраймерної тест-системи для одночасного виявлення геномів збудників вірусної та бактеріальної інфекції.

Практичне значення одержаних результатів. Вивчення генетичної структури порід великої рогатої худоби за використання поліморфних мікросателітних локусів ДНК дає змогу підвищити ефективність оцінки генетичного різноманіття аборигенних та малочисельних порід великої рогатої худоби з метою добору, спрямованого на відтворення тварин бажаних генотипів. Розроблений молекулярно-генетичний спосіб контамінаційного контролю ДНК тварин є науковою основою створення біотехнологічних заходів щодо зменшення репродуктивних втрат та боротьби з безплідністю.

Особистий внесок здобувача. Разом із науковим керівником визначено напрям досліджень, методологічні підходи та схема досліджень. Автором самостійно проведено аналіз літературних джерел, експериментальну частину роботи, статистичне опрацювання даних, аналіз отриманих результатів та їх обговорення. Висновки сформульовано автором спільно з науковим керівником. Автор висловлює щиру подяку завідувачу лабораторії генетики Інституту тваринництва НААН В.І. Россосі, завідувачу відділом імуно- та цитогенетики Інституту Зоотехніки (м. Баліце, Польща) професору Є. Слоті, завідувачу лабораторії епізоотології і мікробіології Полтавської дослідної станції Інституту ветеринарної медицини НААН І.М. Ксьонзу, с.н.с. лабораторії генетики Інституту свинарства НААН К.Ф. Почерняєву за постійну підтримку, плідне обговорення та корисні зауваження.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи були представлені та ухвалені на щорічних конференціях молодих вчених Інституту тваринництва НААН (Харків, 2005, 2009); науково-практичній конференції "Стан і перспективи розвитку біотехнології відтворення тварин" (Харків, 2005); Міжнародних науково-практичних конференціях "Сучасність та майбутнє аграрної науки та виробництва" (Львів, 2006), "Стратегия развития зоотехнической науки" (Жодино, 2009), "Стан, проблеми та перспективи розвитку сучасної аграрної науки і практики" (Львів, 2010).

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 8 наукових робіт, 5 з яких - статті у фахових наукових виданнях відповідної спеціальності, затверджених ВАК України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, загальної методики і основних методів досліджень, 3 розділів результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків, пропозицій виробництву, списку використаних джерел (200 найменувань, в тому числі 120 іноземних), додатків. Дисертація викладена на 137 сторінках комп'ютерного тексту, містить 15 таблиць, 19 рисунків та 4 додатки.

Матеріал і методи досліджень

Дослідження були проведені у лабораторії молекулярної генетики Харківського біотехнологічного центру УААН, лабораторії клітинної та молекулярної біології та лабораторії генетики Інституту тваринництва НААН. Роботи з вивчення поліморфізму мікросателітних локусів ДНК виконано на базі відділу імуно- та цитогенетики Інституту Зоотехніки (м. Баліце, Польща). Загальну схему досліджень представлено на рис. 1.

Відбір проб біологічного матеріалу від великої рогатої худоби проводили за загальновизнаними методиками: із крові, що була відібрана із хвостової вени в пробірки з антикоагулянтом ЕДТА, або розчином лимоннокислого натрію (Тихонов В.М., 1991), зі сперми бугаїв, отриманої за Харківською технологією (Осташко Ф.І., 1998) та зскрібків слизової оболонки вагіни корів (за допомогою зондів Акцелон та "Medscan"). Виділення ДНК проводили методами фенол-хлороформної (Ausubel et al., 1994), сольової екстракції з використанням протеїнази К (Кавасакі з модифікаціями, 1999), за допомогою гуанідинізотіоціанату (Сулімова Г.Є., 1999) та сорбенту Chelex-100 (Claude R., 1997). Наявність ДНК визначали шляхом електрофорезу в 1% агарозному гелі у тріс-боратному буфері за інтенсивністю флуоресценції бромистого етидію, що зв'язується з ДНК, при УФ-опромінюванні (Маніатіс Т. та ін., 1984). Концентрацію та ступінь очищення ДНК визначали електрофоретичним методом - у 0,8% агарозному гелі за інтенсивністю свічення, шляхом порівняння з ДНК фагу л у різних концентраціях (від 50 нг/мкл до 200 нг/мкл), та спектрофотометричним методом - за допомогою спектрофотометру NanoDrop® ND-1000 (Technologies, Inc., США) при довжині хвилі 260-280 нм.



