Молекулярно-генетичний поліморфізм грибів роду Fusarium Link, що вражають кукурудзу

Размещено на http://allbest.ru

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Молекулярно-генетичний поліморфізм грибів роду Fusarium Link, що вражають кукурудзу

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

фузарія кукурудза поліморфізм

Актуальність теми. Пізнання особливостей організації та варіабельності геномів рослин і фітопатогенів, що їх вражають, є однією з важливих проблем біології. Аналіз молекулярно-генетичного поліморфізму з використанням ДНК-технології відкрив нові можливості та з'явився основою нового напряму геноміки. Одним із популярних об'єктів дослідження, разом із рослинами, стають геноми фітопатогенних грибів роду Fusarium. Створення в останні десятиліття в результаті двох «зелених революцій» високопродуктивних генотипів рослин привело до збільшення втрат урожаю від фузаріозів, що викликаються мікроскопічними грибами фузаріями. Епіфітотії призводять до зниження врожаю, внаслідок паразитування та здатності до токсиноутворення (мікотоксикози людей і сільськогосподарських тварин) даних грибів. Хвороба властива майже всім сільськогосподарським культурам. Кукурудза інтенсивніше за інші зернові злаки вражається цими грибами.

Молекулярно-генетичний аналіз видового та штамового складу фітопатогенних грибів, їх ідентифікація та визначення мінливості є важливим етапом дослідження геномів грибів роду Fusarium. Крім того, детальна характеристика геномів фузаріїв та диференціація генотипів, що розрізняються за патогенністю, має значення для добору генотипів рослин, стійких до фузаріозного враження. ДНК-технологія в даний час є найбільш інформативною в сукупності методів дослідження організації та мінливості геномів грибів. За допомогою ПЛР-аналізу можливо поглибити наше уявлення про геном, ідентифікувати та диференціювати генотипи грибів, виявити фізіологічні раси, детектувати патоген в інфікованому матеріалі.

Вивчення молекулярно-генетичної мінливості грибного генома під впливом зовнішніх чинників необхідне для дослідження мікроеволюційних процесів у фузаріїв, що вражають кукурудзу; розробки систем прогнозування та моніторингу фузаріозів; для створення генотипів рослин із агрономічно важливими ознаками, стійких до патогенів і здатних як можливо довше зберігати дані властивості. Економічна цінність досліджень полягає в допомозі отримання повноцінного врожаю, максимального зменшення дії на людину та тварин мікотоксинів, які знаходяться в їжі, інфікованій цими грибами, а також в захисті навколишнього середовища від забруднення пестицидами.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася у відділі молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру в рослинництві (ПБЦ) в рамках науково-технічної програми (НТП) УААН «Сільськогосподарська біотехнологія 2001-2005 рр.» (№ 318/92 від 24.10.01 р.), підпрограми I «Новітні біотехнології в рослинництві» (№ держреєстрації УкрІНТЕІ 0104U003557), напрямку 3 «Використання молекулярно-біологічних методів в генетико-селекційній роботі», за завданням 3.2.2.1 «Маркування генів стійкості кукурудзи до видів роду Fusarium» (№ 0104U003558), а також в рамках НТП УААН «Сільськогосподарська біотехнологія 2006-2010 рр.», підпрограми І «Розробити біотехнології створення нових генотипів в рослинництві та генетичного контролю кількісних і якісних ознак» за завданням 01.09 «Розробка ДНК-технологій генетичного контролю стійкості кукурудзи до фузаріозів» (№ 0106U002670).

Мета і завдання дослідження. Мета даної роботи полягала в дослідженні молекулярно-генетичної організації та мінливості геномів фузарієвих грибів, що вражають кукурудзу.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

1) Вивчення внутрішньоштамової варіабельності F. moniliforme var. lactis.

2) Вивчення внутрішньовидового поліморфізму видів F. moniliforme var. lactis, F. oxysporum var. orthoceras.

3) Молекулярно-генетична характеристика міжвидового поліморфізму грибів роду Fusarium.

4) Розробка системи ПЛР-детекції грибів роду Fusarium, видів F. moniliforme var. lactis, F. graminearum та генів токсиноутворення в інфікованому зерні кукурудзи та продуктах його переробки.

Об'єкт дослідження: мінливість геномів грибів роду Fusarium.

Предмет дослідження: молекулярно-генетичний поліморфізм різних фракцій ДНК фузарієвих грибів.

Методи дослідження: мікробіологічні методи (культивування грибів на живильних середовищах); виділення ДНК з міцелію грибів та зерен кукурудзи; різновиди ПЛР-аналізу (довільно праймована ПЛР, RAPD, ISSR, IRAP, STS); електрофорез в агарозних гелях; комп'ютерна обробка даних (визначення молекулярної маси фрагментів ампліфікації, генетичних дистанцій і конструювання дендрограм).

Наукова новизна отриманих результатів полягає в формулюванні нової наукової проблеми, сенсом якої є дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму геномів фузарієвих грибів, що вражають кукурудзу південно-східного регіону України. Вперше здійснено ПЛР-аналіз популяцій фузаріїв, виділених із уражених зерен гібридів кукурудзи, що вирощується на півдні України. Охарактеризовано рівень молекулярно-генетичної мінливості згідно систематичній ієрархії: мінливість індивідуальних штамів, внутрішньовидовий та міжвидовий поліморфізм роду Fusarium. Вперше, як «інструмент» для повнішого обхвату генома фузаріїв, використано знання щодо нуклеотидних послідовностей мобільних генетичних елементів та їх перестановки. Виявлено закономірності зміни генотипу гриба в результаті контакту з різними генотипами рослин. Показано генетичну віддаленість зразків F. moniliforme із південно-східного і північного регіонів України. Запропоновано трьохступеневу систему молекулярних маркерів для ідентифікації фузаріїв на рівні роду, видів і наявності генів токсиноутворення.

