ДНК–діагностика генетичних ресурсів великої рогатої худоби

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДНК-діагностика генетичних ресурсів великої рогатої худоби

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора сільськогосподарських наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Насиченість продовольчого ринку якісними продуктами вітчизняного виробництва в достатньому обсязі неможлива без інтенсифікації тваринництва, де однією із складових є ефективна селекція. Генетичний потенціал сільськогосподарських тварин прийнято розглядати з точки зору можливості формування генних комплексів, здатних у певних умовах середовища детермінувати бажаний фенотип. Завдяки розвитку генетики кількісних ознак було сформульовано припущення про те, що наявність детальної інформації про тісно зчеплені гени могла б уможливити молекулярно-генетичне маркірування «головних» генів кількісних ознак, а відтак прогнозувати і отримувати генотипи новонароджених тварин за бажаними фенотиповими ознаками.

На рівні порід, стад, споріднених груп генетичні маркери дають можливість отримувати інформацію щодо особливостей племінного матеріалу, оцінювати різноманітність генофонду популяцій, що селекціонуються, прогнозувати зміни, пов'язані з селекційними факторами, виявляти потенційно високопродуктивних тварин у ранньому віці, прогнозувати результати добору при здійсненні спрямованого підбору батьківських пар за генотипом (Буркат В.П., 1985, 1996; Зубець М.В., 1996, 1998; Єфіменко М.Я., 1993; Подоба Б. Є., 1980, 1991).

ДНК-діагностика (генна діагностика) дає можливість, з одного боку, керувати генетичною структурою популяції, підтримуючи оптимальний баланс її алелофонду, з іншого - проводити аналіз генотипу тварин на рівні генів, асоційованих з господарсько-корисними ознаками (Заид А., 2008; Зиновьева Н.А., 2006). Такі гени відносяться до так званих локусів кількісних ознак, QTL (Quantitative Trait Loci's) (Daetwyler H.D., 2008, Ashwell M.S., 2004; Lipkin Е., 2008; Viitala S.M., 2003; Bagnato A., 2008).

Ідентифікація генів та їх мутацій, які визначають напрям і ступінь розвитку кількісної ознаки (QTL), в європейських країнах і США уможливлює отримання великих прибутків за рахунок скорочення генераційного інтервалу, раннього введення маточного поголів'я у процес відтворення та застосування селекції з допомогою маркерів (MAS). За маркерної селекції проводять підбір батьківських пар за комплексом певних генотипів і отримують нащадків із відповідним генетичним потенціалом щодо основних показників продуктивності (Heyen D.W., 1999; Mosig M.O., 1998, 2001; Weller I., 2003, 2008; Alison V. E, 2007; Dekkers C.M., 2004; Gomez-Raya L., 2002).

Тваринництво України нині потребує впровадження нових методів та підходів, які ґрунтуються безпосередньо на аналізі спадкової інформації на рівні регуляторних або структурних ділянок генів в основі якого лежить використання поліморфізму ДНК. На пошук шляхів вирішення цієї проблеми спрямовувалися дослідження і розробки данної роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась як складова науково-дослідних робіт Інституту розведення і генетики тварин НААН за завданнями: «Розробити та впровадити методи генетичної і ДНК-технологічної оцінки генотипів для визначення бажаного типу сільськогосподарських тварин» (№ держреєстрації 0106U005842), «Збереження генофонду сільськогосподарських тварин» (№ держреєстрації 0106U1005845).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - теоретично обґрунтувати і експериментально відпрацювати методологію визначення поліморфізму ДНК за локусами кількісних ознак (QTL) для генетичної оцінки порід великої рогатої худоби і застосування отриманої молекулярно-генетичної інформації у селекційно-племінній роботі.

Для реалізації поставленої мети вирішувалися наступні завдання:

- встановити особливості тварин української чорно-рябої молочної породи за поліморфними локусами капа-казеїну (к-Cn), бета-лактоглобуліну (вLG), гормону росту (GH), лептину (LEP), гіпофізарно-специфічного фактора транскрипції (PIT-1);

- визначити генетичну структуру тварин української червоно-рябої молочної породи за локусами кількісних ознак;

- вивчити особливості генетичної структури тварин симентальської породи за розподілом алельних варіантів генів к-Cn, вLG, GH, LEP, PIT-1, MSTN;

- здійснити порівняльний аналіз генетичної структури за алельними варіантами QTL української чорно-рябої молочної, української червоно-рябої молочної, симентальської та голштинської порід великої рогатої худоби;

- оцінити генетичний потенціал плідників і детермінацію молочної продуктивності локусами кількісних ознак;

- вдосконалити методику одержання високоочищеної ДНК із кріоконсервованої сперми бугаїв;

- розробити та уніфікувати методологію визначення статі та генотипу за локусами кількісних ознак у доімплантаційних ембріонів великої рогатої худоби;

- розробити комплексну систему організації молекулярно-генетичної оцінки тварин та проведення робіт із ДНК-діагностики.

Об'єкт дослідження - поліморфізм генів, асоційованих з господарсько-корисними ознаками у великої рогатої худоби.

Предмет дослідження - особливості генетичної структури племінних ресурсів великої рогатої худоби за локусами кількісних ознак.

Методи дослідження - молекулярно-генетичні - екстракція нуклеїнової кислоти, визначення чистоти та концентрації ДНК, ампліфікація фрагментів ДНК методом сайт-специфічної полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з наступним рестриктним аналізом (метод ПЛР-ПДРФ - поліморфізм довжин рестриктних фрагментів), метод горизонтального електрофорезу ДНК в агарозному гелі; біометричний (статистичний аналіз одержаних результатів із застосуванням комп'ютерних програм «BIOSIS-1», «Statistica», «Gen Alex 6»).

Наукова новизна роботи. Теоретично обґрунтовано і експериментально доведено перспективність використання ДНК-поліморфізму генів кількісних ознак (QTL) в селекційно-племінній роботі з великою рогатою худобою в Україні.

Здійснено молекулярно-генетичний аналіз особливостей генетичної структури основних комерційних порід великої рогатої худоби за локусами кількісних ознак.