Вивчення поліморфізму мікросателітних послідовностей ДНК проводили на біологічному матеріалі (зразки крові) племінного ядра генофондних стад великої рогатої худоби трьох порід: шароле ДПДГ "Гонтарівка" ІТ НААН Вовчанського району Харківської області (n=23), сірої української та світлої аквітанської порід ДПДГ "Поливанівка" Магдалинівського району Дніпропетровської області (n=27 та n=11, відповідно).

З метою створення ПЛР-тест-системи контамінаційного контролю біоматеріалу великої рогатої худоби досліджували проби ДНК, які виділяли із крові великої рогатої худоби, нативної та заморожено-відталої сперми бугаїв та зіскрібків слизової оболонки вагіни корів із підприємств: ТОВ "Агрофірма "Маяк", ВАТ "Лубенське племпідприємство" Полтавської області, СКВ "Міжгір'я" Черкаської області, СТОВ "Нива" Вінницької області, СВК "Заповіт Леніна" Харківської області, племпідприємство Інституту тваринництва НААН (n=87).

Виявлення присутності контамінантів вірусної та бактеріальної природи в біологічному матеріалі великої рогатої худоби проводили за використання розробленої мультиплексної ПЛР-тест-системи, що складається з двох пар праймерів наступної структури: Chl.- прямий 5/-CCG CCC GTC ACA TCA TGG-3/, зворотний 5/-TGG CTC ATC ATG CAA AAG GCA-3/; BHV-1- прямий 5/-CAC GGA CCT GGT GGA CAA GAA G-3/, зворотний 5/-CTA CCG TCA CGT GCT GTG TAC G-3/. Ампліфікацію проводили на термоциклері "Амплі-4" (БіоКом, Росія) за наступною схемою: денатурація геномної ДНК при температурі 95 C протягом 3 хв; потім 40 циклів з параметрами - денатурація ДНК при 95 C протягом 1 хв, приєднання праймерів при 55 C впродовж 1 хв, синтез ДНК при 73 C протягом 1 хв; кінцевий синтез ДНК при 73 C упродовж 5 хв. Візуалізацію продуктів ампліфікації здійснювали шляхом електрофорезу у 2%-му агарозному гелі після фарбування бромистим етидієм за допомогою трансілюмінатору ТУВ-1 в УФ світлі 365 нм та фотографували на цифрову фотокамеру Samsung. Розміри отриманих у ПЛР продуктів визначали за допомогою стандартного маркера молекулярної ваги GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder ("Ферментас", м. Вільнюс, Литва).

Ампліфікацію 10-ти мікросателітних локусів ДНК, які рекомендовані ISAG для контролю походження великої рогатої худоби, проводили в автоматичному режимі на термоциклері Biometra T3000 (Германія) за схемою, яка складається з початкової денатурації ДНК при температурі 98 C протягом 1 хв; потім 30 циклів за схемою - денатурація ДНК при 98 C протягом 20 с, відпал праймерів при 60 C - 75 с, синтез ДНК при 72 C - 30 с; кінцевий синтез ДНК при 72 C - 5 хв. Аналіз поліморфізму мікросателітних локусів проведено методом капілярного гель-електрофорезу на генетичному аналізаторі (секвенаторі) ABI Prism 3130xl (Applied Biosystems, США). Результати електрофоретичного розподілу було проаналізовано за допомогою комп'ютерних програм GeneScan 2.1 та Genotyper 2.0.

Статистичні розрахунки основних популяційно-генетичних параметрів тварин проводили за використання комп'ютерних програм Excel, Tfpga 2000 version 1.3 (Tools for Population Genetic Analyses), Statistika 6.0.

Оптимізація техніки виділення ДНК великої рогатої худоби із крові, сперми та зіскрібків слизової оболонки статевих шляхів

Для виділення ДНК із соматичних та статевих клітин великої рогатої худоби були апробовані, порівняні та адаптовані наступні методи: фенол-хлороформної, сольової екстракції з використанням протеїнази К, гуанідинізотіоціанатний та сорбентний (Chelex-100), аналізуючи наявність, концентрацію та чистоту ДНК. Усі досліджувані методи дали змогу гарантовано отримати препарати ДНК, які після електрофоретичного розподілу в агарозному гелі та специфічної взаємодії з бромістим етидієм викликали реакцію флюоресценції. Зведені дані за результатами вимірювань концентрації та ступеня чистоти ДНК наведені в таблиці 1.

