Молекулярна діагностика латентного вірусу та SSR-ПЛР ідентифікація сортів хмелю (Humulus lupulus L.) української селекції

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ БІОРЕСУРСІВ і ПРИРОДОКОРИСТУВАННЯ УКРАЇНИ

МОЛЕКУЛЯРНА ДІАГНОСТИКА ЛАТЕНТНОГО ВІРУСУ ТА SSR-ПЛР ІДЕНТИФІКАЦІЯ СОРТІВ ХМЕЛЮ (HUMULUS LUPULUS L.)

УКРАЇНСЬКОЇ СЕЛЕКЦІЇ

03.00.20 - біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

ОВЕРЧЕНКО Віталій Віталійович

УДК 575.22:633.791

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному університеті біоресурсів

і природокористування України

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент УААН

Мельничук Максим Дмитрович,

проректор з наукової та інноваційної діяльності

Національного університету біоресурсів

і природокористування України

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук,

старший науковий співробітник,

Постоєнко Володимир Олексійович,

заступник директора з наукової роботи Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів Міністерства аграрної політики України

доктор біологічних наук, професор,

Дуган Олексій Мартем'янович,

завідувач кафедри промислової біотехнології, декан факультету біотехнології і біотехніки Національний технічний університет України «Київський політехнічний інститут» Міністерства освіти і науки України

Захист відбудеться “4” грудня 2009 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.15 у Національному університеті біоресурсів і природокористування України за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус 3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного університету біоресурсів і природокористування України за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус 4, к.28

Автореферат розісланий “3” листопада 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Ю.В. Коломієць

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Першочерговою передумовою одержання високих врожаїв хмелю звичайного (Humulus lupulus L.) є отримання і впровадження у виробництво високоякісного садивного матеріалу з високою сортоспецифічністю та вільного від патогенів, зокрема вірусної природи (Бойко А.Л.,1976; Кормільцев Б.Ф., 1992; Мельничук М.Д., 1996).

Патогени вірусної природи найбільшою мірою поширені на рослинах хмелю, які уражують їх у різних формах (Мельничук М.Д., 1998; Adams A.N.,1980). У 80-х роках минулого століття було показано, що ураженість вірусами окремих сортів хмелю становить понад 90%, що призводить до значних втрат врожайності та погіршення якості хмелесировини. Важливо констатувати той факт, що часто хвороби протікають на рослинах хмелю в латентній формі (Hataya T., 2000; Adams A.N., 1982).

Протягом останніх 40 років в агроценозах України багатьма вченими виявлено понад 20 вірусів, що відносять до груп Ilarvirus, Nepovirus та Carlavirus (Московець С.М., 1970; Бойко А.Л.,1998; Мельничук М.Д., 2000). Зовнішні симптоми, які проявляють уражені рослини хмелю, дуже різноманітні і можуть бути чітко вираженими або зовсім слабкими. Проте деякі рослини і навіть сорти та лінії хмелю є безсимптомними носіями вірусів, що локалізовані у латентній формі. До них відносять латентний вірус хмелю (ЛВХ), який надзвичайно вірулентний і призводить до значних втрат врожаю та погіршення якості шишок хмелю (Мельничук М.Д., 1998; Adams A.N., 1980; Barbara D.J.,1983). До нинішнього часу в Україні практично не існувало високоточних і високоефективних молекулярних діагностикумів для детекції та ідентифікації вірусів, які уражують хміль. На особливу увагу заслуговує питання створення високоточної тест-системи для ідентифікації ЛВХ, якого важко діагностувати через відсутність зовнішніх симптомів ураження, надаючи, при цьому, карантинний сертифікат при реєстрації нових сортів хмелю чи реалізації садивного матеріалу. Саме тому вирішення питання молекулярної ПЛР-діагностики ЛВХ відкриває можливості ефективно здійснювати його діагностику і створювати як донорні плантації для масового розмноження перспективних сортів, так і якісно проводити реєстрацію нових та інтродукованих сортів хмелю в Україні (Мельничук, 2008).

Диференціація та ідентифікація сортів, ліній і гібридів сільсько-господарських рослин є важливим елементом селекції, насінництва та актуальною у захисті авторських прав на сорти. Впровадження молекулярних методів прикладної вірусології і біотехнології, поряд з існуючими методами ідентифікації сортів рослин, дозволяє істотно їх доповнити та скоротити строки ідентифікації сорту за незначної потреби рослинного матеріалу (листки, корені, стебла, тощо), на будь-якій стадії онтогенезу, маючи за пробу мінімальну кількість екстрагованої ДНК рослини.

Тому дослідження в напрямі розробки молекулярних-діагностикумів на вірусну інфекцію ЛВХ та апробування методів SSR-ідентифікації генотипів рослин хмелю є актуальним для хмелярської галузі, з метою підвищення її конкурентоспроможності. В Україні генетичний поліморфізм послідовностей, що повторюються у рослин хмелю звичайного, залишається вивченим недостатньо, а молекулярні методи, які базуються на ДНК-маркерах, до сьогодно для хмелю практично не існували. Деякі методи розроблено та апробовані в Україні лише для окремих сільськогосподарських культур (Парій М.Ф., 2007; Кожухова, 2004; Сиволап, 2001).

