Розробка імуноферментних тест-систем для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу та специфічних Ig G

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Розробка імуноферментних тест-систем для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу та специфічних ig G

03.00.06 - вірусологія

Бова ТЕТЯНА ОЛЕКСАНДРІВНА

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії мікробіології та вірусології тварин Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН

Науковий керівник: кандидат ветеринарних наук, старший науковий співробітник

Сорока Віктор Іванович,

Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН, провідний науковий співробітник лабораторії мікробіології та вірусології тварин

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Лазаренко Людмила Миколаївна,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу проблем інтерферону і імуномодуляторів

доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник

Клестова Зінаїда Сергіївна,

Інститут ветеринарної медицини УААН, завідуюча відділенням організації і координації науково-дослідних робіт

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ензоотичний енцефаломієліт (хвороба Тешена) свиней - це контагіозне вірусне захворювання, яке супроводжується негнійним запаленням мозку та його оболонок, паралічами і парезами. Серед інфекційних хвороб свиней вірусної етіології, що реєструються в Україні, частка хвороби Тешена становить 24% [Бабкін М.В., 2006].

Збудником хвороби Тешена є вірус 1-го серотипу, який належить до родини Picornaviridae, роду Teschovirus, виду Porcine teschovirus [Fauquet C., 2005].

Найбільш чутливі до тешовірусу поросята у 2-6 - місячному віці, рідше свині 7-10 - місячного віку. Клінічні ознаки хвороби у тварин старшого віку реєструються в поодиноких випадках. Залежно від тривалості епізоотичного процесу захворюваність свиней нервовою формою становить 14 - 90 %, а летальність - 75 - 90 % [Романенко В.Ф., Сорока В.И., 1995, Романенко В.П., 2007].

Ефективність боротьби з хворобою Тешена насамперед залежить від своєчасної постановки діагнозу, що ставиться на основі клініко-епізоотологічного обстеження свинопоголів'я, результатів патолого-анатомічних та лабораторних досліджень. Лабораторна діагностика включає ізоляцію вірусу в культурі клітин з наступним типуванням його в реакції нейтралізації вірусу (РН) або імунофлюоресценції та виявлення вірусспецифічних антитіл в сироватках крові тварин. Для цього в Інституті сільськогосподарської мікробіології УААН розроблено набір діагностикумів ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней в реакції нейтралізації вірусу [Романенко В.Ф., Сорока В.И., 1999]. Цей метод і на сьогоднішній день є еталонним й основним тестом, однак він трудомісткий, потребує використання культури клітин, дорогих живильних середовищ. Крім того, постійно існує небезпека контамінації культури клітин сторонньою мікрофлорою. В результаті тривалість постановки діагнозу збільшується з 10-ти до 30 діб.

Останні досягнення молекулярної біології дозволили розробити діагностичні засоби для ідентифікації тешо-, ентеровірусів свиней на основі полімеразної ланцюгової реакції [Zell R., 2000, Palmquist J., 2002, Jimenez-Clavero M., 2003, Жигалева О.Н., 2005]. Проте в Україні вони не зареєстровані і недоступні для масових досліджень у вірусологічних лабораторіях.

В Інституті ветеринарної медицини розроблено набір діагностикумів хвороби Тешена свиней та ентеровірусних гастроентеритів на основі імуноферментного аналізу [Синицин В.А., 2003, Резуненко Е.В., 1995], які виявляють вірусоспецифічні антитіла до збудників цих захворювань в сироватках крові свиней.

Тому проведення порівняльної оцінки лабораторних методів діагностики ензоотичного енцефаломієліту (реакції нейтралізації та твердофазного імуноферментного аналізу) та розробка вітчизняної імуноферментної тест-системи для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу і удосконалення тест-системи для виявлення специфічних антитіл до них в сучасних умовах має актуальне науково-практичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження, представлені в дисертаційній роботі, виконувались згідно з тематичним планом Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН по завданню 02.05 "Розробити та удосконалити систему заходів боротьби з ентеровірусними інфекціями свиней" (№ держреєстрації 0104U005085) НТП УААН № 23 “Ветеринарно-санітарне благополуччя в Україні” (2001-2005 рр.).

Мета i завдання досліджень. Мета - розробити імуноферментні тест-системи для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу та специфічних Ig G.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

· удосконалити схеми очищення, концентрування та зберігання тешовірусних антигенів;

· одержати поліклональні антитіла до тешовірусу свиней першого серотипу та імуноглобулінів класу G свиней, визначити показники їх активності та специфічності;

· на основі одержаних поліклональних антитіл синтезувати антивірусний та антисвинячий пероксидазні кон'югати;

· визначити оптимальні параметри (рН та склад буферних розчинів, час, температура) проведення сендвіч та непрямого варіантів імуноферментного аналізу;

· сконструювати імуноферментну тест-систему для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу;

· сконструювати та випробувати імуноферментну тест-систему для виявлення імуноглобулінів класу G до тешовірусу першого серотипу в сироватках крові свиней.

Об'єктом дослідження є тешо-, ентеровіруси свиней, специфічні антитіла до них та імуноферментні тест-системи.

Предметом дослідження - одержання специфічних компонентів тест-систем для виявлення антигену тешовірусу свиней 1-го серотипу і специфічних антитіл до них, технологія виготовлення та ефективність застосування імуноферментних тест-систем.

Матеріали та методи дослідження. При виконанні поставлених завдань використовувалися вірусологічні - для культивування штамів, імунологічні - для одержання специфічних антитіл, виявлення тешовірусних антигенів і специфічних антитіл до них, фізико-хімічні - для одержання очищених вірусних та глобулінових препаратів та біохімічні методи дослідження - для одержання кон'югатів, а також методи біометричної обробки результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Теоретично та експериментально обґрунтовані технологічні аспекти виготовлення компонентів імуноферментних тест-систем для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу та специфічних антитіл до них для підвищення ефективності діагностики ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней.

Розроблено імуноферментну тест-систему для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу на основі одержаних антивірусних антитіл і пероксидазного кон'югату.