Практичне значення отриманих результатів полягає в отриманні інформації щодо генетичної різноманітності та розуміння молекулярно-генетичної мінливості фітопатогенних грибів, що інфікують економічно важливі культури. Це необхідно для удосконалення методів створення генотипів рослин, стійких до певних захворювань, здатних тривалий час зберігати стійкість у поєднанні з комплексом господарськоцінних ознак. Знання генетичної різноманітності фузарієвих грибів даного географічного регіону і динаміки їх мінливості також дозволить прогнозувати і контролювати фітосанітарний стан зерна і харчової продукції при зберіганні. Розроблено систему експрес-ПЛР-детекції патогена в зерні кукурудзи та в продуктах харчування, що є актуальним для скорочення втрат урожаю та запобігання захворювання людей і тварин мікотоксикозами. ПЛР-детекція є точним, швидким і відносно дешевим методом виявлення джерела інфекції і визначення збудника, і тому рекомендується для тестування урожаю перед закладкою на зберігання, перед висівом в полі; для встановлення рівня забрудненості харчових і кормових продуктів рослинного походження.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу виконано під керівництвом д.б.н., професора, академіка УААН Сиволапа Ю.М. Дисертантом особисто проаналізовано літературні дані за темою дисертації, створено колекцію Fusarium moniliforme, що складається з 39 штамів, проведено виділення ДНК з міцелію та генотипування більш ніж 100 штамів Fusarium в чотирьох повторюваннях. Продемонстровано молекулярно-генетичну мінливість окремих штамів при контакті з різними за стійкістю до фузаріозу генотипами рослин, визначено молекулярно-генетичний поліморфізм в межах видів (F. moniliforme var. lactis, F. gibbosum var. acuminatum, F. oxysporum var. orthoceras) і між видами грибів роду Fusarium. Створено систему експрес-ПЛР-детекції грибів роду Fusarium, видів F. graminearum, F. moniliforme var. lactis і генів токсиноутворення в інфікованому зерні кукурудзи та продуктах його переробки. Розробка систем включала оптимізацію умов виділення ДНК з інфікованого матеріалу; пошук інформації про родо-, видо- та генотипоспецифічні нуклеотидні послідовності в літературних джерелах; оптимізацію умов ПЛР з родо-, видо- та генотипоспецифічними парами праймерів; оцінку чутливості тест-системи (виявлення мінімальної концентрації ДНК патогена, при візуалізації бромистим етідієм); перевірку специфічності ПЛР на коректність відносно об'єктів-мішеней (гриби роду Fusarium, види F. graminearum, F. moniliforme var. lactis) з використанням ДНК організмів різних таксономічних одиниць); детекцію генів токсиноутворення. Продемонстровано можливість практичного застосування методу експрес-ПЛР-детекції.

Автор виражає подяку за допомогу в плануванні дослідницької роботи і творчу участь в процесі дослідження заступнику директора ПБЦ з наукової роботи, д.б.н., с.н.с. Кожуховій Н.Е., за надання матеріалу та інформації про актуальні проблеми селекції і захисту врожаїв к.с/х.н., с.н.с., завідувачу відділу олійних культур Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення УААН (СГІ, м. Одеса, Україна) Варенику Б.Ф., заступнику директора СГІ з наукової роботи, к.б.н. Бабаянц О.В. за люб'язно надані штами роду Fusarium з колекції СГІ, а також співробітникам відділу систематики мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ (ІМВ, м. Київ, Україна) д.б.н. Ждановій Н.Н. та к.б.н., с.н.с. Соколовій О.В. за ідентифікацію 31 штаму F. moniliforme var. lactis, що виділені нами в чисті культури з інфікованих зерен кукурудзи в 2001 році та надання штамів з колекції інституту. Обговорення, аналіз, інтерпретацію одержаних експериментальних даних, а також підготовку публікацій до друку здійснювали спільно з д.б.н., професором, академіком УААН, директором ПБЦ Сиволапом Ю.М. і заступником директора ПБЦ з наукової роботи, д.б.н., с.н.с. Кожухової Н.Е., автор виражає їм щиру подяку.

Апробація результатів дисертації. на Всеукраїнській конференції молодих учених «Засади сталого розвитку аграрної галузі» (Україна, Київ, 28-30.10.2002 р.); на 7-ій Пущинській школі-конференції молодих учених «Биология - наука ХХI века» (Росія, Пущино, 14-18.04.2003 р.); на 2-ій Міжнародній конференції молодих учених «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений» (Україна, Харків, 19-23.05.2003 р.); на IV Міжнародній конференції «Геном растений» (Україна, Одеса, 10-13.06.2003 р.); на Міжнародній науковій конференції «Молекулярная генетика, геномика и біотехнологія» (Білорусь, Мінськ, 24-26.11.2004 р.); на Х з'їзді Товариства мікробіологів України (Україна, Одеса, 15-17.09.2004 р.); на 9-ій Міжнародній Пущинській школі-конференції молодих учених «Биология - наука ХХI века» (Росія, Пущино, 18-22.04.2005 р.); на Міжнародній науковій конференції «Современные проблемы генетики» (Білорусь, Мінськ, 17-18.11.2005 р.); на 10-ій Міжнародній Пущинській школі-конференції молодих учених, присвяченої 50-літтю Пущинського наукового центру РАН, «Биология - наука ХХI века» (Росія, Пущино, 17-21.04.2006 р.); на Міжнародній науковій конференції «Мікробні біотехнології», присвяченій 140-річчю з дня народження Д. К. Заболотного (Україна, Одеса, 11-15.09.2006 р.); на III Міжнародній конференції молодих учених «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution.» (Україна, Одеса, 15-18.05.2007 р.); на Міжнародній науково-практичній конференції «Актуальные проблемы иммунитета и защиты сельскохозяйственных культур от болезней и вредителей» (Україна, Одеса, 11-14.09.2007 р.); V Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» (Україна, Львів, 12-15.05. 2009 р.). Публікації. Опубліковано 23 наукових роботи. Результати даної роботи, що відображають основний її зміст, викладено у семи статтях, Деклараційному патенті України на корисну модель, методичних рекомендаціях, тезах 14 доповідей на наукових конференціях.Структура та об'єм дисертації. Дисертація складається з введення, огляду літератури, розділу матеріалів і методів досліджень, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку цитованої літератури. Робота викладена на 149 сторінках машинописного тексту, включаючи 10 таблиць та 29 рисунків. Список цитованої літератури включає 171 джерело.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи досліджень. Матеріалом для дослідження внутрішньоштамової варіабельності фузарієвих грибів слугували контрастні за патогенністю колекційні штами F. moniliforme var. lactis (далі F. moniliforme):високопатогенний - F. moniliforme 94m та слабкопатогенний - F. moniliforme 34-17. Лінії кукурудзи Одеська 139 (Од139) (стійка до фузаріозу) та R221A (сприйнятлива до фузаріозу) використовували у якості живильного субстрату для вирощування штамів з метою відновлення патогенності. Після «відновлення патогенності» культури штамів культивували на середовищі Чапека (30 г глюкози; 2 г NaNO₃; 1 г KH₂PO₄; 0,5 г MgSO₄*7H₂O; 0,5 г KCl; 18 мг Fe₂(SO₄)₃; 20 г агару; 1000 мл дН₂О). Инкубировали при 24 °С.