Доведено ефективність поєднання аналізу структури популяцій і селекційно-генетичної оцінки маркерного ефекту для добору бажаних генотипів. Розглянуто зв'язок продуктивності тварин і структурованості популяцій великої рогатої худоби за класом ПДРФ ДНК-маркерів, визначено бажані генотипи для підвищення потенціалу порід за надоєм і жирномолочністю.

Встановлено специфіку тварин новостворених української чорно-рябої молочної і української червоно-рябої молочної порід за локусами кількісних ознак. Визначено параметри формування оптимальної структури порід за досліджуваними маркерами.

Оптимізовано методологію одержання високоочищеної ДНК із кріоконсервованої сперми бугаїв-плідників та визначення генотипу тварин на ранніх етапах їх онтогенетичного розвитку. Показано доцільність використання сперми плідників з метою створення банку ДНК.

Уперше розроблено систему генетичного моніторингу великої рогатої худоби за ДНК-маркерами, використання якої в скотарстві України створює передумови для впровадження у виробництво елементів геномної селекції на основі добору бажаного племінного матеріалу на ранніх етапах онтогенезу.

Практичне значення одержаних результатів. Використання отриманих у роботі результатів щодо визначення генотипу тварин за локусами кількісних ознак дозволяє поряд із класичними методами селекційно-племінної роботи підвищувати генетичний потенціал популяцій тварин шляхом цілеспрямованого підбору батьківських пар з метою отримання нащадків бажаного типу за молочною продуктивністю.

На основі одержаних результатів розроблені «Рекомендації з використання спадкового поліморфізму в племінному тваринництві України», «Інструкція з геномного типування в молочному, молочно-м'ясному та м'ясному скотарстві для проведення генетичних досліджень за ДНК-маркерами», «Рекомендації з організації і проведення ДНК-діагностики великої рогатої худоби», рекомендації з комплексної системи молекулярно-генетичної оцінки тварин та методології проведення робіт з ДНК-діагностики «ДНК-діагностика великої рогатої худоби в системі геномної селекції», які розглянуті та рекомендовані до впровадження у виробництво Секцією виробництва та переробки продукції тваринництва і птахівництва Науково-технічною радою Міністерства аграрної політики України (протокол №5 від 15 грудня 2009 р. та протокол №5 від 14 грудня 2010 р.). За результатами роботи одержано п'ять актів впровадження.

Матеріали наукових досліджень використовуються у навчальному процесі Національного технічного університету «Київський політехнічний інститут» (факультет біотехнології і біотехніки) у рамках дисципліни «Генетична інженерія в біотехнології» та у Дніпропетровському державному аграрному університеті на курсах «Генетика у ветеринарній медицині» та «Загальна генетика з біометрією».

Особистий внесок здобувача. Дисертантом розроблено концептуальні підходи до аналізу наукових першоджерел, огляду літератури, проведено аналіз та узагальнення отриманих результатів. Розроблено схему і методику проведення молекулярно-генетичних досліджень та виконано експериментальну програму запланованих робіт. Використання в роботі частини матеріалів експериментальних досліджень, в яких дисертант брав безпосередню участь, погоджено зі співавторами спільних публікацій.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень викладено в доповідях на наукових конференціях молодих учених та аспірантів Інституту розведення і генетики тварин НААН (Чубинське, 2006-2009), творчій дискусії «Проблеми збереження генофонду тварин» (Київ, 2007), щорічних творчих дискусіях та наукових звітах Інституту розведення і генетики тварин НААН (Чубинське, 2007-2009), міжнародній науково-практичній конференції «Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики» (Львів, 2007), ІV міжнародній конференції «Фактори експериментальної еволюції організмів» (Алушта, 2008), міжнародному семінарі «Сучасний стан системи біобезпеки в Україні: значення міжнародного досвіду та вимог для вдосконалення законодавчої бази», міжнародній науково-практичній конференції «Селекція тварин на сучасному етапі розвитку біологічної науки» (Київ, 2009), науково-практичній конференції «ДНК-технології у тваринництві і рослинництві» (Біла Церква, 2009), міжнародному форумі «Лабораторне обладнання для проведення ДНК-аналізу» (Київ, 2007), міжнародній науково-практичній конференції «Сучасні методи репродукції сільськогосподарських тварин: стан і перспективи розвитку» (Харків, 2008), міжнародній науково-практичній конференції «Сучасні технології у тваринництві та їх адаптація до світових вимог» (Харків, 2009), III міжнародній науково-практичній конференції «Аграрний форум-2010» (Суми, 2010), міжнародній науково-практичній конференції «Методи підвищення ефективності селекції у тваринництві (Біла Церква, 2010), VI міжнародній конференції «Фактори експериментальної еволюції організмів» (Алушта, 2010), науково-практичній конференції, присвяченої пам`яті академіка В.П. Бурката «Методологія наукових досліджень з питань селекції, генетики та біотехнології у тваринництві» (Чубинське, 2010), міжнародній науково-практичній конференції «Зоотехнічна наука Поділля: історія, проблеми, перспективи» (Кам'янець-Подільський, 2010), міжнародній науково-практичній конференції «Стан, проблеми та перспективи розвитку сучасної аграрної науки і практики» (Львів, 2010).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 34 наукові праці у наукових журналах, збірниках, матеріалах і тезах конференцій, з них - 25 у фахових виданнях, 3 рекомендації, 1 інструкція.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, 8 розділів результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків і практичних пропозицій. Роботу викладено на 304 сторінках. Ілюстративний матеріал представлений 30 таблицями і 50 рисунками. Список літератури містить 425 джерел, з яких 316 - іноземних авторів.

Матеріал і методи досліджень

У роботі використані зразки крові та сперми тварин української чорно-рябої молочної (125 голів), української червоно-рябої молочної (90 голів), симентальської (112 голів) та голштинської (53 голови) порід великої рогатої худоби, у загальній кількості 380 голів, з різних господарств та племпідприємств України: ДП ДГ «Христинівське», ВАТ НВО «Прогрес» Черкаської області; ТОВ «Генетичні ресурси», ЗАТ «Агро-регіон», СВК ім. Щорса, ТОВ «Агрофірма Київська» Київської області; ВАТ «Менське підприємство по племінній справі в тваринництві» Чернігівської області; ВАТ «Хмельницьке головплемпідприємство», ВАТ «Війтовецьке племпідприємство» Хмельницької області; Банк генетичних ресурсів тварин ІРГТ НААН.

