Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК 578.863.1; 581.15; 579; 632.937

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

ВЛАСТИВОСТІ КЛОНОВИХ ЛІНІЙ СОРТІВ КАРТОПЛІ ПІСЛЯ ОЗДОРОВЛЕННЯ ТА КУЛЬТИВУВАННЯ ІN VITRO

03.00.20 - біотехнологія

ДЕМЧУК ІНГА ВОЛОДИМИРІВНА

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті сільськогосподарської мікробіології

Української академії аграрних наук

Науковий керівник - кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Зарицький Микола Макарович,

Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН, завідуючий відділом фітовірусології і біотехнології

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук, професор

Положенець Віктор Михайлович,

Державний вищий навчальний заклад «Державний агроекологічний університет», завідуючий кафедрою селекції і біотехнології

доктор сільськогосподарських наук,

старший науковий співробітник

Постоєнко Володимир Олексійович,

Державний науково-контрольний інститут біотехнології і штамів мікроорганізмів, заступник директора з наукової роботи

Захист відбудеться «__4___»____грудня_____ 2008 р. о _10_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.15 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ - 41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус 3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ - 41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус 4, к. 28

Автореферат розісланий «__22___»____жовтня__2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Ю.В. Коломієць

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

ґрунту рослина пробірковий біопрепарат

Актуальність теми. Нарівні із садивним матеріалом від добору клонів для відтворення еліти картоплі використовується також матеріал, отриманий з використанням біотехнологій: оздоровлений методом культури меристем та розмножений в умовах in vitro. Нормативно-технічна документація нашої держави Положення про насінництво картоплі / Міністерство сільського господарства і продовольства України ; ІК УААН. - К., 1997. - 28 с. передбачає його використання у первинному та оригінальному насінництві сортів картоплі без випробування в потомстві.

Проте з часом з'являється все більше фактів, що викликають неоднозначну реакцію дослідників та практиків на оздоровлення сортів картоплі культурою меристем. Так, до цього часу лишається дискусійним питання збереження в оздоровленому меристемному матеріалі морфологічних і врожайних властивостей вихідних сортів. Ряд дослідників впевнені, що меристемне походження регенерантів гарантує їх повну тотожність вихідним рослинам (Бутенко Р.Г., 1982, 1990; Калинин Ф.Л. и др., 1992; Трофимец Л.Н., 1994; Коткас К., 2000). Інші стверджують, що внутрішньосортова мериклональна мінливість існує, та, завдяки біологічним особливостям картоплі, зміни зберігаються в бульбових поколіннях (Майщук З.Н., 1985; Рассадина Г.В. и др., 1990; Меличенко Г.И., Ланева И.И., 1993; Адамова А.И., 2000, 2001; Симаков Е.А. и др., 2001). Із врахуванням коефіцієнтів розмноження оздоровленого матеріалу в мікроклональних лабораторіях, поява змінених рослин у первинному насінництві може становити реальну загрозу існуванню сортів (Сидоров В.А., 1990; Мамчур А.Е. и др., 1998; Тимошенко І.І. та ін., 2001).

Важливими умовами успішного використання біотехнологічних методів у насінництві картоплі є визначення терміну культивування оздоровлених клонових ліній in vitro та підвищення адаптивної здатності пробіркових рослин при переводі їх в умови in vivo, оскільки саме на цьому етапі втрачається значна кількість розсади (Адамова А.И. и др., 2002; Реуцкий В.Г. и др., 2005, 2007). Крім того, отриманню якісного насіннєвого матеріалу картоплі методом культури тканин перешкоджає також можливість контамінації мікророслин ендофітною бактеріальною мікрофлорою, в тому числі патогенною (Stead D., 1999), що може роками виживати в культурі тканин картоплі без ознак бактеріального ураження на рослинах, мікробульбах і не виявлятись у середовищі (Cassels A.C., 1991; Grimm F, Baumann B., 1991; Weber J, Schenk G., 1998).

Зважаючи на викладене, актуальним є вивчення розмаху і меж внутрішньосортової мінливості клонових ліній, отриманих в процесі оздоровлення сортів, а також її природи і стабільності в бульбових поколіннях. Необхідною є розробка простої і доступної методики оцінки і відбору продуктивних ліній, тотожних ознакам вихідних сортів. Потребує подальшого вивчення вплив терміну зберігання оздоровлених ліній in vitro на їх відтворювальну здатність і збереження сортових ознак, а також умов підвищення адаптивної здатності пробіркових рослин при переводі у ґрунт. Дисертаційна робота присвячена відпрацюванню цих питань.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконані у відділі фітовірусології і біотехнології Інституту сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук впродовж 2002-2006 років у відповідності із завданнями науково-технічних програм УААН: “Фітовірусологічне обґрунтування та забезпечення оптимальних умов безвірусного насінництва сільськогосподарських культур в різних грунтово-кліматичних умовах України” (номер ДР 0101U003753), “Розробити технологію оздоровлення сортів картоплі біотехнологічними методами та наукові основи інтегрованого захисту оздоровленого матеріалу на всіх етапах відтворення еліти” (номер ДР 0104U005076), “Виробництво насіннєвого матеріалу картоплі культури in vitro” (номер ДР 0104U005077) та “Вдосконалити технології отримання оздоровленого вихідного насіннєвого матеріалу картоплі на основі біотехнологічних методів як базового етапу системи захисту картоплі від інфекцій” (номер ДР 0106U004288).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було визначити вплив біотехнологічного оздоровлення сортів картоплі на властивості отриманих ліній, а відтак, на якість вихідного оздоровленого матеріалу картоплі. Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

- встановити розмах і природу внутрішньосортової мериклональної мінливості рослин in vitro та їх бульбових поколінь в умовах ґрунту;

- розробити комплексну методику оцінки для відбору клонових ліній оздоровлених сортів за продуктивністю і типовістю;

- дослідити вплив тривалого культивування рослин картоплі в умовах in vitro на їх властивості та визначити оптимальні умови підтримання колекції оздоровлених сортозразків;

- створити оптимальні умови для адаптації пробіркових рослин до відкритого ґрунту за допомогою біопрепаратів;

- визначити склад ендофітних бактеріальних асоціацій в рослинах картоплі in vitro та вивчити їх вплив на продуктивність оздоровлених ліній.

