Методи прискорення біотрансформації Т-2 токсину в організмі тварин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Ґжицького

УДК 619:615.918:612.354.3

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

Методи прискорення біотрансформації Т-2 токсину в організмі тварин

16.00.04 - ветеринарна фармакологія та токсикологія

Іщенко Вадим Дмитрович

Львів - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному університеті біоресурсів і природокористування України Кабінету Міністрів України.

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН, заслужений діяч науки і техніки України Хмельницький Григорій Олександрович, Національний університет біоресурсів і природокористування України, професор кафедри фармакології і токсикології

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор Канюка Олександр Іванович, Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Ґжицького, професор кафедри фармакології та токсикології;

кандидат ветеринарних наук Брезвин Оксана Марківна, Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок, старший науковий співробітник лабораторії контролю кормів і преміксів.

Захист дисертації відбудеться «24» березня 2009 р. о 14⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.826.03 у Львівському національному університеті ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Ґжицького за адресою: 79010, м.Львів, вул. Пекарська, 50, аудиторія №1.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Ґжицького за адресою: 79010, м. Львів, вул. Пекарська, 50.

Автореферат розісланий «21» лютого 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат ветеринарних наук, доцент Салата В.З.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Стан здоров'я тварин та безпечність продуктів тваринництва залежать від якості і санітарного стану кормів. Надійною гарантією ветеринарного благополуччя господарств є збалансованість кормів за окремими елементами живлення і постійний контроль за вмістом у них патогенних мікроорганізмів та токсикантів (Кононенко Г.П., Буркін А.А., 2002; Котик А.М., 1999; Смірнов А.М., Таланов Г.А., 1999; Oldenburg E., Breves G., 1989).

Мікотоксини є вторинними метаболітами мікроскопічних грибів, які вже давно визнані одними з найбільш шкідливих для здоров'я тварин і людей (Білай В.Й., 1960, 1977; доповіді експертів ФАО/ВОЗ, 1998, 1999). Сучасний стан мікотоксикології можна оцінити за чисельними оригінальними публікаціями, які присвячені, головним чином, вивченню поширення токсиноутворюючих грибів та їх токсигенного потенціалу, хімічної природи, методів визначення і біологічної дії. Проте, незважаючи на велику кількість робіт, досі мало уваги приділялося розробці надійних методів профілактики мікотоксикозів і терапії уражених тварин (Антонов Н.С., 1994; Духницький В.Б., 2006; Кравченко Л.В., Тутельян В.А., 2005; Папазян Р., 2002; Смирнов В.В., Зайченко А.М., Рубежняк И.Г., 2000; Артюх В.П., Гойстер О.С., Хмельницький Г.О., 2002; Marasas W.F., 2000; Pitt J.I., 2002; WHO technical report, 2002).

Після розкриття основних механізмів біотрансформації ксенобіотиків в організмі було проведено дослідження для встановлення можливості спрямованого впливу фармакологічних препаратів на перебіг цих процесів. Було запропоноване ефективне застосування індукторів ферментативної активності в токсикологічній практиці з лікувальною і профілактичною метою. Відомості про застосування таких речовин у практиці ветеринарної медицини малочисельні, хоча вони є досить перспективними. Застосування індукторів мікросомальних ферментів печінки в комплексі лікувально-профілактичних заходів за Т-2 токсикозу тварин є доцільним не лише тому, що вони сприяють швидкій біотрансформації Т-2 токсину в менш токсичні метаболіти, а й тому, що вони знижують імуносупресивну дію токсину. Окрім того, застосування регуляторів біокаталізу можливе і доцільне при отруєнні іншими токсикантами, але при обов'язковому врахуванні особливостей їх метаболізму (Арчаков А.І., 1975; Доржийн Санжаа, 1993; Істошин В.М., 1996; Кравченко Л.В., Авреньєва Л.І., Тутельян В.А., 1984; Кулінський В.І., 1999; Лужніков Є.А., Костомаров Л.Г., 1989; Ляхович В.В., Цирлов І.Б., 1981; Фролов В.М., Романюк Б.П., Петруня А.М., 1994; Bernhardt R., 2006).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Дослідження за темою дисертаційної роботи проводили в рамках наукової теми кафедри фармакології та токсикології НАУ «Теоретично обґрунтувати застосування антидотів, методів прискореної діагностики та надійної профілактики мікотоксикозів тварин» (№ державної реєстрації 0198U004091), яка входить до галузевої науково-технічної програми «Здоров'я тварин, якість та безпека тваринницької продукції в Україні на 2000-2005 роки».

Мета і завдання досліджень. Метою проведених досліджень було: з'ясувати основні механізми токсичної дії Т-2 токсину на організм тварин, зокрема на активність ферментних систем його біотрансформації; експериментально обґрунтувати застосування індукторів ферментної активності за Т-2 токсикозу.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні завдання:

- здійснити моделювання хронічного та підгострого Т-2 токсикозу тварин різних видів (коти, білі щури, поросята);

- провівши аналіз динаміки клінічних, гематологічних і біохімічних показників у тварин, встановити функціональний стан печінки за дії на організм Т-2 токсину;

- визначити вплив Т-2 токсину і різних біологічно активних речовин на активність ферментних систем печінки;

- теоретично обґрунтувати і експериментально підтвердити ефективність застосування індукторів мікросомальних ферментів печінки за Т-2 токсикозу.

