Наукове обґрунтування і удосконалення генетичних методів дослідження раннього ембріогенезу сільськогосподарських тварин

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ РОЗВЕДЕННЯ І ГЕНЕТИКИ ТВАРИН

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

03.00.15 - генетика

НАУКОВЕ ОБҐРУНТУВАННЯ І УДОСКОНАЛЕННЯ ГЕНЕТИЧНИХ МЕТОДІВ ДОСЛІДЖЕННЯ РАННЬОГО ЕМБРІОГЕНЕЗУ СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКИХ ТВАРИН

КОВТУН СВІТЛАНА ІВАНІВНА

с. Чубинське Київської області - 2008

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

генетика ембріогенез сільськогосподарський тварина

Актуальність теми. Генетика розвитку, яка є широкою, багатоплановою галуззю науки, поєднує в собі розробки молекулярної біології, експериментальної ембріології, цитогенетики. Цитогенетичні, молекулярно-біологічні аспекти оогенезу, сперматогенезу і раннього ембріогенезу ссавців, без яких неможливе вивчення контролюючих механізмів розвитку, розпочали інтенсивно розвиватися з 70-х років ХХ століття (Астауров Б.К., 1972; Дибан А.П., 1974).

Поглиблені дослідження з ембріологічної генетики створили передумови для запровадження сучасних біотехнологічних методів у практику відтворення тварин. З метою підвищення і ефективного використання їх генетичного потенціалу необхідно вивчати складний процес індивідуального розвитку організму від запліднення яйцеклітини, розвитку ембріону і протягом життя, який проходить відповідно до успадкованого генотипу (Свєчин К.Б., 1967, Буркат В.П., 2000, 2006; Кузнєцов В.Є., 2001; Эрнст Л.К., 2001; Brьssow K.P., 2000; Machбty Z. et al., 2002).

Морфологічний та молекулярно-генетичний аналіз реалізації генетичної інформації в ранньому ембріогенезі in vitro є ефективним методом вирішення багатьох питань генетики розвитку (Кузнєцов В.Є., 1997). Зокрема, набуває важливого значення вивчення закономірностей перетворень хроматину in vitro в мейозі ооцитів для реалізації генетичної інформації в процесі ембріогенезу in vitro. Привертають увагу технологічні аспекти ембріологічної генетики сільськогосподарських тварин для контролю запліднювальної здатності сперматозоїдів плідників під час формування ембріонів in vitro.

Вивчення мейотичних та мітотичних перетворень хроматину гамет та ембріонів сільськогосподарських тварин ґрунтується на цитогенетичних методах. Комплексний морфогенетичний аналіз забезпечує оцінку біологічної повноцінності розвитку in vitro ембріонів і дає змогу встановити закономірності генетичних процесів у ранньому ембріогенезі.

Вивчення хромосом під час гаметогенезу та на останніх стадіях раннього ембріогенезу є одним із ефективних підходів до пізнання механізмів реалізації генетичної інформації індивідуального розвитку. Існують проблеми підвищення життєздатності зародків після маніпулювання з ними поза організмом. На вирішення цих питань було спрямовано дослідження дисертаційної роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася як складова частина науково-дослідних робіт Інституту розведення і генетики тварин УААН за темами: «Розробити та удосконалити новітні біотехнологічні методи тиражування та конструювання бажаних генотипів сільськогосподарських тварин» (№ держреєстрації 0101U003121); чотирьох завдань підпрограми 2 НТП УААН «Сільськогосподарська біотехнологія 2006 - 2010» (№№ держреєстрації 0107U005155, 0107U005152, 0107U005153, 0106U005839), програми «Збереження генофонду сільськогосподарських тварин» (№ держреєстрації 0106U005845).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було теоретично обґрунтувати і експериментально відпрацювати методологію комплексного аналізу реалізації генетичної інформації в ранньому ембріогенезі in vitro в системі біотехнологічної селекції сільськогосподарських тварин. Для її вирішення були поставлені наступні завдання:

встановити морфогенетичні закономірності мейотичних змін хроматину в ооцитах корів і свиней in vitro;

в процесі розвитку ембріонів in vitro проаналізувати особливості реалізації генетичної інформації в разі використання епідидимальних сперматозоїдів самців та додавання наноматеріалів;

розробити технологію ембріогенетичної оцінки запліднювальної здатності плідників під час формування ембріонів in vitro;

вдосконалити методи кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів кнурів та обґрунтувати перспективи їх використання для збереження генофонду свиней;

визначити шляхи комплексного застосування методів генетики розвитку для реалізації завдань біотехнологічної селекції.

Об'єкт дослідження - генетичні процеси і закономірності раннього ембріогенезу сільськогосподарських тварин.

Предмет дослідження - динаміка генетичних змін хроматину ооцитів ссавців у мейозі, генетичні механізми запліднення in vitro яйцеклітин, раннього ембріогенезу тварин та розвитку зародків поза організмом.

Методи дослідження - цитогенетичний (аналіз стану хромосомних перетворень під час дозрівання гамет самок та розвитку зародків поза організмом), генетики розвитку (дослідження in vitro гамет сільськогосподарських тварин, дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів корів і свиней), експериментальної ембріології (культивування ембріонів великої рогатої худоби і свиней поза організмом), хімії поверхні (оцінка ефективності використання наноматеріалів), біотехнологічні (нехірургічне вилучення і трансплантація ембріонів великої рогатої худоби), біометричний (статистичний аналіз одержаних результатів).

Наукова новизна роботи. Вперше науково обґрунтовано концепцію і експериментально доведено доцільність комплексного застосування методів генетики розвитку в ранньому ембріогенезі тварин для інтенсифікації селекційного процесу з підвищення генетичного потенціалу великої рогатої худоби і свиней, а також для збереження їх генофонду. Вперше розроблено систему використання методів ембріологічної генетики для удосконалення біотехнологічного маніпулювання із ембріонами сільськогосподарських тварин.

Встановлено, що використання наноматеріалів, які синтезовані на основі високодисперсного кремнезему, вуглеводів та білка, оптимізують середовища для формування in vitro ембріонів свиней, а також для кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів кнурів. Вперше застосовано комплексне визначення запліднювальної здатності сперматозоїдів плідників за результатами формування in vitro ембріонів великої рогатої худоби та свиней. На прикладі трансплантації ембріонів сірої української породи доведено доцільність застосування детального цитогенетичного аналізу зародків під час їх нехірургічного одержання.