Об'єкт дослідження: оздоровлені лінії картоплі in vitro та в бульбових поколіннях, штам мікроміцета Chaetomium cohliodes Palliser 3250, асоціація ендофітних бактерій.

Предмет дослідження: мінливість і продуктивність рослин клонових ліній картоплі під впливом процесів оздоровлення, бактеризації та в залежності від терміну культивування in vitro.

Методи дослідження: лабораторні, вегетаційно-польові, статистичні. З використанням лабораторних методів проводили фітовірусологічне тестування отриманих регенерантів і оздоровлених клонових ліній, аналіз генома регенерантів і клонових ліній, біометричні дослідження мікророслин оздоровлених, колекційних та бактеризованих ліній, біохімічні аналізи бульб клонових ліній, визначення морфологічних і фізіолого-біохімічних властивостей ізолятів ендофітних бактерій. Вегетаційні і польові методи застосовували при вивчені морфологічних і продуктивних ознак оздоровлених сортозразків, адаптивної здатності мікророслин картоплі та впливу на них штаму мікроміцета C. cohliodes Palliser 3250 і асоціації ендофітних бактерій. Оцінку достовірності отриманих результатів та порівняльні аналізи здійснювали згідно методик статистичних аналізів у сільському господарстві і біології за допомогою комп'ютерних програм Statistica 6.0.

Наукова новизна одержаних результатів. З використанням сучасних методів молекулярно-генетичних маркерів вперше в Україні досліджено клонові лінії картоплі після оздоровлення сортів біотехнологічними методами, та доведено, що в межах сортозразків існує внутрішньосортова мінливість між лініями регенерантів за кількісними і якісними ознаками, яка є суттєвою принаймні у трьох бульбових поколіннях. Показано, що мінливість оздоровлених ліній, які походять з меристем та бруньок, має епігенетичну природу, а калліклони відрізняються від рослин вихідного сорту на рівні ДНК.

Вперше вивчено вплив мікроміцета C. cohliodes Palliser 3250 на адаптацію рослин картоплі in vitro при пересадці їх в ґрунтові умови та показано доцільність його застосування в технології одержання вихідного матеріалу картоплі як екологічно-безпечного засобу стимулювання розсади.

Доведено негативний вплив тривалого культивування in vitro на продуктивні та сортові ознаки оздоровлених мікроклонів. Встановлено, що не всі рослини лінії однаково пригнічуються внаслідок перебування in vitro. Показано, що можливим і доцільним є поновлення культури шляхом її ре-ініціації з бруньок кращих клонів колекційних ліній у першому бульбовому поколінні.

Вивчено склад та фізіолого-біохімічні властивості бактеріальної асоціації, виділеної з рослин картоплі in vitro. Представники родів Bacillus, Clavibacter і Pseudomonas розмножуються разом з рослинами in vitro і передаються у їх бульбових поколіннях, як in vitro, так in vivo. Вплив бактеріальної асоціації на рослину-господаря в культурі тканин може проявлятись у широкому спектрі - від повного пригнічення, що є однією з причин втрати життєздатності пробіркових рослин, до стимуляції росту рослин, що виражається, зокрема, у кращому розвитку кореневої системи рослини in vitro. Всі досліджувані ізоляти впливали на патологічний процес, який викликає Erwinia carotovora subsp. сarotovora, знижуючи агресивність патогена.

Практичне значення одержаних результатів. Відпрацьовано методику комплексної оцінки ліній оздоровлених сортозразків картоплі на продуктивність і відповідність сортовим ознакам. Відбір типових високопродуктивних ліній для первинного насінництва дасть можливість запобігти появі змінених форм при оздоровленні і мікроклональному розмноженні сортів картоплі.

Визначено оптимальні умови культивування оздоровлених колекційних сортозразків без втрати ними морфологічних і господарсько-цінних ознак вихідних сортів. Запропонована схема підтримання колекцій оздоровлених сортозразків, яка гарантує збереження життєздатності і господарсько-цінних ознак сортів.

Показано, що застосування біопрепарату на основі мікроміцета С. cohliodes Palliser 3250 у виробництві вихідного матеріалу сприяє збільшенню коефіцієнта приживання розсади і продуктивності рослин.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Інформаційний пошук, опрацювання літературних джерел, розробка схем експериментів, отримання експериментальних даних, їх статистичний обробіток та узагальнення автором дисертації здійснено особисто. Заключний аналіз результатів виконано за участю наукового керівника, завідуючого відділом фітовірусології і біотехнології Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН, к.б.н М.М. Зарицького. RAPD-аналізи ДНК клонових ліній картоплі проведені за сприяння к.б.н А.В. Литовченко (Макс-Планк інститут молекулярної фізіології рослин (Гольм, Німеччина), а ідентифікація ізолятів ендофітних бактерій - к.б.н М.І. Демчинської (Ужгородський національний університет), за що ми висловлюємо їм щиру подяку. Автор вдячний завідувачу лабораторією мікробіометоду к.б.н С.П. Надкерничному за допомогу та наданий для досліджень штам мікроміцета С. cohliodes Palliser 3250. Автор дякує співробітникам відділу фітовірусології та біотехнології за дружню підтримку та корисні поради.

Апробація дисертації. Результати досліджень, які викладено в дисертаційній роботі, було обговорено на наукових нарадах відділу, засіданнях методичної комісії та вченої ради Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН, представлено на конференціях молодих учених Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН у 2002 і 2005 рр., а також: ІІІ з'їзді Українського товариства фізіологів рослин (Тернопіль 2002); Міжнародній науково-практичній конференції „Інтегрований захист рослин на початку ХХІ століття” (Київ, 2004); ІХ конференції молодих дослідників „Актуальні проблеми фізіології, генетики та біотехнології рослин і ґрунтових мікроорганізмів” (Київ, 2005); Першій Міжнародній конференції студентів та аспірантів „Молодь і поступ біології” (Львів, 2005); Міжнародній конференції „Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія, алелопатія” (Київ, 2005); Конференції молодих учених „Сучасні проблеми фізіології рослин i біотехнології” (Ужгород, 2005); Міжнародній науковій конференції "Стратегия и такика защиты растений" (Мінськ, 2006); Міжнародній науково-практичній конференції «Картофелеводство ХХІ века: проблемы и решения» (Мінськ - Самохваловичи, 2007); Міжнародній конферненції «Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти» (Львів, 2007).

