Цитогенетичний контроль у м'ясному і молочному скотарстві

Размещено на http://www.allbest.ru/

3

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ РОЗВЕДЕННЯ I ГЕНЕТИКИ ТВАРИН

УДК 636.2.033/034:575

ЦИТОГЕНЕТИЧНИЙ КОНТРОЛЬ У М`ЯСНОМУ І МОЛОЧНОМУ СКОТАРСТВІ

03.00.15 генетика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

СТАРОДУБ ЛЮБОВ ФЕОФІЛІВНА

Чубинське 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті розведення і генетики тварин Національної академії аграрних наук України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук Костенко Світлана Олексіївна, Національний університет біоресурсів і природокористування, доцент кафедри розведення і генетики тварин ім. М.А. Кравченка

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук, професор, Димань Тетяна Миколаївна, Білоцерківський національний аграрний університет Міністерства аграрної політики та продовольства України, завідувач кафедри екотрофології

кандидат сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник Метлицька Олена Іванівна, Інститут свинарства ім. О.В. Квасницького Національної академії аграрних наук України, завідувач лабораторії селекції відділу розведення і генетики

Захист відбудеться “ 24 “ червня 2011 року о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 27.355.01 Інституту розведення і генетики тварин НААН за адресою: вул. Погребняка, 1, с. Чубинське, Бориспільський район, Київська область, 08321.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту розведення і генетики тварин НААН за адресою: вул. Погребняка, 1, с. Чубинське, Бориспільський район, Київська область, 08321.

Автореферат розісланий “ 20 “ травня 2011 року

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради Ю.В. Мільченко

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Тваринництво є однією із стратегічних галузей економіки України від якої залежить продовольча безпека держави і якість харчування населення. Збільшення виробництва тваринницької продукції можливе в зв'язку з інтенсифікацією галузі скотарства та підвищення генетичного потенціалу продуктивності худоби (Зубець М.В., 2004; Эрнст Л.К., 2008; Жигачев А.И., 2006).

Цитогенетичний аналіз племінних тварин - невід'ємна частина генетичного моніторингу, що дає змогу виявляти тварин-носіїв конститутивних цитогенетичних аномалій, темпи спонтанного та індукованого соматичного мутагенезу і рівень загальної геномної нестабільності тварин (Качура В.С., 1989; Зиновьева Н.А., 2008). Незважаючи на майже 50-річний досвід проведення цитогенетичного аналізу, нині невизначеним залишається рівень спонтанних цитогенетичних аномалій, оскільки тварини характеризуються індивідуальною мінливістю, пов'язаною з різноманітними факторами: вік, стан нейроендокринної системи, вплив фізичних та хімічних чинників (Ильинских Н.Н., 1988; Gustavsson I., 2000). Залишається до кінця не визначеним вплив напряму продуктивності на спонтанний рівень цитогенетичних аномалій у великої рогатої худоби, який необхідно враховувати під час проведення цитогенетичного моніторингу бугаїв-плідників.

У селекційно-племінній роботі важливо використовувати для відтворення тільки таких тварин, потомство яких успадковує високу продуктивність і не несе генетичного вантажу, а також підвищеної чутливості до мутагенних чинників. Зоотехнічна оцінка тварин за екстер'єром і продуктивністю без врахування даних цитогенетичного тестування не дає повної інформації про племінну цінність тварини. Тому цитогенетичний аналіз є необхідною складовою вивчення генофонду порід великої рогатої худоби.

Метою сучасної цитогенетики є вивчення різних каріотипових аномалій і частоти їх прояву. Саме цитогенетичні методи є провідними під час вивчення мутагенності різних чинників і практично єдиними при аналізі мутабільності геному у тваринництві (Яковлев А.Ф., 1985; Семенов А.С., 2010).

Сьогодні у зв'язку з інтенсифікацію селекційно-племінної роботи у напрямі збільшення молочної продуктивності великої рогатої худоби загострюються проблеми пов'язані з погіршенням відтворних якостей корів голштинізованих порід (Глазко Т.Т., 2000). Це вимагає залучення генетичних методів оцінювання тварин з метою розроблення параметрів цитогенетичного контролю, що дасть змогу прогнозувати продуктивні якості тварин і виявляти серед них особин, які характеризуються резистентністю до захворювань, стабільністю каріотипу, зниженою чутливістю до мутагенних чинників різної природи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася як складова науково-дослідних робіт Інституту розведення і генетики тварин НААН за завданням: «Розробити та впровадити методи генетичної і ДНК-технологічної оцінки генотипів для визначення бажаного типу сільськогосподарських тварин» (№ держреєстрації 0106U005842).

Мета і завдання досліджень. Метою досліджень є встановлення зв`язку цитогенетичної мінливості з продуктивними і відтворними якостями у племінних тварин великої рогатої худоби і дослідження генотоксичного впливу. Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1. Проаналізувати цитогенетичні показники у бугаїв-плідників різного напряму продуктивності та дослідити особливості взаємозв'язку хромосомних аномалій у лімфоцитах периферійної крові з якісними і кількісними характеристиками спермопродукції плідників молочного та м'ясного напрямів продуктивності.

2. Визначити рівень поліплоїдії у соматичних клітинах тварин м'ясного напряму продуктивності з різними генотипами за геном гормону росту.

3. Оцінити рівень соматичного мутагенезу у корів української чорно-рябої молочної породи і встановити асоціацію нестабільності каріотипу з їх продуктивними та відтворними якостями.

4. Встановити вікову і породну мінливість каріотипу, а також вплив умов утримання на частоту хромосомних порушень у великої рогатої худоби.

Об'єкт досліджень: цитогенетична мінливість популяцій великої рогатої худоби. корова м'ясний генотип поліплоїдія

Предмет досліджень: цитогенетичний контроль у м'ясному і молочному скотарстві.