Практичне значення одержаних результатів. Спосіб комплексного аналізу запліднювальної здатності сперматозоїдів бугаїв і кнурів за результатами формування ембріонів поза організмом забезпечує об'єктивність оцінки відтворювальної здатності плідників.

Детальну цитогенетичну оцінку ембріонів у взаємозв'язку із морфологічним станом застосовано в разі виконання робіт з трансплантації ембріонів.

Для збереження генофонду свиней та великої рогатої худоби використовувати епідидимальні сперматозоїди кнурів та бугаїв з метою довготривалого збереження генетичного матеріалу.

Матеріали наукових досліджень використані у навчальному процесі Інституту природничо-географічної освіти та екології Національного педагогічного університету ім. М. Драгоманова, Національного аграрного університету, Харківського державного технічного університету сільського господарства Міністерства аграрної політики України, Національного технічного університету «Київський політехнічний інститут» (факультет біотехнології і біотехніки). На Міжнародній виставці «БІО 2006» (квітень, 2006 р., м. Чикаго, США) результати досліджень з вивчення генетичних закономірностей раннього ембріогенезу ссавців увійшли до презентації сучасних біотехнологічних розробок України.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом розроблені концептуальні підходи аналізу наукових першоджерел, огляду літератури і результатів в контексті робіт з цитогенетики та генетики розвитку у тваринництві. Розроблена схема і методика проведення досліджень та виконана експериментальна програма запланованих робіт, які задокументовані мікрофотографіями.

Досліди з вивчення ефективності впливу наноматеріалів на перебіг ембріогенезу свиней in vitro, кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів кнурів виконані спільно із співробітниками Інституту хімії поверхні НАНУ під керівництвом канд. біол. наук Н.П. Галаган. Частина практичної роботи, пов'язана із трансплантацією ембріонів великої рогатої худоби, виконана спільно із спеціалістом атестованої лабораторії племзаводу «Більшовик» (Донецька область) О.В. Дувановим.

Апробація результатів дисертації. Матеріали виконаної роботи викладено в доповідях на наукових конференціях молодих вчених та аспірантів і щорічних творчих дискусіях Інституту розведення і генетики тварин УААН (Чубинське, 2003 - 2007), конференціях молодих вчених і спеціалістів: «Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні» (Київ, 2002), «Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики» (Львів, 2002, 2004).

Результати досліджень доповідалися на міжнародних науково-практичних конференціях, з'їздах:

- «Тваринництво України: селекція, технологія, ветеринарна безпека, економіка, виробництво екологічно чистих продуктів» (Суми, 2002);

- «Фактори експериментальної еволюції організмів» (Алушта, 2003, 2008);

- «Трансплантація ембріонів як інструмент селекції в новому тисячолітті» (Київ, 2004);

- «Актуальні проблеми розвитку тваринництва, ветеринарної медицини, харчових технологій, економіки та освіти» (Львів, 2004);

- «Наноматеріали в хімії, біології та медицині» (Київ, 2005);

- «Тваринництво ХХІ століття: новітні технології, досягнення і перспективи» (Харків, 2006);

- «Нанорозмірні системи. Будова - властивості - технології» (Київ, 2007);

- «Сучасні методи репродукції сільськогосподарських тварин: стан і перспективи розвитку» (Харків, 2008);

- X Український біохімічний з'їзд (Харків, 2006);

- VІІІ з'їзд українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова (Алушта, 2007);

- 2-й з'їзд Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007).

Результати досліджень були оприлюднені під час презентації сучасних біотехнологічних розробок в Україні на Міжнародній виставці «БІО 2006» (м. Чикаго, США), а також на зарубіжних міжнародних науково-практичних конференціях: «Научное наследие П.Н. Кулешова и современное развитие зоотехнической науки и практики животноводства» (Москва, 2004), «Научные проблемы производства продукции животноводства и улучшения ее качества» (Брянськ, 2004), «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 2006), «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (Московская обл., п. Дубровицы, 2006), «Достижения и перспективы развития животноводства» (Кишинев, 2006), «Актуальные проблемы биологии и воспроизводства животных» (Московская обл., п. Дубровицы, 2007), ІХ Польсько-Українському Симпозіумі «Теоретичні і експериментальні дослідження міжфазних явищ та їх технологічні застосування» (Польща, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 51 статтю у наукових журналах, збірниках наукових праць (з них - 38 у фахових виданнях), матеріалах і тезах конференцій, в методичних рекомендаціях і двох матеріалах творчих дискусій, двох монографіях, 1 патент. Робота «Розробка та впровадження сучасних генетико-біотехнологічних методів в практику тваринництва України» (автори - Ковтун С.І., Стоянов Р.О., Жернокльов Г.В.) відзначена Премією Президента України для молодих вчених за 2004 рік.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалу та методики досліджень, 6 розділів результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків і практичних пропозицій. Роботу викладено на 302 сторінках. Ілюстративний матеріал представлений 23 таблицями і 56 рисунками. Список літератури містить 407 джерел, з яких 218 іноземних.

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження виконували в лабораторії клітинної інженерії Інституту розведення і генетики тварин УААН, на базі приватних сільськогосподарських підприємств «Пісківське» Чернігівської області та «Шевченківське» Київської області, племінних заводів «Трубізький» Київської області та «Більшовик» Донецької області, товариства з обмеженою відповідальністю (ТОВ) «Голосієво» за схемою (рис.1) на поголів'ї 252 корів різних порід і 152 свиней породи велика біла.

Для одержання ооцит-кумулюсних комплексів на бойні відбирали яєчники від гінекологічно здорових корів і свиней. Видалення комплексів з антральних фолікулів яєчників корів та свиней здійснювали шляхом розсічення фолікулів лезом бритви, вирізання окремих антральних фолікулів або групи фолікулів з наступним розриванням їх скальпелем одноразового використання і застосовували метод аспірації фолікулів.

Видалення ооцит-кумулюсних комплексів, їх відбір та постановку на дозрівання, запліднення і подальше культивування здійснювали у стерильних умовах боксу. Гамети корів культивували in vitro протягом 24 годин в пластикових чашках Петрі (25 - 30 клітин у 1мл) у середовищі для дозрівання - 199 на розчині Ерла (Sigmа, M 5017), яке доповнювали 20 % інактивованої нагріванням (56C, 30 хв.) еструсної сироватки крові корів власного приготування, 0,068 мг/мл канаміцин сульфату, 0,11 мг/мл пірувату натрію і 0,1 мг/мл глутаміну і 3 - 5 х 10⁶ клітин гранульози на мл, які вилучали із неатретичних фолікулів.