Публікації. Основні положення дисертації викладені в 24 друкованих наукових роботах, з них: 9 - статті у наукових журналах та збірниках наукових праць, у тому числі 3 у фахових виданнях, 13 - матеріали конференцій і тези доповідей, 1 деклараційний патент та 1 інформаційний листок.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 223 стрінках машинописного тексту, містить 88 таблиць, 41 рисунок, 10 додатків. Текстова частина складається зі вступу, п'яти розділів, висновків та пропозицій для практичного використання. Список використаних літературних джерел містить 287 найменувань, в тому числі 58 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

Огляд літератури складається з чотирьох підрозділів, які містять інформацію про сучасні методи оздоровлення картоплі, про причини, механізми і методи тестування мінливості регенерантів. Розглядаються шляхи підвищення адаптаційної здатності пробіркових рослин до ґрунтових умов, в тому числі і за допомогою біопрепаратів. Окремі підрозділи присвячені зберіганню колекцій генетичного матеріалу картоплі, а також дослідженням ендофітної мікрофлори культури тканин картоплі та шляхам її можливого використання. Неоднозначність поглядів фахівців на проблеми оздоровлення, зберігання та адаптації безвірусного садивного матеріалу картоплі обумовлюють актуальність обраних досліджень.

Матеріали і методи досліджень

Досліджували оздоровлені лінії 6 сортів картоплі (Бетіна, Панда, Леді Розетта, Беллароза, Сатурна, Альвара), отримані з використанням методу культури меристеми, культури меристеми в поєднанні з термотерапією, культури меристеми в поєднанні з дією антивірусних речовин, поєднанням всіх трьох варіантів, а також введенням сорту in vitro брунькою зелених пагонів або паростків безвірусних рослин. Лінія, або мікроклон, - вегетативне потомство однієї рослини-регенеранта, всі лінії одного сорту об'єднуються поняттям «сортозразок».

Оздоровлені лінії підтримувались in vitro на поживному середовищі MS (Murasige and Scoog, 1962) при 16-годинному фотоперіоді і температурі у культиваційній кімнаті 22-26^оС.

Вирощування бульбових поколінь ліній проводили згідно технології селекційного процесу (Методичні рекомендації щодо проведення досліджень з картоплею / В. С. Куценко, А. А. Подгаєцький, А. А. Осипчук та ін. ; УААН, Інститут картоплярства. - Немішаєве, 2002. - 182 с.). У другому та третьому бульбових поколіннях отриманих ліній проводили фенологічні спостереження, детальний опис ліній та вихідних материнських рослин за морфологічними ознаками куща, стебла, листка, суцвіття, бульби, світлового паростка та порівняння продуктивності оздоровлених ліній з вихідними материнськими клонами, які слугували контролем та підтримувались добором клонів. Біохімічний склад бульб отриманих ліній досліджували за прийнятими методиками (Методика физиолого-биохимических исследований картофеля / В. П. Кирюхин, Е. А. Ладыгина, М. М. Чеголина, А. В. Парфенов. - М. : НИИКХ, 1989. - 93 с.). Вплив фізіологічних змін, індукованих процесом оздоровлення, на масу клонів ліній в бульбових поколіннях встановлювали за використання однофакторного дисперсійного аналізу, порівнюючи лінії в межах сортозразків. Стабільність геному одержаних ліній регенерантів контролювали методом полімеразної ланцюгової реакції (RAPD) з використанням 7 декамерних праймерів (ТІВ МОLBIOL, Берлін), специфічних для картоплі: ОРА17, OPB15, OPA04, OPC19, OPB05, AggTCACTgA, gCAAgTAgCT.

Ендофітні бактерії виділяли з пробіркових рослин сортів Фантазія, Повінь, Зарево, Чарівниця, Беллароза з ознаками аномального росту методом розтирання з наступним висівом на м'ясо-пептонний, картопляний та гороховий агар. Чашки інкубували в термостаті протягом 5-7 діб при температурі 30 та 37^оС. Здатність виділеної асоціації бактерій уражувати картоплю in vitro було досліджено за використання суспензії двох титрів (2,2·10⁸ і 0,8-1,0 ·10⁸) та живців середньої частини пробіркових рослин мікроклону Слов'янка.

Фізіологічну активність культуральної рідини мікроміцета C. cohliodes Palliser 3250 вивчали за допомогою специфічних біотестів (Калинкевич М. И., 1990; Кефели В. И. и др., 1973; Муромцев Г. С., 1973; Методические рекомендации по определению фитогормонов / Ин-т ботаники им. Н. Г. Холодного. - К., 1988), а її вплив на пробіркові рослини картоплі - біометричними методами.

Статистичний обробіток отриманих результатів проводили згідно методик статистичних аналізів у сільському господарстві і біології (Царенко О. М. та ін., 2000) та набору комп'ютерних програм Statistica 6.0.

Мінливість ліній при оздоровленні сортів картоплі біотехнологічними методами

Комплексне оцінювання 36 оздоровлених ліній 6 сортів картоплі від рівня мікророслин до їх третього бульбового покоління показало, що процес оздоровлення істотно впливає на властивості отриманих ліній. Оздоровлені лінії (ОЛ) значно відрізняються від вихідних материнських клонів (МР) за елементами структури урожаю (маса клонів, кількість і маса бульб), біохімічними показниками якості (вміст крохмалю, редукуючих цукрів та білка в бульбах), а також, у меншій мірі, за морфологічними ознаками бульб і рослин. Так, вже в першому бульбовому поколінні оздоровлені лінії в межах сортозразків істотно відрізняються одна від одної за рівнем продуктивності (табл. 1).

Ця різниця зберігається в наступних бульбових поколіннях з коефіцієнтом кореляції r по відношенню до попереднього року 0,44-0,92. За результатами 2-3-річних порівнянь з клонами МР, найменш продуктивні лінії формують урожай на рівні 63-92% від урожаю вихідних материнських клонів, а найбільш продуктивні - 111-177% (рис. 1).

Розмах мінливості ОЛ, як і коефіцієнт варіації, за масою клонів значно перевищують такі показники для клонів МР, що добре видно на прикладі клонових ліній сорту Панда. На графіку (рис. 2) представлено статистичні характеристики виборок МР та ОЛ впродовж 2003-2006 років: медіану, ѕ масиву даних, а також мінімальні та максимальні значення для кожної виборки. Коефіцієнт варіації за масою клонів для МР та ОЛ становив відповідно 50,3 та 75,2% у 2003 році, 21,5 та 40,3% у 2004 р., 29,3 та 43,4% у 2005 р., 25,4 та 42,7% у 2006 р.