Внутрішньовидовий поліморфізм вивчали на вибірках колекційних штамів F. moniliforme та штамів F. moniliforme, що виділені з ураженого фузаріозом зерна кукурудзи ліній Одеська 139, Одеська 140, Одеська 308, НМV 404, Одеська 141, Дк 964, W401, ВІР 27, які представлені як жовтозерними, так і білозерними формами («свіжовиділені» штами), а також на колекційних штамах F. oxysporum var. orthoceras (далі F. oxysporum).

Для вивчення міжвидового молекулярно-генетичного поліморфізму роду Fusarium використовували різні види роду Fusarium, що належать до різних секцій: секція Discolor: F. gibbosum var. acuminatum, F. gibbosum var. bullatum, F. graminearum, F. culmorum, F. macroceras; секція Elegans: F. moniliforme var. lactis, F. moniliforme var. subglutinans, F. oxysporum var. orthoceras; секція Sporotrichiella: F. sporotrichiella var. tricinctum; секція Roseum: F. avenaceum і один вид з відділу Базидіоміцетів - Pleurotus ostreatus (у якості контролю).

Для розробки системи ПЛР-детекції грибів роду Fusarium, видів F. moniliforme, F. graminearum та tri5, tri6, fum5-генів токсиноутворення використовували штами, що належать до видів F. gibbosum, F. graminearum, F. culmorum, F. macroceras, F. moniliforme, F. oxysporum F. sporotrichiella, F. avenaceum, Saccharomyces vini, Pleurotus ostreatus.

Лінії кукурудзи надані кандидатом сільськогосподарських наук Б.Ф. Вареником (СГІ, м. Одеса). Штами грибів роду Fusarium з колекції відділу фітопатології та ентомології СГІ люб'язно надані кандидатом біологічних наук О.В. Бабаянц.

Виділення ДНК із міцелію грибів. Міцелій збирали в епендорф за допомогою мікробіологічної петлі з твердого культурального середовища - картопляно-цукрозного агару. Зібраний міцелій (близько 500 мг) заливали 500 мкл лізуючого TES-буфера, струшували на вортексі. Інкубували 1 год при 55 °С. Додавали NaCl до концентрації 1,4 М і 1/10 об'єму 10,0 % ЦTAБ. Інкубували 10 хв при 65 °С. Додавали рівний об'єм суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішували до появи білої емульсії. Інкубували 30 хв при 0 °С і центрифугували 10 хв при 14000 об./хв. Надосадну рідину переносили в іншій епендорф, додавали 225 мкл 5,0 М ацетату амонію, обережно перемішували і поміщали на лід на 30 хв; центрифугували 10 хв при 14000 об./хв. Надосадову рідину переносили в іншій епендорф, додавали 0,55 об'єму ізопропанолу; поміщали на лід на 15 хв. Центрифугували 5 хв при 14000 об./хв. Зливали надосадну рідину, осад двічі промивали 1 мл охолодженого 70,0 % етанолу центрифугуванням при 14000 об./хв протягом 2 хв на мікроцентрифузі “Еppendorf 5415”. Надосадову рідину зливали, осад підсушували при кімнатній температурі і додавали 100 мкл TE-буфера з 1 мкг/мл РНКази А, інкубували 1 год при 37 ⁰С. Додавали 300 мкл суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішували до появи білої емульсії. Одержану суміш центрифугували 5 хв при 14000 об./хв на мікроцентрифузі “Еppendorf 5415”, водну фазу (розчин ДНК) переносили в іншій епендорф.

Виділення ДНК гриба з сухого зерна кукурудзи. ДНК гриба виділяли з розмолотих зерен кукурудзи. Кожен, потенційно інфікований, зразок зерна розмелювали в лабораторному електричному млині ЕМ-3А, заздалегідь і згодом обробленої етиловим спиртом та ультрафіолетом. Одержаний з індивідуального зразка порошок (100 мг) поміщали в епендорф, та діяли згідно вищеописаній методиці.

Флуориметричне визначення концентрації ДНК. Концентрацію ДНК визначали на флуориметрі “TKO 100 Dedicated mini Fluorometer” (“Hoefer Scientific Instruments”, США) з використанням TNE-буфера (0,01 M Трис-HCl pH 7,4; 0,2 M NaCl; 0,001 M Na₃EДTA) у присутності 0,1 мкг/мл флуоресцентного барвника Hoechst 33258 згідно інструкції до приладу.

