Генетична диференціація геномів за маркерами ISSR-PCR та RAPD-PCR

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ РОЗВЕДЕННЯ І ГЕНЕТИКИ ТВАРИН

УДК 636.082.12:575.42

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

Генетична диференціація геномів за маркерами ISSR-PCR та RAPD-PCR

03.00.15 - генетика

Дубін Олексій Вікторович

Чубинське - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Білоцерківському національному аграрному університеті Міністерства аграрної політики України.

Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук, професор Димань Тетяна Миколаївна, Білоцерківський національний аграрний університет, завідувач кафедри екотрофології.

Офіційні опоненти:

доктор сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник Подоба Борис Євгенійович, Інститут розведення і генетики тварин УААН, головний науковий співробітник лабораторії генофонду порід;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник ЧЕЧЕНЄВА Тетяна Миколаївна, Національний університет біоресурсів і природокористування України Кабінету Міністрів України, завідувач кафедри молекулярної генетики та біобезпеки.

Захист дисертації відбудеться « 9 » червня 2009 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 27.355.01 Інституту розведення і генетики тварин УААН за адресою: 08321, Київська обл., Бориспільський район, с. Чубинське, вул. Погребняка, 1.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту розведення і генетики тварин УААН, за адресою: 08321, Київська обл., Бориспільський район, с. Чубинське, вул. Погребняка, 1.

Автореферат розісланий « 8 » травня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Ю.В. Мільченко.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Молекулярні-генетичні методи досліджень набувають дедалі більшої популярності у прикладних галузях біологічних наук. Зокрема, ДНК-маркери активно використовуються у сучасній сільськогосподарській генетиці для вирішення низки теоретичних і практичних завдань: діагностики збудників інфекційних захворювань, вивчення генетичної мінливості, генетичної паспортизації та ін.

З великої кількості існуючих напрямів аналізу поліморфізму геномів на особливу увагу заслуговують методи так званого мультилокусного ДНК-профілювання (або ДНК-фінгерпринту) на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Широкого розвитку ці методи набули завдяки своїй простоті, високій чутливості та швидкості проведення досліджень. Нині існує декілька модифікацій цього підходу, які різняться кількістю одержуваних продуктів ампліфікації, довжиною олігонуклеотидних праймерів, умовами проведення ПЛР і методами електрофоретичного розділення продуктів ампліфікації: RAPD-PCR (Williams, 1990), ISSR-PCR (Zietkiewicz, 1994) та ін. Характерна особливість цих методів - первинна «анонімність» продуктів ампліфікації, отриманих за використання випадкових (без цілеспрямованого вибору) праймерів. Це уможливлює застосування згаданих методів як універсальних інструментів аналізу геномів, особливо у випадку, коли первинну нуклеотидну послідовність ще не встановлено.

Незважаючи на тривалий час застосування методів ДНК-профілювання, в Україні для вирішення прикладних генетичних та селекційних завдань вони донині активно не використовуються. Існує також проблема відтворюваності результатів, отриманих у різних лабораторіях, через недосконалість підготовки проб до ПЛР та проведення самої реакції.

Тому актуальним завданням є удосконалення методичних підходів до аналізу геномів вищих організмів, систематизація уявлень про інформативність маркерів RAPD-PCR та ISSR-PCR та визначення критеріїв їх ефективного застосування.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконувалися згідно плану науково-дослідних робіт Інституту агроекології та біотехнології УААН за темою: “Вивчення генофондів рідкісних та зникаючих порід великої рогатої худоби, овець і коней України в різних еколого-географічних умовах розведення” (номер державної реєстрації 0197U014671), а також наукової тематики Білоцерківського національного аграрного університету “Інформативність маркерів ISSR-PCR та RAPD-PCR для дослідження геномів рослин та тварин” (номер державної реєстрації 0108U001634).

Мета та завдання досліджень. Метою дослідження було оцінювання інформативності маркерів ISSR-PCR та RAPD-PCR та ефективності їх застосування для генетичної диференціації геномів вищих організмів.

Для досягнення поставленої мети було виконано наступні завдання:

- провести тестування й оптимізувати умови виділення ДНК із різного біологічного матеріалу;

- оптимізувати умови проведення ПЛР за використання ISSR- та RAPD праймерів та визначити межі оптимальних концентрацій реагентів реакційної суміші;

- підібрати інформативні молекулярно-генетичні маркери для порівняльного вивчення внутрішньовидового поліморфізму геномів (на прикладі представників підродини Bovinae та підродини Phaseoleae);

- дослідити поліморфізм ISSR- і RAPD-маркерів у міжвидовій диференціації зубрів, бізонів та великої рогатої худоби та оцінити їхню інформативність;

- оцінити ефективність застосування маркерів RAPD- та ISSR-PCR для генетичної паспортизації геномів;

- порівняти дискримінаційну здатність ISSR-праймерів з ди- та тринуклеотидними мікросателітними мотивами для дослідження геномів вищих організмів.

Об'єкт досліджень - поліморфізм молекулярно-генетичних маркерів ISSR-PCR та RAPD-PCR.

Предмет досліджень - геноми доместикованих та споріднених з ними диких видів тварин та рослин.

Методи досліджень. Використано наступні методи аналізу біологічного матеріалу: біохімічні - для екстракції геномної ДНК; полімеразної ланцюгової реакції, електрофоретичного розділення продуктів ампліфікації ПЛР в агарозному гелі - для аналізу поліморфізму маркерів RAPD-PCR та ISSR-PCR; незважений парногруповий метод кластерного аналізу (UPGMA) - для побудови дендрограм генетичних взаємовідносин між досліджуваними видами; методи статистичної обробки результатів досліджень.