1. Концентрація ДНК, ізольованої різними методами

Проба	Метод ізоляції ДНК	Метод визначення концентрації ДНК
		Електрофоретичний	Спектрофотометричний
		нг/мкл	нг/мкл*	A260/280*
Кров	фенол-хлороформний	50 - 120	126,67	1,87
	сольовий	50 - 120	112,72	1,86
	гуанідинізотіоціанатний	90 - 120	85,9	1,74
	з Chelex-100	70 - 90	64,58	1,58
Сперма	гуанідинізотіоціанатний	50 - 100	83,8	1,72
	з Chelex-100	20 - 90	63,84	1,46
Сперма заморожено-відтаяна	гуанідинізотіоціанатний	25 - 50	66,83	1,6
	з Chelex-100	30 - 50	55,6	1,55
Зіскрібки	гуанідинізотіоціанатний	25 - 50	66,22	1,59
	з Chelex-100	15 - 50	49,62	1,48

Примітка: * - середні показники.

Встановлено, що за методом розведень найбільшу інтенсивність свічення має ДНК, яка виділена методами фенол-хлороформної та сольової екстракції (120 нг/мкл), при цьому класичний фенол-хлороформний метод потребує значно більших часових та матеріальних витрат. Використання гуанідинізотіоціанатного методу дає змогу отримати кращі показники за концентрацією ДНК (від 25 нг/мкл до 120 нг/мкл), порівняно із сорбентним методом Chelex-100 (від 20 нг/мкл до 90 нг/мкл). За використання спектрофотометричного методу кращими показниками (у середньому 126 нг/мкл) з високим ступенем чистоти (у середньому 1,8) характеризувалася ДНК, яка виділена з крові великої рогатої худоби методом фенол-хлороформної екстракції. Це свідчить про доцільність використання цього методу ізоляції ДНК при створенні банку генетичних ресурсів сільськогосподарських тварин для її довгострокового зберігання.

Отримані нами препарати ДНК із крові, сперми та зіскрібків слизової оболонки вагіни великої рогатої худоби показали ефективність свого використання в ПЛР для дослідження поліморфізму тварин за STR- та цільовими ДНК маркерами.

Аналіз поліморфізму мікросателітних локусів днк популяційної вибірки великої рогатої худоби порід шароле, сірої української та світлої аквітанської

Із метою дослідження особливостей генетичної структури представників генетично цінних аборигенних та малочисельних порід великої рогатої худоби в Україні, відповідно до вимог ISAG і міжнародного комітету з племінних книг (ISBC), оцінювали генетичний поліморфізм 10-ти мікросателітних локусів ДНК (BM2113, ETH10, TGLA126, ЕТН 225, TGLA227, TGLA53, SPS115, INRA23, ETH3, BM1824) тварин племінного ядра стад порід шароле, сірої української та світлої аквітанської. Усі досліджені локуси показали високий поліморфізм.

Загалом було ідентифіковано 152 алелі, включаючи 55 алелей у шароле, 49 - у світлої аквітанської та 48 - у сірої української порід. Кількість алелей варіювала від 10-ти за локусом TGLA53 до 2-х за локусом ЕТН 10 у породи шароле (рис. 2).

Шароле Сіра українська Світла аквітанська

Рис. 2. Кількість ідентифікованих алелей мікросателітних локусів тварин трьох досліджених порід великої рогатої худоби

Розраховано частоти алелей у специфічних локусах та встановлено різниці за частотами ідентифікованих алелей між трьома дослідженими породами великої рогатої худоби. За результатами проведеного аналізу розподілу частот алелей досліджуваних мікросателітних локусів виявлено маркерні алелі, притаманні певним породам.

Так, для породи шароле виявлено унікальні алельні варіанти за локусом INRA023 - алель розміром 200 п.н., за локусом TGLA53 - алелі 154 п.н. та 176 п.н. та за локусом ЕТН 3 алель довжиною 123 п.н. Для сірої української породи також виявлені унікальні алелі - за локусом TGLA53 - 172 п.н., за локусом TGLA126 - 125 п.н., за локусом TGLA227 - 79 п.н. та за локусом INRA023 - 196 п.н. (рис.3).

Визначені унікальні алелі можуть бути використані як високоінформативні породоспецифічні генетичні маркери для ідентифікації біологічних зразків невизначеного походження та після довготривалого зберігання.



Аналіз частот гомо- та гетерозиготних генотипів (рис. 4) окремо за кожним із досліджуваних мікросателітних локусів за всіма трьома породами (характеристика визначеного мікросателітного маркера) показав, що найбільш поліморфним є локус TGLA227 (87,5 % гетерозиготних генотипів), а найбільш консервативним виявився локус ЕТН 10 (57,7 % гомозиготних особин).