Вбачаючи проблему сортоідентифікації сільськогосподарських рослин на умовах членства України в СОТ питання молекулярної диференціації та ідентифікації сортів хмелю також було поставлено за мету роботи зі створення єдиної та якісної біотехнології молекулярної SSR-ідентифікації сортів хмелю української селекції на безвірусній основі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в проблемній лабораторії фітовірусології і біотехнології й Українській лабораторії якості та безпеки продукції АПК НУБіП України (відділ молекулярно-діагностичних досліджень) у рамках науково-дослідних тем «Вивчення механізмів взаємодії фітовірусів із клітинами та розробка методів діагностики вірозів і отримання безвірусних рослин» (номер державної реєстрації 0198U004073) та «Розробка технологій мікроклонального розмноження цінних сільськогосподарських, технічних та декоративних культур біотехнологічними методами та ДНК паспортизація сортів рослин» (номер державної реєстрації 0103U005653).

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційного дослідження є розробка біотехнологічних підходів до діагностики латентного вірусу хмелю та сортоідентифікації генотипів хмелю з використанням молекулярно-біологічних методів.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

- здійснити фітосанітарний аналіз, візуальний контроль та відібрати первинно-інфікований матеріал рослин хмелю із агроценозів Житомирської області;

- визначити біологічні, морфологічні і біохімічні властивості ЛВХ;

- розробити молекулярно-біологічний діагностикум з ідентифікації ЛВХ методом ЗТ ПЛР і провести скринінг латентного ураження сортів хмелю української селекції;

- підібрати та синтезувати SSR-маркери для ДНК-ідентифікації генотипів хмелю української селекції;

- проаналізувати поліморфізм мікросателітних локусів геномної ДНК з оцінкою їх здатності як дискриптів для диференціації основних сортів хмелю української селекції;

- створити комп'ютерну базу даних генетичних паспортів на прикладі 13 сортів хмелю української селекції;

Об'єкт дослідження - діагностика та ідентифікація латентного вірусу та поліморфізм генотипів хмелю звичайного.

Предмет дослідження - латентний вірус хмелю та його структурні компоненти РНК та білок, ДНК нових й перспективних сортів хмелю звичайного.

Методи дослідження - біотехнологічні (виділення нуклеїнових кислот, РНК вірусу, ДНК рослин хмелю та білка оболонки вірусу, концентрація білка), вірусологічні (відбір зразків, експериментальне інфікування рослин індикаторів ЛВХ, електронна мікроскопія), біофізичні (спектрофотометричне визначення титру та концентрації виділеного вірусу), мікроскопічні (електронна мікроскопія), молекулярно-біологічні (проведення SSR-ПЛР та РТ-ПЛР, візуалізація продуктів ПЛР) та комп'ютерно-статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Розширено уявлення про молекулярно-біологічні властивості ЛВХ, проведено моніторинг його ураженості на сортах хмелю звичайного української селекції в умовах Житомирської області. Оптимізовано й модифіковано метод виділення та очищення українського ізоляту латентного вірусу хмелю. Вперше синтезовано специфічні праймери і розроблено ПЛР тест-система для діагностики та ідентифікації вірусної РНК ЛВХ.

Вперше в Україні розроблено молекулярно-біологічні ПЛР-тест системи сортової ідентифікації рослин хмелю звичайного української селекції на основі SSR-маркерів. Показана можливість використання мікросателітних локусів для диференціації генотипів з використанням сучасних методів ПЛР та капілярного електрофорезу при проведенні філогенетичного аналізу 13 сортів хмелю звичайного української селекції.

Проведено апробацію методики ДНК-профілювання на сортах хмелю з високою ідентифікаційною та диференційною здатністю. Розроблено тест-систему, яку рекомендовано Державною службою з охорони прав на сорти рослин для здійснення науково-технічної експертизи при реєстрації нових сортів хмелю, а також для проведення арбітражних досліджень. Запропоновано модель молекулярно-генетичних паспортів генотипів 13 основних сортів хмелю української селекції для комп'ютерного банку даних.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені біотехнології з діагностики латентного вірусу та ДНК-аналізу генотипів хмелю придатні й необхідні для створення конкурентоспроможної системи розмноження новітніх сортів хмелю української селекції, їх реєстрації в Державному реєстрі та при закладанні нових хмільників. Виявлення латентного вірусу хмелю розробленою РТ-ПЛР-тест дозволяє швидко й ефективно здійснювати діагностику як посадкового матеріалу, так і рослин донорів, що використовуються для створення маточних насаджень або підтримуються в колекції сортів in vitro. Запропонована тест-система придатна для контролювання садивного матеріалу хмелю на наявність ЛВХ, що завозиться із-за кордону.

Розроблена методика ідентифікації та диференціації сортів хмелю української селекції на основі 10 SSR-маркерів відкриває нові можливості і дозволяє скоротити час проведення випробування будь-якого сорту хмелю з 3-4 років до кількох тижнів. Результати апробації 13 сортів хмелю свідчать про високу ідентифікаційну та диференційну здатність розробленої системи їх генотипування. Запропоновано варіант запису молекулярно-генетичного паспорта генотипу за допомогою бінарних формул, який засвідчує відміни структури ДНК сорту, лінії, гібриду і дозволяє здійснювати їх унікальну ідентифікацію.

Дані методики апробовано і впроваджено в роботі Державної служби з охорони та захисту прав на сорти рослин (протокол засідання науково-технічної ради №4 від 20 листопада 2007 року) і Українській лабораторії якості та безпеки продукції АПК НУБіП України.