Об'єкт дослідження: удосконалення методів лікування тварин за Т-2 токсикозу та його профілактики.

Предмет дослідження: клінічний стан тварин, гематологічні і біохімічні показники венозної крові котів, білих щурів і поросят, біохімічні дослідження печінки білих щурів.

Методи дослідження: клінічні, гематологічні (кількість еритроцитів, лейкоцитів, кров'яних пластинок, ретикулоцитів, лейкоцитарна формула, осмотична резистентність еритроцитів, вміст гемоглобіну), біохімічні (вміст загального та мікросомального білку, сечовини, метгемоглобіну, трансферину, церулоплазміну, вільних SH-груп, активності аспартатамінотрансферази, аланінамінотрансферази, -глутамілтранспептидази, лужної фосфатази, N-деметилювальної і денітрозувальної активностей цитохрому Р-450, глутатіонредуктази, глутатіонпероксидази), статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на поросятах вивчено вплив лікарських препаратів (нукливету і унітіолу) за хронічного Т-2 токсикозу на активність ферментних систем обох фаз біотрансформації. Встановлено, що Т-2 токсин спричиняє зниження активності ферментних систем детоксикації. Протективна дія нукливету і унітіолу за хронічного експериментального Т-2 токсикозу поросят зумовлена нормалізацією клінічного стану тварин та гематологічних і біохімічних показників крові. Нукливет стабілізує активність цитохрому Р-450 та показники системи глутатіону, унітіол - підвищує активність глутатіонредуктази та збільшує вміст відновленого глутатіону, що забезпечує високу активність цитохрому Р-450. Результати проведених досліджень теоретично і експериментально вказують на можливість застосування регуляторів біокаталізу для лікування тварин за Т-2 токсикозу і його профілактики.

Вперше за результатами дослідження електронно-парамагнітного резонансу крові встановлено, що гіпоксичний стан організму поросят за хронічного Т-2 токсикозу, поряд із гіпохромною анемією, виникає внаслідок зниження вмісту трансферину і церулоплазміну на тлі підвищення концентрації метгемоглобіну, на що не звертали увагу попередні дослідники.

Встановлено здатність Т-2 токсину до функціональної кумуляції, оскільки протягом 7-14 діб після припинення його задавання більшість гематологічних і біохімічних показників не відновлювалися до вихідного рівня при не властивій для нього матеріальній кумуляції.

Наукова новизна та актуальність досліджень підтверджена патентом України «Спосіб зниження негативного впливу Т-2 токсину на організм тварин».

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено методику застосування унітіолу та нукливету для лікування поросят за хронічного Т-2 токсикозу. Дослідженнями встановлено, що застосування унітіолу і нукливету поросятам знижує токсичну дію Т-2 токсину і стимулює обмінні процеси організму. Результати досліджень були використані при написанні «Методичних рекомендацій з діагностики, лікування та профілактики Т-2 токсикозу свиней», які затверджені науково-технічною Радою Державного департаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України (протокол №3 від 31 липня 2003 року) та науково-методичних рекомендацій «Система контролю якості кормів та продукції тваринництва за показниками вмісту мікотоксинів», затверджених науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України (протокол №3 від 23 грудня 2005 року).

Особистий внесок здобувача полягає в науковій інтерпретації літератури за темою дисертації, розробці схем та проведенні експериментальних і лабораторних досліджень, статистичній обробці отриманих результатів та їх аналізі, написанні дисертації, формулюванні висновків.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи апробовані на: ІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції ветеринарних патологів 21-24 листопада 2001 року; І з'їзді токсикологів України (2001 р.); міжнародній конференції ветеринарних фармакологів і токсикологів, присвяченій 100-річчю з дня народження С.В. Баженова 2-5 жовтня 2002 року; наукових конференціях професорського-викладацького складу, наукових співробітників та аспірантів ННІ ветеринарної медицини та якості і безпеки продукції тваринництва Національного аграрного університету (1999-2006 рр.); науково-практичній конференції «Сучасні проблеми ветеринарної токсикології, фармакології та фармації» 31 травня - 1 червня 2006 р. та науково-практичній конференції «Перспективи розвитку ветеринарної медицини України» 26-28 вересня 2007 р. (м. Луганськ).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 19 наукових праць, у тому числі 12 - у фахових виданнях, перелік яких затверджено ВАК України, (1 одноосібна), 4 тези, 2 методичні рекомендації і патент на винахід.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, пропозицій виробництву, додатків і списку літератури. Дисертація викладена на 143 сторінках комп'ютерного тексту, ілюстрована 28 таблицями, 19 рисунками. Список джерел літератури включає 281 найменування, у тому числі українською і російською мовами - 181, іншими мовами - 100.

Основний зміст роботи

Загальна методика та методи досліджень.

Експериментальна частина роботи виконана в 1999-2003 роках в проблемній лабораторії мікотоксикозів тварин кафедри фармакології та токсикології. Клініко-експериментальні дослідження проведені в клініці і віварії факультету ветеринарної медицини НАУ. Біохімічні дослідження з визначення активності ферментних систем детоксикації проводили на базі Інституту екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя МОЗ України.

Експериментальні дослідження проведено в перших двох серіях дослідів (модельні) на котах і білих щурах, в третій - на поросятах великої білої породи двохмісячного віку з масою тіла 15-17 кг на початку експерименту.