Ооцити свиней дозрівали in vitro протягом 46 год. в чашках Петрі по 20 шт. в 2 мл середовища для дозрівання як і для корів, але крім 20 % ЕС додавали в окремих дослідах 20 % ФСТ (фетальна сироватка теляти, Sigma, F 9665). Культивування проводили за температури +38,8єС у присутності 5 % СО₂. Під час дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсні комплекси свиней ділили на три групи:

- середовище для дозрівання - І група;

- середовище для дозрівання з 0,1 % ВДК 200єC або 0,1 % ВДК 400єC - ІІ група;

- середовище для дозрівання з 0,01 % ВДК 200єC або 0,01 % ВДК 400єC - ІІІ група.

Дозрілі in vitro яйцеклітини корів осіменяли замороженими еякульованими сперматозоїдами і сперматозоїдами, які одержували із хвостової частини придатків сім'яників (епідидиміси) статевозрілих самців. Яйцеклітини свиней осіменяли еякульованими або кріоконсервованими епідидимальними сперматозоїдами плідників (Ковтун С.І. та ін., 2005).

Капацитовані поза організмом сперматозоїди бугаїв та ооцити корів спільно інкубували в середовищі TALP-IVF з додаванням суміші ПГЕ (20 мкМ пеніциламіну (Sigma, P 4875), 10 мкМ гіпотаурину (Sigma, H 1384) та 1 мкМ епінефрину (Sigma, E 4250)) протягом 18 год. з концентрацією рухливих сперматозоїдів 1,5 - 2,0 х 10⁶ сперматозоїдів/мл та температурі 38,5С і 5 % СО₂ в атмосфері повітря і рН 7,8.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Загальна схема досліджень

Спільну інкубацію гамет свиней проводили протягом 4 год. з використанням вищезгаданих умов та середовища з добавками, але з концентрацією сперматозоїдів кнура 250 тис. клітин на 1 мл. Концентрацію гамет визначали за допомогою камери Горяєва (Ожин Ф.В. и др., 1983). Ембріони великої рогатої худоби культивували в середовищі 199 на розчині Ерла з 10 % ФСТ, а зародки свиней - з використанням середовища NCSU-23 (Gajda B., 1998).

Свиноматок осіменяли за «Інструкцією із штучного осіменіння свиней» (2003) та методикою з обробки сперми кнурів в умовах ферми фірми «Minitьb». Епідидимальні сперматозоїди, які заморожені у формі відкритих гранул (0,2 мл з 250 млн. гамет), використовували в кількості 15 шт. в 100 мл розбавника «Біоконсан» (автор. свідоцтво №82839 Держкомвинаходів СРСР) на одне осіменіння. В разі нефракційного способу осіменіння підготовлені сперматозоїди вводили в статеві шляхи свиноматок за один прийом з допомогою приладу ПОС - 5.

Підготовку корів до вимивання ембріонів та їх трансплантації проводили згідно відомих методик (Антонюк В.С., 2004; Сергеев Н.И., 2008). У оброблених тварин (середовище PBS; Sigma, D 5652 з додаванням 0,075 мг/мл канаміцин сульфату) ембріони вимивали на 7-й день після осіменіння; проводили їх морфологічну та цитогенетичну оцінку і наступну нехірургічну пересадку ембріонів. Кріоконсервовані зародки голштинської породи німецької селекції трансплантували синхронізованим за статевим циклом телицям-реципієнтам методом «прямої пересадки».

Одержані зародки великої рогатої худоби промивали в середовищі Дюльбеко (PBS, Sigma, D-5652) з додаванням 0,075 мг/мл канаміцин сульфату з 20 % ФСТ і морфологічно оцінювали. Надшвидке заморожування проводили у 0,25 мл пайєтах в розчині ЕФС40 (40 % етиленгліколю, 18 % фіколу 70 і 0,3 М сахарози в PBS з 20 % ФСТ (Ковтун С.І., Щербак О.В., 2005). Для одержання диференційного С-забарвлення мітотичних хромосом ембріонів великої рогатої худоби з метою виявлення локалізації гетерохроматину та ідентифікації Y-хромосоми використовували методику Б. Ейвері (Avery B. et al., 1991) в нашій модифікації (Кузнєцов В.Є. та ін., 2001).

Для визначення статі зародків тестування продуктів ампліфікації після проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) проводили в 2%-му агарозному гелі з наступним їх фарбуванням в розчині бромистого етидію. Візуалізацію здійснювали на трансілюмінаторі в ультрафіолетовому світлі з наступним фотографуванням електрофореграм. Диференціацію ампліконів за розмірами проводили за допомогою маркера молекулярної ваги DNA-Lаdder 50bp («Fermentas»).

Хромосомні порушення під час дозрівання ооцитів in vitro та аналіз стану хроматину ядер ембріонів виявляли шляхом оцінки сухоповітряних препаратів, які готували за допомогою модифікованого методу А. Тарковського (Tarkowski A.K., 1966). Препарати фарбували з використанням 2%-го розчину барвника Гімза і аналізували їх під світловими мікроскопами Jenaval, Carl Zeiss з фотовиводом «Axiostar Plus».

Статистичну обробку одержаних даних проводили за допомогою біометричних методів (Лакин Г.Ф., 1990).

ПОРІВНЯЛЬНИЙ МОРФОГЕНЕТИЧНИЙ АНАЛІЗ ДОЗРІВАННЯ IN VITRO ООЦИТІВ КОРІВ І СВИНЕЙ

Цитогенетична оцінка незрілих ооцитів корів і свиней та динаміка змін стану хроматину за період дозрівання їх in vitro. На цитогенетичних препаратах ооцитів, які вилучені із антральних фолікулів яєчників корів і свиней, вивчали стан мейотичних хромосом. Для цього на основі морфологічної оцінки розподіляли популяцію ооцит-кумулюсних комплексів на три групи: 1 - із щільним кумулюсом, неушкодженою прозорою оболонкою та гомогенною невакуолизованою ооплазмою правильної округлої форми; 2 - із розпушеним кумулюсом та однорідною ооплазмою; 3 - атретичні ооцит-кумулюсні комплекси (денудовані, або з малою кількістю кумулюсних клітин, неоднорідною ооплазмою). Оскільки оцінка структури хроматину ооцитів ссавців можлива лише під час аналізу цитогенетичних препаратів, зажиттєвий зовнішній вигляд кумулюсних клітин та структура ооплазми вказують на здатність ооцитів до їх дозрівання in vitro.