Характеристику поліморфізму досліджуваних генів визначали методом ПЛР-ПДРФ (Grodziker T., 1974; Alexander G., 1988; Сулимова Г., 1992, 2002). Геномну ДНК виділяли з периферійної крові тварин за методикою Маніатіс Т. та ін. (1984); Зинов'євої Н.А. (2002) та з використанням стандартного комерційного набору «ДНК-сорб В» виробництва «Амплісенс» (Росія), згідно з рекомендаціями виробника. Концентрацію ДНК перевіряли шляхом електрофорезу в 2% агарозному гелі. Для проведення полімеразної ланцюгової реакції в роботі використовували реакційну суміш об'ємом 10 мкл: дH₂O - 4.3 мкл, Буфер - ПЛР 5-х (15 м Мg - 1,0 мол) - 2,0 мкл; dNTP суміш 10-х (2мМ кожного) - 0,8 мкл; два праймера (70 нг кожного) - 0,8 мкл; Taq-полімеразу (1 мол/1000 U) - 0,1 мкл; ДНК 50-100 нг - 2,0 мкл.

Температурний режим і кількість циклів ПЛР - ампліфікації для кожного гену були визначені окремо. Ампліфікацію фрагментів досліджуваних генів проводили з використанням наступних праймерів: для локусу капа-казеїну, к-Cn: (5^/-GAAAТСCCТАССАТCAАТACC-3^/ та 5^/ССАTСTАС СTАGTTТAGATG-3^/) (Eggen A., 1998, Pider D., 1991); бета-лактоглобуліну, вLG: (5^/-GTG CTGGACACCGACTACAAAAAG-3^/ та 5^/-GCTCCCGGTATATGACCACCCTCT-3^/ (Medrano D., 1990); гормона росту, GH: (5^/-GСTGСTССTGАGGGСССTТС-3^/ та 5^/ - GСGGСGGСАСТTСАTGАССС-3^/) (Napolitano J., 2001); лептину, LEP: (5^/ - GТСАССАGGАTCААТGАСАТ-3^/; та 5^/-АGСССАGGААТGААGТССАА-3^/') (Pomp D., 1997); гіпофізарно-специфічного фактору транскрипції, PIT-1: (5^/-CAAТ GAGААAGТTGGТGC-3^/ та 5^/-TСTGСАTTCGAGATGCTC-3^/) (Moody J., 1996); міостатину, MSTN: (5^/-TCTAGGAGAGATTTTGGGCTT-3^/ і 5^/-TGGGTATGAGGATACTTTTGC-3^/) (Grobet L., 1997). Для аналізу поліморфізму структурних локусів к-Cn, вLG, GH, PIT-1, LEP, використовували рестриктази, підібрані до кожного локусу, крім MSTN, типували відразу після проведення ПЛР - аналізу (Grobet L., 1997) (табл. 1). Склад суміші для рестрикцій був наступним: H₂O - 3,0 мкл, буфер (10mM MgCl₂,100 mM KCl, 0,1 mg/ml BSA) - 1,5 мкл, рестриктаза - 0,5 мкл, ПЛР - продукт - 10 мкл.

Продукти рестрикції розділяли методом електрофорезу у 2% агарозному гелі з наступним їх фарбуванням у розчині бромистого етидію. Візуалізацію здійснювали на трансілюмінаторі в УФ світлі з наступним фотографуванням електрофореграм цифровою камерою. Диференціацію ампліконів за розмірами проводили за допомогою маркера молекулярної ваги GeneRuler TM 50 bp DNA Ladder, # SM0378, («Fermentas», Литва).

Генетико-популяційний та біометричний аналіз отриманих результатів проводили за використанням методів математичної статистики (ч², критерій Стьюдента, Фішера) (Плохинский Н.А., 1969; Животовский Л.А., 1991; Шебаніна О.В., 2008), а також за допомогою стандартних комп'ютерних програм «GenAlex6», «BIOSIS-1», «Statistica» (Swofford D., 1982).

Рестриктази, використані в роботі

Результати досліджень

Порівняльний аналіз генетичної структури популяцій великої рогатої худоби за локусами кількісних ознак (QTL). Отримані результати щодо встановлення особливостей генетичної структури за локусами: к-Cn, вLG, GH, LEP, PIT-1 та MSTN чотирьох порід великої рогатої худоби дали змогу провести порівняльний аналіз їх генофондів за досліджуваними генами.

За локусом капа-казеїну частота генотипу АА становила відповідно 0,664, 0,778, 0,793 для тварин української чорно-рябої молочної, української червоно-рябої молочної та голштинської порід, гомозиготні за алелем А тварини зустрічалися з частотою 0,467 в симентальській породі.

У популяціях голштинської і української червоно-рябої молочної порід гомозиготні тварини з генотипом ВВ не були виявлені, в українській чорно-рябій молочній породі гомозиготні тварини зустрічалися з частотою 0,024, що в 4,5 рази менше, ніж у тварин комбінованого напряму продуктивності (симентальської породи), для яких цей показник становив 0,108. За розподілом алелів найбільш подібними виявилися українська чорно-ряба молочна, українська червоно-ряба молочна та голштинська породи, у яких частота алеля А становила 0,820, 0,888, 0,896, відповідно. Значно нижчу частоту цього алеля спостерігали у тварин симентальської породи - 0,679.

За локусом к-Cn для тварин молочного напряму продуктивності встановлено закономірність щодо зниження частоти алеля В з підвищенням молочності; частота В алельного варіанту у тварин української чорно-рябої молочної породи становить 0,180, української червоно-рябої молочної породи - 0,112 і у голштинської породи - 0,104, проти 0,320 у сименталів (р < 0,01).

Подібність за генетичною структурою і низька концентрація В-алельного варіанту вітчизняних порід пояснюється тим, що при їх створенні використовували бугаїв голштинської породи, в якій частота цього алеля не більше 20%. За частотою алеля В відзначено відмінність бугаїв (20,7%) порівняно з коровами української чорно-рябої молочної породи (33,6%) та української червоно-рябої молочної породи (22,2%), що пов'язано з жорсткішим відбором бугаїв. Можна припустити, що різні фактори штучного добору впливають на елімінацію В алеля цього гена, одним з яких є добір тварин за ознакою надою і, таким чином, збільшується концентрація тварин носіїв алеля А.