Наукова новизна отриманих результатів. Розроблено методичні засади оптимізації RAPD- та ISSR-PCR для аналізу генетичного поліморфізму ДНК. За використання 46 ISSR- та 44 RAPD-маркерів вивчено особливості генетичної диференціації доместикованих (сіра українська порода) та диких видів (зубр та бізон) підродини бичачих. Вперше проведено порівняльний аналіз інформативності ISSR- та RAPD-маркерів для диференціації видів, що належать до різних таксонів. За допомогою поліморфних локусів зазначених маркерних систем розроблено методику генетичної паспортизації сої.

Практичне значення отриманих результатів. Протестовано та оптимізовано умови проведення ПЛР і виділення геномної ДНК для отримання інформативних та відтворюваних спектрів ампліфікації. Одержані дані щодо поліморфізму ISSR- та RAPD-PCR можуть бути використані у селекційному процесі для класифікації та ідентифікації сортів, підбору відповідних батьківських пар для схрещування з урахуванням їх еколого-географічного походження.

Розроблено систему генетичної паспортизації, яка може бути використана з метою захисту авторських прав селекціонерів та уникнення нелегального розповсюдження перспективного селекційного матеріалу.

Матеріали дисертації використовуються у навчальному процесі на біолого-технологічному, екологічному та агрономічному факультетах Білоцерківського національного аграрного університету та проведенні генетичної експертизи в лабораторії генетичних досліджень державного підприємства Азовський центр ПівденНІРО (м. Бердянськ).

Особистий внесок здобувача. Відповідно до поставленої мети та завдань, дисертантом самостійно було проведено аналіз літературних даних за темою дисертації, розроблено програму досліджень, виконано експеримен-тальну роботу, проведено її аналіз та статистичну обробку даних. Узагальнення результатів досліджень і формулювання висновків належать автору. Із матеріалів наукових експериментів та публікацій дисертант використав за узгодженням із співавторами частину спільно одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи було оприлюднено на звітних сесіях Інституту агроекології та біотехнології УААН (1999-2000 рр.), доповідалися на засіданнях вченої ради екологічного факультету Білоцерківського національного аграрного університету (2007-2008 рр.); на міжнародних науково-практичних конференціях «Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва» (Харків, 1999), «Молекулярно-генетичні маркери тварин» (Київ, 1999), «Землеробство 21 століття - проблеми та шляхи вирішення» (Чабани, 1999), «Наукові пошуки молоді у третьому тисячолітті» (Біла Церква, 2007, 2008).

Публікації. Результати досліджень за темою дисертації опубліковано в 10 наукових працях, з них 6 статей у фахових виданнях, що входять до переліку ВАК, 4 тези доповідей на наукових конференціях.

Структура й обсяг дисертації. Робота складається зі вступу, літературного огляду, опису матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень та їх обговорення, узагальнення результатів досліджень, висновків, пропозицій виробництву, списку використаної літератури та додатків. Обсяг дисертації становить 154 сторінки, в тому числі 36 таблиць, 32 рисунки і 2 додатки. Список літератури включає 224 найменування, в тому числі 189 - іноземних авторів.

Матеріал і методи досліджень

Експериментальну частину досліджень за темою дисертаційної роботи виконували на базі науково-дослідних лабораторій відділу молекулярно-генетичних досліджень Інституту агроекології та біотехнології УААН та міжкафедральної лабораторії новітніх методів дослідження Білоцерківського національного аграрного університету.

Для аналізу поліморфізму маркерів ISSR- та RAPD-PCR було використано ДНК, виділену із проб цільної крові трьох видів підродини Bovinae (зубрів (Bison bonasus), бізонів (Bison bison) та великої рогатої худоби (Bos taurus)), листових дисків 14 сортів культурної сої (Glycine max L.) різного еколого-географічного походження та 5 популяцій дикої уссурійської сої (Glycine soja).

У роботі тестували різні методики виділення геномної ДНК: метод фенол-хлороформної екстракції (Sambrook, 1989), метод за використання катіонного детергенту СТАБ (Doyle, 1987) та метод сорбції за використання силіцій оксиду (Carter, 1993). Концентрацію ДНК визначали за допомогою спектрофотометра та шляхом порівняння у агарозному гель-електрофорезі декількох розведень проби ДНК з відомою концентрацією ДНК фага лямбда. Для оптимізації умов проведення ISSR- та RAPD-PCR тестували параметри проведення ПЛР та концентрації хімічних реагентів реакційної суміші (табл. 1).

Таблиця 1. Діапазони тестованих концентрацій хімічних реагентів реакційної суміші та умов проведення ISSR- та RAPD-PCR

Реагенти та параметри	Межі концентрацій та параметрів
	ISSR-PCR	RAPD-PCR
Концентрація Mg2+, мМ	0,1-3,0	0,1-3,0
Концентрація Taq-полімерази, од.	0,2-3,0	0,2-3,0
Концентрація ДНК, нг/20 мкл	5-100	5-100
Концентрація праймера, мкМ	0,1-2,0	0,1-2,0
Температура відпалу, °С	52-58	35-45
Кількість циклів	30±2	35±2
дНТФ, мкМ	20-300	20-300

Для дослідження геномів було використано 22 ISSR-праймери з якірним нуклеотидом на 3ґ-кінці (10 - з динуклеотидними коровими послідовністями, 12 - з тринуклеотидними) та 9 RAPD-праймерів. ПЛР проводили на ампліфікаторі “Терцик” (Росія) у такому температурному режимі:

ISSR-PCR: початкова денатурація - 4 хв за температури 94 С; 32 цикли: 30 с за 94 С, 30 с за 52-54 С (залежно від праймера), 2 хв за 72 С; термінальна елонгація - 5 хв за 72 С;

RAPD-PCR: початкова денатурація - 4 хв за температури 94С; 35-37 циклів: 45 с за 94 С, 45 с за 40-45 С (залежно від праймера), 2 хв за 72 С; термінальна елонгація - 5 хв за 72 С.