Особистий внесок здобувача. Планування експериментів здійснено спільно із науковим керівником, д.б.н., професором, член-кореспондентом УААН М.Д. Мельничуком. Здобувачем самостійно проведено інформаційний пошук, проаналізовано літературні дані, підготовлено проби, створено стандарти для визначення вірусних геномів у досліджуваному матеріалі. Спільно із с.н.с. С.О. Смирновою та к.б.н. В.Є. Кожукало здійснено моніторинг новітніх сортів української селекції на ураженість латентним вірусом, оптимізовано метод виділення, очищення та концентрування латентного вірусу. Електронно-мікроскопічні дослідження вірусів проведено спільно із с.н.с., к.б.н І.П. Олексієнком. Дизайн і синтез праймерів для проведення SSR-ПЛР, підбір умов реакції та створення тест-систем на основі мікросателітних маркерів для диференціації та ідентифікації генотипів хмелю виконано разом із науковими співробітниками к.б.н. В.Г. Спиридоновим та к.б.н. М.Ф. Парієм, які є співавторами відповідних наукових публікацій та розроблених біотехнологій.

Колекцію 13 сортів хмелю in vitro отримано за ліцензійною угодою від МПП «Апекс» (директор Куковенко В.І.).

Постановка завдань, розробка методичних підходів, обґрунтування й підготовка науково-практичних висновків і друкованих праць здійснено під науковим керівництвом М.Д. Мельничуком. Загальне редагування та обговорення окремих розділів дисертації проведено разом із д.б.н., професором, член-кореспондентом НАН України І.П. Григорюком.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 робіт, з них 5 статей у провідних фахових виданнях, які входять до переліку ВАК України, 2 тези доповідей, 2 методичні рекомендації, подана одна заявка на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, 5 розділів, висновків, рекомендацій виробництву, 5 додатків, списку використаних джерел із 206 найменувань, із них 114 зарубіжних авторів. Робота викладена на 162 сторінках комп'ютерного тексту і включає 19 таблиць та 34 рисунки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

Складається з 7 підрозділів, в яких розглянуто біологічні характеристики основних вірусів хмелю. Викладено наукові дані стосовно способів отримання безвірусного садивного матеріалу хмелю in vitro. Описано наявні біотехнологічні аспекти контролю латентної вірусної інфекції з використанням традиційних та молекулярно-біологічних методів, а також існуючі методи ідентифікації сортів хмелю за господарсько-фенологічними показниками та можливості використання молекулярних маркерів під час сортовипробування рослин хмелю.

Матеріали і методи досліджень

Діагностику та ідентифікацію латентного вірусу хмелю проводили в агроценозах Житомирської області на дев'яти сортах української селекції Зміна, Промінь, Заграва, Потіївський, Альта, Регент, Слов'янка, Кумир та Гайдамацький. Для виявлення спектра чутливих рослин до досліджуваного вірусу, а також специфічних симптомів застосовували біологічне тестування рослинах-індикаторах. Для виділення та очищення досліджуваного вірусу відбирали молоде листя та молоді пагони, за стандартними методиками (Adams A.N.,1982, Мельничук М.Д., 2002). Морфологію вірусних часток вивчали електронно-мікроскопічним методом. Препарати переглядали в електронному мікроскопі JEM-1200 EX, за збільшення 20-100 тисяч. Для підготовки препаратів виділених вірусів використовували метод негативного контрастування. Електрофорез проводили за методикою (Laemmli U.K.,1970).

Олігонуклеотидні праймери синтезували автоматизовано на 3400 ДНК синтезаторі фірми Applied Biosystems. Вірусну РНК виділяли з проростків та молодих листків хмелю. Рослинний матеріал розтирали в рідкому азоті, а подальше виділення РНК проводили за допомогою набору реагентів “Рибо- Сорб” (“Амплисенс”, Москва, Росія), відповідно до інструкції виробника. Реакцію зворотної транскрипції здійснювали одразу після отримання РНК з використанням набору реактивів “Реверта” (“Амплісенс”, Москва, Росія). Відбирали 1 мкл виділеної РНК, розчиненої в об'ємі 10 мкл DEPC-H2O, змішували з 1 мкл Rand-oligo (випадкові гексануклеотиди) та 1 мкл специфічного праймеру. Суміш підігрівали при 70оС 5 хв та охолоджували при 10о протягом 5 хв.

Реакцію зворотної транскрипції (RT PCR) проводили в об'ємі 20 мкл при температурі 37ОС протягом 30 хв з використанням набора “Реверта” (“Амплисенс”, Москва, Росія). Ампліфікацію виконували на ампліфікаторі “GeneAmp 2400” (Applied Biosystems) у наступному температурному режимі: початкова денатурація - 2 хв при 94ОС; 36 циклів - 30 с при 94ОС, 30 с при 61ОС, 2 хв при 72ОС; термінальна елонгація - 5 хв при 72ОС. Реакційна суміш 25 мкл: 50 мМ КCl, 10 мМ трис-HCl (pH 9.0), 0,01% Triton X 100, 0,2 мМ дНТФ, 3 мМ MgCl2, по 0,2 мкМ кожного із праймерів (HLVF і HLVR), 1 одиниця Taq-полімерази.