У першій серії дослідів вивчали вплив Т-2 токсину в токсичних дозах на клінічні, морфологічні і біохімічні показники у котів та застосування унітіолу для лікування при підгострому перебігові Т-2 токсикозу. Спочатку було встановлено основні параметри токсичного впливу Т-2 токсину на організм тварин. Для цього було проведено два досліди на 10 безпородних котах, яким задавали Т-2 токсин щоденно в дозі 0,05 мг/кг маси тіла, один раз на добу протягом 14 діб.

У першому досліді, який тривав 14 діб, було використано 4 коти, у другому, який тривав 21 дoбу, - 6 котів. Для відтворення експериментального токсикозу використовували Т-2 токсин у формі 0,05%-го розчину в 5%-му етиловому спирті. Тварин утримували в індивідуальних клітках при вільному доступі до води. Годівля - стандартний корм «Kitekat». Котів щоденно клінічно обстежували, відбирали кров із яремної вени до введення токсину, на 1 добу та 7 і 14 діб після введення та на 21 добу - у другому досліді. Стан тварин оцінювали за результатами досліджень клінічних, гематологічних та біохімічних показників.

У третьому досліді було сформовано дві групи тварин (по 3 голови в кожній групі). Для встановлення ефективності застосування унітіолу за Т-2 токсикозу тваринам другої групи з лікувальною метою перорально вводили 5% розчин унітіолу в дозі 10 мг/кг маси тіла. Утримання і годівля тварин були такими ж, як і в перших двох серіях дослідів. Кров для досліджень відбирали вранці до годівлі з яремної вени до введення токсину (контроль) та на 1, 7, 14 доби токсикозу.

У другій серії дослідів на білих щурах вивчали можливість протективної дії унітіолу і комплексу антиоксидантів (дибунол, селеніт натрію та -токоферолу ацетат) за Т-2 токсикозу і зв'язок такої дії із впливом на активність ферментних систем печінки.

Досліди третьої серії проводили методом груп-періодів на поросятах, по чотири голови в кожній групі, віком 10 тижнів, масою тіла 15-17 кг. Тварин утримували у станках по дві голови з дворазовою годівлею та вільним доступом до води. Тривалість кожного періоду становила 14 діб. Після закінчення кожного періоду досліду тварин зважували. Перший період - підготовчий, другий - токсикозу, третій - перерви після введення Т-2 токсину, четвертий - токсикозу із застосуванням лікарських препаратів. Т-2 токсин задавали всередину з кормом щодня в дозі 0,1 мг/кг тваринам першої групи та 0,2 мг/кг - другої. Після перерви щоденно внутрішньом'язoво вводили нукливет в дозах відповідно 2 та 5 мг/кг тваринам першої та другої груп. За тваринами велось постійне клінічне спостереження. До початку введення токсину у тварин брали кров із заочного венозного синусу для визначення контрольних показників, а на 7 і 14 добу від початку введення та після 14 діб перерви - для визначення параметрів його токсичного впливу на основі результатів гематологічних та біохімічних досліджень. Після перерви взяття крові відновлювали на 7 та 14 добу з метою визначення ефективності нукливету. За такою ж схемою проводили дослід по вивченню лікувальних властивостей унітіолу за Т-2 токсикозу поросят (доза токсину - 0,2 мг/кг маси тіла). Унітіол згодовували з кормом у дозі 30 мг/кг маси тіла.

У крові визначали: кількість еритроцитів, лейкоцитів, ретикулоцитів і кров'яних пластинок - шляхом підрахунку в лічильній камері з сіткою Горяєва за загальноприйнятою методикою; концентрацію гемоглобіну - гемоглобінціанідним методом; лейкограму - шляхом підрахунку 100 клітин у мазках крові, пофарбованих за Романовським-Гімзою; осмотичну резистентність еритроцитів - макроскопічним методом за Лімбек і Ріб'єр, визначаючи мінімальну та максимальну концентрації гіпотонічних розчинів натрію хлориду, за яких він гемолізує еритроцити; вміст трьохвалентного заліза в трансферині, церулоплазміні та метгемоглобіні - за допомогою запису сигналу електронно-парамагнітного резонансу (ЕПР) радіо-спектрометра «Varian Е-109»; N-деметилювальну та денітрозувальну активність цитохромів Р-450 в лімфоцитах периферійної крові тварин - за С.В. Сноз і Н.П. Дмитренко; активність глутатіонредуктази в еритроцитах - за інтенсивністю окиснення глутатіону; активність глутатіонпероксидази - спектрофотометричним методом за інтенсивністю окиснення NADPH в NADP; рівень глутатіону в безгемоглобіновому фільтраті крові з використанням реактиву Елмана.

У плазмі крові визначали: концентрації загального білку - біуретовим методом; сечовини - уреазним методом; активності аспартатамінотрансферази і аланінамінотрансферази - колориметричним динітрофенілгідразиновим методом за Райтманом і Френкелем; лужної фосфатази - оптимізованим стандарт-методом німецького товариства клінічної хімії згідно рекомендацій Міжнародної федерації клінічної хімії; -глутамілтранспептидази - кінетичним методом за Персійн та Ван дер Сілк.

У гомогенатах печінки білих щурів визначали: вміст мікросомального білку - за методом Лоурі; активності цитохромів Р-450 - за С.В. Сноз і Н.П. Дмитренко; глутатіонредуктази - за окисненням глутатіону; глутатіонпероксидази - спектрофотометричним методом за окисненням NADPH в NADP; рівень глутатіону - з використанням реактиву Елмана.