Розраховано частоти гомо- та гетерозиготних генотипів за всіма досліджуваними мікросателітними локусами в цілому для кожної породи (характеристика породи) та встановлено, що більшою кількістю особин гетерозиготних генотипів (72,8 %) характеризується досліджене стадо сірої української породи великої рогатої худоби (див. рис. 4). Це свідчить про підтримку генетичної різноманітності (високу гетерогенність) цієї популяції, яка необхідна для ефективної селекційної роботи. Для дослідженого генофондного стада великої рогатої худоби породи шароле виявлена значна кількість гомозиготних генотипів (36,9 %), порівняно із сірою українською та світлою аквітанською породами. Така картина може бути пов'язана зі специфічними умовами утримання великої рогатої худоби породи шароле в ДПДГ "Гонтарівка", які склалися протягом останніх двадцяти років. Ця порода розводилася "в собі" та не відбувалося так званого "прилиття крові", яке зазвичай відбувається при закупівлі нових бугаїв-плідників і використанні їх у системі відтворення стада.

За кількістю ідентифікованих алелей досліджених локусів та їх частотами були розраховані ступені гетерозиготності (Н), ефективна кількість алелей у локусі (Е) з метою підтвердження придатності використаних маркерів до вивчення генетичної структури порід, а також індекс ступеня поліморфізму (РІС) (табл. 2).

Так, значення ступеня гетерозиготності (Н) у середньому дорівнює 0,65 (65 %), а в деяких випадках навіть більше 80 % - за локусом TGLA53 у шароле та світлої аквітанської порід (0, 827, або 82,7 % та 0,855, або 85,5 %, відповідно) та за локусом TGLA227 для всіх трьох досліджуваних порід, окрім локусу ЕТН 10 у тварин породи шароле (Н = 0,194, або 19,4 %).

Рівень поліморфності є важливим інтегральним показником, який характеризує кількість активно діючих алелей у популяції (Е). Найвищими показниками цього параметра характеризувався локус TGLA53 у досліджуваної вибірки порід шароле (E=5,78) та світлої аквітанської (E=6,90) та локус TGLA227 у сірої української породи (E=6,37). Зазначені локуси є найбільш поліморфними.

В інших локусах, не беручи до уваги найвищі для локусу TGLA53 та найнижчі для локусу ЕТН 10 показники, кількість активно діючих алелей коливалася в межах від 2,05 (локус ЕТН 225) у породи шароле до 5,38 (локус TGLA227) у світлої аквітанської породи.

Визначений на основі частот алелей параметр РІС (індекс ступеня поліморфізму) показав, що досліджені мікросателітні послідовності характеризуються високим рівнем поліморфізму: значення РІС, розраховані для кожного локусу, були на рівні від 0,45 до 0,86. Отже, можна стверджувати, що досліджувані мікросателітні послідовності є високоінформативними молекулярно-генетичними маркерами та можуть бути використані для оцінки генетичної структури популяцій.

2. Основні показники генетичного різноманіття досліджуваної популяційної вибірки трьох порід м'ясної худоби

ЛОКУС	ШАРОЛЕ (N=23)	СІРА УКРАЇНСЬКА (N=27)	Світла аквітанська (N=11)
	n	H	E	РІС	n	H	E	РІС	n	H	E	РІС
BM1824	3	0,659	2,93	0,535	4	0,650	2,86	0,582	5	0,715	3,51	0,662
BM2113	5	0,668	3,01	0,623	4	0,556	2,25	0,517	5	0,773	4,40	0,864
INRA023	6	0,758	4,13	0,726	6	0,774	4,42	0,739	4	0,684	3,16	0,630
SPS115	5	0,622	2,65	0,583	5	0,538	2,16	0,490	4	0,541	2,18	0,496
TGLA53	10	0,827	5,78	0,810	5	0,716	3,52	0,667	8	0,855	6,90	0,841
TGLA126	3	0,534	2,15	0,477	6	0,774	4,42	0,739	4	0,690	3,23	0,633
TGLA227	6	0,813	5,35	0,788	8	0,843	6,37	0,824	7	0,814	5,38	0,789
ETH3	5	0,534	2,15	0,500	4	0,549	2,22	0,490	3	0,512	2,05	0,444
ETH10	2	0,194	1,24	0,175	3	0,615	2,60	0,533	4	0,434	1,77	0,394
ETH225	5	0,512	2,05	0,459	6	0,765	4,26	0,730	5	0,616	2,60	0,562
	Нсер = 0,61	Нсер = 0,68	Нсер = 0,66

Примітка: n - кількість алелей, H - ступінь гетерозиготності, E - ефективна кількість алелей, PIC - індекс поліморфності, N - кількість тварин у вибірці

За критерієм Стьюдента було розраховано достовірності різниць частот алелей між досліджуваними групами великої рогатої худоби, які порівнювалися між собою. Найбільш достовірні різниці між породами шароле та сірою українською виявлені за локусами INRA023 та ЕТН 10 за всіма наявними алелями. Подібна картина спостерігалася між сірою українською та світлою аквітанською породами. Проте, між породами шароле та світлою аквітанською за даними двома локусами статистично достовірної різниці за частотами виявлених алелей не визначено.