Для диференціації та ідентифікації генотипів хмелю звичайного за SSR- маркерами використовували 13 сортів, введених у культуру in vitro. ДНК виділяли за методикою (Boom R., 1990). Полімеразну ланцюгову реакцію здійснювали в об'ємі реакційної суміші - 25 мкл (10х дНТФ, 5х ПЛР буфер 1,5-3 ммоль MgCl2, 1 од. TaqДНК-полімерази, АмплиСенс, Росія) із використанням 10 пкмоль кожної пари праймерів, 100 нг геномної ДНК хмелю. Ампліфікацію проводили на приладі Applied Biosystems 2400. Умови реакції: початкова денатурація 940С - 5 хв, потім 36 циклів за умов ? денатурація 940С - 45 с, ренатурація (гібридизація) 630С - 1 хв 30 с, елонгація 720С - 30 с, заключний цикл - фінальна елонгація 720С - 10 хв.

Продукти ампліфікації розподіляли на ABI Prism 3130 генетичному аналізаторі. Суміш для капілярного електрофорезу містила 1 мкл розбавленого ПЛР-зразка, 11,5 мкл Hi-Di формаміда (Applied Biosystems) і 0,5 мкл Genescan-350 ROX стандарту (Applied Biosystems), яку аналізували відповідно до інструкції виробника. Розмір флуоресцентних мічених ПЛР-продуктів (у парах нуклеотидів) вивчали за допомогою комп'ютерної програми «Genescan» та «Genotyper». Для визначення генетичних зв'язків і побудови дендрограми використовували програми TREECON for Windows (version 1.3) та Neighbor-Joining UPGMA method version 3.67.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Біологічна характеристика латентного вірусу хмелю та розробка ПЛР-діагностикумів. У результаті обстеження хмільників Житомиської області було виявлено симптоми скручування листя - на сортах хмелю Заграва, Потіївський, Промінь та Слов'янка; хлороз - виявили лише на сорті хмелю Птіївський; міжжилкова мозаїка спостерігалася на Альті, Зміні, Кумирі, Промені та Регенті, енації - на заграві і Слов'янці, карликовість - на Заграві, відповідно (рис. 1-4).

Візуальна діагностика вірусних хвороб хмелю не завжди дозволяє зробити висновки про вірусну природу патогенну. Подальші дослідження безпосередньо зразків сортів Промінь, Заграва та Слов'янка показали, що з перерахованих рослин-індикаторів на квасолі відмічалися системні некрози деградації листків у відповідь на зараження латентним вірусом хмелю (рис. 5).

Вірус виділяли з листків хмелю та з пагонів молодих рослин, які швидше інфікуються, нагромаджують вірус у більшій концентрації, містять менше забарвлюючих сік речовин та ферментів, що ускладнюють очищення. Початковою стадією очищення фітовірусів є екстракція з рослинних тканин, ефективність якої залежить від умов гомогенізації було визначено, що гомогенати з листя хмелю мають здатність швидко окислюватись. За кімнатної температури вони миттєво з яскраво-зеленого забарвлення набувають темно-бурого. Тому, під час гомогенізації використовували рідкий азот і всі процедури виконували на холоді.

Важливе значення для отримання очищеного вірусного препарату має правильний добір робочого буферного розчину. В зв'язку з цим було вивчено різні екстрагуючі буферні системи, а саме: 0,1М Na-фосфатний буфер рН 7,0; 7,4; 8,0; 0,1М трис-НCl рН 7,0; 7,4; 0,3М гліцинів буфер рН 8,5; 0,1М боратний буфер рН 7,6; 7,5. Для підтримки стабільності вірусу при гомогенізації було випробувано різні буферні системи. Найоптимальнішим виявився 0,1М ФБР рН 7,4 з додаванням 0,001М ДТК; 0,05М Na2SO3, який і використовували у подальшій роботі. Для запобігання агрегації вірусних часток до суміші додавали детергенти твін-80, тритон Х-100.

При проведенні електрофорезу проби з очищеним вірусом розчиняли в 0,125М трис-HCl буфері, рН 6,8, який вмістив 2% ДСН і 5% Я-меркаптоетанола та кип'ятили 5 хв на водяній бані. ПААГ із 0,2% ДСН формували з розділяючого гелю (лінійний градієнт пористості від 10 до 30%) та концентруючого гелю висотою 1 см пористості 6,5%. У результаті досліду було зафіксовано одну форетичну смугу з молекулярною вагою 25 кДа (рис. 6).

Під час проведення електронно-мікроскопічних аналізів зразків рослин нових сортів хмелю та рослин-індикаторів у препаратах було виявлено вірусні частки ниткоподібної форми розмірами 670 х 19 нм із внутрішнім каналом 3,5-3,7 нм. Причому у кожному шостому випадку вірусний патоген був виявлений із рослин хмелю, які зовсім не утворювали зовнішніх симптомів (рис 3).

Для створення дизайну праймерів, специфічних до нуклеотидних послідовностей ЛВХ, було проведено біоінформативний аналіз, першим етапом якого став скринінг консервативних послідовностей генів, що кодують білок оболонки відповідного вірусу за допомогою генетичного банку даних (GenBank). На підставі узагальнених даних щодо відомих нуклеотидних послідовностей вірусних геномів було виявлено суворо специфічні консервативні нуклеотидні послідовності, які в подальшому використано як матрицю для олігонуклеотидних затравок у процесі синтезу вірусспецифічних фрагментів нуклеїнових кислот. Аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення «MultAline» (Multiple sequence alignment).