За локусом вLG у досліджених порід виявлено переважну кількість тварин з генотипом АВ. Вірогідність відхилення фактичного розподілу генотипів від теоретично очікуваного за цим локусом у тварин української чорно-рябої молочної і української червоно-рябої молочної порід статистично значима (р < 0,01). Частота цього генотипу у тварин української чорно-рябої молочної і української червоно-рябої молочної порід майже однакова: відповідно 0,576 та 0,578, і наближена до частоти цього генотипу у тварин голштинської породи 0,566, для сименталів кількість гетерозиготних тварин дещо менша - 0,489. Частота гомозиготних тварин з генотипом ВВ однакова в української чорно-рябої молочної і української червоно-рябої молочної порід і становила 0,344, у голштинів - 0,302, а у сименталів - 0,359.

Генотип АА за локусом бета-лактоглобуліну у тварин симентальської породи становить - 0,152, а в популяціях української чорно-рябої молочної і української червоно-рябої молочної значно нижче, відповідно - 0,08 і 0,078, водночас у тварин голштинської породи - 0,132. Отримані результати свідчать, що як і за локусом капа-казеїну за розподілом частот алелів і генотипів локуса бета-лактоглобуліну спостерігається подібність генетичної структури популяцій тварин української чорно-рябої молочної, української червоно-рябої молочної і голштинської порід.

У результаті проведення міжпородного аналізу за локусом GH отримані результати щодо розподілу частот алелів та генотипів.

У популяціях української червоно-рябої молочної і голштинської порід не виявлені тварини, гомозиготні за алельним варіантом V локуса гормону росту, в популяції української чорно-рябої молочної породи їх частка була незначною - 0,056, а в симентальській породі особини бажаного генотипу становили 0,207. Частота гетерозиготного генотипу LV була наступною: українська чорно-ряба молочна - 0,328, українська червоно-ряба молочна - 0,167, голштинська - 0,207 і симентальська - 0,391. Для тварин молочного напрямку продуктивності характерною виявилася висока частота гомозигот LL порівняно з тваринами симентальської породи, у яких частота цього генотипу складала 0,402, а у тварин української чорно-рябої молочної, української червоно-рябої молочної і голштинської - 0,616, 0,833, 0,793, відповідно. Частота алеля L була найнижчою у тварин симентальської породи - 0,598. За цим локусом також встановлено подібність генетичної структури досліджених порід великої рогатої худоби молочного напряму продуктивності.

Симентальська порода за локусом PIT-1 проти інших порід характеризується високою частотою гомозигот ВВ, яка становила 0,719, гомозиготні особини за А алелем не були взагалі виявлені, частота гетерозигот АВ була на рівні 0,281. Для тварин молочних порід: української чорно-рябої молочної, української червоно-рябої молочної, голштинської розподіл як за частотою генотипів, так і алельних варіантів був подібним.

Частота генотипу АА у тварин української чорно-рябої молочної, української червоно-рябої молочної і голштинської порід становила 0,192, 0,155 та 0,208, відповідно. Гомозиготи за В-алелем розподілялась наступним чином: українська чорно-ряба молочна порода - 0,320, українська червоно-ряба молочна - 0,278, голштинська - 0,375. Симентальська порода за локусом PIT-1 на відміну від інших порід відзначається високою частотою гомозигот ВВ, яка становила 0,719, гомозиготні тварини за А-алелем не були виявлені. Частота алеля А у молочних порід української чорно-рябої молочної, української червоно-рябої молочної і голштинської порід - 0,436, 0,438, 0,416 відповідно, що пов'язано, як з напрямом продуктивності, так із історією створення вітчизняних порід.

За локусом LEP в української чорно-рябої молочної породи виявилений такий розподіл генотипів: АА - 0,616, АВ - 0,344, ВВ - 0,04, а в симентальській породі: АА - 0,598, АВ - 0,402, гомозиготних тварин з генотипом ВВ виявлено не було. Частота алеля А в української чорно-рябої молочної породи становила 0,788, а симентальської - 0,799.

Результати генетико-популяційних досліджень трьох молочних порід і однієї комбінованого напряму продуктивності свідчать про перспективність оцінювання рівня гетерогенності популяцій за досліджуваними локусами QTL в окремих стадах при визначенні ступеня селективного тиску (табл. 2).

Генетична мінливість популяцій української чорно-рябої, української червоно-рябої, голштинської та симентальської порід за локусами к-Cn, вLG, GH, PIT-1

Загалом за популяційно-генетичними параметрами за дослідженими QTL локусами встановлено незначний рівень гетерогенності порівнюваних популяцій. Так, коефіцієнт гомозиготності (Сa) коливався в межах від 0,508 в української чорно-рябої молочної породи за локусом PIT-1 до 0,848 в української червоно рябої-молочної породи за локусом GH. Ефективна кількість алелів (Ne), що є відображенням рівня поліморфності кожного діалельного локусу, коливалася в незначних межах: від 1,179 в української червоно-рябої молочної породи до 1,969 в популяції корів української чорно-рябої молочної породи. Досить значний розмах мінливості зафіксовано для тварин української червоно-рябої молочної породи, оскільки рівень фактичної гетерозиготності (H_o) варіював від 0,167 за геном гормону росту до 0,578 для локусу вLG, що може свідчити про наявність генетико-автоматичних процесів, пов'язаних із «прилиттям» крові голштинської породи. Загалом для всіх досліджуваних порід характерне переважання очікуваної гетерозиготності над фактичною.

Молекулярно-генетичне тестування тварин чотирьох порід дало змогу визначити ступінь їх генетичної диференціації (табл. 3).

Генетична диференціація порід

Мінімальна генетична дистанція зафіксована між тваринами української червоно-рябої та голштинської порід, максимальна - між українською червоно-рябою та симентальською породами. Це цілком відповідає характеру відмінностей досліджених популяцій.