Для визначення статистичної достовірності різниці між лініями за продуктивністю в межах сортозразків та оцінки сили впливу фізіологічних змін, індукованих процесом оздоровлення, на урожай клонів отриманих ліній проводили однофакторний дисперсійний аналіз, результати якого наводяться у табл. 2.

Встановлено, що для всіх сортозразків формування урожаю пробірковими рослинами - перше бульбове покоління - на 60-80% залежить від фізіологічних змін, набутих в процесі оздоровлення. Ці зміни обумовлені гетерогенністю вихідних експлантатів, дією антивірусних речовин і компонентів поживних середовищ, строками регенерації, стресом переходу in vitro - ех vitro та ін. При репродукуванні вплив оздоровлення зменшується: у другому бульбовому поколінні його частка у формуванні урожаю складає 50-70%, а третьому - 30-46%. У всіх поколіннях цей вплив є суттєвим.

Оздоровлені лінії в межах сортозразків також істотно відрізнялись одна від одної та МР за біохімічним складом бульб (табл. 3). Лише одна з дев'яти ліній сортозразку Альвара мала достовірно більший від МР вміст крохмалю, і ні одна з ОЛ не перевищувала МР за вмістом білка. П'ять з шести ОЛ сортозразку Панда перевищували МР за вмістом крохмалю і білка.

Природу мінливості оздоровлених клонових ліній вивчали на молекулярному рівні. У світі застосовують кілька різновидів аналізів на основі ПЛР. Найпростішим і широко визнаним є RAPD. Отже, стабільність геномної ДНК ліній чотирьох оздоровлених сортозразків досліджували на рівнях рослин in vitro (Альвара) та рослин 2-3 бульбового покоління (Панда, Альвара, Леді Розетта та Беллароза). Аналіз продуктів ампліфікації показав відсутність змін у будові ДНК ліній, що походили з меристем та бруньок, в порівнянні з МР, тому виявлені відмінності між лініями сортозразків за фенотипом та продуктивністю слід відносити до епігенетичних змін, які входять в норму реакції генотипів цих сортів. Лінії, що походили з морфогенного калюсу, відрізнялись від МР на рівні геномної ДНК.

Використання методу кластеризації дозволяє дані проведених досліджень продуктивних, морфологічних і біохімічних властивостей оздоровлених ліній навести у вигляді філогенетичних дерев, або дендрограм, досліджених сортозразків. На дендограмах графічно відображуються відхилення ліній від фенотипу МР. Так, для сортозразку Панда (рис. 3) серед всіх отриманих регенерантів відмінною безперечно є лінія 167, яка має найменше спільних ознак і суттєво відрізняються за морфологією і продуктивністю як від вихідних материнських клонів, так і від інших ліній цього сортозразку. Найкращі за продуктивністю та біохімічним складом бульб лінії цього сортозразку 165 та 172 знаходяться в одному кластері з клонами МР, що дає можливість виділити їх як сортополіпшувальні лінії.

Таким чином, запропонована методика оцінки оздоровлених сортозразків, яка складається з детального опису фенотипу ліній, порівняння їх за продуктивністю як головною господарсько-цінною ознакою та систематизації отриманих даних за допомогою пакету комп'ютерних програм Statistica 6.0 дає можливість протягом двох років максимально точно і об'єктивно оцінити лінії за кількісними і якісними ознаками, виділити серед них ті, що можуть бути використані для сортополіпшення, а також ті, що мають змінений відносно вихідного сорту морфотип.

Вплив тривалого культивування рослин картоплі in vitro на їх властивості

Колекція оздоровлених сортів, яка підтримується у відділі фітовірусології та біотехнології ІСГМ УААН шляхом послідовних живцювань in vitro, щорічно перевіряється на наявність вірусів. За результатами таких перевірок спостерігали тенденцію до збільшення рівня прихованої форми вірусних інфекцій в рослинах, залежно від часу культивування. Отримані результати підтверджують думку багатьох дослідників про те, що в оздоровленому меристемному матеріалі віруси можуть перебувати в прихованому стані (Нурмисте Б. Х., 1985; Трофимец Л. Н., 1985; Мамчур А. Е. и др., 1991; Шмыгля В. А. и др., 1991, 1995; Трускинов Э. В., 2003), тобто не виявлятися звичайними методами тестування (Жукова М. И., 1998).

Далі, нашими дослідженнями показано, що довгострокове (понад 10 років) культивування оздоровлених клонових ліній in vitro погіршує властивості вихідного матеріалу: рослини мають дуже низький коефіцієнт приживання в ґрунті і повністю втратили продуктивні якості, притаманні вихідним сортам (табл. 4). До однієї з причин цього явища ми відносимо накопичення в пробіркових рослинах бактерій-ендофітів. Бактерії можуть лишатися в експлантатах під час ініціації культури in vitro і супроводжувати рослини культури тканин з покоління в покоління, не зумовлюючи при цьому захворювання або проявляючись у вигляді калусоподібних наростів на жилках листків і стебел та аномаліями у розвитку кореневої системи. Ізоляти ендофітних бактерій, виділені нами з мікророслин картоплі, за результатами фізіолого-біохімічних досліджень віднесено до родів Bacillus, Clavibacter та Pseudomonas.

З метою визначення терміну, коли рослини оздоровлених мікроклонів не втрачають властиву їм життєздатність та продуктивність, і, відповідно, потенційну цінність як сортозразків колекції, проводили порівняльне дослідження різновікових мікроклонів. Елітні клони (ЕК) відповідних сортів слугували контролем. Лінії, ініційовані з бруньок здорових рослин (термін перебування in vitro менше, ніж півроку) та колекційні мікроклони сортів Повінь, Світанок Київський та Луговська (термін перебування in vitro відповідно 2,5, 3 та 18 років), у першому бульбовому поколінні достовірно відрізнялись за масою клонів (рис. 4) та кількістю бульб (дані не приводяться).

Дані дворічних порівнянь урожаю цих ліній з урожаєм ЕК дозволяють стверджувати, що лінії, ініційовані з бруньок здорових рослин, не поступаються або перевищують урожай ЕК як за масою клонів (рис. 5), так і за кількістю бульб. Лінії цих же сортів, які культивувались у колекції in vitro від 2,5 до 3 років, не поступаються за урожаєм ЕК, лише незначно зменшуючи кількість бульб під кущем, а лінія, яка перебувала in vitro 18 років, давала суттєве зменшення за обома досліджуваними ознаками, тобто продуктивність ліній залежить від загального віку мікроклонів.