Реакційна суміш об'ємом 20 мкл містила: 67 мM Tris-HCl (pH 8,8), 17 мM (NH₄)₂SO₄, 0,01 % Tween-20, 0,2 мМ dNTP, 0,8-1,2 од. Tag-полімерази, 30-60 нг геномної ДНК, 1,8-2,2 мМ MgCl₂ та 0,3-0,7 мкМ відповідного праймера.

Електрофоретичне розділення продуктів ампліфікації проводили у 2%-му агарозному гелі завдовжки 15-20 см за використання 1ЧТВЕ-буферу протягом 6-10 год за напруги 60-80 В. Після закінчення електрофорезу гель обробляли бромистим етидієм (0,5 мкг/мл). Для фотографування використовували плівку Мікрат-300 з високою роздільною здатністю. Розміри продуктів ампліфікації визначали за допомогою маркера молекулярної маси GeneRuller 100 bp (“Fermentas”) та комп'ютерної програми Gel Explorer (“Літех”, Росія).

Кластерний аналіз та визначання генетичних дистанцій проводили з використанням коефіцієнтів подібності NLxy, Jxy та SМxy за допомогою комп'ютерної програми “TREES” (Календарь, 1994).

Результати власних досліджень

Тестування та оптимізація методів виділення геномної ДНК. У роботі було тестовано два найпоширеніші методи виділення геномної ДНК - метод фенол/хлороформної екстракції та метод за використання катіонного детергенту СТАБ. Під час порівняння цих методів загальна кількість виділеної ДНК з листових дисків рослин та крові досліджуваних тварин була однаковою - в середньому 1-3 мкг з 100 мг листя чи проростку та 0,5-1 мкг ДНК з 1 см³ крові. Однак під час ампліфікації препарату ДНК, виділеного цими методами, було виявлено відмінності в якісному та кількісному складі отриманих спектрів за використання однієї і тієї самої проби. Найчастіше це траплялося у випадку тривалого зберігання проб у морозильній камері (мінус 20?С). Крім того, виявлено великі коливання концентрації ДНК, виділеної цими методами з окремих проб біологічного матеріалу. Найважливішим етапом, який впливав на ступінь деградації препарату ДНК та концентрацію геномної ДНК, нами було визначено етап початкового лізису біологічного матеріалу. Враховуючи зазначені вище особливості виділення ДНК, для оптимізації цього процесу було використано комплексний підхід - спочатку проводили лізис за стандартними методиками, осаджували клітинний дебріс центрифугуванням, відбирали рідину над осадом і після цього застосовували метод сорбції ДНК за використання силіцій оксиду.

Використаний підхід уможливив оптимізацію етапу виділення ДНК і отримання однакових спектрів ампліфікації за застосування різних первинних протоколів виділення ДНК та умов зберігання проб біологічного матеріалу.

Оптимізація умов проведення ISSR- та RAPD-PCR. Варіювання концентрацій компонентів реакційної суміші та умов проведення RAPD- і ISSR-PCR зумовлюють зміну якості та кількості ПЛР-смуг. Зазвичай найчутливішими до змін умов ампліфікації виявлялися амплікони з високою молекулярною масою (понад 1,5 т.п.о.) за використання високих концентрацій іонів Mg²⁺ (понад 2,5 мМ). Зміна спектрів ампліфікації (поява чи зникнення ампліконів) відбувалася за рахунок продуктів ПЛР низької інтенсивності світіння. Мажорні смуги відтворювалися в усіх проведених експериментах.

Найважливішими чинниками, що впливали на якість ISSR- та RAPD-спектрів, виявилися концентрація ДНК-матриці, температура відпалу праймерів та концентрація праймерів у реакційній суміші. Зміна інших умов ПЛР зумовлювала лише різну інтенсивність світіння продуктів ампліфікації в ультрафіолетовому світлі і не впливала на якість спектрів.

Проведені дослідження дали змогу визначити оптимальні діапазони концентрацій реагентів реакційної суміші та умов ПЛР, в яких такі зміни мінімально впливають на відтворення результатів методів ДНК-фінгерпринту на основі ПЛР, і розроблено загальний алгоритм оптимізації методів мультилокусного ДНК-профілювання.

Загалом ці діапазони виявилися подібними для ISSR- та RAPD-PCR за винятком температури відпалу праймерів та кількості циклів ампліфікації Узагальнені результати визначених оптимальних діапазонів представлено в таблиці 2.

Таблиця 2. Оптимальні концентрації реагентів та параметри ПЛР для проведення ISSR- та RAPD-PCR

Компоненти реакційної суміші та параметри ПЛР	Діапазон оптимальних концентрацій
	ISSR-PCR	RAPD-PCR
Геномна ДНК	30-60 нг/20 мкл	40-60 нг/20 мкл
Іони магнію	1,8-2,2 мМ	1,8-2,2 мМ
Праймер	0,3-0,6 мкМ	0,4-0,7 мкМ
дНТФ	200 мкМ	200 мкМ
Taq-полімераза	0,8-1,2 од.	0,8-1,2 од.
Кількість циклів	32	35-37
Температура відпалу	52-58єС	45єС

Для аналізу відтворюваності маркерів ISSR- та RAPD-PCR, що пов'язана з особливостями роботи різних ампліфікаторів (спосіб програмування, швидкість досягнення температури та ін.), ми порівняли спектри ампліфікації, отримані за використання трьох різних моделей термоциклерів: “Терцик” (ДНК-технологія, Росія), “GeneAmp 2400” (Applied Biosystems, США) та “Master Cycler Gradient” (Eppendorf, Німеччина). Отримані мультилокусні спектри продуктів ПЛР виявилися ідентичними за умови дотримання визначених оптимальних концентрацій хімічних реагентів реакційної суміші.