Встановлено, що всі досліджувані гамети (40 шт.) 1-ї групи ооцитів корів і 97,7 % ооцитів свиней (88 шт.) перебувають на стадії диплотени мейозу і лише 7,5 % та 3,4 % диплотенних хромосом корів та свиней відповідно виявляли ознаки дегенерації. Цим обґрунтовується доцільність добору саме таких ооцит-кумулюсних комплексів для культивування поза організмом з метою одержання зародків сільськогосподарських тварин in vitro.

В 2-й та 3-й групах ооцит-кумулюсні комплекси корів і свиней хоча і мали максимальну кількість клітин на стадії диплотени мейозу, однак дегенерація хроматину значно зростала: 26,7 % і 9,7 % та 55,6 % і 24,5 %, відповідно. Отже, на основі проведених досліджень встановлені критерії відбору ооцит-кумулюсних комплексів за станом кумулюсу і цитоплазми та розроблена комплексна система оцінки якості незрілих ооцитів ссавців, яка поєднує зажиттєву оцінку гамет у взаємозв'язку з цитогенетичним аналізом стану хроматину.

Встановлено позитивний вплив присутності вилучених із фолікулів клітин гранульози (3 - 5 х 10⁶/мл) на розвиток in vitro ооцитів свиней та корів. Під час культивування гамет обох видів тварин у присутності клітин гранульози встановлено, що із 124 досліджених ооцитів корів 81,5 % досягали стадії метафази ІІ мейозу з проявом 5,6 % генерованого хроматину.

Кількість гамет свиней, що досягли такої ж придатної для запліднення стадії мейозу, була дещо зниженою і становила 68,5 % (85/124) з проявом дегенерованого хроматину на рівні 14,1 %. Таким чином, забезпечується ефективне дозрівання ооцитів поза організмом через стероїдну активність клітин гранульози, синтез ними простагландинів та ряду білків, що впливають на стан кумулюсу гамет у період їх дозрівання in vitro (Grasselli F. et al., 1994; Mattioli M., 1996).

Вплив наноматеріалів на ефективність мейотичних перетворень ооцитів свиней. Для оптимізації середовища для культивування ооцитів in vitro вибрали високодисперсний кремнезем (ВДК), оскільки сполуки кремнію, особливо кремнезем, постійно контактуючи із біооб'єктами на різних етапах еволюції, беруть безпосередню участь у життєвих процесах (Луцюк Н.Б. и др., 2003; Галаган Н.П., 2006).

Визначили вплив різних концентрацій ВДК, поверхня якого перед експериментом була оброблена протягом 2 годин температурою 200єС або 400єС - ВДК 200єC і ВДК 400єC. Додавання 0,01 % ВДК 200єC в середовище культивування in vitro ооцитів свиней (табл. 1) забезпечувало формування дозрілих яйцеклітин (рис. 2) на суттєво вищому рівні, порівняно із контролем.

1. Вплив ВДК 200єC на дозрівання ооцитів свиней in vitro

Концентрація добавки у середовищі, %	Всього ооцитів	Кількість, %
		дозрілих ооцитів до метафази ІІ мейозу	дегенерації на метафазі ІІ мейозу
-	138	78a(56,5 ± 4,22)	9с(11,5 ± 3,61)
0,1	160	102ab(63,8 ± 3,80)	10с(9,8 ± 2,94)
0,01	158	110b(69,6 ± 3,66)	9с(8,2 ± 2,61)

a:b - p < 0,05, критерій ч2. В цій та наступних таблицях різні суперскрипти у межах однієї колонки вказують на вірогідну різницю між показниками (р не більше 0,05)

Вищий відсоток дозрілих in vitro до метафази ІІ ооцитів свиней, які культивувалися з 0,01 % ВДК 200єC, і нижча абсолютна кількість дегенерованого хроматину гамет, свідчать про перевагу у використанні 0,01 % цієї добавки, хоча рівень дегенерації в разі додавання 0,01 % ВДК 200єC суттєво не відрізнявся від контролю і 0,1%-вої концентрації.

Під час додавання 0,1 % і 0,01 % іншої добавки ВДК 400єC у середовищі поліпшуються умови культивування ооцит-кумулюсних комплексів свиней поза організмом, хоча порівняно з контролем суттєвою різниця не була (табл. 2).

2. Вплив ВДК 400єC на дозрівання ооцитів свиней in vitro

Концентрація добавки у середовищі, %	Всього ооцитів	Кількість, %
		дозрілих ооцитів до метафази ІІ мейозу	дегенерації на метафазі ІІ мейозу
-	95	52а(54,7 ± 5,10)	7b(13,5 ± 4,74)
0,1	94	59а(62,8 ± 4,99)	10b(16,9 ± 4,88)
0,01	86	52а(60,1 ± 5,28)	4b(7,7 ± 3,70)

Більш ефективною в даних дослідженнях виявилася 0,1%-ва концентрація ВДК 400єC - відсоток дозрілих до метафази ІІ гамет на 8,1 %, порівняно з контролем, а в разі 0,01 % на 5,3 %.

Додавання 0,01%-вої концентрації ВДК 200єC і ВДК 400єC під час дозрівання ооцитів свиней поза організмом свідчить про більш ефективне використання ВДК 200єC через одержання на 14,0 % вищого рівня досягнення гаметами метафази ІІ мейозу, порівняно з контролем (p < 0,01).

На основі порівняльного морфологічного та цитогенетичного аналізу закономірностей дозрівання поза організмом ооцитів корів і свиней визначено критерії ефективного вибору ооцит-кумулюсних комплексів із врахуванням стану кумулюсу і ооплазми. Через важливість такої системи початкового етапу всіх досліджень з ембріологічної генетики можливим є розуміння зв'язку морфологічної оцінки ооцит-кумулюсних комплексів ссавців зі станом хроматину і генетичним потенціалом їх розвитку in vitro.

ВИВЧЕННЯ IN VITRO ГЕНЕТИЧНИХ ЗАКОНОМІРНОСТЕЙ РАННЬОГО ЕМБРІОГЕНЕЗУ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ ТА СВИНЕЙ

Ембріональний розвиток поза організмом сформованих з використанням епідидимальних сперматозоїдів зародків великої рогатої худоби. В лабораторії клітинної інженерії Інституту розведення і генетики тварин УААН виконано комплекс досліджень з кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів бугаїв, їх використання для осіменіння поза організмом та штучного осіменіння самиць (Кузнецова И.Б. и др., 1999; Буркат В.П., 2006; Ковтун С.И. и др., 2007).