За використання розробленої тест-системи для виявлення тешовірусного антигену вперше експериментально доведено антигенну спорідненість штамів тешовірусу свиней першого серотипу, виділених на території України, з міжнародними еталонними штамами.

Удосконалено технологічні етапи інактивації, очищення, концентрування і зберігання тешовірусного антигену та одержання антисвинячого пероксидазного кон'югату, на основі яких створено імуноферментну тест-систему для виявлення імуноглобулінів класу G до тешовірусу свиней першого серотипу, висока чутливість і специфічність якої підтверджена лабораторними випробуваннями.

Практичне значення одержаних результатів. Для розширення спектру доступних лабораторних методів діагностики ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней розроблено імуноферментні тест-системи для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу та специфічних антитіл.

Запропоновані схеми одержання вірусного антигену, поліклональних антитіл, специфічних до тешовірусів свиней та імуноглобулінів класу G свиней, пероксидазних кон'югатів дозволяють одержати високоактивні і високоспецифічні реагенти для виготовлення діагностичних препаратів у біофабричних умовах.

Розроблено науково-технічну документацію: Технічні умови, „Інструкцію з виготовлення і контролю імуноферментної тест-системи для виявлення імуноглобулінів класу G до вірусу хвороби Тешена свиней”, „Листівку-вкладку застосування імуноферментної тест-системи для виявлення імуноглобулінів класу G до вірусу хвороби Тешена свиней”.

Результати досліджень використано при розробці „Рекомендацій з діагностики, профілактики та ліквідації тешо-, ентеровірусних енцефаломієлітів свиней”, які затверджено Вченою радою Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН (протокол № 6 від 5 червня 2006 р.).

Особистий внесок здобувача. Пошук і аналіз наукової літератури за темою дисертаційної роботи, основний обсяг експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення отриманих результатів виконані особисто.

Одержання очищених вірусних антигенів, високоспецифічних сироваток крові тварин, імуноглобулінів класу G свині та кроля, кон'югатів антитіл з пероксидазою хріну, визначення оптимальних умов проведення ТІФА, конструювання імуноферментної тест-системи для виявлення тешовірусу свиней першого серотипу, конструювання імуноферментної тест-системи для виявлення імуноглобулінів класу G до тешовірусу першого серотипу в сироватках крові свиней та її характеристику здобувач проводила самостійно на базі відділу фітовірусології та біотехнології Інституту сільськогосподарської мікробіології за консультативної підтримки кандидата біологічних наук М.М. Зарицького, наукових співробітників І.В. Волкової і О.Є. Мамчура.

Дослідження якісних характеристик кон'югатів та показників інформативності тест-систем проводилося на базі обласної лабораторії ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України (м. Чернігів) за участю завідуючої вірусологічним відділом Н.П. Ненич. Статистичну обробку цифрового матеріалу виконано самостійно.

Планування напрямків досліджень дисертаційної роботи та обговорення одержаних результатів здійснено під керівництвом кандидата ветеринарних наук, старшого наукового співробітника, провідного наукового співробітника лабораторії мікробіології та вірусології тварин Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН Сороки Віктора Івановича.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладено та обговорено на звітних сесіях Вченої ради Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН (м. Чернігів, 2000-2005 рр.), міжнародних науково-практичних конференціях: "Біоресурси і віруси" (Київ, 2001), "ІЕКВМ - 80 років на передовому рубежі ветеринарної медицини" (Харків, 2002), "Актуальні проблеми ветеринарної медицини в умовах сучасного ведення тваринництва" (Феодосія, 2003), "Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики" (Львів, 2003, 2004 рр.), конкурсах експериментальних робіт молодих дослідників в Інституті мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України (Київ, 2002, 2005, 2007 рр.), ІІ-й та ІІІ-й конференціях молодих вчених "Сільськогосподарська мікробіологія: здобутки і проблеми" (Чернігів, 2003, 2005), Х-му з'їзді Мікробіологічного товариства України (Одеса, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових та науково-методичних праць, з них 5 статей у фахових наукових виданнях, перелік яких затверджено ВАК України, 3 статті в інших виданнях, 2 тези доповідей і методичні рекомендації.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 149 сторінках комп'ютерного друку й складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, 2 розділів результатів досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, пропозицій виробництву, списку використаних літературних джерел та додатків. Робота містить 4 додатки, ілюстрована 17 таблицями і 25 рисунками. Список використаної літератури включає 186 найменувань, в тому числі 121 - іноземними мовами.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

РОЗДIЛ 1. Огляд літератури. Охарактеризовано збудника ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней з урахуванням останніх молекулярно-генетичних досліджень і його роль в патології тварин, висвітлено основні методи ідентифікації тешо-, ентеровірусів свиней та етапи підготовки специфічних компонентів для їх проведення. Детально описано методи імуноферментного аналізу для виявлення антигенів пікорнавірусів та антитіл до них.

Експериментальна частина

РОЗДIЛ 2. Матеріали та методи досліджень. В дослідах використовували штами „Чернігівський-2372”, „Березнянський-652”, „Перечинський-642”, „Дніпровський-32”, які належать до тешовiрусiв свиней 1-го серотипу, та И 59 і Р501, які мають антигенні зв'язки з 13 серотипами ентеровірусів свиней. Для контролю використовували еталонні штами тешовірусів свиней 10-ти серотипів: „Teschen 199”, „O 3b”, „O 2b”, „PS 36”, „F 26”, „PS 37”, „F 43”, „UKG 173/74”, „VIR 2899/84”, „VIR 460/88” та штам ентеровірусів групи А „V 13” 8-го серотипу, які були люб'язно надані професором Мальте Даубером (Інститут вірусної діагностики ім. Ф. Леффлера Федерального центру вірусних хвороб тварин, Німеччина). Штами зберігаються в колекції штамів ентеровірусів свиней Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН. Штами вірусів накопичували в перещеплюваних лініях культур клітин нирки ембріона свині (СНЕВ) та нирки новонародженого хом'ячка (ВНК-21).