Колекційні лінії сорту Санте, що культивувались in vitro від 5 до 25 років, досліджено на молекулярному рівні. Результати ампліфікації геномної ДНК мікробульб колекційних мікроклонів з трьома декамерними праймерами свідчать про зміни у структурі ДНК цих ліній.

Слід зазначити також, що колекційні мікроклони, які депонувались in vitro менше 10 років, висаджені у відкритий ґрунт, дають рослини з великим розмахом мінливості за продуктивністю, що дає змогу відбирати у першому бульбовому поколінні цих мікроклонів кращі кущі, з яких, в свою чергу, можливе відновлення належного стану і продуктивності оздоровлених зразків шляхом повторного введення in vitro тестованих пагонів.

Отже, на основі аналізу даних наших досліджень та аналізу робіт іноземних дослідників (Усков А.И., 2000, 2003) можна пропонувати такі умови підтримання колекції оздоровлених сортозразків: культивування in vitro не більше трьох років із заміною або доповненням послідовного живцювання закритими циклами мікророзмноження; періодичне (не менше 1 разу в 3 роки) висаджування існуючих ліній в ґрунт із відновленням продуктивності цих ліній шляхом повторного введення in vitro тестованих пагонів кращих клонів у першому бульбовому поколінні; підтримання паралельної колекції бульбового матеріалу не старше рівня еліти; поповнення колекції новими високопродуктивними лініями.

Підвищення адаптивної здатності пробіркових рослин до ґрунтових умов за допомогою мікроміцета Сhaetomium cohliodes Рalliser 3250

Відомо, що при переводі мікророслин картоплі в ґрунтові умови значна кількість розсади гине внаслідок низького адаптаційного потенціалу пробіркових рослин. Дослідники відмічають, що у мікроклонів картоплі in vitro провідна система знаходиться в незрілому стані, значно редуковані судини ксилеми, не функціонують продихи (Реуцкий В. Г. и др., 2005, 2007). Достатньо очевидно, що фенотип рослини in vitro при пересаджувані з пробірки в ґрунт піддається глибокому стресу, який продовжується до тих пір, доки вказані системи не прийдуть в норму, тобто доки не закінчиться їх переадаптація. За даними Т. Г. Янчевської із співав. (Янчевская Т. Г. и др., 2005), стан ex vitro у рослин картоплі можна розглядати як стресовий протягом 12 днів. Одним із чисельних шляхів вирішення проблеми адаптації пробіркових рослин картоплі до ґрунтових умов є зміна гормонального статусу рослин in vitro під дією екзогенних регуляторів росту, таких як епін, фумар, етамон (Усков А. И. и др., 2005), ТУР (Баранов А. Н., Мусин С. М., 1993), сілк, агат або янтарна кислота (Зубкевич О. Н., 2004) що додаються в поживне середовище під час останнього живцювання.

Нашими дослідженнями виявлено високу ауксинову (182-200%), цитокінинову (133-143%) та суттєву гіберелінову (112-116%) активність культуральної рідини штаму мікроміцета C. cohliodes Palliser 3250. Встановлено стимулюючу дію культуральної рідини гриба в дозі 10-50 мл/л на ріст та розвиток рослин картоплі in vitro при додаванні в рідке поживне середовище під час мікроживцювання: достовірно збільшується маса мікророслин, а також площа листових пластинок. Живці на варіантах середовищ з додаванням культуральної рідини краще вкорінюються і дають більший вихід нормально розвинутої розсади.

Невід'ємним елементом технології виробництва вихідного матеріалу картоплі з рослин in vitro є одержання першого бульбового покоління, або мінібульб, які отримують в теплицях, або - через рулонну розсаду - у відкритому ґрунті. Спосіб одержання розсади картоплі з рослин in vitro в плівкових рулонах (Коткас К. О., 1985) є досить зручним і надійним, але успіх значно залежить від віку i ступеню розвитку пробіркової рослини, стану кореневої системи, якості землесуміші, її температури, вологості та наявності в ній фітопатогенних мiкроорганiзмiв i шкідників. Зважаючи на це, вивчали дію і способи застосування мікроміцета C.cochliodes 3250, що є основою біопрепарату хетоміка, при вирощуванні розсади картоплі з пробіркових рослин.

C.cochliodes 3250 вносили із розрахунку 5-6·10⁷; 5-6·10⁸; 5-6·10⁹ сумкоспор на 1 кг землесуміші, безпосередньо перед виготовленням рулонів та завчасно - за 10 днів до висаджування рослин. Вивчали також внесення мікроміцета у кореневу зону розсади у вигляді одно- та десятивідсоткової суспензії сумкоспор (титри 4-5·10⁶ та 4-5·10⁷ відповідно).

Виходячи з результатів проведених тестувань, можна стверджувати, що під дією внесеного препарату збільшувались висота і біомаса розсади, а також приживлюваність рослин. Слід відмітити значне збільшення площі листових пластинок і щільності тканини листка. Рослини всіх варіантів із внесенням сумкоспор гриба в землесуміш були темно-зеленого кольору, вирівняні за розвитком.

При порівнянні ефективності впливу різних норм та способів внесення мікроміцета C. cochliodes 3250 на ріст розсади картоплі з використанням однофакторного дисперсійного аналізу доведено, що відмінності між варіантами є достовірними, а на долю внесеного препарату як фактору росту рослин приходиться 48,2%, як чинника збільшення об'єму кореневої системи - 29,2%, а площі листків - 84,9%. Найбільш доцільним виявилось внесення гриба в дозі 5-6·10⁷ - 5-6·10⁸ сумкоспор на 1 кг землесуміші, а істотної різниці в прояві дії 1% та 10% суспензії сумкоспор немає.

Таким чином, використання мікроміцета C. cochliodes 3250 є доцільним в технології одержання вихідного матеріалу картоплі із пробіркових рослин, оскільки сприяє ефективній адаптації пробіркових рослин до ґрунтових умов, покращує їх приживлюваність, темпи росту кореневої системи і надземної частини, а також захищає рослини від ураження грибними патогенами. Застосування C. cochliodes 3250 в технології виробництва первинного матеріалу картоплі є екологічно безпечним способом стимуляції росту і розвитку розсади з пробіркових рослин.