Умови проведення полімеразної ланцюгової реакції. ПЛР проводили у 0,5мл-епендорфах у ампліфікаторі MIR-D30 («Sanyo», Японія). Реакційна суміш об'ємом 20 мкл містила: 10 х буфер (для ISSR- та ДП-ПЛР: 50 mМ KCl, 20 mМ Трис-HCl pН 8,4 (25 ^оС), 4 mМ MgCl₂, 0,01 % Твін-20; для RAPD-, IRAP- та STS-ПЛР: 50 mМ KCl, 10 mM Трис-HCl pH 9,0 (25 ^oC), 1,5 mM MgCl₂, 0,01 % желатин); 0,2 mМ кожного dNTP (dАTP, dCTP, dTTP, dGTP); по 0,2 (0,25) мкМ праймера; 2-5 мкл ДНК; 1-2 одиниці ДНК-полімерази Taq. На реакційну суміш нашаровували 20 мкл мінеральної олії. Для уникнення хибнопозитивних результатів при використанні праймерів до родо-, видо- та генотипоспецифічних регіонів геному фузарієвих грибів здійснювали негативний контроль (замість ДНК вносили по 2 мкл стерильної дистильованої води). Процес ампліфікації містив: початкову денатурацію (для різних типів ПЛР температура варіювала в межах 92-96 ^оС), основні цикли - денатурація (1 хв 30 сек-5 хв, 92-94 ^оС), відпалювання праймерів (30 сек-1 хв 30 сек, 42-64 ^оС), елонгація (45 сек-2 хв 30 сек, 70-72 ^оС) та фінальну елонгацію (2-5 хв, 70-72 ^оС).

Електрофорез та візуалізація продуктів ампліфікації. Продукти ПЛР-ампліфікації (10 мкл-аліквоту ПЛР-суміші) змішати з 2 мкл буфера для нанесення такого складу: 0,25 % (w/v) бромфеноловий синій, 0,25 % (w/v) ксиленцианол, 40 % (w/v) сахароза у воді. Фракціонувати в горизонтальному "підводному" 1,5 % агарозному гелі в 1 х ТВЕ-буфері (89 mM Трис-HCl pН 8,2; 89 mM борна кислота; 2 mM Na₃EДTA) при постійної напрузі 100 В за кімнатної температури. Електрофорез припинити згідно з довжиною пробігу ксиленцианолу. Одна доріжка гелю повинна містити зразок ДНК з відомою молекулярною масою (наприклад, маркер молекулярної маси pGEM). ДНК візуалізували бромистим етидієм (концентрація 1 мкг/мл) 10 хв.

Комп'ютерна обробка даних ПЛР-аналізу. Відеозображення електрофоретичних профілів ампліфікованої ДНК і оцінку довжини продуктів ампліфікації отримували за допомогою системи документування та аналізу гелів „Image Master VDS” ("AmershamPharmaciaBiotech", США) згідно інструкції користувача обладнання з використанням програмного забезпечення Image Master 1D Elite. Кластерний аналіз з графічною побудовою дендрограм здійснювали за допомогою комп'ютерної програми "TREES 4.0". Рівень поліморфізму оцінювали у відсотках як відношення поліморфних ПЛР-локусів до загального числа тих, що детектують, ПЛР-локусів:

P= n_p / n_p+n_np х 100 %,

де n_p - кількість поліморфних ПЛР-локусів, а n_np - кількість неполіморфних ПЛР-локусів.

Результати досліджень та їх обговорення. Дослідження внутрішньоштамової молекулярно-генетичної варіабельності F. moniliforme. Розроблено схеми дослідів для визначення часової стабільності культур штамів та мінливості у наслідок пасажів. Здійснювали відновлення патогенності колекційних штамів F. moniliforme var. lactis 94 m (Fm94m) і F. moniliforme var. lactis 34-17 (Fm34-17) шляхом «проведення» штамів «через рослину»: вирощували на субстраті з зерен контрастних за стійкістю до фузаріозу ліній кукурудзи Од 139 та R221A. Повітряний міцелій з поверхні зерен пересівали у чашки Петрі з середовищем Чапека та культивували в термостаті при температурі 24 ^оС 7, 14, 21 добу або здійснювали п'ять пасажів (культивували 14 діб).

У результаті ПЛР-аналізу ДНК, що виділена з отриманих культур штамів, спостерігали зміни їх електрофоретичних спектрів. ПЛР з праймером ОРВ-05 (5'-tgcgcccttc-3') дозволила виявити поліморфні фрагменти у спектрах різних варіантів штамів, відтворювані при повторних експериментах та ампліфікації. На рис. 1 наведено електрофореграму розподілу продуктів ампліфікації ДНК штаму Fmon94m (доріжка № 1) та його варіантів, які вирощували на зерні кукурудзи ліній Од139 та R221A протягом 7, 14 та 21 доби.

Виявлено, що при контакті штаму Fmon94m, що зберігався, із зернами стійкого до фузаріозу генотипу кукурудзи, спостерігається зміна в його ДНК-спектрі варіанту (Fmon94m/Од139), яка полягала у зникненні фрагменту в 1150 п.н. і появі фрагменту з молекулярною масою 1250 п.н. (рис. 1, доріжка 2) при порівнянні із спектрами ДНК Fmon94m з колекції і варіанту, який вирощений на сприйнятливому генотипі кукурудзи (Fmon94m/R221A). Профіль ДНК культури штаму Fmon94m/R221A залишився ідентичним спектру Fmon94m/R221A (рис. 1, дор. 1, 3). Семидобове культивування на середовищі Чапека показало, що ДНК культури Fmon94m/Од139/7 також мала фрагмент розміром 1250 п.н. і позбавлена фрагменту в 1150 п.н. (рис. 1, дор. 4). Спектр ДНК Fmon94m/R221A/7 (рис. 1, дор. 5) такий самий, як і в доріжках 1 та 3. Виснаження живильного середовища та відсутність вільного простору для росту міцелію є факторами, при яких настає «старіння» культур. Спектри ДНК, що виділена з 14-21-добових культур, при ПЛР-ампліфікації не мали фрагментів, що відрізнялися, у культур, вирощених на зернах як стійкого, так і сприйнятливого генотипів кукурудзи (рис. 1, дор. 6-9) і співпадали із спектром ДНК колекційного штаму. Дослідження ДНК культур слабкопатогенного штаму Fmon94m/R221A також дозволило виявити відтворювані поліморфні фрагменти молекулярною масою 1250 п.н. у культур, патогенні властивості яких відновлювали на стійкому (Од139) до фузаріозу генотипі кукурудзи. На відміну від культур F. moniliforme var. lactis 94m, культури F. moniliforme var. lactis 34-17 зберігали придбаний фрагмент впродовж усіх трьох термінів культивування.