Подібна ситуація спостерігалася за локусом SPS115, де встановлена достовірна різниця за частотами алелів 254 п.н., 256 п.н. та 260 п.н. (р<0.05); BM2113, в якому встановлено достовірну різницю за частотами алелей 133 п.н. та 137 п.н. (р<0,001), крім того за локусом TGL227 встановлено достовірну різницю за частотами алелей 81 п.н. та 83 п.н. (р<0,05 та р<0,01, відповідно).

Практично за всіма дослідженими локусами між породами шароле та світлою аквітанською спостерігалася найменша різниця за частотами розподілу виявлених алелів. Враховуючи такі показники, можна стверджувати про генетичну схожість порід світлої аквітанської та шароле та значну віддаленість від них сірої української породи.

Розраховано генетичні дистанції та показники генетичної схожості між породами шароле, сірою українською та світлою аквітанською за мікросателітними маркерами за методом Nei та Roychoudhury (табл. 3), графічне зображення генетичних дистанцій представлено на рис. 5.

3. Генетичні відстані (D) та показник схожості (S) між трьома досліджуваними породами великої рогатої худоби

Відстані (D) Схожість (S)	Породи
	шароле	сіра українська	світла аквітанська
Шароле	*****	0,1749	0,1299
Сіра українська	0,53	*****	0,1526
Світла аквітанська	0,66	0,57	*****

Встановлено, що найбільша розбіжність за рівнем генетичної дистанції спостерігається між породами шароле та сірою українською (0,1749). Значно менша різниця між шароле та світлою аквітанською породами (0,1299). Такі дані підтверджуються і розрахунками індексу генетичної схожості порід. Так, порода шароле найбільшу схожість має зі світлою аквітанською породою (0,66) і найменшу - із сірою українською (0,53).

Спільний кластер був сформований породами шароле та світлою аквітанською, що підтверджується їх спільним французьким походженням, а окреме відгалуження створила сіра українська порода. Отримані дані не суперечать історії створення та подальшого розведення цих порід.

Рис. 5. Дендрограма філогенетичних взаємовідносин між трьома досліджуваними породами, побудована за результатами генетичних відстаней за Nei, методом незваженої парно-групової кластеризації Вагнера

Оцінка стану генетичної рівноваги, відповідно до закону Харді-Вайнберга, та виявлення статистично достовірних різниць між частотами генотипів, що проведено за допомогою методу 2, свідчать про те, що досліджувана нами вибірка є репрезентативною (отримані показники є значно нижчими від критичної величини 2 для визначеної кількості ступенів свободи). За локусами TGLA53 дослідженої вибірки порід шароле та TGLA227 світлої аквітанської встановлено незначне відхилення від стану генетичної рівноваги, різниці між теоретичними та фактичними частотами генотипів є достовірними при p < 0,01. На цьому етапі досліджень важко однозначно визначити причини, які призводять до відхилення від стану генетичної рівноваги; однак, можна припустити вплив застосування штучного осіменіння та використання обмеженої кількості плідників.

Аналіз частот виявлених генотипів та визначений стан генетичної рівноваги за досліджуваними локусами ДНК, свідчить про те, що селекційна робота, яка проводиться в стадах протягом багатьох років, не впливає на мікросателітні ділянки геному, а це свідчить про доцільність вибору саме цих ділянок, як оптимальних із точки зору паспортизації та ідентифікації різних порід великої рогатої худоби.

Виявлення генів-маркерів вилучення біоматеріалу з процесу біотехнології відтворення великої рогатої худоби (контамінаційний контроль)

Окрім надання ідентифікаційного ДНК-паспорту з визначенням конкретних алельних варіантів поліморфних мікросателітних послідовностей, перед закладанням у "банк", необхідно отримати якомога більше інформації про властивості генетичного матеріалу, щоб запобігти збереженню небажаних, а можливо і небезпечних ознак. Нами було розроблено заходи контамінаційного контролю біоматеріалу на початкових етапах його залучення до процесу збереження та відтворення великої рогатої худоби.