Безпосередньо нами доведено перевагу використання свіжовилучених епідидимальних сперматозоїдів бугаїв порівняно із кріоконсервованими еякульованими гаметами під час запліднення яйцеклітин корів in vitro. Встановлено, що з використанням епідидимальних сперматозоїдів бугаїв формується in vitro вірогідно вищий рівень (р < 0,001) запліднених зигот, роздроблених ембріонів (рис. 3) і відповідно розвивається більша кількість зародків поза організмом на доімплантаційних стадіях (табл. 3).

3. Рівень формування in vitro ембріонів великої рогатої худоби залежно від типу сперматозоїдів

Сперматозоїди бугаїв	Всього ооцитів	Кількість, %
		зиготи	2-4-клітинні зародки	морули - бластоцисти
Епідидимальні свіжі	226	189a(83,6±2,46)	171c(75,7±2,85)	51e(22,6±2,78)
Еякульовані кріоконсервовані	252	168b(66,7±2,97)	118d(46,8±3,14)	23f(9,1±1,81)

a:b, c:d, e:f - p < 0,001, критерій ч²

Ми пояснюємо це тим, що у суміші вилучених із придатка сім'яника сперматозоїдів відсутні секрети придаткових статевих залоз. Секрет цих залоз містить декапацитуючі агенти у своєму складі, які перешкоджають передчасному проходженню капацитації гамет за період подолання у природних умовах сперматозоїдами шляху у статевих шляхах самки до місця запліднення яйцеклітин.

В умовах співкультивування поза організмом гамет у повній мірі проявляється це фізіологічно обумовлене явище зниженим, порівняно із використанням епідидимальних сперматозоїдів, рівнем формування ембріонів. Використання епідидимальних гамет бугаїв в умовах in vitro в разі одержання ембріонів поза організмом забезпечує суттєво вищу ефективність їх розвитку.

Вплив наноматеріалів на розвиток ембріонів свиней in vitro та кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів кнурів. Вивчено вплив на ембріональний розвиток свиней in vitro (рис. 4) 0,1%-их концентрацій ВДК 200єC і ВДК 400єC. 0,1%-ва концентрація ВДК 200єC у середовищі культивування ооцит-кумулюсних комплексів свиней забезпечила (порівняно з контролем і з 0,1%-вою концентрацією ВДК 400єC) на 4,8 % і 2,9 % вищий рівень формування зигот, а також на 7,9 % і 7,4 % більшу кількість дроблення ембріонів (рис. 5).

Під час дослідження впливу нанокомпозитів у концентрації 0,01 % на ембріогенез свиней in vitro встановлено суттєву перевагу ВДК 200єC за кількістю запліднених яйцеклітин свиней поза організмом і рівнем дроблення зародків відповідно на 15,6 % і 17,0 % та 8,7% і 20,1 % порівняно з контролем і ВДК 400єC (рис. 5). Механізм впливу наноматеріалів полягає в тому, що через високу сорбційну здатність на поверхні ВДК спонтанно сорбуються білки середовища з утворенням наноматеріалу, який є імобілізованим білком. Водночас така система є вже новим сорбентом для інших компонентів середовища для клітин. На такому носії відбувається каскадне утворення імобілізованих компонентів середовища, які мають властивість до пролонгованої дії. Порівняно з неімобілізованими компонентами це забезпечує вищу активацію процесів в біологічній системі (Галаган Н.П., 2005). Ці закономірності були враховані для удосконалення технології кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів кнурів. Були використані наноматеріали на основі ВДК, білка (БСА) та дисахариду (сахароза) в трьох концентраціях - 0,1 %; 0,01 %; 0,001 %. Встановлено, що у контролі (кріосередовище без додавання наноматеріалів) після розморожування рухливість гамет становила 10 % (перед заморожуванням була на рівні 50 %), а час їх виживання був 2 години (рис. 6, 7).

Суттєво вищу рухливість мали гамети в разі додавання в ЛГЖ-середовище 0,001 % ВДК+сахароза та 0,01 % ВДК+БСА+сахароза. Після розморожування рухливість на рівні 25 - 30 % таких клітин зберігалася до двох годин з поступовим зниженням. Позитивно впливали на рухливість гамет, яка оцінена 20 - 25 %, інші концентрації, але цей показник зберігався менший проміжок часу. Не виключено, що різне просторове розташування молекул вуглеводу в кожному із двох випадків ВДК та ВДК+БСА зумовлює оптимальний ефект наноматеріалів у середовищі із клітинами за різних концентрацій. Отже, для підвищення ефективності кріоконсервування епідидимальних сперматозоїдів кнурів доцільно використовувати ЛГЖ-середовище з 0,001 % ВДК+сахароза або 0,01 % ВДК+БСА+сахароза.

Морфо- та цитогенетичний аналіз розвитку ембріонів in vitro. З метою встановлення генетичних закономірностей раннього ембріогенезу in vitro аналізували вплив різних способів вилучення ооцит-кумулюсних комплексів свиней, додавання різних видів сироваток крові під час культивування ооцитів поза організмом.

Найбільш поширеним методом одержання незрілих ооцит-кумулюсних комплексів із яєчників корів є аспірація за допомогою шприца вмісту видимих на поверхні яєчника фолікулів (Кузнєцов В.Є. та ін., 1998; Lonuis M., 1995), багаторазове надрізання яєчників хірургічним скальпелем (Кузнєцов В.Є., 1998), розривання попередньо ізольованих окремих фолікулів (Katska L. et al., 1993).

Нами вперше оцінена ефективність застосуванням трьох вищевказаних методів для вилучення ооцит-кумулюсних комплексів свиней. Встановлено, що в середньому на один яєчник можна одержати найбільше (28,8 ± 3,69 шт.) придатних для культивування in vitro ооцит-кумулюсних комплексів з використанням методу надрізання яєчників, порівняно із аспірацією (13,5 ± 0,65 шт.) та розриванням (21,0 ± 1,53 шт.). Така кількість ооцит-кумулюсних комплексів під час застосування методу надрізання яєчників є вірогідно вищою (p < 0,001) від двох інших методів вилучення ооцит-кумулюсних комплексів свиней для відбору найбільш придатних для культивування поза організмом. Вказані методи виділення ооцит-кумулюсних комплексів свиней із яєчників не впливали на цілісність і структуру гамет, збереження цілісності і компактності кумулюсу. Це є важливим фактором здатності ооцитів до завершення мейотичного дозрівання поза організмом та подальшого ембріонального розвитку in vitro.