При ПЛР-аналізі мінливості штамів унаслідок п'яти пасажів не виявлено змін у спектрі ампліфікованої ДНК культур (Fmon34-17/R221A і Fmon34-17/Од139) слабкопатогенного штаму Fmon34-17. Дослідження впливу пасажів на мінливість ДНК високопатогенного штаму дозволило виявити відмінності у спектрах ампліфікації його культур (Fmon94m/R221A і Fmon94m/Од139), що проявилось у появі та зникненні фрагментів ампліфікації розміром 2700 п.н., 1250 п.н. і 900 п.н. протягом трьох пасажів та стабілізації спектрів у четвертому, п'ятому пасажах.

Таким чином, встановлено, що при тривалому культивуванні та пасажах штамів F. moniliforme на різних за стійкістю генотипах кукурудзи та живильному середовищі (картопляному агарі) виявлені фазові переходи в генотипах дочірніх субкультур, які супроводжувалися оборотними геномними перебудовами при взаємодії із стійким генотипом рослини та стабілізацією ДНК-спектру, ідентичного вихідним штамам, при пасажах на живильному середовищі.

Молекулярно-генетична характеристика внутрішньовидового поліморфізму роду Fusarium. Еволюція фузаріїв тісно пов'язана із зміною субстрату, зокрема рослинного походження. При дослідженні генетичної варіабельності 31 штаму F. moniliforme, свіжовиділених з уражених зерен кукурудзи, за допомогою ДП-ПЛР-аналізу з використанням десяти довільних праймерів проведено диференціацію штамів. Спектри ДНК були унікальні для кожного штаму, відтворювані при повторних дослідах і включали від 8 до 17 компонентів. Середнє число ампліконів, що генеровані при ампліфікації ДНК кожного штаму, склало 6 на праймер. Загальна кількість різних за молекулярною масою смуг склала 95, з яких поліморфні 93. Мінімальні генетичні дистанції у вибірці штамів відмічено між зразками 11.2 та 11.3 (0,011), а максимальні - між 7.2 та 9.9 (0,496). Рівень поліморфізму склав 97,9 %, у протилежність рівню поліморфізму, який складав 49,4 %, вибірці з 18 штамів F. moniliforme, виділених з різних генотипів кукурудзи, але тривало зберігалися і багато разів пересівалися на штучних живильних середовищах. Низький рівень поліморфізму «старих» культур свідчить про збалансованість генотипового складу штамів в умовах певного температурного режиму та складу живильних речовин. Висока ступінь поліморфізму «свіжих» штамів може обумовлюватися конкуренцією за живильний субстрат та тиском захисних систем рослини-хазяїна.

Обробка даних ДП-ПЛР-аналізу за допомогою комп'ютерної програми "TREES 4.0" (кластерний аналіз та конструювання дендрограм) дозволила виявити, що при кластеризції «старих» штамів F. moniliforme не спостерігається закономірності угрупування зразків. На дендрограмі, що побудована за даними молекулярно-генетичного аналізу, «свіжих» штамів виявлено розподіл штамів у два кластери, які відповідають зразкам, що виділені з білозерних та жовтозерних форм кукурудзи, відповідно.

Усередині кластерів спостерігається угрупування у субкластери, які відобразили спорідненість штамів, ізольованих з певної рослини-хазяїна. Рівень поліморфізму у субкластерах варіював у діапазоні 64,5-72,7 %, що показує відносно слабку дивергенцію геномів штамів F. moniliforme в межах однієї рослини, з якої вони були ізольовані. В той же час, субкластери генетично віддалені один від одного, що, можливо, пов'язано зі спеціалізацію даних фітопатогенів до живильного субстрату рослини-господаря.

Таким чином, показано, що рівень молекулярно-генетичного поліморфізму штамів F. moniliforme тривало культивованих нижче (49,4 %), ніж свіжовиділених з ураженого матеріалу (98 %). Серед свіжовиділених штамів виявлено групування за спеціалізацією відносно білозерних/жовтозерних форм і індивідуальних генотипів кукурудзи.

ПЛР-аналіз внутрішньовидової варіабельності F. oxysporum. Молекулярно-генетичне дослідження внутрішньовидової різноманітності F. oxysporum var. orthoceras проводили на вибірці з 19 штамів шляхом ПЛР з довільними, ISSR- та RAPD-праймерами. Рівень поліморфізму штамів склав 78 %. Між кластеризацією штамів за даними профілювання ДНК, морфологічними характеристиками та рівнем патогенності не виявлено чітких асоціацій, хоч і спостерігається така тенденція при розгляді окремих кластерів. У дослідженнях Assigbetse та інш. (1994) встановлено внутрішньовидове різноманіття F. oxysporum f. sp. vasinfectum (46 ізолятів). Рівень поліморфізму серед них склав 55 %. Кластерний аналіз відобразив групування ізолятів в три кластери відповідно їх належності до рас і географічного походження, але угрупування штамів за рівнем патогенності не виявлено.

Використання IRAP-ПЛР з парою праймерів, що спрямовані на детекцію ретротранспозону skippy, дозволило отримати інформацію про зв'язок кластеризації штамів і наявності в їх геномах skippy-подібних послідовностей. Кластеризація за даними ДП-ПЛР-аналізу співпала з результатами IRAP-ПЛР, тобто з наявністю skp1/skp2-подібних фрагментів ретротранспозону skippy у складі геномів штамів. Показана наявність skp1/skp2-подібних фрагментів ретротранспозону skippy тільки в геномі представників F. oxysporum і відсутність їх у інших видів.

Таким чином, показано діапазон мінливості F. oxysporum при використанні в якості молекулярних маркерів послідовностей мобільних генетичних елементів (ретротранспозонів), які впливають на кількість і структуру ДНК, що повторюються, в геномах грибів.