Попереднє очищення вірусів проводили хлороформом, в подальшому використовували дві схеми. За першою схемою вірусну суспензію концентрували сульфатом амонію з наступним очищенням на колонці, наповненою сефадексом G 50. За другою - проводили цикл диференційного центрифугування з подальшим очищенням ультрацентрифугуванням в градієнті густини сахарози [Майнор П., 1988]. В подальшому градієнт сахарози замінили 30 % сахарозною подушкою. Визначали оптимальні умови процесу (час, концентрацію сахарози, буферний розчин для ресуспендування). Контролювали чистоту очищеного вірусного антигену спектрофотометрично, електронно-мікроскопічно і в непрямому варіанті ТІФА з антитілами до білків культури клітин СНЕВ. Підбирали консервант для зберігання очищеного та інактивованого тешовірусного антигену.

Для отримання гіперімунної сироватки до тешовірусів свиней 1-го серотипу кролів імунізували очищеними вірусними антигенами за модифікованою схемою Романенка В.П., 2000. Антисвинячу сироватку крові одержували на кролях, яких імунізували очищеними препаратами імуноглобулінів класу G за модифікованою схемою Неверової М.С., 1992. Модифікація схем полягала у використанні ад'юванту Montanide ISA 25 виробництва фірми „SEPPIC” (Франція). Всього використано 20 кролів породи шиншила вагою 2,0-2,5 кг, які утримувалися у віварію Інституту сільськогосподарської мікробіології. Активність і специфічність сироваток перевіряли непрямому ТІФА і РН у першому випадку, а також в непрямому й конкурентному варіантах ТІФА та подвійною імунодифузією в гелі - у другому.

Імуноглобуліни класу G з гіперімунних сироваток виділяли висолюванням сульфатом амонію з наступною іонообмінною хроматографією на колонці з ДЕАЕ-целюлозою [Кэрстак Э., 1983, Егоров А.М., 1991]. Чистоту контролювали спектрофотометрично [Досон Р., 1991] і електрофоретично [Гааль Э., 1982].

Кон'югацію очищених кролячих Ig G з пероксидазою хріну проводили перйодатним методом [Nakane P., Kawaoi A., 1974, в модифікації Кетті Д., 1991]. Контролювали одержані кон'югати в прямому ТІФА з використанням гомологічних і гетерологічних антигенів.

Ідентифікацію тешовірусного антигену проводили в сендвіч-варіанті твердофазного імуноферментного аналізу. Підбирали оптимальні умови проведення реакції, а саме: час, буферний розчин, температуру інкубації. Контролем слугували еталонні штами тешо-, ентеровірусів свиней.

Антитіла в сироватках крові свиней виявляли в непрямому варіанті ТІФА. Визначали оптимальний час, буфер і температуру сенсибілізації тешовірусного антигену на планшетах. Проводили підбір стабілізаторів як компонентів буферного розчину для розведення специфічних компонентів.

При конструюванні та випробуванні імуноферментної тест-системи для виявлення антитіл до тешовірусу 1-го серотипу використовували сироватки крові свиней. Кров відбирали у клінічно здорових і вакцинованих тварин, щеплених живою вакциною на основі штаму „Перечинський-642” виробництва Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН, віком 2-10 місяців, які утримувались у господарствах Чернігівської області. Експериментально заражені вірулентними штамами поросята 2 місячного віку (18 гол.) утримувалися у віварію Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН.

Сироватки крові свиней паралельно досліджували в реакції нейтралізації і твердофазному імуноферментному аналізі. Всього серологічно досліджено 103 проби сироваток крові свиней.

Статистичну обробку результатів твердофазного імуноферментного аналізу проводили з використанням t-критерію Стьюдента за допомогою програми Microsoft Excel.

Граничний рівень (ГР, cut off) тест-системи, за яким одержаний результат дослідження антигену або сироватки слід вважати позитивним або ж негативним, розраховували за формулою: , де ОГ-_ср. - середнє значення оптичної густини негативних контролів. Чутливість імуноферментної тест-системи для виявлення антитіл до вірусу хвороби Тешена в сироватках крові свиней визначали за формулою: , де Ч - чутливість системи, N_п - кількість позитивних аналізів в даній системі, N_хн - кількість хибнонегативних аналізів. Специфічність імуноферментної системи визначали за формулою: , де С - специфічність системи, N_н - кількість негативних аналізів в даній системі, N_хп - кількість хибнопозитивних аналізів.

РОЗДІЛ 3. Одержання специфічних компонентів імуноферментних тест-систем, дослідження їх властивостей. Відпрацювання оптимального методу очищення вірусного антигену проводили на моделі штаму „Чернігівський-2372” тешовірусу свиней 1-го серотипу. На рис.1 представлено схеми очищення і концентрування вірусного антигену, які описано вище.

Проведені дослідження показали, що інфекційна активність вихідного вірусного матеріалу складала 8,250,29 lg ТЦД₅₀/см³.

При очищенні ультрацентрифугуванням в градієнті густини сахарози найбільший титр вірусу (8,670,29 lg ТЦД₅₀/см³) спостерігався в 35%-й концентрації сахарози. Тому для спрощення процедури очищення і уникнення помилок при розкрапуванні градієнту ультрацентрифугування вірусів в подальшому здійснювали через 30%-ву сахарозну подушку протягом 3,5 годин з ресуспендування осаду в тріс або фосфатному буферних розчинах з додаванням детергенту Tween-20.

Результати спектрофотометричного дослідження вірусного антигену, який був сконцентрований сульфатом амонію і очищений гель-фільтрацією на колонці з сефадексом G-50, засвідчили, що співвідношення Е₂₆₀/Е₂₈₀ становило 1,04, що не характерно для очищених вірусів. Електронно-мікроскопічні дослідження штаму „Чернігівський-2372” вірусу хвороби Тешена показали, що поряд з поодинокими вірусними частками сферичної форми, спостерігаються порожні вірусні капсиди, які відрізняються зафарбленою серцевиною.

Підтвердженням недостатнього очищення вірусного антигену були результати непрямого варіанту ТІФА з антитілами імунної сироватки до культури клітин СНЕВ. Позитивним контролем слугувала культуральна суспензія СНЕВ. В ТІФА тешовірусний антиген, очищений за схемою 1, при розведенні 1:16-1:64 дав інтенсивне забарвлення з Ig G до культури клітин СНЕВ в межах 0,6-0,9 оптичних одиниць (рис. 2).