Методи досліджень: цитогенетичні - аналіз метафазних пластинок клітин периферійної крові великої рогатої худоби; мікроядерний тест; молекулярні - полімеразна ланцюгова реакція з наступним рестрикційним аналізом фрагментів ДНК; зоотехнічні - аналіз продуктивності тварин великої рогатої худоби; статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні показано взаємозв'язок хромосомних аномалій у лімфоцитах периферійної крові і якісних та кількісних характеристик спермопродукції плідників молочного та м'ясного напрямів продуктивності. Встановлено асоційований вплив цитогенетичної мінливості на м'ясну продуктивність великої рогатої худоби.

Вперше визначені генетичні механізми зв'язку нестабільності каріотипу з продуктивними та відтворними якостями корів української чорно-рябої молочної породи.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено нові підходи до прогнозування господарсько корисних ознак великої рогатої худоби на основі молекулярних та цитогенетичних маркерів, які дають змогу здійснювати науково обґрунтований підбір плідників для поліпшення продуктивності нащадків; оцінювати рівень хромосомної нестабільності та наявність імовірних мутагенних чинників; виявляти тварин-носіїв конститутивних цитогенетичних аномалій; виділяти тварин із підвищеним рівнем хромосомної нестабільності як групу ризику, пов'язану з порушенням систем репарації та можливими прихованими запальними процесами.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем спільно із науковим керівником сформульовано тему і мету, визначено основні напрями та методи досліджень. Автором роботи опрацьовано та проаналізовано опубліковані за темою дисертації наукові праці вітчизняних та зарубіжних вчених. Дисертантом особисто здійснено весь перелік запланованих лабораторних досліджень: культивування лімфоцитів крові, виділення ДНК, аналіз цитогенетичних препаратів. Проведено інтерпретацію одержаних результатів, статистичну обробки отриманих даних, сформульовано висновки та пропозиції виробництву.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були оприлюднені на звітних сесіях Інституту розведення і генетики тварин НААН України (2007 - 2011 рр.).

Апробація результатів проводилася на ІІ міжнародній конференції молодих учених «Біологія від молекули до біосфери» (Харків, 2007); VІ науковій конференції молодих вчених та аспірантів (Чубинське, 2008); міжнародній науково-методичній конференції, присвяченій 200-річчю від дня народження Ч. Дарвіна і 150-річчю виходу у світ «Походження видів» (Брянськ, 2009); міжнародній науково-практичній конференції «Селекція тварин на сучасному етапі розвитку біологічної науки», присвяченій 100-річчю від дня народження професора М. А. Кравченка» (Київ, 2009); VІІІ науковій конференції молодих вчених та аспірантів (Чубинське, 2010); міжнародній науково-практичній конференції «Методи підвищення ефективності селекції у тваринництві» (Біла Церква, 2010); міжнародному науково-практичному семінарі «Теоретичні основи і практична координація наукових досліджень у селекції сільськогосподарських тварин, гігієнічній профілактиці та біотехнології ведення тваринництва» (Вінниця, 2011); міжнародній науково-практичній конференції «Актуальні проблеми збереження біоресурсів, селекція та відтворення тварин» (Київ, 2011); міжнародній науково-практичній конференції «Зоотехнічна наука: історія, проблеми, перспективи» (Кам'янець-Подільський, 2011).

Публікації результатів досліджень. За темою дисертації опубліковано 15 наукових робіт у наукових журналах, збірниках наукових праць, матеріалах і тезах конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із змісту, переліку умовних позначень, вступу, огляду літератури, матеріалів і методики досліджень, результатів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, пропозиції виробництву, додатків та списку літератури (210 джерел, у тому числі 80 іноземними мовами). Робота містить 135 сторінок комп`ютерного тексту, 32 таблиці, 14 рисунків, 4 додатки.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Обсяг проведених досліджень відображений у таблиці 1, загальна схема досліджень представлена на рисунку 1.

1. Перелік господарств і порід тварин, у яких проведено цитогенетичне тестування

Господарство	Досліджено
	порода	кількість тварин	метафазних пластинок, n
ТЗОВ ЛНВЦ «Західплемресурси	Голштинська (чорно-ряба масть)	9 >	900
	Симентальська	4 >	400
Хмельницьке головплемпідприємство	Голштинська (чорно-ряба масть)	8 >	800
	Абердин-ангус	4 >	400
Війтовецьке племоб`єднання	Голштинська (чорно-ряба масть)	3 >	250
	Абердин-ангус	5 >	500
Менське племоб`єднання	Симентальська	10 >	1000
ТОВ «Агрікор Холдинг»	Поліська м'ясна	13 >	1000
	Шароле	6 >	500
	Абердин-ангус	10 >	900
	Південна м'ясна	10 >	900
	Симентальська	5 >	450
ДСП«ГСЦУ»	Голштинська (чорно-ряба масть)	8 >	800
Всього		95 >	8800
СВК ім. Щорса	Українська чорно-ряба молочна	24 +	2500
СТОВ «Агросвіт»	Українська чорно-ряба молочна	28 +	2800
Всього		52 +	5300

Методика одержання цитогенетичних препаратів із лімфоцитів периферійної крові передбачала таку послідовність етапів: взяття крові, її транспортування, підготовку стерильних флаконів із живильним середовищем, приготування препаратів, забарвлення, фотографування, аналіз метафазних пластинок. У процесі досліджень враховували: кількісні порушення хромосом - анеуплоїдію (А-І; 2n±2) та (А-ІІ; 2n±10), поліплоїдію (ПП), клітини із асинхронністю розщеплення центромірних районів хромосом (АРЦРХ), структурні аберації - розриви хромосом та хроматид.

Мікроядерне тестування проводили на цих самих препаратах, підраховуючи двоядерні лімфоцити (ДЯ), одноядерні лімфоцити з мікроядрами (МЯ), мітотичний індекс (МІ).

Відтворну здатність (об'єм еякуляту (мл); концентрацію сперміїв (млрд./мл); загальну кількість сперміїв в еякуляті (млрд.); рухливість сперміїв (бали); запліднювальну здатність сперміїв від першого осіменіння (%), екстер`єрні особливості бугаїв вираховували за матеріалами племінного обліку (форма №1 - мол., форма №1 - м`яс.).