Молекулярно-генетична характеристика міжвидового поліморфізму роду Fusarium. Досліджували вибірку з представників видів роду Fusarium, що належать до чотирьох секцій (Discolor, Elegans, Sporotrichiella, Roseum). Використовували вісім видів та різновиди фузарієвих грибів та один вид грибів з відділу Базидіоміцетів - Pleurotus ostreatus. Рівень поліморфізму між видами роду Fusarium склав 100 %, що демонструє генетичну відособленість кожного виду та узгоджується з поняттям генетичного критерію виду. У роботі Xu та інш. (2000) по вивченню міжвидової різноманітності, рівень поліморфізму між F. acuminatum, F. avenaceum, F. сulmorum та F. graminearum дорівнював 95 %, що свідчить про унікальність видових спектрів. Кластерний аналіз відобразив дійсне угрупування видів у секції і віддаленість відділу Базидіоміцетів від Аскоміцетів.

Таким чином, згідно величинам значень генетичних дистанцій між видами роду Fusarium показана генетична відособленість видів і групування їх в таксономічні секції.

Розробка системи ПЛР-детекції грибів роду Fusarium, видів F. graminearum, F. moniliforme var. lactis та генів токсиноутворення в інфікованому зерні кукурудзи та продуктах його переробки. Розробка надійної, ефективної системи детекції фузарієвих грибів, зокрема, детекції на основі ПЛР та впровадження її у якості діагностуючого інструменту в рослинництві та харчової промисловості для виявлення фузаріозного ураження є актуальним, внаслідок збільшення втрат урожаїв та погіршення якості харчової продукції через фузаріоз. У основі методу ПЛР-детекції фузаріїв лежить ампліфікація ділянок геному, специфічних для роду Fusarium, видів F. moniliforme, F. graminearum та генів токсиноутворення (tri5, tri6 чи fum5) в розчині ДНК зразків зерна, що тестують. Наявність фрагментів ампліфікації ДНК певного розміру - 431 п.н., 561 п.н., 896 п.н., 845 п.н., 596 п.н., 544 п.н., оцінювали як факт, що свідчить про присутність інфекції в дослідному матеріалі, - безпосередньо представники роду Fusarium, види F. moniliforme або F. graminearum та tri5, tri6, fum5-гени токсиноутворення, відповідно.

Оптимізація етапів системи ПЛР-детекції. У процесі розробки ДНК-технології детекції фузарієвих грибів здійснено добір інформації про послідовності специфічних молекулярних маркерів, проведено багатоступеневу оптимізацію умов ПЛР з праймерами, що добрані для детекції роду, видів та генів токсиноутворення на модельних об'єктах (чистих культурах грибів роду Fusarium) шляхом визначення оптимальної температури відпалу праймерів, концентрації ДНК, концентрації праймерів, кількості ДНК-полімерази Taq, складу ПЛР-буфера.

Визначено чутливість системи на всіх етапах відносно «пошуку» і відпалу на унікальних сайтах, що виражено в кількісному співвідношенні грибної ДНК до ДНК кукурудзи в дослідних зразках: для родоспецифічної детекції найменший вміст ДНК фузаріїв у порівнянні зі вмістом ДНК кукурудзи відповідає 10^-5-кратному розведенню (ДНК роду Fusarium в сто тисяч разів менше, у порівнянні з кількістю ДНК кукурудзи), для детекції виду F. moniliforme достатньо меншої в сто разів кількості грибної ДНК в суміші з фоновою ДНК кукурудзи, при детекції видів F. graminearum та tri5, tri6, fum5-генів токсиноутворення, які відповідають за синтез трихотеценів та фумонізину, відповідно - в 1000 разів меншої кількості, ніж ДНК кукурудзи. Високий рівень чутливості методу ПЛР-детекції дозволяє виявити наявність патогена у випадках безсимптомної інфекції і на ранніх стадіях ураження.

Для перевірки специфічності детекції використовували ДНК представників роду Fusarium (F. gibbosum, F. graminearum, F. culmorum, F. macroceras, F. moniliforme, F. oxysporum F. sporotrichiella), ДНК грибів роду Saccharomyces (S. vini) і ДНК кукурудзи (Zea mays L.) з молекулярними маркерами до роду та видів. В результаті електрофорезу продуктів ПЛР родо- та видоспецифічні фрагменти спостерігали тільки у зразках ДНК, що належали безпосередньо до роду Fusarium, видів F. moniliforme чи F. graminearum. При ПЛР-аналізі ДНК інших видів продукти ампліфікації були відсутні. На вибірці з шести колекційних токсинопродукуючих зразків грибів роду Fusarium перевірено специфічність молекулярних маркерів до генів токсиноутворення tri5, tri6, fum5.

Система ПЛР-детекції фузарієвих грибів. Пропонований спосіб ПЛР-детекції фузаріозного ураження уявляє трьохступеневу систему, яка містить такі етапи: детекція безпосередньо роду Fusarium, детекція видів (F. moniliforme та/або F. graminearum), детекція генів токсиноутворення (tri5, tri6 та/або fum5).

Розробка ПЛР-детекції фузаріїв на рівні роду є першим кроком системи, оскільки при фузаріозі виявляють як основний патогенний вид, так і присутність супутніх, які при зміні зовнішніх умов можуть стати переважаючими, що обумовлює потрібність визначення наявності патогена взагалі. Видова ідентифікація важлива для оцінки динаміки розвитку популяцій при зміні зовнішніх умов. Детекція наявності потенційних токсинопродуцентів дозволить зменшити ризик отруєння людей і тварин мікотоксинами, що знаходяться в інфікованій харчової продукції та кормах.

Приклади використання. Аналізу підлягали зразки кукурудзяної крупи, пластівців та консервованої кукурудзи різних вітчизняних виробників. У дослідних зразках крупи не виявлено фрагментів родоспецифічної ампліфікації, що свідчило про відсутність інфекції та високу якість продукції. При скринінгу зразків пластівців спостерігали наявність фузаріїв, що було виражено у вигляді утворення продуктів родо- та видоспецифічної (F. moniliforme) ампліфікації і відсутність генотипоспецифічної ампліфікації. Тестування консервованої кукурудзи дозволило виявити наявність інфекції на всіх трьох стадіях детекції: по-перше, на рівні роду; по-друге, на рівні виду F. graminearum; по-третє, наявність гену tri5.