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення важливого наукового завдання з визначення мінливості ліній при оздоровленні картоплі біотехнологічними методами та природи цієї мінливості, показано стабільність змін в бульбових поколіннях оздоровлених ліній. На підставі цього доведена можливість виділення клонових ліній для поліпшення сортів картоплі при їх оздоровленні. Встановлено вплив тривалого культивування рослин in vitro на прояв у них морфологічних і господарських ознак. Доведено перспективність використання гриба-антагоніста C. cohliodes Palliser 3250 для підвищення адаптивності пробіркових рослин при пересадці їх у ґрунт. У ході проведених досліджень дійшли таких висновків:

1. Оздоровлення різних сортів картоплі біотехнологічними методами суттєво впливає на властивості отриманих клонових ліній. Встановлено мериклональну мінливість ліній за продуктивними, біохімічними та морфологічними ознаками. На частку фізіологічних змін, індукованих процесом оздоровлення як одного з чинників, що обумовлюють продуктивність клонових ліній, у першому бульбовому поколінні припадає 60-80%, у другому - 52-70% та у третьому - 25-46%. Низькопродуктивні лінії формували урожай на рівні 63-91% від урожаю вихідних материнських клонів, а високопродуктивні - 111-177%.

2. З використанням ДНК-аналізу методом RAPD встановлено, що зміни, які виявлені у меристемних ліній, отриманих із застосуванням хіміо- і термотерапії, не є результатом перебудови ДНК, а носять епігенетичний, або фізіологічний, характер. Результати дослідження з калюсними лініями свідчать про генетичну природу мінливості у них.

3. На основі скринінгу оздоровлених клонових ліній доведена можливість відбору ліній з однаковим морфотипом та істотно вищім, ніж у вихідних материнських клонів, проявом господарських ознак. Розроблена методика комплексної оцінки ліній при оздоровленні картоплі значно зменшує загрозу біологічного забруднення сортів.

4. Показано, що культивування клонових ліній картоплі шляхом послідовних живцювань in vitro понад 10 років призводить до повної втрати ними господарської цінності, а також може спричинювати зміни у структурній організації геномної ДНК цих ліній. Запропоновано циклічну схему культивування оздоровлених колекційних ліній in vitro до 3-х років та наступне поновлення шляхом ре-ініціації з бруньок кращих клонів цих ліній у першому бульбовому поколінні.

5. Встановлено, що метаболіти мікроміцета Chaetomium cochliodes 3250 мають ауксинову, цитокінінову та гіберелінову активність, тому використання його культуральної рідини та самого гриба є екологічно безпечним способом стимуляції росту і розвитку картоплі в технології одержання вихідного матеріалу для покращення якості розсади як на етапі масового передпосадкового мікроклонального розмноження рослин, так і під час висадки пробіркових рослин в ґрунт теплиці або плівкових рулонів. Внесення сумкоспор в грунт або передпосадкова обробка коріння мікророслин суспензією сумкоспор є доступними способами застосування гриба-антагоніста, який сприяє ефективній адаптації пробіркових рослин до ґрунтових умов.

6. Відхилення в рості і розвитку пробіркових рослин (калюсоподібні нарости на стеблах та листках, щіткоподібні корінці з потовщеннями на них) обумовлюються зміщенням біологічної рівноваги в системі рослина - асоціація ендофітних бактерій в умовах in vitro.

7. Встановлено, що бактерії, асоційовані з пробірковими рослинами картоплі, передаються бульбовими поколіннями цих рослин, як in vitro, так in vivo. Бактеризація впливає на рослини клонових ліній картоплі у широкому діапазоні, змінюючи їх морфологію, продуктивність та біохімічні показники бульб.

8. Виділені ізоляти ендофітних бактерій родів Bacillus та Pseudomonas інгібують патологічний процес, спричинений збудником мокрої гнилі картоплі. Тому проблему бактерій-ендофітів в пробірковому матеріалі можна розглядати як перспективу для створення in vitro штучних асоціацій ендофітів з рослинами, які сприятимуть підвищенню стійкості рослин до фітопатогенів в бульбових поколіннях.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. Відбір типових високопродуктивних ліній для первинного насінництва дасть можливість запобігти появі змінених форм при оздоровленні і мікроклональному розмноженні сортів картоплі. Тому при отриманні оздоровленого вихідного матеріалу для первинного насінництва доцільним буде:

- ініціація культури in vitro з меристемних верхівок бруньок зелених пагонів з одним-двома примордіями, недопущення калюсоутворення з експлантів та рослин-регенерантів з калюсу;

- бракування низькопродуктивних безвірусних ліній у першому бульбовому поколінні; ретельна перевірка відібраних високопродуктивних ліній у другому бульбовому поколінні на відповідність морфологічним та господарським ознакам вихідних материнських клонів із повним статистичним аналізом отриманих дворічних даних по кожній лінії;

- оформлення паспортів сортополіпшувальних оздоровлених ліній для передачі їх у лабораторії мікророзмноження або у колекції оздоровлених сортів.

2. Запропоновано оптимізовану схему підтримання колекцій оздоровлених ліній, яка гарантує збереження життєздатності і господарсько-цінних ознак сортів:

- культивування ліній in vitro не більше трьох років із заміною або доповненням послідовного живцювання закритими циклами мікророзмноження (рослина - мікробульба у стані спокою - рослина);

- періодичне (не менше 1 разу в 3 роки) висаджування існуючих ліній в ґрунт із відновленням продуктивності цих ліній шляхом повторного введення in vitro тестованих пагонів кращих клонів у першому бульбовому поколінні;

- підтримання паралельної колекції бульбового матеріалу не старше рівня еліти та поповнення колекції новими високопродуктивними лініями.

3. Застосування культуральної рідини та живої культури (препарату хетоміка) мікроміцета С. cohliodes Palliser 3250 у виробництві вихідного матеріалу сприяє збільшенню коефіцієнта приживання розсади і продуктивності рослин (патент 68222А, акти впровадження).

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Особливості вирощування картоплі в культурі in vitro / І. В. Демчук, О. М. Петренко, Л. П. Коломієць, С. П. Надкерничний, М. М. Зарицький // Наукові записки Тернопільського педуніверситеру. - 2002. - № 3 (18). - С. 205-209 (схеми експериментів, участь в отриманні та аналізі результатів, участь в написанні статті).