Аналіз відтворної здатності корів здійснювали за такими показниками: вік першого отелення, тривалість сервіс-періоду, кількість осіменінь. Взаємозв'язок каріотипової мінливості з молочною продуктивністю встановлювали за такими показниками: надій молока за 305 днів першої лактації, жива маса корів у віці 18 місяців.

Оцінювання поліморфізму гена гормону росту (GH) здійснювали методом полімеразної ланцюгової реакції з наступним рестрикційним аналізом фрагментів ДНК (ПЛР-ПДРФ). Для аналізу поліморфізму цього гена використовували рестриктазу - Alu I.

Статистичну обробку отриманих даних здійснювали стандартними методами (Плохинский Н.П., 1974; Меркурьева Е.К., 1991) із використанням комп'ютерної програми Microsoft Excel.

Рис. 1 Схема досліджень

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Цитогенетичний моніторинг плідників великої рогатої худоби різного напряму продуктивності. У каріотипі плідників великої рогатої худоби виявлено спектр спонтанних хромосомних мутацій геномного і структурного типу (рис. 2).

а а	б	в
г	д	е

Рис. 2 Каріотипи плідників великої рогатої худоби: а) у нормі; б) хромосомний розрив; в) хроматидний розрив; г) асинхронне розщеплення центромірних районів хромосом; д) анеуплоїдія (2n=58); е) поліплоїдія (4n=120). Зб. Ч1000 разів

У плідників молочного напряму продуктивності спостерігали найвищий відсоток клітин із асинхронним розщепленням центромірних районів хромосом (табл. 2). Характерною рисою тварин м`ясного напряму продуктивності є високий рівень поліплоїдних клітин.

2. Хромосомний поліморфізм плідників різних напрямів продуктивності, %, (±m)

Напрям продуктивності	Кількість тварин	Вік, роки	Анеуплоїдія-І	Анеуплоїдія-ІІ	Поліплоїдія	АРЦРХ	Розриви хромосом	Розриви хроматид
Молочний	28	2-7	2,4±0,65	2,5±0,55	-	4,5±1,53	1,8±0,42	3,1±0,85
Комбінований	19	2-6	2,0±1,76	-	0,2±0,12	0,3±0,28	2,0±0,87	1,6±1,08
М`ясний	48	1,5-4	0,5±0,23-10,6±2,95	0,2±0,10-7,2±3,80	2,1±0,40-6,9±0,97	-	0,8±0,60-6,4±0,91	0,9±0,60-6,1±3,52

За структурними порушеннями хромосом (хромосомні та хроматидні розриви) плідники трьох різних напрямів продуктивності не мали істотних розбіжностей. Цитогенетична мінливість структурних і кількісних порушень хромосом у досліджених плідників великої рогатої худоби трьох напрямів продуктивності не перевищувала параметрів, встановлених іншими цитогенетиками

Мінливість цитогенетичних параметрів у бугаїв голштинської породи чорно-рябої масті. Найбільший рівень соматичного мутагенезу серед каріотипової мінливості плідників різних підприємств спостерігався у тварин Хмельницького головплемпідприємства (табл. 3).

3. Хромосомний поліморфізм у плідників голштинської породи (чорно-рябої масті), %

Підприємство	Кількість тварин	Вік, роки	Анеуплоїдія -І	Анеуплоїдія-ІІ	АРЦРХ	Розриви хромосом	Розриви хроматид
«Західплемресурси»	9	3	1,7±0,46	2,3±0,50	3,9±0,77	1,6±0,46	2,0±0,50
Хмельницьке головплемпідприємство	4	3	1,5±0,75	2,9±1,35	5,7±1,23*	3,3±1,35	5,2±1,79
Війтовецьке племпідприємство	3	3	2,9±0,76	2,6±1,41	2,7±0,29	1,3±1,05	3,2±1,88
Хмельницьке головплемпідприємство	4	5-7	4,5±1,85	4,0±1,03	9,0±2,35	2,1±1,82	4,3±2,23
ДСП «ГСЦУ»	8	2-4	1,5±0,28	0,9±0,28	1,0±0,20*	0,7±0,26	1,1±0,38

Примітка: *P>0,95

Підвищений рівень А-І і А-ІІ спостерігали у плідників 5-7-річного віку, що може бути обумовлено віковими особливостями цих тварин. Найвищий відсоток клітин з АРЦРХ, який відображає передумови виникнення числових порушень, спостерігали у плідників 3-х та 5-7-річного віку Хмельницького головплемпідприємства (P>0,95). Схожі результати отримано при аналізі хромосомних порушень (хромосомні та хроматидні розриви).. Це свідчить про наявність неврахованого мутагенного чинника, який діяв на тварин Хмельницького головплемпідприємства. Цим чинником могла бути якість води або корму в період взяття крові.

Внутрішньопородна цитогенетична нестабільність у бугаїв симентальської породи. Аналіз каріотипової мінливості у плідників симентальської породи комбінованого напряму свідчить, що кількісні і структурні зміни найбільш виражені у тварин ТОВ «Агрікор Холдинг». Це пояснюється тим, що ці тварини другої генерації і тому менш консолідовані, а також не можна виключити впливу паратипових чинників на тварин (табл. 4).

4. Цитогенетичний моніторинг каріотипової мінливості у плідників комбінованого напряму продуктивності, %

Підприємство	Кількість тварин	Вік, роки	Анеуплоїдія-І	Анеуплої дія-ІІ	Поліплоїдія	АРЦРХ	Розриви хромосом	Розриви хроматид
«Західплемресурси»	4	5	0,3±0,10	-	-	1,3±0,36	1,0±0,58	0,5±0,23
Менське плем-підприємство	4	2-4	1,0±0,58	-	-	-	1,6± 0,70	1,0±0,58
Менське плем- підприємство	6	5-6	0,4±0,13	-	0,60±0,20	-	1,2±0,31	0,7±0,18
ТОВ «Агрікор Холдинг»	5	2-3	6,6±3,15	-	-	-	4,2±2,00	4,4±2,10

Наявність поліплоїдних клітин, а також частота клітин з АРЦРХ у тварин «Західплемресурси» пов'язані з комбінованим напрямом її продуктивності.