Отримані результати досліджень піддавали статистичному аналізу з використанням комп'ютерної програми Microsoft Excel методом Монцевічюте-Ерінгене.

Результати досліджень та їх аналіз.

Клінічні та гематологічні показники у котів при експериментальному підгострому Т-2 токсикозі.

На 6-у годину після введення котам Т-2 токсину в дозі 0,05 мг/кг маси тіла клінічний стан тварин значно погіршувався. Спостерігалось виражене пригнічення та розлад травлення з ознаками діареї. Калові маси рідкі, з домішками слизу. У деяких тварин спостерігалась блювота. Встановлено підвищення температури тіла і прискорення пульсу. За добу після введення токсину клінічний стан тварин дещо нормалізувався. Протягом наступних діб зник апетит, посилилися ознаки пригнічення. На 6-8 добу від початку досліду у окремих тварин були серозні витікання із носових отворів, посилення салівації, хрипи, а у однієї - блювота. Серцевий поштовх відчутно слабшав, показники клінічного стану погіршувались. На кінець дослідного періоду тварини були виснаженими, їх маса тіла зменшувалася на 15 % і складала 2,2 кг проти 2,7 кг до початку досліду.

Більш виражених змін зазнавали гематологічні показники. На 7 добу від початку введення Т-2 токсину в обох дослідах у тварин встановлено лейкопенію. Кількість лейкоцитів у крові тварин вірогідно зменшилася у першому досліді на 80,5 %, у другому - на 74,5 %. Лейкопенія була і на 14 добу токсикозу. Навіть за 7 діб після припинення введення токсину у крові котів кількість лейкоцитів була на 42,6 % нижчою від початкового показника. Кількість еритроцитів в обох дослідах не зазнавала вірогідних змін і залишалася близькою до контрольного показника. Рівень гемоглобіну крові після незначного підвищення за добу від початку введення Т-2 токсину поступово зменшувався у тварин в обох дослідах. Зменшення величини кольорового показника вказує на розвиток у дослідних тварин гіпо-хромної анемії.

Суттєво змінювалась і лейкограма крові котів. За добу після початку введення Т-2 токсину збільшувалась кількість паличкоядерних нейтрофілів при незначному зменшенні кількості сегментоядерних. На 7-у добу було встановлено збільшення кількості еозинофілів в 3,8 раза, а кількість паличкоядерних нейтрофілів зменшилась, наближаючись до вихідного рівня. Одночасно в обох дослідах встановлено зменшення кількості лімфоцитів (майже у 3 рази). Навіть на 7-у добу після припинення задавання токсину кількість лімфоцитів була меншою від вихідної в 1,3 раза, еозинофілів у 2 рази, а паличкоядерних нейтрофілів більшою у 3,3 раза. Необхідно зазначити, що характерними змінами лейкограми при підгострому Т-2 токсикозі є незначна нейтропенія у першу добу токсикозу із зсувом ядра нейтрофілів вліво протягом усього періоду дослідів і абсолютно протилежний характер змін кількості еозинофілів порівняно із паличкоядерними нейтрофілами, а також поступова значна лімфоцитопенія.

Біохімічні показники крові котів за експериментального Т-2 токсикозу.

Зміни рівня білку при Т-2 токсикозі котів мали деяку різницю в обох дослідах, проте спільним було зменшення його в період з першої по сьому добу токсикозу, що співпадало з найбільш вираженим погіршенням клінічного стану дослідних тварин і змінами гематологічних показників. Одночасне зниження концентрації сечовини на 7-у добу токсикозу вказує на порушення у цей період синтетичних процесів у печінці (табл. 1).

Таблиця 1. Вміст загального білку і сечовини в плазмі крові котів при введенні Т-2 токсину (M±m; n=6)

Примітка: у цій і наступних таблицях * - Р0,05, ** - Р0,02, *** - Р0,01, **** - Р0,001.

Значних змін зазнавала активність ферментів. На 1-у добу активність лужної фосфатази у плазмі крові котів була майже у 2 рази вищою порівняно з вихідним показником. На 7 добу її активність зменшилась і складала лише 76,7 % від контролю, на 14 добу цей показник був вищим контролю на 60 %. Активність -глутамілтранспептидази у плазмі крові котів у першому досліді протягом дослідного періоду була вищою порівняно з контролем на 1-у добу на 110 %, на 7 добу - на 51 %, на 14 добу - на 43 %. Активність амінотрансфераз протягом 14 діб у обох дослідах знижувалась. Для АсАТ цей показник на 1-у добу був нижчим порівняно з контролем на 20 %, на 7 добу - на 29 %, а на 14 добу - на 51 %. Навіть за 7 діб після припинення задавання токсину активність ферменту не досягала вихідного показника. Встановлені зміни активності ферментів, ймовірно, є наслідком порушення білкового обміну за Т-2 токсикозу, а також свідчать про функціональні та структурні розлади печінки.

Клінічний стан та гематологічні показники крові котів за Т-2 токсикозу і при застосуванні унітіолу.

Клінічний стан і гематологічні показники поросят за Т-2 токсикозу та при застосуванні нукливету.