Внутрішньовидовий поліморфізм геномів за маркерами ISSR- та RAPD-PCR. За використання методів мультилокусного профілювання було досліджено рівень генетичної мінливості у деяких доместикованих і споріднених з ними диких видів тварин і рослин.

Для аналізу молекулярно-генетичного поліморфізму трьох видів тварин (зубра, бізона та великої рогатої худоби) загалом було використано 8 праймерів: 4 RAPD- та 4 ISSR-праймери. Молекулярна маса продуктів ампліфікації варіювала від 2400 п.о. до 400 п.о. залежно від праймера. Максимальну кількість поліморфних ПЛР-продуктів (12) було отримано з RAPD-праймером UBC-14. Сумарно за використання 8 праймерів отримано 82 продукти ампліфікації, 51 (62,19 %) з яких були поліморфними. При цьому RAPD-праймери характеризувалися більшою кількістю поліморфних ампліконів (70,45 %), ніж ISSR-праймери (52,63 %). Значення маркерних індексів (МІ) для ISSR- та RAPD-праймерів за диференціації досліджених видів тварин достовірно не відрізнялися (р<0,05). Найбільше значення МІ (4,12) спостерігали для RAPD-праймера UBC-10 (табл. 3). Отже, загальний рівень поліморфізму, який виявили використані у роботі ДНК-маркери, у диких і одомашненого видів був порівнянним.

Показники середньої гетерозиготності (Hav) та частки поліморфних локусів (Р) як у випадку ISSR-PCR, так і RAPD-PCR, розраховані для бізона та великої рогатої худоби також достовірно не відрізнялися (р<0,05). Це свідчить про близький рівень генетичної мінливості цих видів за дослідженими ДНК-маркерами. Тимчасом значення Hav та Р для трьох RAPD- та всіх ISSR-праймерів у зубра були достовірно нижчими. Таким чином, ступінь генетичної спорідненості між особинами в стаді зубрів унаслідок тісного інбридингу був вищий, ніж у стаді бізонів та великої рогатої худоби.

Порівняння аналогічних показників здійснили також для популяцій дикої уссурійської та сортів культурної сої. Серед отриманих продуктів ампліфікації було виявлено 53,33 % поліморфних. Рівень поліморфізму, розрахований окремо для кожного методу ДНК-фінгерпринту, виявився порівнянним: 55,17 % для ISSR-PCR та 51,95 % для RAPD-PCR.

Таблиця 3. Показники генетичної мінливості диких та домашніх представників родини бичачих за ISSR- та RAPD-маркерами

Праймер	ВРХ	Зубр	Бізон	МІ
	Hav	Р	Hav	Р	Hav	Р
(GA)9C	0,348	0,72	0,212	0,72	0,346	0,43	3,44
(AG)9C	0,198	0,42	0,126	0,42	0,189	0,34	3,86
(AC)9C	0,232	0,23	0,134	0,17	0,228	0,13	3,26
(AC)9T	0,335	0,67	0,236	0,68	0,332	0,47	3,17
UBC-10	0,246	0,48	0,212	0,34	0,318	0,24	4,12
UBC-13	0,187	0,35	0,146	0,26	0,164	0,21	3,93
UBC-14	0,286	0,42	0,192	0,36	0,264	0,32	3,84
UBC-15	0,134	0,13	0,126	0,24	0,137	0,20	3,63

Певні відмінності було виявлено і в структурних особливостях спектрів ISSR- та RAPD-PCR, притаманних кожному з досліджених видів сої. У випадку ISSR-PCR популяції дикої сої мали більше продуктів ампліфікації та більшу кількість поліморфних ПЛР-локусів на праймер, ніж сорти. Було виявлено 8 амліконів, представлених лише у генотипах дикої сої та удвічі меншу кількість видоспецифічних ампліконів у сортів сої. RAPD-спектри диких популяцій сої мали меншу “різноманітність”. Отримано три унікальних локуси, що зустрічалися лише у дикої сої. Не виявлено ПЛР-продуктів, представлених тільки у культурних сортів, тобто спектри культурної сої репрезентували окрему сорт-специфічну частину спектрів дикої сої. Разом з тим, рівень генетичної мінливості за показниками середньої гетерозиготності та частини поліморфних локусів суттєво не різнилися у сортів культурної та популяцій дикої сої як за використання RAPD-PCR-, так і ISSR-PCR-праймерів. Аналогічну картину спостерігали в разі порівняння маркерних індексів (МІ).

Інформативність маркерів ISSR-PCR та RAPD-PCR у міжвидовій диференціації геномів. Побудовані на основі отриманих спектрів ампліфікації маркерів RAPD-PCR дендрограми генетичних взаємовідносин між великою рогатою худобою (ВРХ), зубром та бізоном не збігалися з дендрограмами для маркерів ISSR-PCR.

За даними RAPD-аналізу, генетично найближчими виявилися бізон та зубр, а найвіддаленішими - пара ВРХ - бізон. За даними поліморфізму ISSR-маркерів, генетично найближчими виявилися ВРХ та зубр. Генетичні дистанції, розраховані на основі індексів генетичної подібності у випадку RAPD-аналізу, були дещо більшими.

На нашу думку, на характер кластеризації одомашненого виду та представників дикої фауни вплинули особливості застосованих методів ПЛР (з випадковими праймерами). І якщо у випадку RAPD-PCR розташування видів повністю узгоджується з уявленнями про їхню еволюцію, то результати оцінки генетичної спорідненості видів за ISSR-маркерами з динуклеотидними мікросателітними послідовностями не збігаються з сучасними уявленнями щодо філогенетичних взаємовідносин між цими видами тварин. При цьому кластеризація видів, виконана окремо за кожним із ISSR-праймерів, також різнилась. Це можна пояснити особливістю методу ISSR-PCR - ампліфікації послідовності ДНК, безпосередньо пов'язаної з мікросателітами, швидкість мутацій яких може коливатися, що істотно ускладнює тлумачення отриманих результатів. Очевидно, що високий рівень поліморфізму маркерів ISSR- та RAPD-PCR зручний і незамінний у разі вирішення завдань внутрішньовидового аналізу, але може призводити до певних помилок під час міжвидових порівнянь.