Цитогенетичний скринінг каріотипу у плідників м'ясного напряму продуктивності. Аналіз цитогенетичної мінливості плідників м'ясного напряму показав, що кількісні порушення хромосом найбільш виражені у тварин породи абердин-ангус Війтовецького племпідприємства (табл. 5). Асинхронне розщеплення центромірних районів хромосом у даних плідників зустрічається із частотою 8,6 %, що у 4 рази вище показника, встановленого іншими дослідниками (Яковлев А.Ф., 1985; Дзіцюк В.В., 2009). Найвищий відсоток метафаз із хроматидними розривами був характерний для тварин цього господарства, що у 1,6 раза вище за показник, характерний для тварин всієї породи.

5. Цитогенетичні дослідження плідників м'ясного напряму продуктивності, %

Порода	Кількість тварин	Вік, роки	Анеуплоїдія-І	Анеуплоїдія-ІІ	Поліплоїдія	АРЦРХ	Розриви хромосом	Розриви хроматид
ТОВ «Агрікор Холдинг»
Поліська м'ясна	13	2-3	1,2±0,34	0,15	6,9±0,97	-	6,4±0,91	2,1±0,54
Шароле	6	2-3	0,8±0,31	1,1±0,40	-	-	3,5±1,50	3,0±1,31
Абердин-ангус	10	2-3	5,5±1,20	4,7±1,40	6,1±1,16	-	0,75±0,6	0,9±0,66
Південна м'ясна	10	2-3	2,8±1,30	5,0±1,30	2,1±0,40	-	2,4±1,07	3,9±1,20
Хмельницьке головплемпідприємство
Абердин-ангус	4	4	0,5±0,23	3,3±3,11	6,3±6,25	-	1,5±0,88	5,5±5,37
Війтовецьке племпідприємство
Абердин-ангус	5	1,5	10,6±2,95	7,2±3,80	-	8,6±4,75	2,7±1,50	6,1±3,52

Найбільшу кількість метафаз із розривами хромосом спостерігали у плідників поліської м'ясної породи (6,4 %), що могло свідчити про зниження активності імунної системи, оскільки елімінація пошкоджень хромосом залежить від її активності. Таким чином, досліджені тварини поліської породи характеризувалися зниженим імунним статусом.

Вікова мінливість каріотипу у плідників різних напрямів продуктивності. Результати дисперсійного аналізу вікової мінливості каріотипу у плідників голштинської і симентальської порід подано на графіку (рис. 2).

Рис. 2 Вікова мінливість каріотипу у плідників молочного і комбінованого напряму продуктивності

З віком збільшується частота клітин із асинхронним розщепленням центромірних районів хромосом (P>0,95; P>0,99).

Взаємозв'язок цитогенетичних порушень і спермопродукції у плідників молочного напряму продуктивності. Для визначення взаємозв'язку каріотипової нестабільності із запліднювальною здатністю плідників, бугаїв голштинської породи 3-х річного віку господарств ”Західплемресурси”, Хмельницького головплемпідприємства, Війтовецького племпідприємства поділили на групи, залежно від показника запліднювальної здатності сперматозоїдів (табл. 6).

6. Хромосомна мінливість і запліднювальна здатність у плідників голштинської породи, %

№ групи	Кількість тварин	Запліднилося від І осіменіння	Анеуплоїдія-І	Анеуплоїдія-ІІ	АРЦРХ	Розриви хромосом	Розриви хроматид
1	6	66,5±1,50*	1,7±0,50*	0,8±0,72	3,6±0,74*	1,3±0,56	1,6±0,69
2	10	74,2±2,39*	0,5±0,31*	1,22±0,63	3,3±0,86*	1,4±0,50	1,0±0,19

Примітка: *P>0,95

Результати досліджень показали, що у тварин першої групи запліднювальна здатність сперміїв була значно меншою порівняно з тваринами другої групи із достовірною різницею (P>0,95). Було також виявлено підвищену кількість клітин з А-І із достовірною різницею (P>0,95) і тенденцію до підвищеного рівня розривів хроматид у цієї групи тварин. Зв'язок між мінливістю каріотипу і спермопродуктивністю бугаїв визначили за допомогою коефіцієнта кореляції. Усі виявлені зв'язки мали від'ємний характер. Найвищий коефіцієнт кореляції виявили між АРЦРХ та запліднювальною здатністю сперміїв у плідників голштинської породи (r = -0,6590, P>0,95). Значні кореляційні зв'язки було виявлено між розривами хромосом і хроматид та запліднювальною здатністю сперміїв плідників. Вони становили відповідно -0,6153 та -0,6024 (P>0,99). Коефіцієнт кореляції між анеуплоїдією і відсотком запліднення корів становив -0,5330 (P>0,95). Таким чином, цитогенетичний аналіз плідників має цінність для відбору тварин за спермопродуктивністю.

Взаємозв'язок цитогенетичних порушень і спермопродукції у плідників комбінованого напряму продуктивності. Для аналізу запліднювальної здатності сперміїв плідників і каріотипової мінливості бугаїв 5-6-річного віку симентальської породи комбінованого напряму згрупували залежно від показника запліднювальної здатності сперматозоїдів (табл. 7). Одержані результати показали, що тварини першої групи відрізнялися від тварин другої групи запліднювальною здатністю сперміїв. У тварин першої групи спостерігали тенденцію до збільшення клітин із асинхронним розходженням центромірних районів хромосом. Різниця за іншими показниками хромосомної мінливості суттєво не відрізнялася. Кореляційний зв'язок між клітинами з асинхронним розщепленням центромірних районів хромосом і рухливістю сперміїв та їх запліднювальною здатністю зворотній та статистично достовірний (P>0,99 і P>0,999 відповідно). Це означає, що зі збільшенням частоти клітин з АРЦРХ зменшується рухливість та запліднювальна здатність сперміїв.