Контроль чистоти вірусних антигенів, очищених диференційним центрифугуванням з наступним ультрацентрифугуванням в градієнті густини сахарози, показав, що співвідношення Е₂₆₀/Е₂₈₀ складало 1,68.

Електронною мікроскопією у препаратах, сконцентрованих і очищених за схемою 2, виявлено скупчення повних віріонів та відсутність порожніх вірусних капсидів (рис. 3).

Про високий рівень очищення тешовірусу свиней першого серотипу від компонентів культури клітин свідчили результати ТІФА (рис. 2). Тешовірусний антиген, який очищено за другою схемою, реагував з Ig G до культури клітин СНЕВ в межах негативного контролю.

При дослідженні активності одержаного тешовірусного антигену а непрямому ТІФА з гомологічними антитілами встановлено, що його титр складав 1:10240, а робоче розведення - 1:640.

Оскільки отриманий тешовірусний антиген використовувався в подальшому не тільки для імунізації кролів, а й сенсибілізації планшет, постало питання про його тривале зберігання, адже очищені антигени були активними лише 1 тиждень під час зберігання при - 18С. Нашими дослідженнями встановлено, що використання гліцерину у співвідношенні 1:1 не знижує титр і робоче розведення вірусного антигену протягом 9 місяців під час зберігання їх при -18С.

За удосконаленою схемою проведено очищення інших штамів тешовірусів свиней, таких як „Перечинський-642”, „Березнянський-652”, „Дніпровський-32” 1-го серотипу та політипових Р501 та И59, що підтверджено даними спектрофотометрії, електронної мікроскопії та ТІФА.

Таким чином, визначено оптимальну схему очищення тешовірусного антигену, яка включає диференційне центрифугування з подальшим ультрацентрифугуванням через 30%-ву сахарозну подушку. Отримано тешовірусні антигени з титром 1:10240 та робочим розведенням 1:640 в непрямому варіанті твердофазного імуноферментного аналізу та доведено, що гліцерин у співвідношенні 1:1 зберігає активність тешовірусного антигену протягом 9 місяців. тешовірусний серотип свиня кров

Наступним етапом нашої роботи було одержання специфічних антитіл до тешовірусу свиней першого серотипу, які в подальшому використовувались в імуноферментній тест-системі для визначення тешовірусного антигену, та до імуноглобулінів G свиней, які були використані в імуноферментній тест-системі для визначення специфічних антитіл в сироватках крові свиней.

За модифікованою схемою Романенка В.П., 2000, отримано гіперімунні сироватки крові кролів до штаму „Чернігівський-2372” тешовірусу свиней 1-го серотипу з титром 1:512-1:1024 в РН та 1:2048-1:8192 в ТІФА.

В препаратах імуноглобулінів класу G, що були виділені з гіперімунних сироваток крові кролів, вміст білка становив 2-10 мг/см³, а на електрофореграмі вони представлені лише однією смугою, що свідчило про їх гомогенність. В непрямому варіанті ТІФА титр антитіл, специфічних до тешовірусу 1-го серотипу, становив 1:10240, а робоче розведення 1:2560. Вони реагували тільки з гомологічним антигеном, а з білками культур клітин ліній СНЕВ, ВНК-21 та бичачого сироваткового альбуміну (БСА) реакцію не спостерігали.

В препаратах імуноглобулінів класу G, одержаних з сироватки крові клінічно здорових свиней, вміст білка дорівнював 6,25 мг/см³. Електрофорезом в поліакриламідному гелі підтверджена їх однорідність.

Титри антисвинячих антитіл в гіперімунних кролячих сироватках, одержаних за схемою Невєрової М.С., 1991, в нашій модифікації, за методом Ouchterlony O., 1978, становили 1:16-1:32, в конкурентному варіанті ТІФА - 1:320, в непрямому варіанті 1:51200.

Таким чином, розроблено модифіковані схеми гіперімунізації кролів з використанням масляного ад'юванту ISA 25, що дозволяє одержати високоактивні сироватки до тешовірусів свиней 1-го серотипу та до імуноглобулінів класу G свиней з титрами відповідно 1:10240 і 1:51200 в непрямому варіанті твердофазного імуноферментного аналізу.

Найважливіші специфічні компоненти імуноферментних тест-систем - це пероксидазні кон'югати. Активність отриманого антивірусного кон'югату в прямому варіанті ТІФА становила 1:10240, а його робоче розведення - 1:2560. З білками культури клітин СНЕВ, ВНК-21 та БСА пероксидазний кон'югат в реакцію не вступав. Даний реагент в подальшому успішно використовувався в сендвіч-варіанті ТІФА з виявлення тешовірусу свиней 1-го серотипу (рис. 4).

Антисвинячий пероксидазний кон'югат перехресно не реагував з імуноглобулінами кроля та кози і мав низький фоновий рівень. Його титр становив 1:51200, а робоче розведення - 1:6400. Надалі він використовувався як універсальний реагент при проведенні непрямого варіанту ТІФА з виявлення вірусоспецифічних антитіл в сироватках крові свиней (рис. 5).

Таким чином, на основі очищених антивидових та антивірусних імуноглобулінів класу G синтезовані пероксидазні кон'югати з титрами відповідно 1:51200 і 1:10240, робочими розведеннями - 1:6400, 1:2560.

РОЗДIЛ 4. Конструювання імуноферментних тест-систем для діагностики хвороби Тешена свиней. При конструюванні імуноферментної тест-системи для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу підібрано інгредієнти буферного розчину для розведення специфічних компонентів та час взаємодії антитіл з антигеном.

Були випробувані бичачий сироватковий альбумін, яєчний альбумін та сухе знежирене молоко. Встановлено, що найкращими стабілізаторами виявилися яєчний альбумін у концентрації в буфері 5 мкг/см³ та сухе знежирене молоко в концентрації 120 мкг/см³. У зв'язку з обмеженою розчинністю сухого молока і необхідністю його освітлення центрифугуванням в подальших дослідах використовували яєчний альбумін.