При аналізі насіння кукурудзи, що використовують у селекційних роботах, рекомендовано здійснення детекції грибів на рівні роду і, у разі виявлення родоспецифічної ампліфікації, проведення подальшого ПЛР-аналізу з використанням видо- та генотипоспецифічних молекулярних маркерів для визначення динаміки розвитку популяцій фузаріїв і для виявлення наявності потенційних токсинопродуцентів, відповідно. Етап видової ідентифікації можна виключити у випадку детекції фузаріїв у харчових виробах, оскільки при цьому важливо виявлення ураження взагалі на рівні роду та генів токсиноутворення.

Таким чином, розроблено трьохступеневу систему діагностики фузаріозу сільськогосподарських рослин за ДНК-типуванням. Система ПЛР-детекції фузарієвих грибів є допоміжним методом діагностики фузаріозу, який дозволить проводити скринінг дослідного матеріалу на наявність інфекції за короткі терміни в зразках як з явною, так і з прихованою інфекцією, завдяки високому рівню чутливості та специфічності відносно ДНК об'єкту-мішені, і може використовуватись для проведення оцінки мікробіологічних ризиків (наявність, доза і поширеність інфекції) в таких об'єктах: у живих рослинах на різних стадіях онтогенезу, у зерні при закладці на зберігання і при різних термінах зберігання (для визначення динаміки розвитку інфекції), у зерні перед посівом, у ґрунті, а також для контролю якості харчових виробів та кормів рослинного походження.

ВИСНОВКИ

1. При тривалому культивуванні та пасажах штамів F. moniliforme на різних за стійкістю генотипах кукурудзи і живильному середовищі (картопляному агарі) виявлені фазові переходи в генотипах дочірніх субкультур, які супроводжувалися оборотними геномними перебудовами при взаємодії із стійким генотипом рослини і стабілізацією ДНК-спектру, ідентичного вихідним штамам, при пасажах на живильному середовищі.

2. Рівень молекулярно-генетичного поліморфізму тривало культивованих штамів F. moniliforme нижче (49,4 %), ніж свіжовиділених з ураженого матеріалу (98 %). Серед свіжовиділених штамів виявлене групування за спеціалізацією відносно білозерних/жовтозерних форм і індивідуальних генотипів кукурудзи.

3. Показано діапазон мінливості F. oxysporum при використанні в якості молекулярних маркерів послідовностей мобільних генетичних елементів (ретротранспозонів), які впливають на кількість і структуру ДНК, що повторюються, в геномах грибів.

4. Згідно величинам значень генетичних дистанцій за даними ПЛР-аналізу, між видами роду Fusarium показана генетична відособленість видів і групування їх в таксономічні секції.

5. На основі дослідження консервативних ділянок геномів фузарієвих грибів розроблена система їх детекції в рослинному матеріалі і продуктах його переробки.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Розуміння процесів та причин молекулярно-генетичної мінливості фітопатогенних грибів, які інфікують сільськогосподарські культури, є важливим для створення стійких до захворювань ліній та гібридів, здатних довгий час зберігати стійкість в поєднанні з комплексом господарський цінних ознак.

2. Знання генетичної різноманітності фузарієвих грибів даного географічного регіону і динаміки їх мінливості дозволить прогнозувати та контролювати епідеміологічну картину при зберіганні зерна та продуктів його переробки.

3. Система експрес-ПЛР-детекції є точною, швидкою та відносно дешевою для виявлення інфекції та визначення збудника і, тому рекомендується для тестування врожаю перед закладкою на зберігання, перед висівом в полі, для встановлення рівня забрудненості харчових та кормових продуктів рослинного походження.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Дерев'янко О. (Захарова О.) Молекулярно-генетичний аналіз популяцій Fusarium spp. південного регіону України / О. Дерев'янко, Н. Кожухова, О. Бабаянц, Ю. Сиволап // Вісник ОНУ. - 2004. - Т. 9, вип. 5, № 1. - С. 105-112.

2. Дерев'янко О. О. (Захарова О. О.) ПЛР-аналіз внутрішньовидового поліморфізму Fusarium oxysporum v. оrthoceras / О. О. Дерев'янко, А. П. Луцик, О. В. Бабаянц, Н. Е. Кожухова, Ю. М. Сиволап // Вісник українського товариства генетиків і селекціонерів. - 2006. - Том 4, № 1. - С. 12-20.

3. Деревянко О. А. (Захарова О. А.) Молекулярные маркеры геномов фузариев для определения инфицированности зерна кукурузы / О. А. Деревянко, Н. Э. Кожухова, Ю. М. Сиволап // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. праць. - 2006.- Т. 3. - С. 93-97.

4. Кожухова Н. Е. Молекулярно-генетична ідентифікація мікотоксигенних фузаріїв / Н. Е. Кожухова, О. О. Захарова, Ю. М. Сиволап // Одеський медичний журнал. - 2007. - Вип. 104, № 6. - С. 54-56.

5. Захарова О. А. Генетическая вариабельность Fusarium moniliforme Sheldon, поражающего зерна кукурузы / О. А. Захарова, М. Б. Вареник, Н. Э. Кожухова, Ю. М. Сиволап // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: Зб. наук. праць. - К.: Логос, 2007.- Т. 1. - С. 40-44.

6. Кожухова Н. Е. ДНК-маркери в насінництві кукурудзи / Н. Е. Кожухова, О. О. Захарова // Наукові праці Південного філіалу «Кримський агротехнологічний університет» НАУ. - 2008. - Вип. 107. - С. 142-144.

7. Захарова О. О. ПЛР-аналіз мінливості геному та розробка технології ідентифікації грибів роду Fusarium / О. О. Захарова, Н. Е. Кожухова, Ю. М. Сиволап // Мікробіологія та біотехнологія. - 2008. - Вип. 3, № 2. - С. 48-53.

8. Пат 17730. Україна, Спосіб експрес-детекції Fusarium moniliforme Sheldon var. lactis (Pirotta et Riboni) Bilai у зерні кукурудзи / Сиволап Ю. М., Кожухова Н. Е., Захарова О.О.; Південний біотехнологічний центр в рослинництві; заявл. 31.03.2006; опубл. 16.10.2006. Бюл. № 5 - 6 с.