При згодовуванні поросятам корму із Т-2 токсином у дозах 0,1 мг/кг і 0,2 мг/кг маси тіла встановлено зниження динаміки росту тварин (рис. 1), а з часом - блідість слизових оболонок та появу некротичних вогнищ у ділянках губ та рильця. Шкіра втрачала еластичність, щетина ставала скуйовдженою. Спостерігали порушення координації руху та тремор скелетної мускулатури у деяких тварин за 15-20 хвилин після поїдання корму. За двотижневої перерви клінічний стан тварин нормалізувався. У поросят відновився апетит, почала збільшуватися маса тіла. Не було симптомів пригнічення нервової системи, порушення координації рухів та тремору м'язів; відновилася еластичність шкіри та блиск шерсті.

Застосування нукливету в дозах 2 мг/кг та 5 мг/кг маси тіла із одночасним згодовуванням тваринам Т-2 токсину у дозах 0,1 та 0,2 мг/кг маси тіла відповідно не спричинило видимих змін стану тварин порівняно із періодом перерви. На тлі введення поросятам Т-2 токсину із одночасним застосуванням нукливету прирости маси тіла тварин були майже у 2 рази більшими, ніж у період токсикозу.

Виражені зміни встановлено у кількості лейкоцитів і кров'яних пластинок. Після надходження Т-2 токсину в дозі 0,1 мг/кг маси тіла кількість лейкоцитів була максимальною на 7-у добу токсикозу і перевищувала показник на початку досліду на 89,9 %. Збільшення кількості лейкоцитів встановлено і за дії Т-2 токсину у дозі 0,2 мг/кг, але в цьому випадку показник був максимальним на 14-у добу токсикозу, перевищуючи контрольний на 22,5 %. Застосування нукливету на тлі експериментального Т-2 токсикозу сприяло нормалізації кількості лейкоцитів у крові тварин обох дослідних груп (табл. 4).

Таблиця 4. Кількість лейкоцитів, кров'яних пластинок і ретикулоцитів у крові поросят (Т-2 токсин - 0,1 мг/кг; нукливет - 2 мг/кг маси тіла; Мm, n=4)

У тварин обох дослідних груп встановлено зменшення кількості кров'яних пластинок. Введення Т-2 токсину в дозах 0,1 та 0,2 мг/кг призвело до зменшення кількості кров'яних пластинок на 14-у добу токсикозу та за 14 діб після припинення введення токсину. Нукливет проявляв нормалізуючий вплив на кількість кров'яних пластинок за дії Т-2 токсину в різних дозах.

Суттєвих змін зазнавали показники кількості ретикулоцитів. Одночасно встановлено анізоцитоз і анізохромія. У крові виявляли значну кількість мікроцитів, частіше гіпохромних, і поодиноких макроцитів.

В обох дослідах при введенні тваринам Т-2 токсину у різних дозах спостерігали зменшення осмотичної резистентності еритроцитів, що призводило до їх гемолізу (рис. 2). У першому досліді, за дози токсину 0,1 мг/кг маси тіла, абсолютні величини показників максимальної і мінімальної осмотичної резистентності зростали: мінімальної - на 0,14, максимальної - на 0,06 (% натрію хлориду в розчині). За дози токсину 0,2 мг/кг максимальна і мінімальна осмотична резистентність підвищилась на 0,07.

При застосуванні поросятам нукливету встановлено виражений нормалізуючий вплив на цей показник в обох дослідах. Хоча показники були дещо вищими порівняно із контрольними, за винятком максимальної осмотичної резистентності еритроцитів, що була встановлена за дії Т-2 токсину у дозі 0,1 мг/кг маси тіла, коливання величини показників були не вищими 0,02 (% натрію хлориду в розчині). Тобто, препарат володіє мембраностабілізуючою дією на еритроцити.

Дія Т-2 токсину в дозі 0,1 мг/кг маси тіла на організм поросят супроводжувалась зменшенням на 7-у добу токсикозу кількості нейтрофілів із зсувом ядра вліво, одночасно у периферійній крові збільшилась кількість лімфоцитів. У по-дальшому їх кількість зменшилася, а зсув ядра нейтрофілів вліво став більш вираженим. Застосування поросятам нукливету в дозі 2 мг/кг маси тіла призводило до наближення співвідношення різних видів лейкоцитів до вихідних показників, але при цьому серед нейтрофілів паличкоядерні форми переважали над сегментоядерними. При збільшенні дози токсину до 0,2 мг/кг маси тіла на 7-у добу токсикозу встановлено незначну нейтрофілію із зсувом ядра вліво та поступову зміну співвідношення агранулоцитів в бік зменшення кількості лімфоцитів та збільшення кількості моноцитів. За таких умов введення нукливету в дозі 5 мг/кг маси тіла стабілізувало показники лейкограми.

Показники електронно-парамагнітного резонансу крові за Т-2 токсикозу та застосуванні нукливету

При пероральному введенні поросятам Т-2 токсину в дозі 0,1 мг/кг маси тіла встановлено підвищення вмісту метгемоглобіну у крові на 88,6 % на чотирнадцяту добу токсикозу. Після чотирнадцятидобової перерви показник вмісту метгемоглобіну був більш ніж у два рази меншим від початкового при статистично вірогідній різниці (табл. 5). Введення поросятам внутрішньом'язево нукливету в дозі 2 мг/кг маси тіла призводило до подальшого зменшення рівня метгемоглобіну - 26,6 % порівняно з показником на початку досліду.