Використовуючи консенсусну нуклеотидну послідовність гена, що кодує білок оболонки латентного вірусу хмелю, за допомогою програмного забезпечення «Primer3» було створено дизайн праймерів (табл. 1)

Таблиця 1 ? Молекулярно-біологічні характеристики ПЛР праймерів до латентного вірусу хмелю.

Наступним кроком біоінформативного аналізу стала візуалізація місць гібридизації праймерів з ДНК матрицею консенсусної послідовності (рис. 8)

Дані пари праймерів виявляють стовідсоткову специфічність до геному латентного вірусу хмелю. Аналізуючи пари праймерів за GC-складом, встановлено, що вони знаходяться в оптимальному діапазоні. Тому дану пару праймерів було рекомендовано до синтезу, яка також не виявляла специфічності до нуклеотидних послідовностей геномів інших організмів (з утворенням ПЛР-продукту розміром 330 пар нуклеотидів), які занесено до генетичного банку даних. У подальшому праймери дістали назву: Forward ? HpLV1 1 і Reverse - HpLV2.

Виділений вірус ідентифікували за допомогою зворотної транскрипції полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ ПЛР). З отриманих електронно-мікроскопічних результатів, на основі даних зроблено припущення про належність досліджуваного вірусу до групи Carlаvirus. У результаті аналізу відібраних проб з дев'яти сортів хмелю ЗТ ПЛР було виявлено, що зразки сортів Промінь, Заграва та Слов'янка мали однаковий продукт ампліфікації розміром 330 п.н. (рис. 9), що відповідає теоретично розрахованій довжині ПЛР-продукту для латентного вірусу хмелю (див. табл. 1).

У результаті досліджень на вірусоносійство рослинного матеріалу трьох новітніх ароматичних сортів хмелю з синтезованими ПЛР праймерами до ЛВХ отримано продукти ампліфікації з сортів Промінь, Заграва та Слов'янка, що підтверджує попередні дослідження та вказує на присутність ЛВХ у досліджувальних зразках.

ДНК-аналіз генотипів хмелю із застосуванням мікросателітних маркерів. Для генетичного аналізу застосовували 10 мікросателітних відомих локусів (11a-59, 7a-82, HlG-A3, HlG-T1, HlG-T5, 3a-88, 5-2, HlG-A4, HlG-A9, HlG-T2). Було встановлено, що 9 із 10 локусів є поліморфними, за винятком локусу 7a-82, який виявився мономорфним для генотипів хмелю. Проведеним ПЛР аналізом виявлено 45 алелів. Результати диференціації мікросателітних локусів за довжиною алелів представлено в табл. 2.

Доведено, що найменша кількість алелів міститься в локусах 11a-59 і 7a-82, два алеля з розмірами 179 й 190 пар нуклеотидів у першому, 196 та 198 - другому локусі. Під час аналізу генотипів хмелю із праймерами до мікросателітних локусів 3a-88 і 5-2 визначили сім алелів з диференційованими розмірами (191, 193, 196, 198, 200, 219, 223 та 149, 168, 176, 179, 181, 183 та 185 пар нуклеотидів відповідно). Три алеля зафіксовано за допомогою електрофоретичного аналізу продуктів ампліфікації з праймерами до мікросателітних локусів HlG-A3, чотири в локусах HlG-A4 і HlG-T2, п'ять у HlG-T1 та HlG-A9, шість у HlG-T5. Середня кількість алелів на один генотип становить 4,5.

Таблиця 2 ? Алелі мікросателітних локусів, виявлених при генотипуванні 13 сортів хмелю звичайного української селекції

Для спрощеного запису генотипів рослин хмелю визначено алелі залежно від їхнього розміру, які позначали латинськими літерами A, B, C, D, E, F, G, де А ? найменший за розмірами алель при електрофоретичному розподілі продуктів ампліфікації, літера В відповідає наступному за розміром алелю, G ? найбільший фрагмент у мікросателітних локусах 3a-88 та 5-2. У результаті такого кодування можливо створити комп'ютерну базу сортів хмелю української селекції.

У результаті експериментального визначення оптимальної концентрації компонентів ПЛР-суміші, підбору оптимальних умов для проведення ампліфікації та уніфікації всього процесу ПЛР, було запропоновано проведення мультиплексного ампліфікування генотипів хмелю з комплексом мікросателітним маркерів, що у свою чергу дозволило суттєво зекономити витрату реактивів на проведення досліджень та скоротити час аналізу. Для створення мультиплексу було проаналізовано мінімальні і максимальні довжини отриманих мікросателітних локусів (найбільший і найменший розмір кожного локусу) та барвник, яким фарбували SSR-маркери. Для виконання мультиплексу брали лише 9 із 10 мікросателітних маркерів, бо другий 7а-82 виявився моноалельним. Для оптимізації умов проведення ПЛР у першу чергу підбирали температуру відпалу праймерів. Ми експериментальним шляхом встановлено, що оптимальні умови проведення полімеразної ланцюгової реакції генотипів хмелю з SSR-маркерами мають відповідні параметри (табл. 3).

Таблиця 3 ? Умови та параметри ампліфікації

Візуалізацію продуктів ампліфікації за використання мультиплексної комбінації маркерів з різними величинами ампліфікованих локусів здійснювали за допомогою генетичного аналізатора ABI Prism 3130 (рис. 10).