9. Сиволап Ю. М. Молекулярно-генетична детекція грибів роду Fusarium у зерні кукурудзи (Zea mays L.). Методичні рекомендації / Ю. М. Сиволап, Н. Е. Кожухова, О. О. Захарова - Одеса, 2007. - 8 с.

10. Дерев'янко О. О. (Захарова О. О.) ПЛР-аналіз молекулярно-генетичної різноманітності популяції грибів Fusarium moniliforme var. lactis / О. О. Дерев'янко, Н. Е. Кожухова, Ю. М. Сиволап // Засади сталого розвитку аграрної галузі: Матеріали Всеукраїнської конференції молодих вчених. Київ, 28-30.10.2002 р. - Київ, 2002. - С. 63-64.

11. Деревянко О. А. (Захарова О. А.) ПЛР-анализ межвидового полиморфизма грибов рода Fusarium / О. А. Деревянко // Биология - наука ХХI века: Матеріали 7-ої Пущинської школи-конференції молодих учених. Пущино, Росія, 14-18.04.2003 р. - Пущино, 2003. - С. 328.

12. Деревянко О. А. (Захарова О. А.) Анализ молекулярно-генетического полиморфизма грибов рода Fusarium / О. А. Деревянко, Н. Э. Кожухова, Ю. М. Сиволап // Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений: 2-а Міжнародна конференція молодих учених. Харків, 19-23.05.2003 р. - Харків, 2003. - С. 26-27.

13. Деревянко О. А. (Захарова О. А.) Молекулярно-генетическое изучение фузариев, поражающих кукурузу / О. А. Деревянко, Н. Э. Кожухова, Ю. М. Сиволап // Геном растений: IV Міжнародна конференція. Одеса, 10-13.06.2003 р. - Одеса, 2003. - С. 15.

14. Дерев'янко О. О. (Захарова О. О.) Генетична мінливість мікроскопічних грибів Fusarium moniliforme Sheldon південного регіону України / О. О. Дерев'янко, Г. Ю. Шевчук, Т. В. Гудзенко // Х з'їзд Товариства мікробіологів України: тези доповідей. Одеса, 15-17.09.2004 р. - Одеса, 2004. - С. 341.

15. Деревянко О. А. (Захарова О. А.) Молекулярно-генетический полиморфизм Fusarium moniliforme var. lactis южного региона Украины / О. А. Деревянко, Н. Э. Кожухова, Ю. М. Сиволап // Молекулярная генетика, геномика и биотехнология: Міжнародна наукова конференція. Мінськ, Білорусь, 24-26.11.2004 р. - Мінськ, 2004. - С. 330-331.

Особистий внесок здобувача 80 % - проведено ПЛР-аналіз «свіжовиділених» ізолятів, сконструйовано дендрограму, визначено перевагу фузарієвих грибів виду F. moniliforme у живильних речовинах, що знаходяться у білозерної кукурудзі.

16. Деревянко О. А. (Захарова О. А.) ПЦР-анализ изменчивости генотипов Fusarium moniliforme Sheldon вследствие серии пассажей / О. А. Деревянко, А. Ю. Шевчук, Ю. М. Сиволап // 9-а Міжнародна Пущинська школа-конференція молодих учених. Пущино, Росія, 18-22.04.2005 р. - Пущино, 2005. - С. 18-19.

17. Деревянко О. А. (Захарова О. А.) ПЛР-анализ молекулярно-генетической изменчивости культур штаммов Fusarium moniliforme Sheldon / О. А. Деревянко, А. Ю. Шевчук, Ю. М. Сиволап // Современные проблемы генетики: Міжнародна наукова конференція. Мінськ, Білорусь, 17-18.11.2005 р. - Мінськ, 2005. - С. 81.

18. Деревянко О. А. (Захарова О. А.) Молекулярно-генетическая характеристика популяций Fusarium Южного региона Украины / О. А. Деревянко, Г. Д. Попелюк, Н. Э. Кожухова, Ю. М. Сиволап // 10-а Пущинська школа-конференція молодих учених, присвячена 50-річчю Пущинського наукового центру РАН. Пущино, Росія, 17-21.04.2006 р. - Пущино, 2006. - C. 15.

19. Хилюк Е. С. Оценка временной стабильности культур штаммов Fusarium moniliforme с помощью ПЦР-анализа / Е. С. Хилюк, О. А. Захарова, Ю. М. Сиволап // Мікробні біотехнології: Міжнародна наукова конференція, присвячена 140-річчю з дня народження Д. К. Заболотного. Одеса, 11-15.09.2006 р. - Одеса, 2006. - С. 33.

20. Попелюк Г. Д. ПЦР-детекция Fusarium graminearum в зерне кукурузы / Г. Д. Попелюк, О. А. Захарова, Н. Э. Кожухова, Ю. М. Сиволап // Мікробні біотехнології: Міжнародна наукова конференція, присвячена 140-річчю з дня народження Д. К. Заболотного. Одеса, 11-15.09.2006 р. - Одеса, 2006. - С. 23.

21. Zakharova O. Express-detection systems development of fungi in maize food products / O. Zakharova, K. Hiluk, A. Trigub, G. Popeluk, E. Talashova, N. Kozhukhova, Yu. Sivolap // Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution.: III International Young Scientists conference. Odessa, 15-18.05.2007. - Одеса, 2007. - С. 233.

22. Захарова О. О. ПЛР-діагностика фузаріозу у зерні кукурудзи та кукурудзяних харчових виробах / О. О. Захарова, К. С. Хілюк, А. В. Тригуб, О. В. Талашова, Н. Е. Кожухова, Ю. М. Сиволап // Актуальные проблемы иммунитета и защиты сельскохозяйственных культур от болезней и вредителей: Міжнародна науково-практична конференція. Одеса, 11-14.09.2007 р. - Одеса, 2007. - С. 36-37.

23. Звездін Г. Молекулярно-генетичний поліморфізм Fusarium gibbosum var. acuminatum / Звездін Г., Захарова О. // Молодь і поступ біології: V міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів. Львів, 12-15.05.2009 р. - Львів, 2009. - Т. 2. - С. 114-115.

Размещено на Allbest.ru