Таблиця 5. Показники ЕПР крові поросят (Т-2 токсин - 0,1 мг/кг, нукливет - 2 мг/кг; Мm, n=4)

На 14-у добу токсикозу встановлено зниження вмісту трасферину та церулоплазміну в крові на 25,6 і 3 % відповідно. Після припинення введення тваринам Т-2 токсину рівень трансферину дещо підвищився, проте не досягав вихідного. Застосування нукливету поросятам на тлі Т-2 токсикозу сприяло зростанню вмісту трансферину в крові на 26,5 % і незначному підвищенню вмісту церулоплазміну.

Отже, в основі гіпоксичного стану за Т-2 токсикозу тварин є не лише анемія внаслідок порушення кровотворної функції за дії токсину. Ці явища ускладнюються підвищенням вмісту метгемоглобіну в крові тварин і порушенням всмоктування та транспорту заліза, на що вказує зниження рівня трансферину при дії Т-2 токсину на організм поросят. Застосування нукливету в дозі 2 мг/кг маси тіла на тлі введення Т-2 токсину в дозі 0,1 мг/кг маси тіла усуває метгемоглобінемію та підвищує рівень трансферину в крові.

Вплив нукливету в різних дозах на активність ферментних систем детоксикації організму поросят за Т-2 токсикозу.

За дії Т-2 токсину в дозі 0,1 мг/кг маси тіла встановлено зниження активності майже всіх досліджуваних ферментних систем детоксикації (табл. 6).

Активність ферментів системи глутатіону при введенні тваринам нукливету на тлі дії Т-2 токсину знизилась, проте, якщо на першому етапі досліду їх активність була меншою відповідно на 42,1 % та 26,5 %, то на третьому етапі на 20,4 % та 12,2 %. Поряд з тим встановлено підвищення вмісту відновленого глутатіону на 14,9 %, тоді як при надходженні лише Т-2 токсину його вміст знизився на 26,5 %.

Таблиця 6. Активність ферментних систем детоксикації у крові поросят (Т-2 токсин - 0,1 мг/кг, нукливет - 2 мг/кг; Мm, n=4)

У дозі Т-2 токсину 0,2 мг/кг маси тіла зростав його пошкоджуючий вплив на організм (табл. 7). При цьому зберігалася та ж сама тенденція змін, що і за дози Т-2 токсину 0,1 мг/кг маси тіла, тобто вони були менш вираженими при застосуванні тваринам нукливету на тлі дії Т-2 токсину.

Аналізуючи отримані результати досліджень, можна стверджувати, що одним з механізмів протективної дії нукливету на організм поросят за хронічного Т-2 токсикозу є його стимулюючий вплив на ферментні системи детоксикації. Причому, препарат в однаковій мірі діє на обидві фази цього процесу.

Таблиця 7. Активність ферментних систем детоксикації у крові поросят (Т-2 токсин - 0,2 мг/кг, нукливет - 5 мг/кг; Мm, n=4)

Вплив унітіолу на перебіг Т-2 токсикозу поросят.

У попередніх дослідах на лабораторних тваринах було доведено можливість ефективного застосування унітіолу з лікувальною та профілактичною метою за Т-2 токсикозу, а також показано, що дія препарату пов'язана із впливом його на процеси детоксикації ксенобіотиків у організмі тварин. Передбачаючи можливу протективну дію препарату за Т-2 токсикозу продуктивних тварин, зокрема, поросят, було досліджено вплив унітіолу на перебіг токсикозу та активність ферментних систем детоксикації. Встановлено зниження активності цитохромів Р-450, яка при введенні Т-2 токсину і при застосуванні унітіолу на тлі Т-2 токсикозу, яка складала відповідно 28,6 % та 23,5 % від показника на початку досліду.

Більш виражені зміни встановлено при дослідженні показників системи глутатіону. При введенні поросятам Т-2 токсину відмічалося різке зниження активності ферментів системи глутатіону, а також зменшення вмісту відновленого глутатіону у крові поросят. Так, вміст відновленого глутатіону зменшився до рівня 36,2 % порівняно із показником на початку досліду, а активність глутатіонредуктази та глутатіонпероксидази знижувалась до рівня 18,5 % та 20,4 % відповідно.

При введенні поросятам унітіолу у дозі 30 мг/кг маси.тіла на тлі дії Т-2 токсину також знижувалась активність досліджуваних ферментів, проте порівняно із періодом введення Т-2 токсину їх активність була вищою. Активність глутатіонредуктази складала 31,3 %, а глутатіонпероксидази - 26,9 % від показника до введення токсину. Введення поросятам унітіолу на тлі Т-2 токсикозу призвело до значного підвищення у крові тварин рівня відновленого глутатіону. Його вміст у крові поросят в цей період навіть перевищував на 7,2 % показник до початку введення Т-2 токсину.

Свідченням нормалізуючого впливу унітіолу на перебіг Т-2 токсикозу поросят є результати дослідження клінічного стану тварин. При згодовуванні поросятам протягом двох тижнів корму із Т-2 токсином спостерігали ознаки токсикозу - сповільнення росту, відсутність апетиту, блювота і розрідження калових мас. Найбільш вираженими ці ознаки були на 12 добу токсикозу. За час двотижневої перерви клінічний стан тварин нормалізувався - вони поїдали корм навіть за наявності запаху сірководню. За період токсикозу середньодобові прирости зменшилися майже у 5 разів - з 294 до 55 г, а при застосуванні унітіолу - орієнтовно на 1/5 - із 305 до 238 г, що також підтверджує захисну дію унітіолу за Т-2 токсикозу поросят.