7. Хромосомна мінливість і запліднювальна здатність у плідників симентальської породи господарств ”Західплемресурси” і Менського племпідприємства, %

№ групи	Кількість тварин	Запліднилося від І осіменіння	Анеуплоїдія-І	Анеуплоїдія-ІІ	АРЦРХ	Розриви хромосом	Розриви хроматид
1	3	68,3±0,40	-	-	1,7±0,69	0,3±0,2	0,7±0,23
2	6	71,7±1,42	0,5±0,17	-	0,7±0,28	0,7±0,28	1,1±0,24

Зв'язок між розривами хромосом та хроматид і показниками спермопродукції від'ємний, проте слабкий. Отже, з підвищенням відсотку хромосомних та хроматидних розривів, знижується запліднювальна здатність сперміїв.

Хромосомна нестабільність каріотипу і відтворна здатність плідників м`ясного напряму продуктивності. У плідників породи абердин-ангус Хмельницького головплемпідприємства 3-х річного віку першої групи відсоток запліднювальної здатності сперматозоїдів нижчий порівняно з тваринами другої групи (P<0,95) (табл. 8).

8. Середні показники хромосомної мінливості і запліднювальної здатності у плідників породи абердин-ангус, (%)

№ групи	Кількість тварин	Запліднилося від І осіменіння	Анеуплоїдія-І	Анеуплоїдія-ІІ	АРЦРХ	Розриви хромосом	Розриви хроматид
1	3	65,5±1,50	-	-	10,0±7,10	0,5±0,33	10,5±9,50
2	3	70,5±0,50	6,1±4,35	1,5±1,0	0,5±0,35	1,0±0,71	-

Плідники першої групи характеризувалися підвищеною кількістю клітин із асинхронним розщепленням центромірних районів хромосом. Структурні порушення у вигляді розривів хроматид були характерні тільки для тварин цієї групи. Наявність клітин із анеуплоїдією (А-І, А-ІІ) характерна для тварин другої групи. Аналізуючи результати проведеного кореляційного зв'язку між показниками спермопродукції і хромосомними порушеннями встановили, що рухливість сперміїв у досліджених плідників породи абердин-ангус найбільше залежить від відсотку клітин із розривами хромосом (r = -0,9623, P>0,95).

Таким чином, цитогенетичний аналіз плідників має прогностичну цінність для відбору тварин за спермопродуктивністю. Доказом цього є попереджуюча діагностика генетичного вантажу плідників породи абердин-ангус Війтовецького племпідприємства. У плідників Джокера 8119, Амура 8053, Лорда 8057, Валета 8055 проявилася спермопродуктивність низької якості (рухливість сперміїв - 3 бали) і вони були вибракувані зі стада.

Провівши цитогенетичну характеристику каріотипу даних плідників, встановили, що у чотирьох вище зазначених тварин відсоток клітин з А-І коливався у межах 9-16 %, а у плідників Амура і Лорда рівень клітин з А-ІІ становив 16-20 %, що суттєво відрізняється від середніх показників у тварин господарств ТОВ «Агрікор Холдинг» і Хмельницького облплемгосподарства. Частота клітин із асинхронним розходженням центромірних районів хромосом у плідників Джокера і Лорда у 5-12 разів вища порівняно з тваринами породи абердин-ангус, дослідженими іншими авторами. Рівень структурних порушень у тварин (хромосомні розриви - у Лорда, Валета; хроматидні розриви - у Джокера і Лорда) - вищий у 7-11 та 1,4-3,6 рази відповідно, порівняно з бугаями ТОВ «Агрікор Холдинг» і Хмельницького головплемпідприємства. Використовуючи дані власних досліджень про від'ємний кореляційний зв'язок між хромосомними порушеннями і запліднювальною здатністю та рухливістю сперміїв у бугаїв різного напряму продуктивності робимо висновок, що підвищений рівень хромосомної нестабільності пояснює репродуктивні властивості цих плідників. На нашу думку, причиною підвищеної каріотипової мінливості у даних плідників є пригнічення імунного статусу організму. Дослідження Н.Н. Ильинских із співавт. (1997) показали, що інгібування систем, які контролюють генетичний гомеостаз організму, призводить до збільшення в організмі частоти клітин з цитогенетичними порушеннями, що може призвести до дисфункціональних змін.

Зв'язок цитогенетичної мінливості з м'ясною продуктивністю у великої рогатої худоби. Головна мета селекції м`ясної худоби - поліпшення м'ясних якостей тварин. Для цього необхідний постійний контроль племінних тварин на наявність у них цитогенетичних аномалій, як складника комплексної генетичної оцінки племінних тварин, особливо, під час породотворчого процесу та породовипробування. Ступінь зв'язку між мінливістю каріотипу і конституцією і екстер'єром у бугаїв ТОВ «Агрікор Холдинг» м'ясного напряму продуктивності таких порід: поліська м'ясна, абердин-ангус, південна м'ясна, шароле визначали за кореляцією між будовою тіла і загальним розвитком тварини та частотами хромосомних порушень. Виявлено позитивний кореляційний зв'язок між кількістю поліплоїдних клітин та від'ємний кореляційний зв'язок між іншими досліджуваними хромосомними аномаліями у периферійній крові з показником конституції і екстер'єру у бугаїв м'ясного напряму продуктивності. Таким чином, цитогенетичний аналіз можна використовувати для відбору плідників м`ясних порід.

Поліплоїдія у соматичних клітинах - один з генетичних маркерів генотипу плідників м'ясних порід. У розв`язанні питань селекції м`ясних порід худоби актуальним є зв`язок поліплоїдії й енергії росту. Встановлено, що поліплоїдія пов'язана із зміною активності генів, а геномні дуплікації в соматичних клітинах, асоційовані з модифікацією білкового обміну.

Метою роботи було вивчення взаємозалежності наявності поліплоїдних клітин, в клітинах крові великої рогатої худоби м'ясного напряму продуктивності і певних алельних варіантів гену гормону росту (GH). Гормон росту ссавців регулює інтенсивність метаболізму білків, які беруть участь у формуванні м'язових тканин. Провели молекулярно-генетичне дослідження поліморфізму гену гормону росту у тварин ТОВ «Агрікор Холдинг» м'ясного напряму продуктивності таких порід: поліська м'ясна, абердин-ангус, південна м'ясна (табл. 9).