Для зменшення неспецифічної взаємодії між білками використовують сечовину, як речовину, що активно руйнує водневі зв'язки. За співвідношенням ОГ+/ОГ- найкращий результат отримано при додаванні в буферний розчин 30 мг/см³ сечовини.

Для найкращої взаємодії антигену із сенсибілізованими антитілами важливо також визначити її оптимальну тривалість. Представлені в табл. 1 свідчать, що найоптимальнішим часом є 60 хв. Збільшення терміну інкубації до 120 хв. суттєво не впливало на значення оптичної густини, а зменшення його до 30 хв. не достатньо для активної взаємодії антигену з антитілом.

Таблиця 1. Вплив тривалості взаємодії вірусного антигену з сенсибілізованими антитілами на результати сендвіч-варіанту твердофазного імуноферментного аналізу

Досліджувані антигени	Показники оптичної густини, одиниці
	30 хв.	60 хв.	120 хв.
Чернігівський-2372	0,443±0,0089	1,101±0,0070	1,223±0,0079
ОГзразка/ОГ-	5,09	10,01	9,86
Березнянський-652	0,188±0,0078	0,366±0,0112	0,376±0,0073
ОГзразка/ОГ-	2,16	3,33	3,03
Перечинський-642	0,437±0,0080	0,988±0,0106	1,108±0,0060
ОГзразка/ОГ-	5,02	8,98	8,93
ОГсер.+	0,365	0,818	0,902
ОГсер.+/ОГ-	4,20*	7,44*	7,24*
СНЕВ	0,087	0,110	0,124

Примітка. * - Р<0,05.

Таким чином, визначено оптимальні параметри проведення сендвіч варіанту твердофазного імуноферментного аналізу, згідно з якими взаємодія антитіл з антигенами протягом 1 години при + 37С та додавання в буферний розчин 5 мкг/см³ яєчного альбуміну та 30 мг/см³ сечовини забезпечують необхідну специфічність реакції.

Завершальним етапом нашої роботи було визначення ймовірних можливостей застосування сендвіч-варіанту ТІФА для виявлення антигену тешовірусів свиней 1-го серотипу. В результаті проведених досліджень встановлено, що показники оптичної густини при дослідженні антигенів тешовірусу свиней 1-го серотипу достовірно (Р<0,001) відрізнялися від цих показників при дослідженні вірусів інших серотипів (табл. 2).

Враховуючі одержані дані розраховували граничний рівень тест-системи, який дорівнював 0,314. Тобто позитивним вважається результат, коли оптична густина на 10 % перевищує граничне значення, більше 0,345 оптичних одиниць. Якщо оптична густина нижче за 10 %, тобто менше 0,283, результат вважається негативним. Сумнівним вважається результат дослідження тешовірусного антигену, коли значення оптичної густини знаходиться в „сірій зоні”, в межах 0,283<ОГ<0,345.

Таблиця 2. Результати сендвіч-варіанту ТІФА при дослідженні тешо-, ентеровірусів свиней (n=3).

Штам	Серотип	Оптична густина, одиниці	ОГ/ОГ-
Березнянський-652	ТВС-1	0,3670,009*	3,34
Перечинський-642	ТВС-1	0,9990,018*	9,08
Чернігівський-2372	ТВС-1	1,1010,017*	10,01
Teschen 199	ТВС-1	0,9440,018*	8,58
ОГ+ (Мm) 0,8530,330
O3b	ТВС-2	0,2290,019	2,08
O2b	ТВС-3	0,2210,022	2,01
PS 36	ТВС-4	0,2120,022	1,93
F 26	ТВС-5	0,1960,012	1,78
PS 37	ТВС-6	0,1900,017	1,73
F 43	ТВС-7	0,1660,021	1,51
UKG 173/74	ТВС-8	0,1160,028	1,06
VIR 2899/84	ТВС-9	0,1170,017	1,07
V13	ЕВС-8	0,1150,022	1,05
СНЕВ		0,1100,003	1,00
ОГ- (Мm) 0,1670,049

Примітка. * - Р<0,001 відносно негативних контролів.

Значення оптичної густини при дослідженні тешовірусного антигену штаму „Березнянський-652” достовірно відрізняється від значень оптичної густини при дослідженні інших антигенів тешовірусу свиней першого серотипу (Р<0,05), однак перевищує граничне значення і не потрапляє до „сірої зони”, тому результат вважається позитивним.

Статистична обробка результатів досліджень антигенів тешовірусу свиней першого серотипу в розробленій тест-системі показала, що значення оптичної густини при дослідженні еталонного штаму Teschen 199 достовірно не відрізняються від значень оптичної густини при дослідженні штамів тешовірусів свиней першого серотипу, виділених на території України.

Таким чином, сконструйовано імуноферментну тест-систему для виявлення антигену, яка дозволяє ідентифікувати тешовіруси свиней першого серотипу. За використання імуноферментної тест-системи для виявлення тешовірусного антигену свиней вперше встановлено антигенну спорідненість штамів тешовірусів свиней першого серотипу, виділених на території України, з міжнародними еталонними штамами.

При конструюванні тест-системи ТІФА для виявлення специфічних антитіл до тешовірусу першого серотипу в сироватках крові свиней, насамперед, визначили умови іммобілізації вірусного антигену на твердому носії. За результатами дослідів, представлених в табл. 3, встановлено, що найкраща сорбція відбувається при розведенні антигену в карбонатно-бікарбонатному буферному розчині, якому і віддавалася перевага при подальших дослідженнях.