Накопичення в популяціях гетерозиготних генотипів може бути наслідком використання плідників із відповідним комплексом генів. Не є винятком механізм залучення в селекційний добір гетерозиготних особин, оскільки вони зазвичай є більш адаптованими до технологічних умов утримання та забезпечують підвищення показників продуктивності. Відмітимо окремо значення фіксаційного коефіцієнта (F) в межах різних порід. Так, показник -0,003 в української чорно-рябої молочної породи може свідчити про селективну нейтральність цього локусу, тобто розповсюдження генотипів за цим локусом не відхиляється від теоретично очікуваного за Гарді-Вайнбергом (ч² - 0,405). Навпаки, для симентальської породи, значення фіксаційного коефіцієнта за геном гормону росту дорівнює (+0,395), що може бути наслідком гомогенного внутрішньо-популяційного підбору, внаслідок чого збільшилася кількість гомозиготних генотипів. За локусом GH це призводить до збільшення концентрації генотипів VV, асоційованих з підвищеною жирномолочністю, що є характерним лише для симентальської породи комбінованого напряму продуктивності.

Таким чином, розподіл частот алелів та генотипів, їх формування визначається особливостями селекційної роботи, яка проводиться з кожною породою окремо, відповідно до її належності напряму продуктивності і не пов'язаний з використанням споріднених схрещувань при розведенні тварин та їх належності до однієї чи декількох ліній. Отримана інформація додатково до класичних методів селекційно-племінної роботи уможливлює створення популяцій тварин шляхом цілеспрямованого генетичного добору і підбору батьківських пар з відповідним генетичним потенціалом щодо, зокрема, молочної продуктивності.

Зв'язок поліморфізму локусів к-Cn, вLG, GН, Pit-1, LEP з молочною продуктивністю. Встановлення відмінностей між тваринами різних порід за ознакою надій і певним генотипом за локусом к-Cn дало змогу виявити різні асоціації типу «генотип - ознака» залежно від породи. Так, для корів української чорно-рябої молочної породи надій тварин з генотипом АВ перевищував АА на 18,9% (р < 0,1), АВ > ВВ на 24,9% (р < 0,05); для корів української червоно-рябої молочної породи АА > ВВ - на 8%; у симентальської породи ВВ > АА на 4,09%, ВВ > АВ на 14,7% (р < 0,1).

У результаті порівняльного аналізу молочної продуктивності корів різних порід великої рогатої худоби залежно від генотипу за локусом вLG були отримані наступні результати: для корів української чорно-рябої молочної породи за таким показником, як вміст білка в молоці, тварини з генотипом АВ > ВВ на 0,13%, АВ > АА на 1,18% (р < 0,01); у корів української червоно-рябої молочної породи надій тварин з генотипом АА > АВ на 8,5% (р < 0,05), АА > ВВ на 9,5% (р < 0,1), за таким показником, як вміст жиру в молоці тварин з генотипом АВ > АА на 0,16% і АВ > ВВ на 0,08%; у симентальської породи за вмістом жиру в молоці тварини з генотипом ВВ > АВ на 0,04%.

За локусом гормону росту GH за надоєм у української чорно-рябої молочної корови з генотипом LV > LL на 10,9% (р < 0,1), LV > VV на 7,3%, за вмістом жиру в молоці LL > LV на 0,038%, VV > LL на 0,037%, VV > LV на 0,07%; в української червоно-рябої молочної породи за вмістом білка в молоці тварини з генотипом LL > LV на 0,001%, за вмістом жиру в молоці з генотипом LV > LL на 0,099%; за надоєм тварини симентальської породи з генотипом LL > LV на 2,7%, а LL > VV на 10,4%, за вмістом жиру в молоці тварини з генотипом LV > LL на 0,23% і LV > VV на 0,24%. Збільшення концентрації L-алеля серед популяцій вказує на його селекційну перевагу перед V-варіантом внаслідок забезпечення більшої лактогенної дії.

За локусом PIT-1 за таким параметром, як надій молока, корови української чорно-рябої молочної породи з генотипом АА > ВВ на 8,9%, АА > АВ на 6,1%; в української червоно-рябої молочної надій виявився вищим у тварин з генотипом АВ > АА на 4,8% і АВ > ВВ на 4,3%, вміст білка в молоці у тварин з генотипом АВ > АА на 0,021%, а вміст жиру в молоці АВ > АА на 0,064% і АВ > ВВ на 0,002%.

За геном лептину LEP тварини української чорно - рябої молочної породи за вмістом жиру в молоці мали високо вірогідну різницю ВВ > АВ на 0,06% (р < 0,01) і ВВ > АА на 0,5% (р < 0,01), АВ > АА на 0,4% (р < 0,01); для симентальської породи надій виявився вищим АВ > АА на 0,31%, а за вмістом білка в молоці тварини з АВ > ВВ на 0,05%. Слід відзначити різнобічний характер кореляцій між генотипом за геном LEP і породною належністю тварин. Так, високий уміст жиру в молоці у корів української чорно-рябої молочної породи визначався наявністю особин ВВ- і АВ генотипів.

Проведення аналізу між генетичними характеристиками та молочною продуктивністю корів, виходячи з виявлених вірогідних асоціацій між досліджуваними локусами і продуктивністю, дало можливість визначити бажаний комплексний модельний генотип для кожної з порід.

На підставі отриманих результатів за досліджуваними генами та враховуючи полігенний характер детермінації формування молочної продуктивності запропонований комплексний модельний генотип для підвищення надою для української чорно-рябої молочної породи - к-Cn^АВвLG^АВGH^LVPit-1^ААLEP^АА, української червоно-рябої молочної породи - к-Cn^ААвLG^ААGH^LLPit-1^AB, симентальської породи - к-Cn^ВВвLG^ВВGH^LLLEP^AB; для підвищення жирномолочності: для тварин української чорно-рябої молочної породи - к-Cn^АВвLG^АВGH^VVPit-1^ААLEP^BB/AB, української червоно-рябої молочної породи - к-Cn ^AAвLG^ABGH^LVPit-1^AB, симентальської породи - к-Cn^ВВвLG^ВВGH^LVLEP^AA.

Таким чином, вплив алеля QTL локусу на формування певної ознаки неоднаковий в межах різних порід, оскільки в кожній породі формується не тільки унікальний генофонд, але і своєрідний генний комплекс, що відповідає за формування полігенної ознаки, що обумовлено умовами утримання, годівлі, системою селекційної роботи.