Таким чином, залежно від типу маркерів та нуклеотидної послідовності праймерів оцінка генетичної спорідненості трьох видів - зубрів, бізонів та великої рогатої худоби - може бути різною. Відтак, у випадку ДНК-аналізу необхідна індивідуальна оцінка інформативності та ефективності використання окремих маркерів для виконання конкретних завдань.

Генетична паспортизація сортів сої за використання поліморфних спектрів ампліфікації RAPD- та ISSR-PCR. Для генетичної паспортизації 14 сортів культурної сої за допомогою RAPD-PCR було використано 5 декануклеотидних праймерів - UBC-1, UBC-2, UBC-3, UBC-6 та UBC-9, спектри яких мали поліморфні та чіткі амплікони. У випадку ISSR-PCR було застосовано 2 тринуклеотидні праймери - (AGC)₆G та (CTC)₆A - і один динуклеотидний - (AС)₉C. Під час аналізу до уваги брали поліморфні продукти ампліфікації, що стабільно відтворювалися не менш ніж у трьох незалежних експериментах і легко типувалися.

Дані спектрів електрофоретичного розділення продуктів ампліфікації записували, використовуючи бінарний код: 1 - наявність, 0 - відсутність відповідної смуги (амплікону) на треку. На основі бінарного коду реєстрували генотип рослини у вигляді “генетичної формули” - кожному праймеру присвоювали відповідну літеру латинського алфавіту, а поліморфному локусу - порядковий номер (табл. 4).

Таблиця 4. Генетичні формули досліджуваних сортів культурної сої за даними RAPD- та ISSR-аналізу

Сорт	Генетична формула
	RAPD-PCR	ISSR-PCR
Витязь 50	A1A2B2C3C5	А1А4В1В2
Юг 30	A3A5B1B3B5C1C3C5	А3А7А9В1В4
Амурська 57	A2A3A4C5	А1А3А4А7А9В2В3
Подолянка	A2B3B5C5	А1А4А5А8А10В1В2
Амурська 41	A2A3A4B2C5D1	А1А2А5А8В1В2
Київська 451	A2A5B3B5C1C3C5	А1А4А8В4
Київська 27	A2A5B3B5B6C1C6	А1А5А8А10В1
Іскра	A2B3B5C1C5	А1А3А7А9В1В2
Устя	A4A5B1B3C1C3C4D1	А1В1В2С2
Памір	A2A5B3B4B5C3C5C7D2	А1А8А10В3В4С1
Нива	A2B3B5C1E1	А1В2
Чернівецька 8	A3B2B5C1C2C7D2	А1А8А10В4
Подільська 416	A1A2A5B1B3B5C1C3C5	А1А2А4А5А6А8В1В2В4
Ватра	A2B3B5C1	А1А4А5А8В3

Загалом за участі п'яти RAPD-праймерів було використано 19, а трьох ISSR-праймерів - 16 поліморфних продуктів ампліфікації ПЛР. Їх виявилось достатньо для точної паспортизації досліджених сортів. Генетичну ідентифікацію окремого сорту проводили шляхом порівняння отриманої генетичної формули з формулами усіх проаналізованих сортів.

Дискримінаційна здатність ISSR-праймерів з ди- та три-нуклеотидними мікросателітними мотивами. Структурні особливості ISSR-маркерів аналізували за спектрами ампліфікації, отриманими для великої рогатої худоби та сортів сої. Сумарні результати проведеного дослідження наведено у таблиці 5.

Таблиця 5. Характеристика використаних у роботі ISSR-праймерів

Праймер	Bos taurus	Glycine max L.
	кількість ампліконів	маркерний індекс	тип реакції*	кількість ампліконів	маркерний індекс	тип реакції
(TG)9C	-	-	2	-	-	2
(TG)9A	-	-	2	-	-	2
(GT)10C	14	2,82	3	-	-	1
(GT)9C	12	3,22	3	-	-	2
(AC)9G	8	1,12	3	9	3,12	3
(AC)9C	11	3,26	3	13	2,94	3
(AC)9T	7	3,17	3	13	2,86	3
(GA)9C	8	3,44	3	10	2,78	3
(AG)9C	9	3,86	3	13	3,26	3
(CT)9G	10	2,34	3	-	-	2
(AGC)6G	32	4,86	3	42	4,18	3
(AGC)6C	18	4,12	3	-	-	3
(AGC)6T	16	3,98	3	-	-	2
(TCG)6G	16	3,46	3	14	3,24	3
(GCT)6A	12	4,42	3	-	-	1
(CAC)7T	-	-	2	26	3,42	3
(CAC)7A	-	-	2	-	-	1
(GTG)7A	19	4,22	3	28	3,95	3
(GTG)7C	14	3,16	3	-	-	2
(CTC)6A	12	2,96	3	12	2,89	3
(CTC)6C	10	2,24	3	-	-	1
(GAG)6C	-	-	2	15	3,14	1

Примітка:* тип реакції: 1 - відсутність ампліконів, 2 - дифузні спектри без чітких дискретних смуг, 3 - чіткі продукти та інформативні спектри ПЛР

На основі одержаних спектрів ISSR-праймери розділили на три групи. До першої належали праймери, за використання яких ПЛР-продукти були відсутні. Таку картину спостерігали лише за аналізу рослинної ДНК з праймерами (GT)₁₀C, (GCT)₆A, (CAC)₇A, (CTC)₆C та (GAG)₆C. Поясненням цього може бути відсутність у геномі сої мікросателітних локусів з такою кількістю повторів або особливістю їх утворення та еволюції (існування недосконалих повторів). генетичний поліморфізм бізон худоба