Висновки

У дисертації за результатами експериментальних досліджень на тваринах різних видів доведена можливість зниження негативного впливу Т-2 токсину на організм шляхом застосування засобів, що здатні прискорювати біотрансформацію Т-2 токсину. Встановлено, що протективна дія нукливету та унітіолу за Т-2 токсикозу пов'язана із стимулюючим їх впливом на активність ферментних систем обох фаз біотрансформації токсину.

1. У дослідах на котах підтверджено їх високу чутливість до дії Т-2 токсину, який у дозі 0,05 мг/кг маси тіла спричиняє підгостру форму токсикозу, що супроводжується пригніченням центральної нервової системи, розладами травлення (блювота, діарея), катаром верхніх дихальних шляхів, ослабленням серцевої діяльності.

2. У крові котів при введенні Т-2 токсину в дозі 0,05 мг/кг маси тіла встановлено стійку лейко- і тромбоцитопенію (кількість лейкоцитів на 14-у добу токсикозу зменшувалася на 61,5-93,7 %, Р?0,05; кров'яних пластинок - на 76,7 %, Р?0,02), а також розвиток анемії, на що вказує різке зниження вмісту гемоглобіну і зменшення величини кольорового показника. У плазмі крові котів знижується рівень загального білку і підвищується концентрація сечовини, зростає активність лужної фосфатази і -глутамілтранспептидази із зниженням активності аміно-трансфераз.

3. Протягом семи діб після припинення введення тваринам Т-2 токсину більшість досліджуваних показників не відновлювалися до вихідного рівня, а подальше зменшення рівня гемоглобіну і зниження активності АлАТ вказує на наявність явища функціональної кумуляції, оскільки Т-2 токсину не властива матеріальна кумуляція.

4. Застосування при експериментальному Т-2 токсикозі 5%-го розчину унітіолу котам (10 мг/кг маси тіла всередину) і щурам (30 мг/кг маси тіла підшкірно) стимулює обмінні процеси і запобігає прояву клінічних ознак токсикозу. Унітіол стабілізує активність ферментних систем метаболізму Т-2 токсину в печінці, сприяє підвищенню рівня мікросомального білку і забезпечує вищий рівень активності цитохрому Р-450, що пов'язано із стабільністю вмісту відновленого глутатіону і активності глутатіонредуктази.

5. При хронічному Т-2 токсикозі поросят, викликаного щоденним згодовуванням корму з токсином у дозах 0,1 та 0,2 мг/кг маси тіла, настає послаблення апетиту, зменшуються прирости маси тіла на 16 % та 44 % відповідно, порушується травлення без ознак діареї, але з розрідженням калових мас, блювота, поява вогнищ некрозу шкіри в ділянці носа, порушення координації руху та тремор скелетних м'язів у деяких тварин за 15-20 хвилин після прийому корму.

6. У морфологічному складі крові поросят встановлено збільшення кількості кров'яних пластинок і ретикулоцитів до 7-ї доби токсикозу і зменшення їх в подальшому. Зміни кількості лейкоцитів за дози Т-2 токсину 0,1 мг/кг маси тіла мали такий же характер, одночасно у лейкограмі відмічалося поступове збільшення кількості паличкоядерних і зменшення сегментоядерних нейтрофілів. За дози токсину 0,2 мг/кг маси тіла настає незначний лейкоцитоз, розвиток моноцитозу і лімфоцитопенії.

7. Кількість еритроцитів і вміст гемоглобіну крові практично не змінювалися за обох доз токсину, проте встановлено якісні зміни еритроцитів - анізоцитоз і анізохромія. Осмотична резистентність еритроцитів знижувалась. Після введення поросятам протягом 14 діб Т-2 токсину в дозі 0,1 мг/кг маси тіла у крові підвищувався рівень метгемоглобіну на 88,6 % і знижувався вміст трансферину на 25,5 %.

8. Введення поросятам за хронічного Т-2 токсикозу нукливету (2 і 5 мг/кг маси тіла внутрішньом'язово) та унітіолу (30 мг/кг маси тіла всередину) усуває прояви клінічних ознак токсикозу, сприяє нормалізації гематологічних і біохімічних показників крові, попереджаючи розвиток лейкоцитопенії та анемії, підвищує прирости маси тіла на 27,6-32,2 %. Позитивна дія нукливету та унітіолу на перебіг хронічного Т-2 токсикозу поросят пов'язана із впливом препаратів на системи детоксикації токсину в організмі поросят. Нукливет у однаковій мірі проявляє свій вплив на обидві фази детоксикації, а унітіол впливає переважно на другу фазу, забезпечуючи зростання активності глутатіонредуктази (на 12,8 %) і високий вміст відновленого глутатіону в крові тварин.

Пропозиції виробництву

1. Застосування лікарських засобів, які підвищують активність ферментних систем біотрансформації, рекомендується для зниження негативного впливу Т-2 токсину на організм тварин.