2. Демчук І. В. Вплив терміну культивування in vitro на властивості оздоровлених мікроклонів картоплі / І. В. Демчук // Аграрна наука і освіта. - 2007. - Т. 8, № 5-6. - С. 32-37.

3. Демчук І. В. Ефективність оздоровлення сортів картоплі біотехнологічними методами / І. В. Демчук, М. М. Зарицький // Сільськогосподарська мікробіологія. - Чернігів, 2007. - Вип. 6. - С. 155-166 (статистична обробка та аналіз результатів проведених експериментів, текст статті).

4. Демчук І. В. Використання мериклональної мінливості оздоровлених регенерантів для підвищення якості вихідного матеріалу картоплі / І. В. Демчук, О. М. Петренко, М. М. Зарицький // Сільськогосподарська мікробіологія. - Чернігів, 2005. - Вип. 1-2. - С.188-200 (участь в проведенні експериментів, статистична обробка та аналіз результатів, текст статті).

5. Демчинська М. І. Ендофітна мікрофлора культури тканин картоплі / М. І. Демчинська, І. В. Демчук // Сільськогосподарська мікробіологія. - Чернігів, 2005. - Вип. 3. - С. 123-134 (аналіз наукової літератури, участь в написанні статті).

6. Демчук І. В. Вплив бактерізації мікророслин картоплі на їх продуктивність в бульбових поколіннях / І. В. Демчук // Науковий вісник Ужгородського університету. - 2006. - Вип. 18. - С. 103-108.

7. Демчинська М. І. Бактерії-ендофіти в культурі тканин картоплі / М. І. Демчинська, І. В. Демчук, С. М. Мороз // Науковий вісник Ужгородського університету. - 2006. - Вип. 19. - С. 143-145 (виділення ізолятів, участь у написанні статті).

8. Демчук И. В. Изменчивость линий при оздоровлении сортов картофеля биотехнологическими методами / И. В. Демчук // Проблемы сельского хозяйства : междунар. сб. науч. тр. - Калининград: КГТУ, 2006. - С. 231-241.

9. Демчук И. В. О необходимости отбора высокопродуктивных линий при оздоровлении сортов картофеля биотехнологическими методами / И. В. Демчук, Е. Н. Петренко, Н. М. Зарицкий // Картофелеводство : сб. науч. тр. - Минск: РУП «Науч.-практ. центр НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству, 2007. - Т. 13. - С. 27-37 (участь в експериментах, статистична обробка та аналіз результатів, текст статті).

10. Пат. 68222 А Україна, A01G1/00, A01N63/00, C12N1/00. Процес виробництва насіннєвого матеріалу картоплі в культурі in vitro / Демчук І. В., Петренко О. М., Надкерничний С. П., Коломiєць Л. П., Зарицький М. М.; заявник та патентовласник Інст.с-г.мікробіол. УААН. - № 20031110525 ; заявл.21.11.2003 ; опубл. 15.07.2004 ; Бюл. № 7 (аналіз наукової літератури, проведення досліджень, статистична обробка результатів, участь у написанні тексту)

11. Ендофітні бактерії, які спричинюють аномалії розвитку рослин картоплі при мiкроклональному розмноженні / М. І. Демчинська, І. В. Демчук, О. М. Петренко, І. В. Волкова, С. М. Мороз : Збірник статей учасників міжнародної конференції [«Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія»], (Київ, 4 - 6 жовтня 2005 р.) / Національна академія наук України [та ін.]. - К., 2005. - С. 34-37 (участь в отриманні та аналізі результатів, текст статті).

12. Використання гриба-антагоніста Chaetomium cohliodes Palliser 3250 в технології виробництва вихідного матеріалу картоплі / І. В. Демчук, О. М. Петренко, С. П. Надкерничний, Л. П. Коломієць, І. М. Пінчук, М. М. Зарицький : Матеріали міжнародної науково-практичної конференції [«Інтегрований захист рослин на початку ХХІ століття»], (Київ, 2004 р.) / Українська академія аграрних наук, Інститут захисту рослин. - К., 2004. - С. 399-406 (схеми експериментів, участь в отриманні та аналізі результатів, текст статті).

13. Використання гриба-антагоніста Chaetomium cohliodes Palliser 3250 в технології виробництва вихідного матеріалу картоплі / І. В. Демчук, О. М. Петренко, С. П. Надкерничний, Л. П. Коломієць, І.М. Пінчук, М. М. Зарицький : Х з'їзд Товариства мікробіологів України, (Одеса, 15-17 вересня 2004 р.) / Національна академія наук України [та ін.]. - Одеса, 2004. - С. 44 (проведення досліджень, текст).

14. Антивірусна терапія сортів картоплі / О. М. Петренко, І. В. Демчук, М. М. Зарицький, Л. П. Коломієць : ІV Міжнародна конференція [«Біоресурси і віруси»], (Київ, 27-30 вересня 2004 р.) / Київський національний університет імені Тараса Шевченка. - К., 2004. - С. 90-91 (проведення частини досліджень, участь в написанні тексту).

15. Демчук І. В. Вплив терміну культивування in vitro на вихідні характеристики оздоровлених сорозразків картоплі / І. В. Демчук, О. М. Петренко : Тези доповідей ІХ конференції молодих дослідників, присвяченої 100-річчю від дня народження академіка АНУРСР і ВАСГНІЛ П. А. Власюка [«Актуальні проблеми фізіології, генетики та біотехнології рослин і ґрунтових мікроорганізмів»], (Київ, 24-25 лютого 2005 р.) / Інститут фізіології рослин і генетики НАН України. - К., 2005. - С. 70 (проведення досліджень, текст).

16. Демчук І. В. Мінливість регенерантів при оздоровленні сортів картоплі біотехнологічними методами / І. В. Демчук : Тези доповідей Першої міжнародної конференції студентів та аспірантів [«Молодь і поступ біології»], (Львів, 11-14 квітня 2005 р.) / Львівський національний університет імені Івана Франка. - Львів, 2005. - С. 124.

17. Демчук І. В. Вплив ендофітної мікрофлори на якість вихідного матеріалу картоплі / І. В. Демчук, О. М. Петренко, І. В. Волкова : Міжнародна конференція [«Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія»], (Київ, 4 - 6 жовтня 2005 р.) / Національна академія наук України [та ін.]. - К., 2005. - С. 15 (проведення досліджень, текст).