Переваги методу надрізання яєчників свиней для вилучення ооцит-кумулюсних комплексів підтверджено результатами оцінки ембріогенезу in vitro після осіменіння яйцеклітин розмороженими епідидимальними сперматозоїдами (табл. 4).

Коли для культивування ооцит-кумулюсні комплекси вилучали надрізанням яєчників, рівень утворення зигот, дроблення зародків та розвитку до стадії ранньої морули був відповідно на 3,9 %, 5,2 % і 3,6 % вищим відносно групи досліду з вилученими ооцит-кумулюсних комплексів методом аспірації. Перевага надрізання яєчників очевидна, оскільки за часом вилучення та постановки ооцит-кумулюсних комплексів свиней на культивування не виявлено негативного впливу цього методу на їх життєздатність та подальший ембріональний розвиток, а також забезпечено формування більшої абсолютної кількості ембріонів свиней in vitro.

4. Одержання ембріонів свиней поза організмом залежно від способу вилучення ооцит-кумулюсних комплексів із яєчників

Спосіб вилучення	Осіменених ооцитів	Кількість, %
		зигот	2 - 4-клітинних зародків	ранніх морул
Аспірація фолікулів	105	74а(70,5±4,45)	55b(52,4±4,87)	34c(32,4±4,57)
Надрізання яєчників	125	93а(74,4±3,90)	72b(57,6±4,42)	45c(36,0±4,29)
Розривання фолікулів	85	59а(69,4±5,00)	43b(50,6±5,42)	26c(30,6±5,00)

Порівняльна оцінка ефективності використання в середовищі дозрівання ооцитів свиней сироватки крові корів у стані охоти (еструсна сироватка) та фетальної сироватки теляти на розвиток гамет in vitro та їх компетентність до ембріогенезу не виявила вірогідної різниці. Рівень заплідненості яйцеклітин свиней поза організмом під час дозрівання ооцитів був на 6,6 % меншим з додаванням фетальної сироватки проти еструсної (табл. 5). Рівень дроблення ембріонів, коли ооцити дозрівали з фетальною сироваткою, виявився на 5,4 % нижчим.

Додавання еструсної сироватки крові корів не збільшує суттєво кількості ооцитів свиней, що дозріли до метафази ІІ мейозу та були запліднені поза організмом, але підвищує частоту формування ембріонів на доімплантаційних стадіях розвитку. Саме еструсна сироватка сприяє кращому цитоплазматичному дозріванню ооцитів свиней поза організмом, без якого гамети не матимуть змоги запліднюватися та проявляти ембріональний розвиток в умовах in vitro.

5. Використання в середовищі дозрівання ооцитів двох видів сироваток крові під час формування ембріонів свиней in vitro

Сироватка крові	Кількість осіменених ооцитів	Кількість ембріонів, %
		зигот	2-4-клітин- них зародків	морул-бластоцист
Еструсна корів	463	273a (59,0 ± 2,29)	207b (44,7 ±2,31)	125с (27,0 ± 2,06)
Фетальна теляти	267	140a (52,4 ± 3,06)	105 b (39,3 ±3,00)	53d (19,9 ± 2,44)

с:d - p < 0,05, критерій ²

З метою удосконалення морфогенетичного аналізу повноцінності зародків нами проведено аналіз цитогенетичних препаратів ембріонів великої рогатої худоби та свиней на різних стадіях (від двох бластомерів до бластоцисти). Цитогенетичний аналіз забезпечує виявлення хромосомних порушень, що виникають ще під час гаметогенезу, в період дозрівання та запліднення ооцитів і під час ембріонального розвитку (Ковтун С.І., 2002). Всі хромосомні порушення, які виникають на будь-яких етапах гаметогенезу, ведуть до загибелі зародків (Brьssow K.P., 2000). Детальний цитогенетичний аналіз допомагає визначитися з етапами розвитку ембріона на стадії бластоцисти (рання, розширена, повністю розширена).

Аналізували цитогенетичні препарати ембріонів, вилучених від корів-донорів (племзавод «Більшовик») і встановили, що всі бластоцисти перебували на ранньому етапі розвитку. Це підтверджено наявністю відповідної кількості клітин у кожному ембріоні (64 - 130 бластомерів). Оцінені візуально ембріони як повноцінні (n = 25) містили морфологічно нормальні ядра з ядерцями. Всі ядра, або їх переважна більшість були пікнотичними у зародків, які були оцінені як дегенеровані (n = 35), або містили частину неповноцінних бластомерів. Вони характеризувалися ущільненням хроматину і неможливістю виявлення ядерець.

Отже, врахування ознак дегенерації ембріонів ссавців у вигляді лізису, руйнування бластомерів, порушення зв'язків між бластомерами (рис. 8) підвищує ефективність контролю оцінки раннього ембріогенезу.

АНАЛІЗ ЕМБРІОНАЛЬНОГО РОЗВИТКУ IN VITRO В УМОВАХ ПРАКТИЧНОЇ РЕАЛІЗАЦІЇ РОЗРОБЛЕНИХ МЕТОДІВ

Генетичний контроль запліднювальної здатності сперматозоїдів бугаїв та кнурів методом одержання ембріонів поза організмом. Для комплексної оцінки запліднювальної здатності сперматозоїдів плідників нині можна з успіхом застосовувати метод одержання ембріонів поза організмом (Кузнєцова І.Б. та ін., 2002). Для підвищення ефективності цього методу нами проведені дослідження з оцінки запліднювальної здатності заморожено - розмороженої сперми 5 бугаїв української чорно-рябої молочної породи за результатами запліднення поза організмом інтактних та позбавлених прозорої оболонки (ZF - zone free) ооцитів корів. Визначено, що бугай Галстук 1753 проявляє знижену запліднювальну здатність під час осіменіння поза організмом ооцитів корів (табл. 6). Але за результатами тільності після 1-го осіменіння плідники відрізнялися менше.

Виявлено найменший рівень пенетрації у групі осіменіння інтактних яйцеклітин корів заморожено-розмороженими сперматозоїдами бугая Галстук 1753, коли критеріями пенетрації гамет є наявність ядер у бластомерах ембріонів і присутність двох або більшої кількості пронуклеусів в ооплазмі яйцеклітин. Це пояснюється тим, що частина головок сперматозоїдів, які проникли в ооплазму інтактних яйцеклітин, не перетворилися на пронуклеуси.