Аналіз генотипів тварин за локусами кількісних ознак. Визначені генотипи плідників української червоно-рябої молочної породи, яких використовували в селекційній роботі в ДП ДГ «Христинівське» (табл. 4). Встановлено, що за локусами капа-казеїну, бета-лактоглобуліну і Pit-1 лише два бугаї - гетерозиготні, а саме Оллє і Тумпі. Бугаї Віце і Херрі виявилися гомозиготними за усіма дослідженими генами і тому мають найбільшу селекційну цінність, оскільки при правильному доборі корів мінімалізують переведення бажаних генів у нащадків в гетерозиготний стан. Бугай Роман гетерозиготний за генами бета-лактоглобуліну і Pit-1. Першим етапом нашого аналізу було визначення відтворення батьківського генотипу бугая його дочками.

Генотипи бугаїв ДП ДГ «Христинівське»

Із двадцяти шести пар тварин за локусом к-Cn двадцять дочок (76,9%) мали генотип батька, за локусом вLG - вісім дочок (30,8%). За локусом GН цей показник був найвищим: двадцять одна тварина мала генотип батька (80,8%), а за геном Pit-1 виявили п'ятнадцять тварин, що мали той самий генотип, що і бугай, а їх кількість становила 57,7%.

За аналізу розподілу генотипів між матерями і їх нащадками за локусом капа-казеїну у чотирнадцяти тварин генотип збігався з материнським у 53,8% випадків, за геном бета-лактоглобуліну у одинадцяти дочок генотип збігався з материнським у 42,3% випадків, за геном гормону росту однаковий з материнським мали генотип шістнадцять тварин 61,5%, а за геном Pit-1 сім тварин (26,9%). Аналіз формування генотипів в парах батько - потомок, мати - потомок був проведений без урахування генотипу матері в першій парі і при урахуванні генотипу бугая в другій парі. Тому, з метою аналізу успадкування певних генотипів за досліджуваними генами був проведений аналіз генотипів за тріадами бугай - корова - нащадок (рис. 7). За аналізу формування генотипів в тріадах встановлено, що 33,3% були нащадками гомозиготних тварин за локусом к-Cn і мали генотип АА, 41,6% нащадків були гомозиготні за А-алелем і 16,7% гетерозиготні за теоретично очікуваної гетерозиготності 50% в батьківських парах, де один із батьків був гетерозиготний і мав генотип АВ, а другий - гомозиготний з генотипом АА. За локусом бета-лактоглобуліну в батьківських парах генотипів АВ і ВВ фактична гетерозиготність нащадків становила 41,7% за теоретично очікуваної 50%, а в гетерозиготних парах за цим геном фактична гетерозиготність становила 25% за теоретично очікуваній в 50%, гомозиготні нащадки за В алелем становили 33,3% при теоретично очікуваної гомозиготності 50%. За локусом GН 50% тварин були нащадками гомозиготних батьків за L-алелем і мали генотип LL, в парах тварин, де один з батьків гомозиготнй за L-алелем, а другий гетерозиготний з генотипом LV, за теоретично очікуваної гетерозиготності 50%, фактична гетерозиготність нащадків становила 25%, а гомозиготні тварини - 16,7%.

За локусом Pit-1 від гетерозиготних батьків фактична гетерозиготність нащадків становила 25% за теоретично очікуваної 50% гомозиготні нащадки становили 33,3%, в парах, де один з батьків був гомозиготний фактична гетерозиготність була 25% за теоретично очікуваної 50%. Теоретично очікуваний за Гарді-Вайнбергом розподіл алелів серед нащадків батьків з відомим генотипом не реалізується оскільки штучна популяція підлягала впливу добору в напрямі збереження гомозиготних генотипів.

Таким чином, на підставі отриманих результатів щодо розподілу генотипів за досліджуваними локусами та результатів аналізу їх успадкування встановлено, що їх формування залежить від особливостей підбору, який проводиться безпосередньо в популяції і не пов'язаний із використанням близькоспоріднених варіантів підбору тварин та їх належності до певних ліній і підпорядковується загальним закономірностям щодо успадкування алельних варіантів кодомінантних генів.

Оптимізація методу отримання високоочищеної ДНК з кріоконсервованої сперми плідників. Більшість компонентів, що використовуються при кріоконсервуванні сперми, є інгібіторами як при виділенні ДНК, так і при проведенні полімеразної ланцюгової реакції, наприклад, гліцерин як компонент лактозо-гліцериножовткового розчинника (ЛГЖ). Тому з метою уніфікації і ефективності проведення досліджень нами була відпрацьована і запропонована для використання технологія виділення ДНК з кріоконсервованої сперми, яка складається з декількох етапів. Очищені сперматозоїди отримували методом спливання або «флотації» (swim-up) з деякими модифікаціями, які розроблені нами. При цьому застосовували одноразове 15-хвилинне спливання найбільш рухливих сперматозоїдів у скляних флаконах, розміщених під кутом 45. Відібрану суспензію центрифугували при 3100 об/сек (900 g) упродовж 5 хвилин, супернатант відбирали, а осад розбавляли свіжим середовищем TALP без іонів Ca²⁺ до концентрації 1-5 х 10⁷ сперматозоїдів/мл. У разі проведення аналізу ДНК за допомогою ПЛР відібрані методом «swim-up» гамети позбавлені негативного впливу компонентів розріджувача і сім'яної плазми під час проведення експериментів. Після одерження сперматозоїдів методом «swim-up» проводили виділення ДНК; концентрацію та ступінь її очищення визначали спектрофотометрично, при довжині хвилі 260-280 нм. Оптична густина D=1 при 260 нм, що відповідає приблизно 50 мкг/мл дволанцюгової ДНК. Відношення D260/D280, що дорівнює 1,8 або 2,0 свідчить про чистоту препарату ДНК. Якщо препарат містить домішки білка, або реагентів, що використовувалися для виділення ДНК, то вищевказане відношення значно менше цих показників. Нативність ДНК визначали за допомогою електрофорезу в 1% агарозному гелі за відсутності «шлейфа» фрагментів ДНК та інтенсивності флуоресценції бромистого етидію при УФ опромінюванні електрофореграм.

Генетичні ресурси бугаїв симентальської і голштинської порід великої рогатої худоби. З метою вивчення генетичної структури популяцій бугаїв за досліджуваними локусами були протестовані плідники симентальської породи ВАТ «Менське підприємство по племінній справі в тваринництві» (n - 32 гол.), Банку генетичних ресурсів тварин ІРГТ (n - 20) та голштинської породи (n - 53 гол) з ВАТ НВО «Прогрес», ВАТ «Хмельницьке головплемпідприємство»; ВАТ «Війтовецьке племпідприємство», ТОВ «Генетичні ресурси».