Встановлено, що до найбільш поширених у господарствах України інфекційних захворювань великої рогатої худоби, що призводять до безплідності та ембріональної смертності, відносяться хламідіоз та інфекційний ринотрахеїт, які найчастіше виявляються в асоціації (Малошевич В.Е., 2005; Апатенко В.М., 2005; Губенко І.А., 2002). Необхідним є створення мультиплексної ПЛР-тест-системи з одночасного виявлення геному збудників хламідіозу та інфекційного ринотрахеїту в біологічному матеріалі тварини. Для розробки праймерів для ПЛР нами підібрано фрагмент молекули ДНК збудника, який відрізнявся генетичною консервативністю та був присутній лише у визначеного виду мікроорганізмів у певного гена. Проведено аналіз геному цих збудників у міжнародній базі даних GeneBank (США) та EMBL (Europian Molecular Biology Library, Німеччина), визначено найбільш консервативні ділянки їх геномів із високим рівнем гомології та до них підібрано праймери.

Встановлено, що для ідентифікації секвенованих мікроорганізмів бактеріальної природи (до яких відноситься збудник хламідіозу) найбільш інформативними є гени 16S та 23S рибосомальної РНК. На відміну від фенотипічних та біохімічних властивостей, видова послідовність 16S рРНК стабільної природи, характеризується високим рівнем гомології нуклеїнових кислот та є специфічною для мікроорганізмів на видовому рівні. Для збудника інфекційного ринотрахеїту, етіологічнім чинником якого є герпесвірус 1-го типу, одним із глікопротеїнів, що найкраще характеризує BHV-1 і виступає як специфічний та інформативний маркер наявності саме геному BHV-1, є молекула глікопротеїну І - gI.

Нами було здійснено вирівнювання відібраних нуклеотидних послідовностей за допомогою комп'ютерної програми "Align X Vector NTI Suite" з наступним аналізом їх варіабельності, визначено консервативні ділянки для ампліфікації конкретного фрагменту. Сконструйовано праймери для ідентифікації ділянки 16S-23S рРНК геному збудників хламідіозу, що є найбільш консервативною в геномі всіх видів хламідій (довжиною 1000 п.н.) та фрагменту гена глікопротеїну І (gI) вірусу інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби (довжиною 468 п.н.).

Визначено оптимальні параметри полімеразної ланцюгової реакції - концентрацію та кількість компонентів реакційної суміші, температурні умови проведення ампліфікації (оптимальна температура відпалу двох пар праймерів становила 55 0С) та створено мультиплексну ПЛР-тест-систему з одночасного виявлення збудників хламідіозу та інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби (табл. 4).



У пробах ДНК, які виділені з крові великої рогатої худоби дослідженої популяційної вибірки порід шароле, сірої української та світлої аквітанської, що протестовані за мікросателітними маркерами та залучаються до програми збереження, за використання розробленої тест-системи не було встановлено присутності ДНК контамінаційних агентів вірусної та бактеріальної природи.

За результатами ампліфікації з використанням розробленої тест-системи, у шести пробах ДНК (від чотирьох корів та двох бугайців) було виявлено присутність хламідійного геному - на електрофореграмі спостерігалась смуга розміром 1000 п.н., що відповідає фрагменту ДНК збудника хламідіозу, а в тому числі в пробах ДНК від двох корів було виявлено присутність збудника інфекційного ринотрахеїту - на електрофореграмі спостерігалась смуга розміром 468 п.н., що відповідає фрагменту ДНК цього збудника (рис. 6).



Рис. 6. Електрофореграма продуктів ПЛР по виявленню Clamydophila spp. та BHV-1 за допомогою розробленої системи праймерів: DNA Ladder - маркер розмірів ДНК з шагом 100 п.н.

Для підтвердження наявності геному збудника хламідіозу та перевірки придатності розробленої тест-системи, досліджувані проби ДНК також були проаналізовані за використання трьох комерційних наборів реагентів з виявлення моноінфекцій фірми "ИзоГен" (Росія), які дозволені для використання в лікувально-профілактичних та санітарно-профілактичних установах України. Встановлено позитивну кореляцію між результатами, отриманими за використання комерційної тест-системи "GenePakТМPCR DNA test Chl", яка містить родоспецифічні олігонуклеотидні праймери, що обмежують ділянку геному Chlamydophila, та власно розробленою системою праймерів. З метою первинної родової диференціації Chlamydia та Chlamydophila була проведена ампліфікація дослідних зразків ДНК з використанням ПЛР-тест-системи "GenePakТМPCR DNA test Ctr", яка містить видоспецифічні олігонуклеотидні праймери, що обмежують ділянку геному Chlamydia trachomatis. У результаті електрофоретичного розподілу продуктів ампліфікації в агарозному гелі не виявлено присутності інфекційного агенту в жодному із досліджуваних зразків. Таким чином доведено, що виявлений нами збудник хламідіозу належить до роду Chlamydophila, а не до Chlamydia, і може спричинювати захворювання у великої рогатої худоби.