6. Оцінка плідників за результатами запліднення поза організмом

Кличка, номер	Кількість осіменених яйцеклітин	Дослідження поза організмом	Середня кількість пронуклеусів у ZF-ооцитах	Запліднено телиць після 1-го осіменіння, n (%)
		дозрівання ооцитів n,%	запліднення n, %	дроблення n, %
Фокс 1809	40	36a(90,0)	28b(70,0)	20f(50,0)	4,9	44i(68,7)
Рон 2232	39	28a(71,8)	26bd(66,7)	19f(48,7)	4,6	250i(70,0)
Рик 1821	63	47a(74,6)	37b(58,7)	31f(49,2)	3,7	69i(70,4)
Галстук 1753	50	37a(74,0)	21c(42,0)	18fg(36,0)	2,8	34i(65,4)
М'ятний 4871	91	73a(80,0)	69be(75,8)	56fh(61,5)	5,0	98i(70,5)

d:c - P < 0,05; b:c, g:h - P < 0,01; c:e - P < 0,001, критерій ч²

Використання методу запліднення ZF-ооцитів корів, які дозріли поза організмом, за результатами середньої кількості сформованих пронуклеусів дістає додаткове підтвердження відмінностей у рівні запліднювальної здатності сперматозоїдів різних плідників. Найнижчий рівень середньої кількості пронуклеусів у сформованих ZF-зиготах в разі осіменіння спермою плідника Галстук 1753 підтверджує нижчу запліднювальну здатність in vitro його гамет.

За результатами оцінки запліднювальної здатності сперматозоїдів кнурів-плідників не встановлено вірогідних відмінностей між гаметами під час осіменіння яйцеклітин in vitro і за результатами штучного осіменіння свиноматок (табл. 7). Для оцінки запліднювальної здатності сперматозоїдів шляхом запліднення яйцеклітин поза організмом необхідно 5 - 6 діб, а в разі штучного осіменіння цей термін подовжується до року.

Запропонований комплексний метод оцінки запліднювальної здатності сперматозоїдів бугаїв та кнурів in vitro за частотою пенетрацї оолеми гомологічних яйцеклітин і рівнем заплідненості яйцеклітин та розвитку зародків in vitro дає змогу оцінювати плідників з метою їх племінного використання, а також в системі комерційного використання племінних тварин.

7. Результати запліднювальної здатності кнурів-плідників

№ кнура	Результати штучного осіменіння	Результати запліднення in vitro
	осіменених свиноматок, гол.	запліднених, гол., %	осіменених яйцеклітин, шт.	запліднених яйцеклітин, шт., %
4096	60	41а *(68,3)	86	45а(52,3)
339	52	34b(65,4)	95	62b(65,3)
4255	50	40c(80,0)	70	53c(75,7)

*- показники порівнюються в межах одного рядка

Оцінка запліднюваності свиноматок шляхом застосування кріоконсервованих епідидимальних сперматозоїдів кнурів. Дослідження виконувалися шляхом однократного осіменіння свиноматок на 3-й день після виявлення ознак статевої охоти. Як контроль використовували осіменіння свиноматок підготовленою еякульованою спермою кнурів згідно «Інструкції із штучного осіменіння свиней» (2003).

Не встановлено вірогідних відмінностей за рівнем заплідненості свиноматок з використанням еякульованих та кріоконсервованих епідидимальних сперматозоїдів кнурів (табл. 8). Це переконливо доводить перспективність використання таких гамет для одержання потомства від цінних плідників та в разі збереження генофонду.

8. Ефективність використанням сперматозоїдів залежно від методу їх одержання

Метод одержання сперматозоїдів кнурів	Кількість осіменених свиноматок, гол.	Заплідненість свиноматок, n, %	Опоросилося, n, %
Еякульовані свіжоотримані	26	18 а (69,2)	18 b (100,0)
Епідидимальні кріоконсервовані	15	10 а (66,7)	8 b (80,0)

ГЕНЕТИКО-ТЕХНОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ ЕМБРІОНІВ У ЗВ'ЯЗКУ З РАННІМ ЕМБРІОГЕНЕЗОМ У ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ

Вплив «прямої пересадки» сформованих in vivo ембріонів на тільність телиць-реципієнтів. Трансплантація кріоконсервованих ембріонів передбачає оцінку їх якості за морфологічними показниками. Останнім часом знаходить розповсюдження метод «прямої пересадки» заморожено - розморожених ембріонів великої рогатої худоби, коли трансплантацію зародків реципієнтам здійснюють відразу після розморожування без відмивання від кріопротектора. У цьому випадку як кріопротектор найчастіше використовують 1,5-молярний розчин етиленгліколю (Кузнєцов В.Є., 2001). Недоліком методу «прямої пересадки» є використання недостатньо оцінених ембріонів.

Використовуючи «пряму пересадку» ембріонів великої рогатої худоби голштинської породи німецької селекції, ми дослідили їх життєздатність залежно від стадії розвитку ембріонів (пізні морули і ранні бластоцисти).

Серед використаних зародків (n = 25) 44 % були на стадії пізньої морули і 56 % - ранні бластоцисти. В результаті трансплантації ранніх бластоцист тільність і народження телят були на рівні 72,7 % (8 із 11), а пересаджені пізні морули імплантувалися на рівні 35,7 % (5 із 14). Перевага на 37 % у приживленні ембріонів на стадії ранньої бластоцисти, порівняно із пізніми морулами, свідчить про перспективність використання ранніх бластоцист для одержання телят-трансплантантів.

Отже, використання зародків, які заморожені для «прямої пересадки», із врахуванням стадії розвитку і відповідна підготовка реципієнтів підвищують ефективність нехірургічної трансплантації ембріонів великої рогатої худоби. Детальний аналіз стадій розвитку ембріонів великої рогатої худоби, які заморожуються в рідкому азоті і призначені для імпорту або збереження генофонду, дає змогу прогнозувати рівень приживлення ембріонів під час нехірургічної трансплантації. Це особливо важливо за умови високої вартості ембріонів із цінним генетичним потенціалом. Тому в разі імпорту кріоконсервованих ембріонів поряд із їх походженням доцільно враховувати рекомендації ембріолога щодо відбору кожного зародка.

Морфо- та цитогенетичні аспекти ембріогенезу під час ембріотрансплантації. Оцінка ембріопродуктивності корів сірої української породи показала високий рівень їх суперовуляції після гормональної обробки. Це забезпечило вилучення в середньому 9 ембріонів на одну голову, що відповідає рівню ембріопродуктивності корів інших порід (Бабенков В.Ю., 2004).

Детальним морфологічним та цитогенетичним аналізом встановлено, що відсоток придатних для пересадки зародків зменшується із збільшенням кількості вилучених ембріонів за одне вимивання.