До другої групи належали праймери, для яких були характерні дифузні спектри без чітких дискретних смуг: (TG)₉C, (TG)₉A, (GT)₉C, (CT)₉G, (AGC)₆T та (GTG)₇C - у випадку ПЛР-аналізу сої та (TG)₉C, (TG)₉A, (CAC)₇T, (CAC)₇A та (GAG)₆C - з пробами ДНК великої рогатої худоби. З огляду на те, що ПЛР дає змогу ефективно ампліфікувати локуси, відстань між якими становить не більше 3 т.п.о., така картина може свідчити про розташування інвертованих локусів на більшій відстані один від одного або з їх великою кількістю у досліджених геномах. У такому разі для успішного застосування цих праймерів доцільно збільшувати кількість якірних нуклеотидів з метою підвищення специфічності реакції.

Для третьої групи, до якої належала більшість використаних у роботі олігонуклеотидів, одержано чіткі продукти та інформативні спектри ампліфікації. Загальна кількість ампліконів варіювала залежно від мікро- сателітного мотиву праймеру, якірного нуклеотиду та досліджуваного геному.

Під час аналізу геному великої рогатої худоби було отримано більшу кількість поліморфних локусів (8 з динуклеотидною послідовністю та 9 - з тринуклеотидною), ніж за аналізу рослинної ДНК (5 з динуклеотдною послідовністю та 6 - з тринуклеотидною). При цьому показники середньої кількості та частки поліморфних локусів для тринуклеотидних праймерів були достовірно вищими (табл. 6). Значення маркерних індексів тринуклеотидних праймерів, які дають змогу оцінити поліморфність окремих праймерів у разі дослідження того чи іншого геному, також були вищими як за аналізу рослин, так і тварин.

Таблиця 6. Середня кількість (N_ср) та частка поліморфних локусів (Р_ср) за використання маркерів ISSR-PCR

Праймери	Glycine max L.	Bos taurus
	Nср	Рср	Nср	Рср
Динуклеотидні	11,60	6,40	11,25	6,80
Тринуклеотидні	22,83	10,17	16,50	12,40

Таким чином, отримані в роботі результати засвідчили, що тестовані методи мультилокусного ДНК-профілювання - ISSR- та RAPD-PCR, характеризуються достатнім рівнем генетичного поліморфізму для вирішення практичних та теоретичних завдань сільськогосподарської генетики (генетичної паспортизації, визначення рівня генетичного поліморфізму та ін.). Проведення полімеразної ланцюгової реакції за чітким алгоритмом та за оптимальних умов зумовлює отримання відтворюваних та інформативних ПЛР-спектрів.

Одержані результати в перспективі можуть бути використані для спрямованого вибору праймерів, дають змогу рекомендувати високополіморфні маркери для генетичної диференціації геномів тварин і рослин, передусім для аналізу на видовому рівні. Разом з тим, застосування маркерів ISSR- та RAPD-PCR для міжвидових порівнянь має певні обмеження, які варто враховувати під час виконання філогенетичних досліджень.

Висновки

1. На прикладі представників підродини Bovinae та підродини Phaseoleae теоретично обґрунтовано і практично доведено високу інформативність ISSR- та RAPD-маркерів для генетичної диференціації геномів вищих організмів, а також можливість їхнього використання для генетичної паспортизації.

2. Найважливішим етапом екстракції ДНК, що впливає на якісні та кількісні характеристики препарату ДНК, є початковий лізис біологічного матеріалу. Додаткове очищення препарату ДНК методом сорбції на силіцій оксиді уможливлює отримання чітких та відтворюваних спектрів ампліфікації ISSR- та RAPD-PCR.

3. Оптимальними умовами проведення полімеразної ланцюгової реакції за використання досліджених у роботі 22 ISSR- та 9 RAPD-праймерів є наступні: концентрація геномної ДНК - 30-60 нг; іонів Mg²⁺ - 1,8-2,2мМ; dNTP - 200 мкМ; Taq-полімерази - 0,8-1,2 од.; ISSR-праймерів - 0,3-0,6 мкМ; RAPD-праймерів - 0,4-0,7 мкМ; кількість циклів - 32 для ISSR-PCR та 35-37 для RAPD-PCR; температура відпалу - 52-58єС та 45єС відповідно.

4. Одомашнений (Bos taurus) і дикі види тварин підродини бичачих (Bison bison, Bison bonasus), а також сорти культурної (Glycine max L.) та популяції дикої уссурійської сої (Glycine soja) характеризуються високим і порівнянним рівнем генетичної мінливості за маркерами ISSR- та RAPD-PCR. Так, середня гетерозиготність сірої української породи за маркерами ISSR- та RAPD-PCR становила відповідно 0,278 та 0,213, бізона - 0,274 та 0,221, зубра - 0,177 та 0,169. Аналогічні показники для дикої та культурної сої становили відповідно 0,357 та 0,345 і 0,411 та 0,406.

5. Залежно від типу маркерів та нуклеотидної послідовності праймерів, оцінка генетичної спорідненості трьох видів - зубрів, бізонів та великої рогатої худоби - може бути різною. Відтак у випадку ДНК-аналізу необхідна індивідуальна оцінка інформативності та ефективності використання окремих маркерів для виконання міжвидових порівнянь.

6. Поліморфні системи маркерів ISSR- та RAPD-PCR дають змогу проводити генетичну паспортизацію. Так, для ідентифікації 14 сортів сої різного еколого-географічного походження достатнім було застосувати 5 RAPD-праймерів (UBC-1, UBC-2, UBC-3, UBC-6, UBC-9) або 3 ISSR-праймери ((AGC)₆G, (CTC)₆A, (AC)₉C).