Експериментально встановлено, що сорт хмелю Руслан містить 23 алеля, Тріумф ? 20, Національний ? 17, Славянка - 12, Кумир ? 15, Промінь ? 19, Злато Полісся ? 17, Оболонський ? 18, Хмелеслав ? 14, Альта ? 14, Потіївський - 18, Гайдамацький - 21 та Заграва - 18 (табл. 4). Для створення комп'ютерного банку генетичних паспортів сортів хмелю української селекції було переведено отримані дані в бінарний вираз. Наявність або відсутність певного алеля позначається як «1» або «0». За таким принципом можливо побудувати генетичний паспорт геному хмеля (табл. 5). Це дозволяє легко ідентифікувати і диференціювати проаналізовані, за даними 10 мікросателітними локусами, сорти та вихідний селекційний матеріал хмелю. Як показав аналіз сортів хмелю за 10 SSR-маркерами кожний представлений генотип має власний і унікальний набір алелів. Це дозволяє чітко розрізняти їх при проведенні SSR-ПЛР аналізу.

Таблиця 4 ? Результати генотипування 13 сортів за 10 мікросателітними локусами

Таблиця 5 ? Бінарний генетичний код 13 сортів хмелю звичайного української селекції

На підставі поліморфізму SSR-маркерів було побудовано дендрограму філогенетичних взаємозв'язків, яку розраховували за наявними алелями 10 мікросателітних локусів 13 генотипів хмелю (рис. 11). При цьому найбільшою спорідненістю відзначалися сорти хмелю Потіївський і Заграва, що становить 0,091, найменшою ? Руслан та Заграва. Їхня спорідненість становить 0,24, що є мінімальним та максимальним показниками спорідненості між сортами хмелю.

Запропонована система генотипування дозволяє створити розширений комп'ютерний банк генетичних паспортів і вихідного селекційного матеріалу. На підставі отриманих даних можливо з високою точністю проводити ідентифікацію та диференціацію сортів хмелю.

Показано можливість використання розробленої тест-системи за 10 мікросателітними локусами для ДНК-паспортизації на прикладі проаналізованих 13 сортів хмелю звичайного української селекції. Виявлено 45 алелів, кількість яких за локусами коливається від 2 до 7. Побудовано філогенетичну дендрограму, яка демонструє ступінь спорідненості між сортами хмелю звичайного, які умовно розподілено на три кластери за ПЛР-аналізом геномної ДНК SSR-маркерами. До І кластеру належать сорти хмелю Руслан, Кумир і Хмелеслав, ІІ - Тріумф, Промінь, Злато Полісся, Гайдамацький й Альта, ІІІ - Національний, Слов'янка, Оболонський, Потіївський та Заграва. В межах І і ІІ кластерів найбільша генетична відстань становить 0,19, ІІІ - 0,16.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нові біотехнологічні прийоми з молекулярно-біологічного контролю та ідентифікації вірусної інфекції хмелю, викликаної латентним вірусом хмелю, та представлена розробка SSR-ПЛР тест-системи ідентифікації генотипів хмелю (Humulus lupulus L.) української селекції.

1. На основі біологічного тестування патогенів на рослинах-індикаторах квасолі і кабачків та методу електронної мікроскопії ідентифіковано ниткоподібний вірус хмелю розмірами 670 х 19 нм., який віднесено до групи Carlavirus.

2. Оптимізовано методику виділення та очищення нативного вірусного патогену із додаванням до рослинного екстракту 0,001М диетилдитіокарбамату та 0,05М Na2SO3, із використанням методу диференційного центрифугування з високим коефіцієнтом стабільності вірусних часток.

3. Вперше проведено молекулярно-біологічний скринінг консервативних послідовностей 16 вірусів рослин, що належать до групи Carlavirus. Підібрано, синтезовано й зареєстровано в генетичному банку специфічні ПЛР праймери до латентного вірусу хмелю (Gen Bank № АВ032469).

4. Розроблено оптимальні умови проведення РТ ПЛР та створено молекулярно-біологічний діагностикум з ідентифікації латентного вірусу хмелю, що дозволило виявити його в агроценозах Житомирщини на сортах Промінь, Заграва та Слов'янка.

5. Вперше показано ефективність застосування молекулярно-біологічного діагностикуму з виявлення та ідентифікації латентного вірусу хмелю на безсимптомних рослинах хмелю.

6. ПЛР-експрес аналізом із застосуванням мікросателітних маркерів (11a-59, 7a-82, HlG-A3, HlG-T1, HlG-T5, 3a-88, 5-2, HlG-A4, HlG-A9, HlG-T2) проаналізовано і диференційовано 13 найпоширеніших сортів хмелю української селекції.

7. Розроблено власну універсальну маркерну SSR-ПЛР-тест систему сортоідентифікації, яку удосконалено шляхом застосування мультиплексу (триплексу) в різних комбінаціях молекулярних маркерів із відповідними температурними режимами (температура відпалу праймерів 630 та концентрацією реакційної суміші (об'єм реакційної суміші 25 мкл, ДНК - 2 мкл, праймери по 2 мкл).

8. Проведено філогенетичний аналіз, який показав наявність сортоспецифічоісті та існування трьох окремих генетичних кластерів сортів хмелю звичайного української селекції.