Таблиця 3. Вплив буферних розчинів на сенсибілізацію мікропланшетів тешовірусним антигеном

Досліджувані сироватки крові свиней	Показники оптичної густини, одиниці
	0,05 М карбонатно-бікарбонатний буфер рН 9,6	0,01 М натрій-калій фосфатний буфер рН 7,4	0,05 М тріс-HCl буфер з 0,1 М NaCl рН 7,2
№ 178 - позитивна	1,361	1,289	0,984
№ 241 - позитивна	1,469	1,401	1,112
№ 173 - позитивна	1,650	1,570	1,288
ОГ+ (Мm)	1,4930,1460	1,4200,1416	1,1280,1526
№ 195 - негативна	0,099	0,117	0,201
№ 179 - негативна	0,111	0,125	0,235
№ 200 - негативна	0,117	0,145	0,254
ОГ- (Мm)	0,1090,0092	0,1290,01442	0,2300,0269
Співвідношення ОГ+/ОГ-	13,7*	11*	4,9*

Примітка. * - Р<0,05

На результатах ТІФА також позначилися тривалість сорбції вірусного антигену та температура, при якій вона відбувалася (табл. 4). Найкращі результати одержані при іммобілізації вірусного антигену протягом 18 годин при +4С.

Таблиця 4. Вплив часу та температури на сенсибілізацію мікропланшетів тешовірусним антигеном

Досліджувані сироватки крові свиней	Показники оптичної густини, одиниці
	4С	37С
	2 год.	18 год.	2 год.	18 год.
№ 178	0,542	1,361	0,917	0,963
№ 241	0,681	1,469	1,123	1,188
№ 173	0,724	1,650	1,266	1,296
ОГ+ (Мm)	0,6490,0951	1,4930,1460	1,1020,0175	1,1490,1699
№ 195	0,112	0,099	0,098	0,101
№ 179	0,134	0,111	0,128	0,128
№ 200	0,159	0,117	0,117	0,134
ОГ- (Мm)	0,1350,0235	0,1090,0092	0,1140,0152	0,1210,0176
Співвідношення ОГ+/ОГ-	4,8*	13,7*	9,3*	9,5*

Примітка. * - Р<0,01

Результати порівняльного вивчення впливу стабілізаторів на взаємодію антиген-антитіло яєчного і бичачого сироваткового альбумінів та сухого знежиреного молока показало, що найкращі стабілізуючі властивості виявив яєчний альбумін, додавання якого в буферний розчин в кількості 5 мкг/см³ давало більше співвідношення між позитивним і негативним контролями.

Таким чином, оптимізовано умови сенсибілізації вірусного антигену та склад буферного розчину для сироваток і кон'югату при проведенні непрямого варіанту ТІФА.

Наступним етапом нашої роботи було визначення граничного рівня, за яким можна стверджувати про наявність або відсутність антитіл до тешовірусу свиней 1-го серотипу в сироватках крові. За результатами дослідження 42 негативних сироваток крові свиней граничний рівень дорівнює 0,182. В зв'язку з цим, позитивним вважається результат, коли оптична густина перевищує граничне значення на 10 %, тобто більше 0,200. Якщо оптична густина нижче за 10 %, тобто менше 0,164, сироватка крові вважається негативною.

Для підсумкової оцінки інформативності розробленої тест-системи визначали її специфічність та чутливість. За результатами порівняльної оцінки імуноферментної тест-системи і реакції нейтралізації при дослідженні 22 негативних сироваток крові свиней нами була встановлена 100 %-ва специфічність тест-системи.

Чутливість тест-системи визначали при дослідженні 19 сироваток крові свиней, що за результатами реакції нейтралізації гарантовано містили антитіла до тешовірусу свиней 1-го серотипу (табл. 5). Одержані результати свідчать про 95 %-ву чутливість тест-системи, оскільки оптична густина сироватки № 10 була меншою граничного значення.

Таблиця 5. Чутливість імуноферментної тест-системи для виявлення антитіл до тешовірусу 1-го серотипу в сироватках крові свиней

№ сироватки	Оптична густина, одиниці	Похибка	Титр в РВН
1	0,561*	0,0128	1:32
2	0,911*	0,0055	1:128
3	1,253*	0,0354	1:128
4	1,322*	0,0069	1:128
5	1,400*	0,0277	1:128
6	1,494*	0,0274	1:128
7	1,028*	0,0123	1:128
8	0,679*	0,0032	1:128
9	1,444*	0,0252	1:128
10	0,112*	0,0043	1:32
11	0,858*	0,0020	1:128
12	0,465*	0,0195	1:32
13	0,512*	0,0219	1:64
14	1,286*	0,0082	1:128
15	0,467*	0,0132	1:32
16	0,476*	0,0030	1:32
17	1,594*	0,0631	1:128
18	1,598*	0,0328	1:128
19	1,671*	0,0225	1:128
ОГ (Мm) 1,007±0,483
Позитивний контроль	0,885	0,0036	1:128
Негативний контроль	0,099	0,0063	0

Примітка. * - Р<0,001 відносно негативного контролю.

Випробування розробленої тест-системи в порівнянні з реакцією нейтралізації показало, що сироватки крові від клінічно здорових свиней не містять антитіл до тешовірусу свиней 1-го серотипу.

Результати випробування розробленої тест-системи з метою дослідження динаміки формування поствакцинального імунітету у щеплених живою вакциною проти хвороби Тешена свиней показали, що високий рівень антитіл в сироватках крові тварин спостерігався через 1-4 місяці після щеплення (табл. 6). Так, середньогеометричні титри вірусоспецифічних антитіл в РН становли 111 (+7,2%, - 6,7%), а в ТІФА - 274 (+15,7%, - 13,5%). Через 6-10 місяців титри антитіл знизилися відповідно до 12 (+48,5%, - 33,5%) та 32 (+30,1%, - 23,1%).

Таблиця 6. Результати дослідження сироваток крові щеплених живою вакциною проти хвороби Тешена свиней.

Вік тварини	Час після вакцинації	Результати дослідження
		в РН	в ТІФА
			титрування	ОГ*
3 міс.	1 міс.	1:128	1:128	1,286
3 міс.	1 міс.	1:128	1:256	1,594
4 міс.	2 міс.	1:128	1:512	1,253
4 міс.	2 міс.	1:128	1:512	1,322
4 міс.	2 міс.	1:128	1:512	1,494
4 міс.	2 міс.	1:128	1:256	0,858
4 міс.	1 міс.	1:64	1:128	0,512
6 міс.	4 міс.	1:128	1:512	1,400
6 міс.	3 міс.	1:128	1:256	0,911
6 міс.	3 міс.	1:64	1:128	0,679
Мm	111 (+7,2%, - 6,7%)	274 (+15,7%, - 13,5%)	1,1310,366
8 міс.	6 міс.	1:32	1:64	0,465
9 міс.	6 міс.	1:32	1:64	0,467
11 міс.	9 міс.	1:8	1:32	0,341
11 міс.	8 міс.	1:4	1:16	0,221
12 міс.	10 міс.	1:4	1:16	0,264
Мm	12 (+48,5%, - 33,5%)	32 (+30,1%, - 23,1%)	0,3520,113

Примітка. * - оптична густина (одиниці) при дослідженні сироваток крові свиней в одному розведенні.