18. Природа ендофітних бактерій, які спричинюють захворювання мікроклональних рослин картоплі / М. І. Демчинська, І. В. Демчук, О. М. Петренко, І. В. Волкова, С. М. Мороз : Міжнародна конференція [«Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія»], (Київ, 4 - 6 жовтня 2005 р.) / Національна академія наук України [та ін.]. - К., 2005. - С. 16 (виділення ізолятів, фото, участь у частині досліджень та написанні тексту).

19. Демчук І. В. Комплексна оцінка ліній сортозразків картоплі, оздоровлених біотехнологічними методами / І. В. Демчук, М. М. Зарицький : Тези наукової конференції молодих учених [«Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології»], (Ужгород, 1-3 грудня 2005 р.) / Ужгородський національний університет [та ін.]. - Ужгород, 2005. - С. 44-45 (проведення та аналіз досліджень, текст).

20. Демчинська М. І. Мікробне забруднення експлантів картоплі під час ініціації культури in vitro / М. І. Демчинська, І. В. Демчук, С. М. Мороз : Тези наукової конференції молодих учених [«Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології»], (Ужгород, 1-3 грудня 2005 р.) / Ужгородський національний університет [та ін.]. - Ужгород, 2005. - С. 43-44 (виділення ізолятів, участь у написанні тексту).

21. Демчук И. В. Эндофитные бактерии, выделенные из растений культуры тканей картофеля и их влияние на качество исходного материала / И. В. Демчук, М. И. Демчинская, Н. М. Зарицкий : Тезисы докладов международной научной конференция [«Стратегия и тактика защиты растений»], (Минск, 28 февраля - 2 марта 2006 г.) / РУП «Інститут защиты растений» НАН Беларуси. - Минск, 2006. - Вып. 30, ч. 1. - C. 213-215 (проведення та аналіз досліджень, текст).

22. Мельничук Ф. С. Взаємовідносини між ендофітними бактеріями та збудником м'якої гнилі картоплі / Ф. С. Мельничук, М. І. Демчинська, І. В. Демчук : Матеріали міжнародної науково-практичної конференції [«Інтегрований захист рослин. Проблеми та перспективи»], (Київ, 13-16 листопада 2006 р.) / Українська академія аграрних наук, Інститут захисту рослин. - К., 2006. - С. 144 (виділення ізолятів).

23. Демчук І. В. Зміна властивостей колекційних мікроклонів картоплі (Solanum tuberosum L.) за умов тривалого культивування іn vitro / І. В. Демчук, О. М. Петренко, М. М. Зарицький : Тези доповідей ІІІ міжнародної конференції [«Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти»], (Львів, 4-6 жовтня 2007 р.) / Львівський національний університет імені Івана Франка [та ін.]. - Львів, 2007. - С. 66 (участь у проведенні досліджень, статистична обробка та аналіз результатів, текст).

24. Производство исходного семенного материала картофеля культуры in vitro / И. В. Демчук, Е. Н. Петренко, С. П. Надкерничный, Л. П. Коломиец, Н. М. Зарицкий // Инф. листок. - Чернигов : ЦНТЭИ. - 2003. - № 36 - 2 с. (проведення та аналіз досліджень, текст).

АНОТАЦІЇ

Демчук І.В. Властивості клонових ліній сортів картоплі після оздоровлення та культивування in vitro. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20. - біотехнологія. - Національний аграрний університет, Київ, 2008.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню впливу активного оздоровлення сортів картоплі методами біотехнології та культивування отриманих ліній in vitro на властивості клонових ліній, а відтак, на якість вихідного оздоровленого матеріалу картоплі. Окремий розділ присвячено застосуванню мікроміцета Chaetomium cochliodes 3250 для підвищення адаптивної здатності рослин in vitro при пересаджуванні їх у грунт.

Показано, що оздоровлення сортів картоплі методом культури меристем в поєднанні з термо- та хіміотерапією істотно впливає на властивості отриманих клонових ліній. Встановлено внутрішньосортову мінливість клонових ліній за продуктивними, біохімічними та морфологічними ознаками. Результати, отримані з використанням ДНК-аналізу методом RAPD, дозволяють зробити висновок про епігенетичну, або фізіологічну, природу мінливості оздоровлених клонових ліній, які походять з меристем та бруньок. Мінливість ліній, що походять з морфогенного калюсу, має генетичну природу. Розроблена методика комплексної оцінки клонових ліній значно зменшує загрозу біологічного забруднення сортів картоплі після їх оздоровлення. Показано, що культивування клонових ліній картоплі шляхом послідовних живцювань in vitro понад 10 років внаслідок низки причин призводить до повної втрати ними господарської цінності, а також може спричинювати зміни у структурній організації геномної ДНК цих ліній. Запропоновано отпимізовану циклічну схему культивування колекційних клонових ліній оздоровлених сортів картоплі. Встановлено, що метаболіти мікроміцета C. cochliodes 3250 мають суттєву ауксиново-цитокінінову, а також гіберелінову активність, тому використання його культуральної рідини та самого гриба є екологічно безпечним способом стимуляції росту і розвитку картоплі в технології одержання вихідного матеріалу як на етапі масового передпосадкового мікроклонального розмноження рослин, так і під час висадки мікророслин в ґрунт.

Ключові слова: картопля, оздоровлення методом культури меристем, мікроклон, мінливість, клонова лінія, RAPD-ПЛР, мікроміцет Chaetomium cochliodes 3250.

Демчук И.В. Свойства клоновых линий сортов картофеля после оздоровления и культивирования in vitro. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20. - биотехнология. - Национальный аграрный университет, Киев, 2008.

Учитывая, что оздоровленный биотехнологическими методами материал сортов картофеля на Украине клонируется и используется для воспроизводства элиты без испытания полученных линий в потомстве, то изучение размаха и границ внутрисортовой изменчивости свойств оздоровленных клоновых линий, а также ее природы и стабильности в клубневых поколениях, является актуальным. Данная диссертационная работа посвящена исследованию влияния активного оздоровления сортов картофеля методами биотехнологии и культивирования полученных линий in vitro на свойства клоновых линий, а, следовательно, на качество исходного оздоровленного материала картофеля. Отдельный раздел посвящен применению микромицета Chaetomium cochliodes 3250 для повышения адаптивной способности растений картофеля in vitro при пересаживании их в почву.

...