9. Вперше отримано й запропоновано варіант молекулярно-генетичного паспорта генотипів сортів хмелю звичайного з ідентифікацією структурних особливостей ДНК сорту, лінії, гібриду.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

Розроблені біотехнології з діагностики латентного вірусу та ДНК-аналізу генотипів хмелю необхідні для створення конкурентоспроможної системи розмноження новітніх сортів хмелю української селекції, їх внесення до Державного реєстру та при закладанні нових хмільників.

Розроблені методичні рекомендації з ДНК-ідентифікації та диференціації сортів хмелю української селекції на основі 10 SSR-маркерів відкривають нові можливості і дозволяють скоротити час проведення випробування будь-якого сорту хмелю з 3-4 років до кількох тижнів. Результати апробації 13 сортів хмелю свідчать про високу ідентифікаційну та диференційну здатність розробленої системи їх генотипування.

Запропоновано варіант запису молекулярно-генетичного паспорта генотипу за допомогою бінарних формул, який засвідчує відміни структури ДНК сорту, лінії, гібриду і дозволяє здійснювати їх унікальну ідентифікацію.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Діагностика та ідентифікація вірусів хмелю (Humulus lupulus L.) новітньої української селекції / М.Д. Мельничук, С.О. Смирнова, В.Є. Кожукало, В.В. Оверченко, О.І. Козак, В.С. Стеценко, К.П. Михайличенко, І.П. Штанько // Бюлетень Інституту сільськогосподарської мікробіології. - 2000. ? №7. ? С. 37-38. (Здобувачем здійснено відбір зразків, проведено первинну діагностику, підготовлено статтю до друку).

2. Методичні підходи по виділенню та очистці карлавірусу хмелю на плантаціях світової колекції України / М.Д. Мельничук, В.Є. Кожукало, В.В.Оверченко, С.О. Смирнова // Аграрна наука і освіта. - 2001. ? Т. 2, №1-2. ? С. 5-10. (Здобувачем здійснено візуальну діагностику та відбір зразків, підібрано умови для виділення вірусу, проведений скринінг літературних джерел).

3. Карлавіруси в агроценозах / М.Д. Мельничук, В.В. Оверченко, О.А. Бойко, А.Л. Бойко // Захист рослин. - 2002. - № 11. - С. 13. (Здобувачем здійснено скринінг літературних джерел, проведено діагностику карлавірусів інфікованих рослин).

4. Мельничук М.Д. Діагностика латентного вірусу хмелю на сортах української селекції / М.Д. Мельничук, В.В. Оверченко, О.В. Дубін // Мікробіологічний журнал - 2003. - Т. 65, № 4. - С. 43-50. (Здобувачем проведено відбір зразків, діагностику латентного вірусу, визначено біологічні властивості ЛВХ, підготовлено статтю до друку).

5. Ідентифікація генотипів хмелю (Humulus lupulus L.) за мікросателітними маркерами. / М.Д. Мельничук, В.В.Оверченко, В.Г. Спиридонов, М.Ф. Парій // Наукові доповіді НАУ. - 2008. ? №4 (12). - http://www.nbuv.gov.ua/e-Journals/nd/2008-4/08mmdomm.pdf, (Здобувачем проведено відбір зразків, виділення ДНК, підібрано умови ампліфікації, отримано і проаналізовано результати та підготовлено статтю до друку).

6. Генетичне різноманіття сортів хмелю звичайного (Humulus lupulus L.) української селекції. / М.Д. Мельничук, В.В.Оверченко, В.Г. Спиридонов, М.Ф. Парій, І.П. Григорюк // Доповіді НАН України. - 2008. - №11. ? С. 152-155. (Здобувачем проведено відбір зразків, виділення ДНК, підібрано умови ампліфікації, отримано і проаналізовано результати та підготовлено статтю до друку).

7. Моніторинг латентного вірусу хмелю на сучасних та перспективних сортах української селекції / В.В. Оверченко, С.О. Смирнова, В.Є. Кожукало, М.Д. Мельничук : Сборник тезисов ІІ международной конференции молодых ученых «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений», (Харьков, 19-мая 2003 г.) / Институт растениеводства им. В.Я. Юрьева УААН. ? Харьков: ИР им. В.Я. Юрьева, 2003. ? С.288-289.

8. Оверченко В.В. ДНК-аналіз генотипів хмелю (Humulus lupulus L.) за допомогою SSR-маркерів. / В.В. Оверченко, М.Д. Мельничук, І.П. Григорюк: Тези доповідей Міжнародної науково-практичної конференції до 75-річчя Ботанічного саду Дніпропетровського національного університету «Сучасні проблеми інтродукції та акліматизації рослин.», (Дніпропетровськ, 8-11 вересня 2008 р.) / Міністерство освіти і науки [та ін.]. - Дніпропетровськ: Видавництво ДНУ, 2008. - С. 65 - 66.

9. ДНК-ідентифікації генотипів хмелю звичайного (Humulus lupulus L.) на основі SSR - маркерів: Методичні рекомендації / М.Д. Мельничук, В.В.Оверченко, В.Г.Спиридонов, М.Ф. Парій. ? К.: Видавничий центр НАУ. - 2008. - 24 с.

10. Технологія прямої in vivo адаптації клонованих in vitro рослин хмелю (Humulus lupulus L.): Методичні рекомендації / М.Д. Мельничук, А.Л. Бойко, І.П. Григорюк, В.О. Дубровін, А.А. Клюваденко, В.В. Оверченко. ? К. : Видавничий центр НАУ, 2008. - 14 с.