Переважна більшість плідників вітчизняної селекції, спермопродукція яких зберігається в Банку генетичних ресурсів тварин ІРГТ НААН, одержані у племзаводах Черкаської та Київської областей, лише 2 плідники належать Менському племпідприємству та 2 - Городенківському племпідприємству.

Індивідуальний аналіз генотипів показав, що плідники Вулкан 7540 (л. Воїна), Садовий 6368 (л. Радоніса) є гомозиготами за бажаним алелем В локусу капа-казеїну, що відповідає за підвищений вміст білка в молоці корів. Також виявлено 7 плідників, що гомозиготні за бажаним алелем L локусу гормону росту Найбільш різноманітним є генотип плідника Бріліанта 8766 (л. Бісера), який гетерозиготний за всіма трьома локусами k-Cn^АВвLG^АВGH^LV. Використання таких плідників на маточному поголів'ї сприятиме вивченню механізмів розподілу бажаних алелів в потомстві та формування консолідованих груп тварин бажаного типу. Накопичення в банку ДНК генетичних ресурсів тварин ІРГТ НААН сперми плідників, які вибули з племпідприємств, створює передумови для проведення поглиблених наукових досліджень з врахуванням мікроеволюційних процесів, що відбуваються в популяціях. Одним з конструктивних підходів до постановки таких дослідів може бути аналіз закономірностей розподілу алелів, які маркірують генотипи окремих плідників.

Одержання потомства від виявлених гетерозиготних плідників з Банку генетичних ресурсів тварин ІРГТ дає можливість провести оцінку селективної цінності окремих алельних варіантів за характером їх розподілу, а також дослідити зв'язок відповідних маркерів з іншими ознаками.

Аналіз генотипів бугаїв симентальської породи дав змогу виявити перспективних поліпшувачів. Бугай Грот мав три бажаних алеля потенційної молочної продуктивності в гомозиготному стані: вLG^ВВGH^LL та LEP^АА, однак для досягнення бажаного ефекту необхідний добір до цього бугая корів з ВВ генотипом за к-Cn. Гомогенний підбір до цього бугая корів вLG^ВВ та GH^LL сприятиме насиченню популяції бажаними алелями. Добір корів з генотипом GH^VV та LEP^АА сприятиме підвищенню жирномолочності молока нащадків. Бугай Дрозд 1745 містить у своєму генотипі бажаний комплекс алелів за QTL локусами к-Cn, вLG та LEP. Найкращим варіантом поєднаннь в парі мати-батько можна спрогнозувати гомогенний підбір за вказаними локусами, крім локусу GH, оскільки бугай є гетерозигтним за цим геном.

У вітчизняних сименталів бугай Дрозд 1745 з лінії Сигнала гомозиготний за В-алельним варіантом гена к-Cn. Більшість тварин як вітчизняної, так і зарубіжної селекції гетерозиготні за цим геном, так само, як і за генами вLG та GH. Гомозиготними за алелем V гормону росту виявилися плідники вітчизняних сименталів Ірис 7400114070 і Діл 2300148691, австрійський Ваді 241914245. За всіма дослідженими локусами, гомозиготним виявився бугай Грот 2495 вітчизняної селекції та Рандібой AT235113945 автрійської селекції. Загалом генетична структура досліджених тварин за генами к-Cn, вLG, GH, Pit-1, LEP відповідає комбінованому напряму продуктивності симентальської породи.

Розповсюджені широко в Україні українська чорно-ряба і українська червоно-ряба молочні породи вітчизняної селекції створювались і в подальшому удосконавлювалися з використанням племінного матеріалу голштинської проди. За геном к-Cn серед 53 бугаїв голштинської породи було виявлено 11 особин з генотипом АВ (20,7%), гомозиготних тварин з генотипом ВВ виявлено не було. За геном вLG спостерігалися тварини трьох генотипів АА, АВ, ВВ. Відсоток гетерозиготних плідників в популяції становив 56,6%. Частота бугаїв з генотипом АА становила 0,132, а з ВВ 0,302. За геном гормону росту GH частота алельного варіанту V становила 0,104 (р < 0,001), переважна кількість - 42 (79,2%) тварини - мали гомозиготний генотип LL і його частота становила 0,793, тварини з генотипом VV взагалі виявлені не були.

Серед досліджених бугаїв з ВАТ НВО «Прогрес» чотири бугаї, а саме: Епік 25783, Еккі 38927, Тренд-Кнок 15552 і Аура 34221 були гомозиготні за всіма генами і мали генотип к-Cn^AAвLG^AAGH^LL. Згідно проведених нами досліджень, такий генотип є модельним для тварин української червоно-рябої молочної породи з потенційно вищими показниками молочної продуктивності. Очевидно, повторюваність виявлених генетичних закономірностей розподілу генотипів за трьома локусами у представників голштинської і української червоно-рябої молочної порід свідчить про значний вплив голштинізації на структуру генофонду української червоно-рябої молочної породи. За геном к-Cn було виявлено три гетерозиготних тварини, які несуть корисний алель В за цим локусом, а саме: Драго 976242, Джамір 22731, Бенаро 55968.

Таким чином, отримані результати щодо індивідуальних генотипів плідників за локусами к-Cn, вLG, GН, Pit-1, LEP і MSTN на племпідприємствах дає можливість проводити підбір батьківських пар тварин для отримання нащадків з відповідним генетичним потенціалом з метою удосконалення молочних порід великої рогатої худоби за якістю молока і його технологічними властивостями. Встановлена низька концентрація В алельного варіанту за локусом к-Cn у бугаїв голштинської породи і, як наслідок, низьку частку носіїв алельного варіанту В у новостворених українських червоно і чорно-рябої породах. Серед усіх досліджених тварин голштинської породи не було виявлено жодної тварини з генотипом ВВ за локусом к-Cn, а в симентальській породі лише два плідники. Концентрація алеля В в популяції бугаїв голштинської породи знаходилась в межах 20,7%, симентальської 68,7%. Молекулярно-генетичну інформацію щодо генотипів бугаїв доцільно використовувати при формуванні селекційних програм з розведення і удосконалення великої рогатої худоби. Консолідованість за генотипами, асоційованими з молочною продуктивністю, може бути досягнена лише за умов постійного генетичного моніторингу плідників і підвищення концентрації бажаних алелів в гомозиготному стані.