Таким чином, розроблено імуноферментну тест-систему для виявлення імуноглобулінів класу G до тешовірусу першого серотипу в сироватках крові свиней з чутливістю 95 % і специфічністю 100 %, ефективність якої підтверджена на сироватках крові свиней при дослідженні динаміки формування поствакцинального імунітету.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації теоретично і експериментально обґрунтовано нові підходи підвищення ефективності діагностики ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней шляхом використання імуноферментних тест-систем для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу та специфічних імуноглобулінів класу G.

2. Визначено оптимальну схему очищення тешовірусного антигену, яка включає диференційне центрифугування з подальшим ультрацентрифугуванням через 30%-ву сахарозну подушку. Отримано тешовірусні антигени з титром 1:10240 та робочим розведенням 1:640 в непрямому варіанті твердофазного імуноферментного аналізу та доведено, що гліцерин у співвідношенні 1:1 зберігає активність тешовірусного антигену протягом 9 місяців при -18С.

3. Розроблено модифіковані схеми гіперімунізації кролів з використанням масляного ад'юванту ISA 25, що дозволяють отримати високоактивні сироватки до тешовірусу свиней першого серотипу та до імуноглобулінів класу G свиней з титрами відповідно 1:1024-1:4096 і 1:51200 в непрямому варіанті твердофазного імуноферментного аналізу.

4. На основі очищених антивидових та антивірусних імуноглобулінів класу G синтезовані пероксидазні кон'югати з титрами відповідно 1:51200 і 1:10240, робочими розведеннями - 1:6400 і 1:2560.

5. Визначено оптимальні параметри проведення сендвіч варіанту твердофазного імуноферментного аналізу, згідно з якими взаємодія антитіл з антигенами протягом 1 години при + 37С та додавання в буферний розчин 5 мкг/см³ яєчного альбуміну і 30 мг/см³ сечовини забезпечують необхідну специфічність реакції.

6. За використання скоструйованої нами імуноферментної тест-системи для виявлення тешовірусного антигену свиней вперше встановлено антигенну спорідненість штамів тешовірусів свиней першого серотипу, виділених на території України, з міжнародними еталонними штамами.

7. Визначено оптимальні параметри проведення непрямого варіанту твердофазного імуноферментного аналізу, згідно з якими застосування 0,05 М карбонатного буферного розчину при +4С тривалістю 18 годин забезпечує необхідну сенсибілізацію мікропланшетів вірусним антигеном, а додавання 5 мкг/см³ яєчного альбуміну в буферний розчин для розведення сироваток і кон'югату сприяє підвищенню специфічності реакції.

8. Розроблено імуноферментну тест-систему для виявлення імуноглобулінів класу G до тешовірусу першого серотипу в сироватках крові свиней з чутливістю 95 % і специфічністю 100 %, ефективність якої підтверджена на сироватках крові свиней при дослідженні динаміки формування поствакцинального імунітету.

9. Розроблено нормативно-технічну документацію на імуноферментну тест-систему для виявлення імуноглобулінів класу G до вірусу хвороби Тешена в сироватках крові свиней: технічні умови (ТУ У), інструкція з виготовлення і контролю та настанова по застосуванню.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. „Рекомендації з діагностики, профілактики та ліквідації тешо-, ентеровірусних енцефаломієлітів свиней”, схвалені методичною комісією Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН (протокол № 2 від 30 березня 2006 року) та затверджені Вченою радою Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН (протокол № 6 від 5 червня 2006 р.).

2. Нормативно-технічна документація на імуноферментну тест-систему для виявлення імуноглобулінів класу G до вірусу хвороби Тешена в сироватках крові свиней: Технічні умови (ТУ У), Інструкція з виготовлення і контролю та Настанова по застосуванню, розглянута Вченою радою (протокол № 8 від 26 серпня 2005 р.) та затверджена директором Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Бова Т.О. Очищення вірусних препаратів для розробки діагностикумів хвороби Тешена / Т.О. Бова, В.І. Сорока, С.В. Дерев'янко, І.В. Волкова, О.Є. Мамчур // Мікробіологічний журнал. - 2004. - Т.66, № 4. - С. 86-92. (Здобувач особисто проводив очищення вірусного антигену різними методами).

2. Бова Т.О. Стандартизація універсальних пероксидазних кон'югатів / Т.О. Бова, В.І. Сорока, І.В. Волкова // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького. - Львів, 2003. - Т. 5, № 2, Ч. 2. - С.6-9. (Здобувачем особисто проведено експериментальні дослідження та аналіз результатів щодо одержання антисвинячого пероксидазного кон'югату).

3. Бова Т.О. Методичні підходи до створення тест-системи для визначення антитіл до вірусу хвороби Тешена свиней на основі ТІФА / Т.О. Бова, С.В. Дерев'янко, В.І. Сорока, А.О. Бокун // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького. - Львів, 2004. - Т. 6, № 2, Ч. 1. - С.3-9. (Дисертантом особисто проведені експериментальні дослідження, аналіз і узагальнення одержаних результатів).

4. Бова Т.О. Прискорений метод діагностики ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней / Т.О. Бова, С.В. Дерев'янко, В.І. Сорока // Мікробіологічний журнал. - 2005. - Т.67, № 6. - С. 49-56. (Здобувачем особисто проведено експериментальні дослідження, аналіз та узагальнення результатів).