анотація

Оверченко В.В. Молекулярна діагностика латентного вірусу та SSR-ПЛР ідентифікація сортів хмелю (Humulus lupulus L.) української селекції. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Національний університет біоресурсів і природокористування України, вул. Героїв оборони 15, м. Київ, 03041.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню латентного вірусу хмелю та створення сучасної ефективної тест-системи для ідентифікації даного вірусу методом ЗТ ПЛР, а також можливості застосування мікросателітних маркерів для генетичної диференціації генотипів хмелю звичайного (Humulus lupulus L.).

Проведено дослідження з вивчення біологічних властивостей українського ізоляту латентного вірусу хмелю з подальшим виділенням, очищенням та концентруванням, а також отримані електронно-мікроскопічні дані по цьому вірусу. На основі отриманих позитивних контролів із використанням світової бази даних генетичних послідовностей (GenBank) було розроблено універсальні ПЛР тест-системи, які спрямовані на виявлення та діагностику латентного вірусу хмелю. Створені ПЛР тест-системи дозволили провести скринінг новітніх сортів хмелю української селекції та ідентифікувати досліджуваний вірус. На підставі визначених нуклеотидних послідовностей розроблено систему діагностики, що базується на застосуванні ЗТ-ПЛР з використанням власне синтезованих маркерів.

Розроблено методику ідентифікації та диференціації генотипів хмелю української селекції, з використанням SSR-ПЛР. Для розробки молекулярної тест-системи було проведено генетичний аналіз 13 сортів хмелю української селекції, а також підібрано й проаналізовано 10 мікросателітних локусів та синтезовано SSR-праймери. Проведено уніфікацію ПЛР та адаптовано до українських генотипів хмелю. На основі отриманих даних створено комп'ютерний «генетичний» банк даних та побудовано філогенетичні зв'язки між даними сортами хмелю.

Ключові слова: латентний вірус хмелю, молекулярна діагностика, ЗТ-ПЛР, SSR-ПЛР, молекулярно-генетичний поліморфізм, ДНК-маркери, ідентифікація генотипів хмелю.

вірус хміль маркер генетичний

Оверченко В.В. Молекулярная диагностика латентного вируса и SSR-ПЦР идентификация сортов хмеля (Humulus lupulus L.) украинской селекции. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. - Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, ул. Героев обороны 15, м. Киев, 03041.

Диссертационная работа посвящена исследованию латентного вируса хмеля и создания современной эффективной тест-системы для идентификации данного вируса методом РТ ПЦР, а также возможности применения микросатэлитных маркеров для генетической дифференциации генотипов хмеля обычного (Humulus lupulus L.).

Проведено исследование биологических свойств украинского изолята латентного вируса хмеля с последующим выделением, очисткой и концентрированием, а также получены электронно-микроскопические данные по этому вирусу. На основе полученных позитивных контролей с использованием мировой базы данных генетических последовательностей (Genbank) были разработаны универсальные ПЛР тест-системы, которые направлены на выявление и диагностику латентного вируса хмеля. Созданные ПЦР тест-системы позволили провести скрининг новейших сортов хмеля украинской селекции и идентифицировать исследуемый вирус. На основании определенных нуклеотидных последовательностей разработана система диагностики, которая базируется на применении РТ-ПЦР с использованием собственно синтезированных маркеров.

Оптимизированные условия проведения реакции амплификации открывают возможности для широкого внедрения ПЛР диагностикумов для идентификации латентного вируса хмеля в лабораторную практику, а также использования фитосанитарного контроля, при регистрации новых сортов, экспорте и импорте посадочного материала и как контроль донорных насаждений в процессе выращивания.

Разработана методика идентификации и дифференциации генотипов хмеля украинской селекции, с использованием SSR-ПЦР. Для разработки молекулярной тест-системы был проведен генетический анализ 13 сортов хмеля украинской селекции. Были подобраны и проанализированы 10 микросателитных локусов и синтезированы SSR-праймери. Проведена унификация ПЛР и адаптирована к украинским генотипам хмеля. На основе полученных данных создан компьютерный «генетический» банк данных и построены филогенетические связи между данными сортами хмеля.

Показанная возможность использования мультиплекса позволяет снизить себестоимость анализа и сократить время на его проведение.

Вновь созданные системы диагностики и идентификации могут быть использованы в вирусологической и биотехнологической научной практике в качестве надежного инструмента для исследований латентного вируса и изучения генетического многообразия сортов, гибридов и диких форм хмеля.

Ключевые слова: латентный вирус хмеля, молекулярная диагностика, РТ-ПЦР, SSR-ПЦР, молекулярно-генетический полиморфизм, ДНК-маркеры, идентификация генотипов хмеля.

Overchenko V.V. Molecular diagnostics of latent virus and SSR-PCR identification of sorts of hop (Humulus lupulus of L.) of the Ukrainian selection. Manuscript.

Dissertation on the receipt of scientific degree of candidate of agricultural sciences from speciality 03.00.20 - biotechnology. - National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Heroev oboroni st. 15, Kyiv, 03041.

Dissertation work is dedicate to research of latent virus of hop and creation of modern effective test-system for identification of this virus by the method of RT PCR and also possibilities of application of microsatellite markers for genetic differentiation of genotypes of hop (Humulus lupulus L.).

Research from the study of biological properties is conducted of the Ukrainian isolate of latent virus of hop with a subsequent removing, cleaning and conce...