9. Розподіл генотипів за геном соматотропного гормону і наявність поліплоїдних клітин у тварин м'ясного напряму продуктивності ТОВ «Агрікор Холдинг»

Генотипи	Тварини з даним генотипом, 30 гол.	Тварини, для яких характерна поліплоїдія, 10 гол.
LL	56,7 %	13,3 %
LV	30 %	20,0 %
VV	13,3 %	0,0 %

У 33,3 % досліджених тварин спостерігали геномні дуплікації у клітинах крові. Загальний аналіз тварин м'ясних порід, у яких спостерігали поліплоїдні метафазні пластинки, свідчить, що найбільше - 56,7 % тварин гомозиготних (LL), гетерозигот (LV) майже удвічі менше - 30 %, а гомозигот (VV) - найменше 13,3 %. Якщо порівняти відсоток тварин із поліплоїдією і відповідним їм генотипом за геном гормону росту, то бачимо таку картину: тварин з генотипом LL - 40 %, з генотипом LV у 1,5 рази більше - 60 % і у тварин з генотипом VV поліплоїдія зовсім не проявилася (рис. 5).



М плр LL LL LL LL LL LV VV LL LL LV LV LL LL LL

Рис. 3 Електрофореграма продуктів ПЛР- ПДРФ аналізу поліморфізму гену GH у плідників великої рогатої худоби

З огляду на те, що поліплоїдію асоціюють із процесами метаболізму білків, на який впливають також продукти гена гормону росту, можна вважати, що дуплікація геному пов'язана з гетерозиготністю за геном гормону росту.

Таким чином, для прогнозу м'ясної продуктивності доцільним є використання цитогенетичних і молекулярно-генетичних маркерів. Можна рекомендувати для селекції тварин, що мають збільшений рівень поліплоїдних клітин при умові зменшення рівнів частот клітин із анеуплоїдією та хромосомними абераціями.

Цитогенетичний моніторинг корів української чорно-рябої молочної породи. Найбільш реальним і дешевим шляхом реєстрації наслідків мутаційного впливу є дослідження хромосомних і геномних змін, тобто цитогенетичні дослідження каріотипової мінливості (Рубан Ю.Д., 2000).

Цитогенетичне тестування корів двох популяцій показало, що у тварин господарства СТОВ «Агросвіт» А-І зустрічалася із частотою 17,8 % (Р>0,999). Це у 1,8 рази більше в порівнянні з тваринами господарства СВК ім. Щорса із достовірною різницею між середніми величинами (Р>0,999). Порівняння прояву А-ІІ у двох групах тварин виявило, що дана мінливість у 4,6 рази частіше зустрічається у корів другої групи порівняно з першою із достовірною різницею між середніми величинами (Р>0,999). Поліплоїдні клітини у лімфоцитах периферійної крові у корів СТОВ «Агросвіт» не були виявлені. Структурні порушення хромосом виражені у вигляді хромосомних і хроматидних розривів (табл. 10).

10. Результати цитогенетичного моніторингу маточного поголів'я української чорно-рябої молочної породи господарств СВК ім. Щорса та СТОВ «Агросвіт»

Кількість тварин	А-І, %	А-ІІ,%	ПП	Хромосомні розриви,%	Хроматидні розриви, %	АРЦРХ, %	МЯ, ‰	ДЯ, ‰	МІ, ‰
СВК ім. Щорса
24	9,9± 7,10***	2,5± 2,50	0,8± 2,10	2,4± 2,30	2,2± 2,10	1,3± 3,10*	2,2± 1,30**	2,9± 1,20**	4,1± 2,70
СТОВ «Агросвіт»
28	17,8± 9,20***	11,5± 6,80	-	5,3±4,82***	3,2±3,78	2,4± 3,58***	3,4± 1,90**	4,0± 2,28**	8,0± 5,26

Примітка: *P>0,95; **P>0,99; ***P>0,999

Частота хромосомних розривів у маточного поголів'я СТОВ «Агросвіт» становила 5,3 % (Р>0,999) і не перевищувала показників, характерних для тварин даної породи. Порівняно з маточним поголів'ям СВК ім. Щорса у тварин СТОВ «Агросвіт» хромосомні розриви зустрічаються частіше удвічі із достовірною різницею середніх величин Р>0,99. Частота хроматидних розривів у корів СТОВ «Агросвіт» у 1,5 рази вища порівняно з тваринами СВК ім. Щорса із недостовірною різницею середніх величин. Водночас аберації хромосом у тварин двох господарств не перевищують середніх показників, характерних для даної породи. Вища частота хромосомних аберацій у корів СТОВ «Агросвіт» свідчить про велику варіабельність тварин. Частота клітин з АРЦРХ у популяції корів СТОВ «Агросвіт» проявлялась у межах 0-21,4 % (середнє значення - 2,4 %, Р>0,999), а у корів СВК ім. Щорса у межах від 0 до 12,5 % (середнє - 1,3 %, Р >0,95).

Аналіз мікроядерного тесту виявив наступне: одноядерні лімфоцити з мікроядрами у корів господарства СТОВ «Агросвіт» зустрічалися з частотою 3,4 ‰, що в 1,5 рази більше, ніж у тварин СВК ім. Щорса із достовірною різницею середніх величин (Р>0,99). Двоядерних лімфоцитів у 1,3 разів більше 4,0 ‰ із достовірною різницею середніх величин (Р>0,99) у худоби СТОВ «Агросвіт» порівняно з СВК ім. Щорса. Однак ці дані не перевищували показників, характерних для тварин дослідженої породи, це свідчило про відсутність прямого токсичного впливу на організм тварин двох господарств.

Вікова мінливість каріотипу молочної худоби. Характеристика хромосомної мінливості корів двох вікових груп показала, що у тварин двох господарств з віком кількість лімфоцитів периферійної крові з А-ІІ та асинхронним розщепленням центромірних районів хромосом збільшується. Спостерігали тенденцію до збільшення хроматидних розривів у тварин старшого віку, на що вказують також результати досліджень інших авторів (Кузнецов С.М., 1986).