7. Серед досліджених 9 RAPD- та 22 ISSR-праймерів найбільш інформативними для генетичної диференціації геномів виявлено ISSR-маркери з тринуклеотидними мікросателітними повторами. Середня кількість і частка поліморфних локусів за цими маркерами у сірої української породи великої рогатої худоби становила відповідно 16,6 та 12,4, у сортів сої - відповідно 22,8 та 10,2.

Пропозиції виробництву

1. Для уникнення зниження рівня генетичного поліморфізму та накопичення негативних ефектів близькоспорідненого схрещування в генетико-селекційній роботі слід проводити попередню молекулярно-біологічну паспортизацію тварин та рослин.

2. Під час проведення паспортизації та визначання рівня генетичної мінливості тварин і рослин доцільно використовувати ISSR-праймери з тринуклеотидними мікросателітними повторами, які характеризуються високим рівнем поліморфізму, а відтак мають високу інформативність.

3. Методи мультилокусного профілювання на основі ПЛР - RAPD-PCR та ISSR-PCR - рекомендуються для використання у селекційній практиці з метою захисту авторських прав селекціонерів та уникнення нелегального розповсюдження перспективного селекційного матеріалу, у програмах зі збереження рідкісних і зникаючих видів сільськогосподарських та диких тварин.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Полиморфизм белков, RAPD-PCR и ISSR-PCR маркеров у зубров, бизонов и крупного рогатого скота / В.И. Глазко, Т.Н. Дымань, С.И. Тарасюк, А.В. Дубин // Цитология и генетика. - 1999. - Т. 33, № 6. - С. 30-39. (Дисертант брав участь у проведенні експерименту, аналізі матеріалу, написанні статті).

2. Генетические взаимоотношения между сортами сои, оцененные с использованием ISSR-маркеров / В.И. Глазко, А.В. Дубин, Р.И. Календарь, Г.В. Глазко // Цитология и генетика. - 1999. - Т. 33, № 5. - С. 47-51. (Дисертант провів дослідження, обробку та аналіз результатів, взяв участь у написанні статті).

3. Дубін О.В. Тестування умов проведення ISSR-PCR та їх оптимізація для аналізу геному сої (Glycine max) / О.В. Дубін, Т.М. Димань // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету. - Біла Церква, 2007. - Вип.46. - С.49-54. (Дисертант провів дослідження, обробку та аналіз матеріалу, написав статтю).

4. Дубін О.В. Генетична паспортизація сортів сої (Glycine max) за допомогою RAPD-PCR / О.В. Дубін, Т.М. Димань // Аграрні Вісті. - 2007. - №.1. - С.12-15. (Дисертант провів дослідження, обробку та аналіз результатів, написав статтю).

5. Дубін О.В. Інформативність маркерів ISSR-PCR у дослідженні геномів рослин і тварин / О.В. Дубін, Т.М. Димань // Аграрні вісті. - 2008. - №2. - С.7-9. (Дисертант провів дослідження, обробку та аналіз результатів, написав статтю).

6. Дубін О.В. Поліморфізм маркерів ISSR-PCR та RAPD-PCR у деяких представників підродини бичачих / О.В. Дубін, Т.М. Димань // Вісник Білоцерківського національного аграрного університету. - 2008. - Вип.53. - С.43-48. (Дисертант провів дослідження, обробку та аналіз результатів, написав статтю).

7. Глазко В.И. Полиморфизм ISSR у некоторых сортов сои / В.И. Глазко,
А.В. Дубин, Г.В. Глазко, Р.И Календарь // Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва: міжнар. конф.: тези доп. - Харків, 1999. - С. 139-141.

8. Дубин А.В. ISSR-маркеры в анализе генетических взаимоотношений между сортами домашней сои и популяциями дикой сои / А.В. Дубин, В.И. Глазко // Землеробство ХХІ століття - проблеми та шляхи вирішення: міжнарод. наук.-практ. конф., 8-10.06.1999: тези доп. - Київ-Чабани, 1999.- С.184-185.

9. Дубін О.В. Молекулярно-генетичний поліморфізм та паспортизація сортів культурної сої за використання RAPD-PCR та ISSR-PCR / О.В. Дубін // Наукові пошуки молоді у третьому тисячолітті: IV держ. наук.-практ. конф., 16-17.05.2007: тези доп. - Біла Церква, 2007. - С.26.

10. Дубін О.В. Оптимізація умов проведення ISSR-PCR та RAPD-PCR для аналізу геномів рослин та тварин / О.В. Дубін // Наукові пошуки молоді у третьому тисячолітті: міжн. наук.-практ. конф., 15-16.05.2008: тези доп. - Біла Церква, 2008. - С.64.

Анотації

Дубін О.В. Генетична диференціація геномів за маркерами ISSR-PCR та RAPD-PCR. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут розведення і генетики тварин УААН, с. Чубинське, Київської обл., 2009.

Дисертаційну роботу присвячено вивченню інформативності двох типів молекулярно-генетичних маркерів (ISSR- та RAPD-PCR) для диференціації геномів тварин і рослин на прикладі трьох видів підродини бичачих, сортів культурної та популяцій дикої сої.

Розроблено загальний алгоритм оптимізації методів мультилокусного ДНК-профілювання та запропоновано методику стандартизації протоколів виділення геномної ДНК. Визначено оптимальні діапазони концентрацій реагентів реакційної суміші та умов проведення ISSR- та RAPD-PCR.

За даними поліморфних спектрів ISSR- та RAPD-PCR визначено показники генетичної мінливості та популяційної різноманітності зубра, бізона та сірої української породи великої рогатої худоби. Виконано порівняльний аналіз інформативності ISSR- та RAPD-методів для міжвидової диференціації тварин.