2. Для лікування поросят за хронічного Т-2 токсикозу і профілактики отруєнь рекомендується застосовувати нукливет у дозі 2-5 мг/кг маси тіла внутрішньом'язово щоденно протягом двох тижнів, а також унітіол у дозі 30 мг/кг маси тіла всередину разом із кормом щоденно.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Хмельницький Г.О. Клінічний стан та морфологічні зміни крові у тварин при підгострому Т-2 токсикозі / Г.О. Хмельницький, В.Б. Духницький, В.Д. Іщенко // Науковий вісник НАУ. - 2000. - Вип. 28. - С. 231-233 (Дисертант брав участь у проведенні досліджень та написанні статті).

2. Духницький В.Б. Вплив Т-2 токсину на організм тварин / В.Б. Духницький, В.Д. Іщенко // Науковий вісник НАУ. - 2001. - Вип. 34. - С. 165-169 (Дисертант брав участь у проведенні досліджень та написанні статті).

3. Хмельницький Г.О. Вплив унітіолу на перебіг Т-2 токсикозу / Г.О..Хмельницький, В.Б. Духницький, В.Д. Іщенко // Науковий вісник НАУ. - 2001. - Вип. 42. - С. 30-34 (Дисертант брав участь у проведенні досліджень та написанні статті).

4. Хмельницький Г.О. Вплив деяких біологічно активних речовин на фер-ментні системи здорових та затравлених Т-2 токсином щурів / Г.О. Хмельницький, В.Д. Іщенко, В.Б. Духницький // Науковий вісник НАУ. - 2002. - Вип. 50. - С. 181-185 (Дисертант провів експериментальні дослідження та підготував статтю).

5. Іщенко В.Д. Зміни активності ферментних систем печінки при хронічному Т-2 токсикозі поросят / В.Д. Іщенко, В.Б. Духницький // Науковий вісник НАУ. - 2002. - Вип. 55. - С. 70-74 (Дисертант провів експериментальні дослідження та підготував статтю).

6. Хронічний експериментальний Т-2 токсикоз поросят / Хмельниць- кий Г.О., Духницький В.Б., Іщенко В.Д., Стойков І.І. // Ветеринарна медицина України. - 2002. - № 10. - С. 38-40 (Дисертант брав участь у проведенні досліджень та написанні статті).

7. Духницький В.Б. Картина крові котів та поросят при хронічному Т-2 токсикозі / В.Б. Духницький, В.Д. Іщенко // Науковий вісник ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького. - 2004. - Т. 61,Ч. 2. - С. 167-174 (Дисертант брав участь у проведенні досліджень та написанні статті).

8. Іщенко В.Д. Вплив нукливету на активність ферментних систем поросят за Т-2 токсикозу / В.Д. Іщенко // Вісник аграрної науки. - 2004. - № 11. - С. 79-81.

9. Духницький В.Б. Антидотні властивості унітіолу при гострому отруєнні нітратами великої рогатої худоби та при Т-2 токсикозі поросят / В.Б. Духницький, Г.О. Хмельницький, В.Д. Іщенко // Науковий вісник НАУ. - 2005. - Вип. 89. - С. 16-20 (Дисертант брав участь у проведенні досліджень та написанні статті).

10. Іщенко В.Д. Роль регуляції ферментної активності нукливетом і унітіолом у зниженні негативної дії Т-2 токсину / В.Д. Іщенко, В.Б. Духницький // Науковий вісник НАУ. - 2005. - Вип. 89. - С. 301-304 (Дисертант провів дослідження та написав статтю).

11. Стан обмінних процесів в організмі тварин за хронічного експериментального Т-2 токсикозу / Духницький В.Б., Хмельницький Г.О., Іщенко В.Д., Бойко Г.В. // Збірник наукових праць Луганського національного аграрного університету. - 2007. - № 78/101. - С. 189-197 (Дисертант брав участь у проведенні досліджень та написанні статті).

12. Іщенко В.Д. Зміни показників електронно-парамагнітного резонансу крові тварин за дії різних видів токсикантів / Іщенко В.Д., Малюк М.О. // Науковий вісник НАУ. - 2007. - Вип. 108. - С. 146-149 (Дисертант провів частину досліджень та написав статтю).

13. Патент України 4491, А61К31/355 «Спосіб зниження негативного впливу Т-2 токсину на організм тварин»: Духницький В.Б., Іщенко В.Д.; заявл. 19.05.2004; опубл. 17.01.2005. - Бюл. №1.

14. Методичні рекомендації з діагностики, лікування та профілактики Т-2 токсикозу свиней / Хмельницький Г.О., Духницький В.Б., Новіцький К.М., Бойко Г.В., Іщенко В.Д. Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Мін. АП України від 31.07.2003 р., реєстр. №15-14/322 (Дисертант брав участь у підготовці та написанні методичних рекомендацій).

15. Система контролю якості кормів та продукції тваринництва за показниками вмісту мікотоксинів : науково-методичні рекомендації / Хмельницький Г.О., Духницький В.Б., Бойко Г.В., Іщенко В.Д. Затверджені науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини Мін. АП України, протокол №3 від 23 грудня 2005 р. (Дисертант брав участь у підготовці та написанні методичних рекомендацій).

16. Духницький В.Б. Клінічний стан, морфологічні та біохімічні показники крові у тварин при підгострому Т-2 токсикозі / В.Б. Духницький, В.Д. Іщенко // Тези доповідей наукової конференції професорсько-викладацького складу, наукових співробітників та аспірантів факультету ветеринарної медицини НАУ. - Київ, 2001. - С. 94.