Зв'язок хромосомної мінливості з продуктивними якостями і відтворною здатністю корів. Генетичний аналіз на основі цитогенетичних маркерів дає змогу зробити прогноз продуктивності тварин, здійснювати науково обґрунтований підбір батьківських пар. Отримані нами результати дисперсійного аналізу свідчили, що найсильнішим є асоційований вплив хромосомних розривів на тривалість сервіс-періоду (Р>0,99), сила впливу при цьому становила 43 %. Встановили від'ємний (Р>0,95 та Р>0,99), кореляційний зв'язок між хромосомними аномаліями (хроматидними розривами і асинхронністю розщеплення центромірних районів хромосом) і показниками маси тіла телиць у віці 18 місяців. Отже, геномна нестабільність каріотипу та структурні порушення хромосом пов'язані з відтворною здатністю маточного поголів'я та ростом та і розвиток телиць (статева зрілість телиць - жива маса у віці 18 місяців і вік першого отелення). Контроль спонтанного мутагенезу у корів дає можливість виявити і вилучити носіїв високого рівня хромосомних порушень. Такий контроль уможливить прогностичний аналіз генетичної повноцінності потомства, яке може бути отримане від досліджуваних тварин.

Висновки

1. Цитогенетичний аналіз племінних ресурсів тварин є невід'ємним елементом генетичного моніторингу, який уможливлює виявлення тварин-носіїв конститутивних цитогенетичних аномалій і оцінку племінних якостей плідників та маточного поголів'я великої рогатої худоби.

2. Встановлено вірогідний вплив умов утримання бугаїв-плідників різних напрямів продуктивності на асинхронне розщеплення центромірних районів хромосом. У бугаїв голштинської породи частота клітин із асинхронним розщеплення центромірних районів хромосом - 48 % (P>0,95); симентальської - 92 % (P>0,999), у породи абердин-ангус - 26 % (P>0,99).

3. У плідників м'ясного напряму продуктивності виявлено породну мінливість прояву анеуплоїдії (анеуплоідія-І - 74 % (P>0,95), анеуплодія-ІІ - 75 % (P>0,95). Породна відмінність кількість хромосомних та хроматидних розривів не виявлена.

4. Встановлено породну особливість каріотипу плідників. Найвищий відсоток клітин із поліплоїдією (2,6-6,9 %) виявлено у тварин м'ясного напряму продуктивності, а найбільша частота клітин із асинхронним розщепленням центромірних районів хромосом (4,5 %) характерна для бугаїв молочного напряму.

5. Встановлено вікову мінливість прояву асинхронного розщеплення центромірних районів хромосом у бугаїв. У бугаїв голштинської породи сила впливу віку на асинхронне розщеплення центромірних районів хромосом становила 0,2499 (P>0,99), у тварин симентальської породи - 0,2217 (P>0,95).

6. У голштинської та симентальської порід виявлено від'ємну кореляцію асинхронного розщеплення центромірних районів хромосом із запліднювальною здатністю плідників (r = -0,6590, Р>0,95 і r = -0,9381, Р>0,999) відповідно та розривами хромосом (r = -0,6135, Р>0,999) та хроматид (r = -0,6024, Р>0,999) у тварин голштинської породи.

7. Встановлено позитивний кореляційний зв'язок (r =0,510) кількості поліплоїдних клітин у периферійній крові з вираженістю екстер'єрного типу, притаманного бугаям м'ясних порід.

8. На поголів'ї української чорно-рябої молочної породи показано асоційований вплив геномної нестабільності каріотипу на живу масу телиць у віці 18 місяців (анеуплодія-І - 22 %, P>0,99) та структурних порушень хромосом на тривалість сервіс-періоду (хромосомні розриви - 43 %, P>0,99).

9. Між хроматидними розривами, асинхронним розщепленням центромірних районів хромосом і живою масою телиць української чорно-рябої молочної породи у віці 18 міс. визначено від'ємний кореляційний зв'язок (r = -3429, P>0,95; r = -4603, P>0,99).

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. В системі селекції великої рогатої худоби налагодити систематичний контроль стану каріотипу племінних тварин для виявлення носіїв хромосомних та геномних порушень генетично обумовлених.

2. З метою відбору плідників із високим репродуктивним потенціалом проводити цитогенетичний контроль ремонтного молодняку.

3. При відборі племінних бугайців м`ясних порід надавати перевагу тваринам, які мають поліплоїдні клітини, за умови зменшення у їх каріотипі частоти клітин із анеуплоїдією та хромосомними абераціями.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Костенко С. Міжпородна диференціація бугаїв-плідників за цитогенетичними параметрами / Світлана Костенко, Любов Стародуб // Вісник аграрної науки. 2009. № 4. С. 44-45. (Дисертант провела цитогенетичне тестування тварин, статистично опрацювала матеріал, узагальнила одержані результати).

2. Костенко С. Зв'язок спермопродуктивності з мінливістю цитогенетичних параметрів бугаїв-плідників симентальської та голштинської порід великої рогатої худоби / Світлана Костенко, Любов Стародуб // Науковий вісник національного університету біоресурсів і природокористування України. 2009. № 138. С. 246-251. (Дисертант провела цитогенетичне дослідження, проаналізувала результати експерименту і брала участь у обговоренні і написанні статті).

3. Цитогенетична експертиза плідників як один із методів селекції / І. С. Каменська, Й. З. Сірацький, Л. Ф. Стародуб [та ін.] // Розведення і генетика тварин. 2009. № 43. С. 138-144. (Дисертант провела цитогенетичне дослідження, проаналізувала результати експерименту).

4. Молекулярно-генетичний та цитогенетичний аналіз популяції української чорно-рябої молочної породи / І. А. Рудик, К. В. Копилов, Д. М. Басовський, Л. Ф. Стародуб [та ін.] // Технологія виробництва і переробки продукції тваринництва. Біла Церква, 2010. Випуск 4 (72). С. 108-111. (Дисертант теоретично обґрунтувала та самостійно провела цитогенетичний моніторинг досліджуваних тварин).