Досліджено молекулярно-генетичний поліморфізм 5 популяцій дикої уссурійської та 14 сортів культурної сої за допомогою ISSR- та RAPD-методів. Визначено генетичні взаємовідносини між генотипами сої на основі отриманих спектрів ампліфікації та розраховано відповідні генетичні дистанції. За використання поліморфних локусів п'яти RAPD- та трьох ISSR-праймерів розроблено методику генетичної паспортизації сортів сої.

Виконано порівняння дискримінаційного потенціалу використаних у роботі ПЛР-методів для дослідження геномів рослин і тварин.

Ключові слова: генетична диференціація, молекулярно-генетичний поліморфізм, полімеразна ланцюгова реакція, RAPD-PCR, ISSR-PCR, ДНК-маркери, генетична паспортизація.

Дубин А.В. Генетическая дифференциация геномов с помощью маркеров ISSR- PCR и RAPD-PCR. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт разведения и генетики животных УААН, с. Чубинское, Киевской обл., 2009.

Диссертационная работа посвящена изучению информативности двух типов молекулярно-генетических маркеров (ISSR- и RAPD-PCR) для генетической дифференциации геномов животных и растений.

Для исследований были использованы пробы цельной крови трех видов животных подсемейства бычьих (Bos taurus, Bison bison, Bison bonasus), а также листовые диски 14 сортов культурной (Glycine max L.) различного географического происхождения и 5 популяций дикой уссурийской сои (Glycine soja). Генетическая дифференциация геномов изучалась при использовании 9 маркеров RAPD-PCR и 22 маркеров ISSR-PCR.

Разработан общий алгоритм оптимизации методов мультилокусного ДНК-профилирования и предложена методика стандартизации протоколов выделения геномной ДНК. Определены оптимальные диапазоны концентраций реагентов реакционной смеси и условий проведения ISSR- и RAPD-PCR.

Показано, что наиболее важным этапом экстракции ДНК, который влияет на качественные и количественные характеристики полимеразной цепной реакции, является начальный лизис биологического материала. Дополнительное очищение препарата ДНК методом сорбции на диоксиде кремния делает возможным получение более четких и воспроизводимых спектров амплификации ISSR- и RAPD-PCR.

По данным полиморфных спектров ISSR- и RAPD-PCR определены показатели генетической изменчивости и популяционного разнообразия трех видов подсемейства бычьих. Показано, что доместицированный и дикие виды бычьих характеризуются высоким и сопоставимым уровнем генетической изменчивости по изученным полиморфным системам. Выполнен сравнительный анализ информативности ISSR- та RAPD-методов в межвидовой дифференциации животных. Оценка генетического родства изученных видов в большой степени зависит от типа используемых маркеров и нуклеотидной последовательности праймеров.

На основании полученных спектров амплификации определены генетические взаимоотношения между генотипами сои и рассчитаны соответствующие генетические дистанции. При использовании полиморфных локусов пяти RAPD- (UBC-1, UBC-2, UBC-3, UBC-6, UBC-9) и трех ISSR-праймеров ((AGC)₆G, (CTC)₆A, (AC)₉C) разработана методика генетической паспортизации, которая позволила идентифицировать 14 сортов культурной сои.

Выполнены сравнения дискриминационной способности использованных в работе ПЦР-методов для исследования геномов растений и животных. Доказано, что при проведении паспортизации и определении уровня генетической изменчивости животных и растений целесообразно использовать ISSR-праймеры с тринуклеотидными микросателлитными последова-тельностями, которые характеризуются высоким уровнем полиморфизма.

Во избежание снижения уровня генетического полиморфизма и накопления негативных эффектов близкородственного скрещивания в генетико-селекционной работе рекомендовано использовать предварительную молекулярно-генетическую паспортизацию животных и растений.

Методы мультилокусного профилирования - RAPD-PCR та ISSR-PCR - рекомендованы для использования в селекционной практике с целью защиты авторских прав селекционеров и предупреждения нелегального распространения перспективного селекционного материала, а также в программах сохранения редких и исчезающих видов сельскохозяйственных животных.

Ключевые слова: генетическая дифференциация, молекулярно-генетический полиморфизм, полимеразная цепная реакция, RAPD-PCR, ISSR-PCR, ДНК-маркеры, генетическая паспортизация.

Dubin O.V. Genetic differentiation of genomes on ISSR-PCR and RAPD-PCR markers. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of agricultural sciences on specialty 03.00.15 - genetics. - Institute of Animal Breeding and Genetics UAAS, v. Chubinske, Kyiv Region, 2009.

The dissertation is devoted to study of informativeness of two types of molecular-genetic markers (ISSR-PCR and RAPD-PCR) for differentiation of animal and plant genomes. Bovinae and Phaseoleae species were used as models.

Algorithm of optimization of multilocus fingerprint was applied and method of standardization of DNA extraction protocol was proposed. Optimal range of reagent concentration and conditions of ISSR- and RAPD-PCR conducting were determined.

According to data of ISSR- and RAPD-PCR polymorphic spectra the indicators of genetic variability and population diversity of European bonsais, American bison and Ukrainian Gray Cattle were determined. It was made the comparative analysis of informativeness of ISSR- and RAPD-methods for interspecies differentiation of animals.

The molecular-genetic polymorphism of 5 populations of wild and 14 sorts of cultural soybean were investigated by means of ISSR-PCR and RAPD-PCR-methods. On the base of received amplification spectra the genetic distances between soybean genotypes were determined. Method of genetic pasportization of soybean sorts was proved using polymorphic loci of 5 RAPD- and 3 ISSR-primer.

The comparative analysis of discrimination potential of used PCR-method for investigation of animal and plant genomes was made.

Key words: genetic differentiation, molecular-genetic polymorphism, polymerase chain reaction, RAPD-PCR, ISSR-PCR, DNA-markers, genetic pasportization.

Размещено на Allbest.ru

...