Для підтвердження наявності геному збудника інфекційного ринотрахеїту та перевірки придатності розробленої тест-системи, досліджувана ДНК була проампліфікована з використанням комерційної ПЛР-тест-системи "GenePakТМPCR DNA test BHV-1". Проби ДНК, які позитивно прореагували при використанні власно розробленої тест-системи, показали наявність смуги розміром 355 п.н., що відповідає фрагменту ДНК збудника герпесвірусу великої рогатої худоби 1-го типу за використання комерційної тест-системи.

На підставі даних про наявність геномів збудників інфекційних захворювань вірусної та бактеріальної природи в зразках ДНК від великої рогатої худоби, що отримані за допомогою власно розробленої системи праймерів та підтверджені при використанні комерційних тест-систем, можна стверджувати, що праймери нами підібрано оптимально і вони ефективно спрацювали. Це, у свою чергу, створює підґрунтя для використання розробленого алгоритму при створенні мультиплексних ПЛР-тест-систем для одночасної детекції ДНК двох і більше збудників інфекційних захворювань, перш за все тих, які можуть виступати в асоціації з метою підвищення ефективності біотехнології відтворення сільськогосподарських тварин.

Висновки

Розроблено комплексний підхід щодо оцінки та збереження генетичного різноманіття порід великої рогатої худоби України за використання мікросателітних ДНК-маркерів та системи контамінаційного контролю біоматеріалу, який призначено для створення кріобанку генетичних ресурсів племінного ядра малочисельних зникаючих порід.

Визначено оптимальні методи та умови виділення ДНК із клітин крові, сперми та зіскрібків слизової оболонки вагіни великої рогатої худоби. Для довгострокового зберігання ДНК доцільне використання сольового та фенол-хлороформного методів екстракції (концентрація препаратів ДНК 80-100 нг/мкл та чистота А 260/280 1,8); для проведення експрес-аналізів - сорбенту Chelex-100, для дослідження великої кількості проб ДНК-гуанідинізотіоціанатного методу.

Розроблено мультиплексну ПЛР-тест-систему, як молекулярно-генетичний спосіб контамінаційного контролю біоматеріалу великої рогатої худоби. Створено мультипраймерну систему для ідентифікації ділянки 16S-23S рРНК геному збудників хламідіозу та фрагменту гена глікопротеїну І (gI) вірусу інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби. Визначено оптимальні умови проведення полімеразної ланцюгової реакції для одночасного виявлення контамінантів вірусної та бактеріальної природи.

Досліджено генетичну структуру племінного ядра генофондних стад великої рогатої худоби порід шароле, сірої української та світлої аквітанської за 10-ма мікросателітними локусами ДНК в техніці капілярного електрофорезу. Найбільшим числом алельних варіантів досліджуваних локусів характеризується порода шароле (55 алелей), у сірої української та світлої аквітанської порід ідентифіковано 48 та 49 алелей, відповідно. Найбільш поліморфними є локуси TGLA53 (10 алелей у шароле та 8 алелей у світлої аквітанської порід) та TGLA227 (8 алелей у сірої української породи).

Розкрито статистично вірогідні унікальні алельні варіанти в особин породи шароле (за мікросателітними локусами INRA023 - 200 п.н. та 218 п.н., TGLA53 - 154 п.н. та 176 п.н., ETH3 - 123 п.н.) та унікальні алелі у тварин сірої української породи (за локусами INRA023 - 196 п.н. та 216 п.н., TGLA53 - 172 п.н., TGLA126 - 111 п.н. та 125 п.н., TGLA227 - 79 п.н. та ETH225 - 152 п.н.), які можуть слугувати високоінформативними породоспецифічними маркерами.

Встановлено відносне зниження генетичної різноманітності породи шароле (Н = 0,61 та Е = 3,35), порівняно з сірою українською (Н = 0,67 та Е = 3,50) та світлою аквітанською (Н = 0,66 та Е = 3,51), відмічено істотну перевагу гомозиготних генотипів над гетерозиготними за мікросателітними локусами ЕТН 10 - 87,0 %, TGLA126 - 56,5 %, ETH225 - 52,2 % у породи шароле.

Виявлений низький рівень генетичної дистанції між породами шароле та світлою аквітанською (0,1299) відбиває характер історичних зв'язків між ними і свідчить про ефективність використання обраних мікросателітних локусів для оцінки генетичної диференціації порід великої рогатої худоби.