5. Костенко С. О. Цитогенетичні параметри плідників м'ясного напряму продуктивності великої рогатої худоби / С. О. Костенко, Ю. В. Вдовиченко, Л. Ф. Стародуб // Технологія виробництва і переробки продукції тваринництва. Кам'янець-Подільський, 2010. Випуск 18. С. 98-100. (Дисертант провела цитогенетичне тестування, теоретично обґрунтувала одержані результати, написала статтю).

6. Зв'язок цитогенетичної мінливості із селекційними ознаками молочної худоби / Л. Ф. Стародуб, С. О. Костенко, І. А. Рудик [та ін.] // Вісник Сумського національного аграрного університету. 2010. № 7. С. 135-139. (Дисертант провела цитогенетичне тестування, теоретично обґрунтувала одержані результати, статистично опрацювала матеріал).

7. Костенко С. Вплив цитогенетичних порушень на якість спермопродукції плідників великої рогатої худоби / Світлана Костенко, Любов Стародуб // Науковий вісник національного університету біоресурсів і природокористування України. 2010. № 145. С. 65-73. (Дисертант теоретично обґрунтувала експериментальні дослідження, провела аналіз результатів експерименту, написала статтю).

8. Костенко С.О. Прогноз продуктивності первісток української чорно-рябої молочної породи на основі цитогенетичних та молекулярно-генетичних маркерів / С. О. Костенко, К. В. Копилов, Л. Ф. Стародуб [та ін.] // Наукові доповіді НАУ [електронний ресурс]. 2010. 6 (22). 13 с. режим доступу до журн.: http://nd.nubip.edu.ua/2010-6/10ksomgm.pdf. (Дисертант теоретично обґрунтувала та самостійно провела цитогенетичний моніторинг досліджуваних тварин).

9. Костенко С. Прогноз продуктивності бугаїв м'ясних порід на основі цитогенетичних та молекулярно-генетичних маркерів / С. Костенко, Л. Стародуб // Науковий вісник національного університету біоресурсів і природокористування України. 2011. № 160. С. 266-273. (Дисертант теоретично обґрунтувала експериментальні дослідження, провела аналіз результатів експерименту, написала статтю).

10. Стародуб Л. Ф. Цитогенетичний моніторинг бугаїв-плідників Львівського науково-виробничого центру «Західплемресурси» / Л. Стародуб, С. Костенко // Біологія від молекули до біосфери: ІІ міжнародна конференція молодих учених, 19-21 листопада 2007 р: тези доповідей молодих учених.Х., 2007. С. 162-163.

11. Стародуб Л. Ф. Цитогенетична експертиза плідників / Л. Ф. Стародуб // Матеріали VІ наукової конференції молодих вчених та аспірантів, 20 травня 2008 року, с. Чубинське. К.: Аграрна наука, 2008. С. 88-89.

12. Стародуб Л. Ф. Нестабильность генома - один из путей эволюции кариотипа у крупного рогатого скота / Л. Ф. Стародуб // Современные проблемы эволюционной биологии: международная научно-методическая конференция, посвященная 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина и 150-летию выхода в свет «Происхождения видов», 12-14 февраля 2009 г. Брянск, 2009. Т. 11. С. 278-282.

13. Стародуб Л. Ф. Аналіз відтворної здатності плідників великої рогатої худоби різного напряму продуктивності та оцінка рівня їх соматичного мутагенезу / Л. Ф. Стародуб // Матеріали VІІІ наукової конференції молодих вчених та аспірантів, Чубинське, 13 травня 2010. К.: Аграрна наука, 2010. С. 70-71.

14. Стародуб Л. Роль цитогенетичних маркерів при прогнозі продуктивності великої рогатої худоби / Л. Стародуб, С. Костенко // Зоотехнічна наука: історія, проблеми, перспективи: міжнародна науково-практична конференція. Камянець-Подільський, 2011. С. 204-206.

АНОТАЦІЯ

Стародуб Л.Ф. Цитогенетичний контроль у м'ясному і молочному скотарстві. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут розведення і генетики тварин НААН України, с. Чубинське, Київської області, 2011.

У дисертаційній роботі науково обґрунтовано підходи до оцінки хромосомної мінливості у плідників молочного, комбінованого і м'ясного напряму продуктивності. Встановлено, що кількісні порушення хромосом залежать від напряму продуктивності тварин. Найвищий відсоток клітин із поліплоїдією (2,6-6,9 %) виявлено у тварин м'ясного напряму продуктивності, а найбільша частота клітин із асинхронним розщепленням центромірних районів хромосом (4,5 %) характерна для бугаїв молочного напряму. Для прогнозу м'ясної продуктивності доцільним є використання цитогенетичних та молекулярних маркерів.

Встановлено вікову залежність прояву частоти клітин із асинхронним розщепленням центромірних районів хромосом у бугаїв різного напряму продуктивності.

Зв'язок між мінливістю каріотипу і спермопродуктивністю бугаїв визначили за допомогою коефіцієнта кореляції. Усі виявлені зв'язки мали зворотній характер. Найвищий коефіцієнт кореляції виявили між АРЦРХ і запліднювальною здатністю сперміїв у плідників голштинської породи (r = -0,6590, P>0,95). Значні кореляційні зв'язки було виявлено між розривами хромосом і хроматид та запліднювальною здатністю сперміїв плідників, вони становили відповідно -0,6153 і -0,6024 (P>0,99). Коефіцієнт кореляції між анеуплоїдією і відсотком запліднення корів становив -0,5330 (P>0,95). Таким чином, цитогенетичний аналіз плідників має цінність для відбору тварин за спермопродуктивністю.

Визначено від'ємний кореляційний зв'язок між хроматидними розривами, асинхронним розходженням центромірних районів хромосом і живою масою телиць української чорно-рябої молочної породи у віці 18 місяців

Ключові слова: голштинська порода (чорно-ряба масть), симентальська порода, м'ясні породи великої рогатої худоби, соматичний мутагенез, каріотипова мінливість, поліплоїдія, анеуплоїдія, хромосомна аберація, хроматидна аберація, гормон росту, спермопродуктивність.

АННОТАЦИЯ

Стародуб Л.Ф. Цитогенетический контроль в молочном и мясном скотоводстве. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт разведения и генетики животных НААН Украины, с. ...