Використання методів ДНК-діагностики для визначення статі та генотипування тварин великої рогатої худоби на ранніх етапах онтогенетичного розвитку. З метою розроблення та впровадження швидкого методу визначення статі доімплантаційних ембріонів та їх генотипування за генами продуктивності нами була розроблена і адаптована методологія з оптимізації умов з генотипування ембріонів за локусами капа-казеїну, бета-лактоглобуліну, гормону росту методом ПЛР-ПДРФ та ідентифікації статі доімплантаційних ембріонів із одночасним застосуванням Y-специфічних та Х-специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції без наступного рестриктного аналізу фрагментів (рис. 8), що скорочує процедуру і спрощує інтерпретацію отриманих результатів.

У результаті ДНК-аналізу щодо визначення статі доімплантаційних ембріонів ефективність визначення статі зародків з допомогою ПЛР-аналізу була на рівні 86% (26/30). Із 30 досліджених ембріонів 9 мали по одному фрагменту розміром 216 п.н., що вказує на їх жіночу стать і 17 ембріонів мали по 2-фрагмента розміром в 216 п.н. і 173 п.н. тобто чоловічої статі.

Таким чином, для оптимізації перебігу ампліфікації підібрані оптимальні температурні та часові режими проведення ПЛР-аналізу, а також склад реакційної суміші. Запропонований метод щодо визначення генотипу за QTL та статі доімплантаційних ембріонів великої рогатої худоби дає можливість одночасно проводити ампліфікацію як Х, так і Y-послідовностей хромосом. Впровадження сучасних генетико-біотехнологічних методів дає змогу проводити трансплантацію ембріонів із вже відомою статтю та визначеними генотипами, що створює передумови для підвищення економічної ефективності біотехнологічної селекції.

Методологія і принципи організації селекційно-племінної роботи з застосуванням молекулярно-генетичних маркерів. Інтенсифікація селекційного процесу значною мірою пов'язана з інтегральною оцінкою генотипу в системі генетичного моніторингу, який покликаний об'єднати в збалансовану систему комплекс генетичних тестів з метою всебічної оцінки селекційного матеріалу. Таку оцінку дає генетична інформація, що безпосередньо пов'язана з певними генами або генними комплексами.

Використання в селекційній роботі методів ДНК-аналізу на рівні генів, що відповідають за прояв бажаних кількісних ознак (QTL) або зчеплених з ними генів, має ряд переваг перед традиційними методами селекції, оскільки базується безпосередньо на аналізі генотипу, не залежить від впливу навколишнього середовища, надає можливість проводити відбір генетично кращих тварин на ранніх етапах їх онтогенетичного розвитку, простота, швидкість і висока достовірність отриманих результатів дає змогу збільшити ефективність тваринництва за рахунок окупності витрат на генотипування поголів'я за найбільш важливими продуктивними ознаками і легкості інтеграції MAS-селекції у виробництво. Саме такий підхід створив підґрунтя для впровадження і практичної реалізації багаторівневої системи молекулярно-генетичної сертифікації тварин. Відбір особин, гомозиготних чи гетерозиготних за бажаними алелями досліджуваного гена, дає змогу значно зменшити кількість можливих недоцільних схрещувань у популяціях. Це стає дедалі важливішим у зв'язку з тим, що кількість тестів і бажаних комбінацій QTL збільшується.

На підставі результатів виконаної роботи були розроблені «Рекомендації з організації і проведення ДНК-діагностики великої рогатої худоби», «Інструкція геномного типування в молочному, молочно-м'ясному та м'ясному скотарстві для проведення генетичних досліджень за ДНК-маркерами» та рекомендації з комплексної системи молекулярно-генетичної оцінки тварин та методології проведення робіт з ДНК-діагностики «ДНК-діагностика великої рогатої худоби в системі геномної селекції» затверджені та рекомендовані до впровадження Секцією виробництва та переробки продукції тваринництва і птахівництва Науково-технічної ради Міністерства аграрної політики України (протокол №5 від 15 грудня 2009, протокол №5 від 14 грудня 2010 рр.).

Саме нині, в зв'язку з вступом України до СОТ відповідно міжнародних вимог та рекомендацій ISAG/FAO, ICAR інших нормативних документів з метою забезпечення контролю генетичної якості племінних (генетичних) ресурсів при відтворенні, експорті, імпорті, підвищенні економічної ефективності та конкурентоспроможності галузі в Україні існує нагальна необхідність розроблення та впровадження системи молекулярно-генетичної ідентифікації, яка б давала можливість здійснювати контроль переміщення тварин і отримання на їх основі якісної продукції на усіх етапах технологічного ланцюга; обов'язкову оцінку всього племінного матеріалу на визначення/підтвердження походження, відсутність спадкових захворювань та на наявність бажаних алельних варіантів генів QTL, асоційованих з показниками продуктивності, що забезпечить не тільки впровадження в тваринництво системи геномної селекції, а й реалізацію комплексу завдань в системі збереження генетичного різноманіття тварин щодо аналізу структури порід, виявлення їх генетичного потенціалу, визначення генофондового статусу суб'єктів племінної справи у тваринництві.

Висновки

1. Науково обґрунтовано концепцію комплексного застосування молекулярно-генетичних маркерів у селекційно-племінній роботі. Встановлені особливості формування генетичної структури основних комерційних порід великої рогатої худоби за поліморфізмом локусів кількісних ознак, що є підгрунтям впровадження елементів маркер асоційованої селекції в молочному скотарстві та розроблена методологія організації і проведення робіт з ДНК-діагностики.

2. Встановлено унікальність генетичної структури тварин української чорно-рябої молочної породи за локусами к-Cn, вLG, GН, Pit-1, LEP. Наявність високовірогідних кореляцій між різними генотипами тварин цієї породи за дослідженими QTL і показниками молочної продуктивності дали змогу визначити бажаний модельний генотип корів для підвищення надою: к-Cn^АВвLG^АВGH^LVPit^ААLEP^АА; жирномолочності: к-Cn^АВвLG^АВGH^VVPit-1^ААLEP^BB/AB.