Виявлено високий поліморфізм досліджуваних 10-ти мікросателітних локусів (РІС та Н 0,5), що вказує на ефективність використання цих послідовностей ДНК при вивченні генетичної структури великої рогатої худоби породи шароле, сірої української та світлої аквітанської порід, а також при проведенні індивідуальної паспортизації та контролю походження тварин.

Запропоновано алгоритм сертифікації зразків ДНК аборигенних та зникаючих порід великої рогатої худоби, які підлягають довгостроковому збереженню, за умов ідентифікації унікальних алелей мікросателітних локусів та створення "паспорту якості" біоматеріалу з обов'язковим контамінаційним контролем ДНК.

Пропозиції виробництву

1. Для збереження генетичного біорізноманіття порід при створенні кріобанків біологічного матеріалу аборигенних та малочисельних порід великої рогатої худоби застосовувати комплексний підхід щодо маркування зразків ДНК за мікросателітними маркерами та ДНК-маркерами контамінаційного контролю.

2. При проведенні протиепідемічних заходів на племпідприємствах та племрепродукторах рекомендуємо використовувати розроблену тест-систему з одночасного виявлення збудників хламідіозу та інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби методом ПЛР.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Шкавро Н.М. Молекулярно-генетичний підхід до діагностики інфекційних захворювань сільськогосподарських тварин на моделі хламідіозу ВРХ / Н.Н. Шкавро, Е.В. Щербак // Науково-технічний бюлетень, № 89 / ІТ УААН. - Харків, 2005. - С. 168-171. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, статистичне опрацювання даних, написано основний текст статті, сформульовано висновки).

2. Шкавро Н.М. Застосування методів ПЛР-аналізу у біотехнології відтворення сільськогосподарських тварин / Н.Н. Шкавро, Е.В. Щербак // Науково-технічний бюлетень, № 91 / ІТ УААН. - Харків, 2005. - С. 159-162. (Дисертантом зібрано та проаналізовано джерела літератури, проведено експериментальні дослідження, підготовлено роботу до друку).

3. Шкавро Н.М. Виявлення ДНК збудників хламідіозу та ІРТ ВРХ за допомогою полімеразної ланцюгової реакції / Н.Н. Шкавро, Е.В. Щербак, І.М. Ксьонз // Біологія тварин. - Львів, 2006. - Т. 8, № 1-2.- С. 255-259. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, статистичне опрацювання даних, написано основний текст статті, сформульовано висновки).

4. Шкавро Н.М. Аналіз генетичної структури м'ясних порід великої рогатої худоби на основі використання мікросателітних маркерів ДНК / Н.М. Шкавро, В.І. Россоха, А. Радко // Науково-технічний бюлетень, № 99 / ІТ УААН. - Харків, 2009. - С. 129-135. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, статистичне опрацювання даних, написано основний текст статті, сформульовано висновки).

5. Россоха В.І. Пошук породоспецифічних генетичних ДНК-маркерів для типування біологічних зразків великої рогатої худоби / В.І. Россоха, Н.М. Шкавро // Науковий вісник ЛНУВМБТ ім. С.З. Гжицького. - 2010. - Т. 12; №2(44), Ч. 3. - С. 211-217. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, статистичне опрацювання даних, написано основний текст статті, сформульовано висновки).

6. Шкавро Н.М. Поліморфізм мікросателітних маркерів ДНК двох порід великої рогатої худоби / Н.М. Шкавро, А. Радко, Е. Слота [та ін.] // Вісник Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. - Серія: біологія. - 2010. - № 905, Вип. 11. - С. 120-126. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, статистичне опрацювання даних, написано основний текст статті, сформульовано висновки).

7. Шкавро Н.Н. Выделение ДНК из соматических и половых клеток млекопитающих / Н.Н. Шкавро, Е.В. Щербак // Матеріали VII Міжнародної науково-практичної конференції "Наука і освіта".- Дніпропетровськ. - 2004. - Т. 56.- С. 12-13. (Дисертантом зібрано та проаналізовано джерела літератури, проведено експериментальні дослідження, підготовлено роботу до друку).

8. Россоха В.И. К вопросу изучения генетической структуры крупного рогатого скота породы шароле на основе использования микросателлитных маркеров ДНК / В.И. Россоха, Н.Н. Шкавро, А. Радко [и др.] // Стратегия развития зоотехнической науки: тезисы докладов Междунар. научно-практ. конф., посвященной 60-летию зоотехнической науки Беларуси. - Жодино: Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству, 2009. - С. 127-129. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, статистичне опрацювання даних, написано основний текст статті, сформульовано висновки).

Размещено на Allbest.ru

...