5. Бова Т.О. Розробка сендвіч-варіанту імуноферментного аналізу для виявлення тешовірусного антигену / Т.О. Бова, В.І. Сорока, С.В. Дерев'янко, А.О. Бокун // Вісник Одеського національного університету. - 2005. - Т. 10, Вип. 7. Біологія. - С. 339-343. (Здобувач особисто провів експериментальні дослідження та аналіз результатів).

6. Бова Т.О. Спосіб одержання антивидової сироватки крові / Т.О. Бова, В.І. Сорока // Ветеринарна медицина: Міжвід. темат. наук. зб. -Харків, 2003. - Вип. 82. - С. 96-99. (Дисертантом особисто виконані експериментальні дослідження, аналіз та узагальнення результатів).

7. Бова Т.О. Оптимізація твердофазного імуноферментного аналізу для індикації тешовірусів свиней / Т.О. Бова, С.В. Дерев'янко, В.І. Сорока // Сільськогосподарська мікробіологія: Міжвід. темат. наук. зб. - 2005. - Вип. 1-2. - С. 156-163. (Дисертантом особисто проведено експериментальні дослідження методом твердофазного імуноферментного аналізу та узагальнення одержаних результатів).

8. Бова Т.О. Результати апробації імуноферментної тест-системи для виявлення імуноглобулінів класу G до вірусу хвороби Тешена в сироватках крові свиней / Т.О. Бова, В.І. Сорока // Сільськогосподарська мікробіологія: Міжвід. темат. наук. зб. - 2005. - Вип. 3. - С. 104-112. (Дисертантом особисто виконані експериментальні дослідження, аналіз та узагальнення результатів).

9. Бова Т.О. Можливість використання інактивованого вірусу для постановки ІФА // Біоресурси і віруси: ІІІ Міжнародна конференція, 11-15 вересня 2001 р. - Київ, Фітосоціоцентр, 2001. - С. 25.

10. Бова Т.О., Сорока В.І., Дерев'янко С.В., Бокун А.О. Виявлення тешовірусного антигену з використанням сандвіч варіанту імуноферментного аналізу // Х з'їзд Товариства мікробіологів України. Одеса, 15-17 вересня 2004 р. - Одеса: Астропринт, 2004. - С. 351.

11. Сорока В.І., Бокун А.О., Дерев'янко С.В., Божок Л.В., Бова Т.О. Рекомендації з діагностики, профілактики та ліквідації тешо-, ентеровірусних енцефаломієлітів свиней. - Чернігів: ІСГМ УААН, 2006. - 28 с. (Здобувачем особисто проведено експериментальні дослідження щодо застосування імуноферментних методів діагностики тешо-, ентеровірусних енцефаломієлітів свиней).

АНОТАЦІЯ

Бова Т.О. Розробка імуноферментних тест-систем для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу та специфічних ig G. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2008.

Дисертація присвячена підвищенню ефективності лабораторної діагностики ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней шляхом розробки імуноферментних тест-систем для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу та специфічних імуноглобулінів класу G.

Одержано і охарактеризовано стабільні специфічні компоненти імуноферментних тест-систем: тешовірусний антиген, вірусоспецифічні антитіла, антивірусний й антисвинячий пероксидазні кон'югати.

Визначено оптимальні параметри проведення сендвіч і непрямого варіантів твердофазного імуноферментного аналізу.

Сконструйовано імуноферментну тест-систему для виявлення антигену, яка дозволяє ідентифікувати тешовіруси свиней першого серотипу. За використання імуноферментної тест-системи вперше встановлено антигенну спорідненість штамів тешовірусів свиней першого серотипу, виділених на території України, з міжнародними еталонними штамами.

Розроблено імуноферментну тест-систему для виявлення імуноглобулінів класу G до тешовірусу першого серотипу в сироватках крові свиней з чутливістю 95 % і специфічністю 100 %, ефективність якої підтверджена на сироватках крові свиней при дослідженні динаміки формування поствакцинального імунітету. Розроблено нормативно-технічну документацію на тест-систему та проведено лабораторні випробування.

Ключові слова: тешовіруси, вірусний антиген, антитіла, пероксидазний кон'югат, гіперімунна сироватка, реакція нейтралізації, імуноферментний аналіз, тест-система.

Бова Т.А. Разработка иммуноферментных тест-систем для определения антигена тешовируса свиней первого серотипа и специфичных ig G. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2008.

Диссертация посвящена повышению эффективности лабораторной диагностики энзоотического энцефаломиелита (болезни Тешена) свиней путём разработки иммуноферментных тест-систем для выявления антигена тешовируса свиней 1-го серотипа и специфических иммуноглобулинов класса G.

Определена оптимальная схема очистки тешовирусного антигена, включающая дифференциальное центрифугирование с последующим ультрацентрифугированием через 30 % сахарозную подушку. Получены тешовирусные антигены с титром 1:10240 и рабочим разведением 1:640 в непрямом варианте ТИФА. Установлено, что глицерин в соотношении 1:1 не снижает рабочих характеристик тешовирусных антигенов при хранении в течение 9 месяцев при - 18С.

Разработаны модифицированные схемы иммунизации кроликов при использовании масляного ад'юванта ISA 25, позволяющие получить высокоактивные сыворотки к тешовирусу свиней 1-го серотипа и иммуноглобулинам класса G свиней с титрами соответственно 1:1024-1:4096 и 1:51200 в непрямом варианте твердофазного иммуноферментного анализа.

На основе очищенных антивидовых и антивирусных иммуноглобулинов класса G синтезированы пероксидазные конъюгаты с титрами соответственно 1:51200 и 1:10240, рабочими разведениями - 1:6400, 1:2560.

Определены оптимальные параметры проведения сэндвич варианта ТИФА, при которых взаимодействие антител с антигенами в течение 1 часа при + 37С и добавление в буферный раствор 5 мкг/см³ яичного альбумина, а также 30 мг/см³ мочевины обеспечивают необходимую специфичность реакции.

Сконструирована иммуноферментная тест-система для определения антигена, которая позволяет идентифицировать тешовирусы свиней первого серотипа. При использовании тест-системы впервые установлено антигенное родство штаммов тешовирусов свиней первого серотипа, выделенных на территории Украины, с международными эталонными штаммами.

Определены оптимальные параметры проведения непрямого варианта Т...