Так, із 11 ембріонів, вимитих у Берегової 8888/30 за одну обробку лише 45,4 % є найбільш життєздатними, а із 12 ембріонів від Золушки 8873/7542 всі зародки не проявляли ознак життєздатності і готовності до подальшої імплантації та розвитку. Під час одержання п'яти ембріонів за одне вилучення всі вони були придатними для пересадки реципієнтам.

Дещо нижчий показник імплантації і тільності реципієнтів відмічено в разі пересадки ембріонів від Чудесної 88775/4660, коли вимито 8 зародків (з них лише 3 морфологічно нормальні). Рівень приживлення цих зародків - 66,7 %, а на зниження кількості життєздатних ембріонів вплинула наявність незапліднених яйцеклітин (25,0 %), а також 37,5 % умовно придатних для нехірургічної трансплантації ембріонів.

Встановлено, що серед пересаджених реципієнтам пізніх морул тільність і народження телят відмічено у 50,0 %, а трансплантовані свіжовилучені ранні бластоцисти проявили вищу на 16,7 % життєздатність, яка реалізувалася в отеленні реципієнтів (рис. 9) на рівні 66,7 % від кількості пересаджених зародків.

Надшвидке заморожування ембріонів великої рогатої худоби та їх морфо- та цитогенетична оцінка. Після запліднення яйцеклітин корів in vitro або in vivo відбувається асинхронний розвиток зародків до стадії бластоцисти - найбільша кількість формується на 7-й та 8-й день після початку осіменіння. Метою досліджень було вивчити ефективність заморожування таких ембріонів та покращити умови їх виживання.

Встановлено, що за одноступеневої еквілібрації в розчині ЕФС40 підвищується частота життєздатних ембріонів після надшвидкого заморожування залежно від дня формування бластоцист і тривалості еквілібрації зародків перед заморожуванням (рис. 10). Найбільш ефективною виявилася 1,5-хвилинна еквілібрація ембріонів (15 шт.) на стадії бластоцисти, які сформувалися на 7-й день від осіменіння яйцеклітин in vitro, а розвиток розморожених 8-денних бластоцист (9 шт.) виявився значно нижчим і складав 33 %.

Після 2 хв. перебування в розчині ЕФС40 перед заморожуванням всі 7-денні бластоцисти (8 шт.) також виявилися життєздатними за результатами їх культивування поза організмом, а 8-денні ембріони (12 шт.) проявляли виживаність на більш високому рівні, порівняно з 1,5-хвилинною еквілібрацією.

Встановлено, що подальше збільшення часу еквілібрації (5 та 10 хв.) в розчині ЕФС40 негативно впливає на життєздатність сформованих поза організмом кріоконсервованих ембріонів великої рогатої худоби внаслідок токсичного впливу кріопротектору на клітини і свідчить про вищу біологічну повноцінність ембріонів на стадії 7-денних бластоцист через одержання 20 % життєздатних зародків після 5-хвилинної еквілібрації (всього було кріоконсервовано 10 ембріонів) і 0 % виживання 8-денних ембріонів (14 шт.).

У дослідженнях з надшвидкого заморожування в розчині EФС40 вилучених in vivo ембріонів від корів-донорів (племзавд «Більшовик») з метою спрощення процедури вітрифікації застосовано одноступеневу еквілібрацію протягом 1,5 хв. і зародки на стадії пізньої бластоцисти. Встановлено (табл. 9), що розвиток зародків після розморожування і культивування поза організмом за таких умов становить в середньому 95,2 %.

9. Ефективність вітрифікації вилучених від корів-донорів ембріонів

Кличка і номер корови-донора	Порода	Всього вітрифікованих ембріонів, шт.	Кількість, % життєздатних після розморожування
Хесана 2711	голштинська (червоно-ряба масть)	7	6 (85,7)
Оралка 7855	голштинська (чорно-ряба масть)	10	10 (100,0)
Лінійка 1897	укр. чорно-ряба молочна	4	4 (100,0)
Всього	3	21	20 (95,2)

Після нехірургічної трансплантації таких ембріонів підготовленим реципієнтам відмічена тільність тварин на рівні 25 %.

ЦИТО- ТА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНІ ПІДХОДИ ДО ВИЗНАЧЕННЯ СТАТІ ЗАРОДКІВ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ

Для підвищення ефективності генетико-біотехнологічних методів у скотарстві велике значення має зажиттєве визначення статі зародків. Нами розроблено два способи такої оцінки: цитогенетичний метод і молекулярно-генетичний.

Розробка і використання різних методів диференційного забарвлення підвищує можливості аналізу хромосом для визначення статі зародків. Цитогенетичний метод для досліджень особливостей ембріогенезу незамінний для ідентифікації хромосом анеуплоїдних зигот, виявлення інактивованої Х-хромосоми, аналізу химеризму та ін.

З метою зажиттєвого визначення статі зародків одержували придатні для цитогенетичного аналізу С-забарвлені метафазні пластинки ембріонів, які вилучали від корів-донорів (43 шт.).

Така концентрація колхіцину протягом короткого часу дії на ембріони, що інтенсивно діляться, не виявляє токсичного впливу на клітини.

На диференційно забарвлених препаратах хромосом всі аутосоми і Х-хромосома містили С-сегменти центромерного гетерохроматину, а Y-хромосома майже повністю складалася із гетерохроматину (рис. 11).

В разі використання полімеразної ланцюгової реакції в тваринництві проводиться паспортизація порід та ефективне розділення ембріонів за статтю перед трансплантацією їх реципієнтам (Xu K.P. et al., 1992; Ковтун С.І., 2002; Буркат В.П. та ін., 2005). З метою визначення статі зародків цей метод забезпечує ампліфікацію послідовностей ДНК, специфічних для Y-хромосоми.

Для оптимізації перебігу ампліфікації нами підібрані оптимальні температурні та часові режими проведення ПЛР-аналізу, а також склад реакційної суміші. Встановлено, що оптимальним є наступний склад реакційної суміші: 10-х ПЛР-буфер (100 мM Tris HCL, pH - 8,8; 500 мM KCl, 0,8 % Nonidet P40); 25мM MgCL₂ - 1,5мM; 2мM dNTP - 0,5 мM кожного; Taq - полімераза (1,25U/50мкл). ДНК 50 - 100 нг/25 мкл. Суміш доводили до загального об'єму 25 мкл деіонізованою водою.

Встановлено, що довжина специфічного для Y-хромосоми продукту ампліфікації у великої рогатої худоби становить 173 пар нуклеотидів (п.н.), а довжина Х-специфічного фрагмента - 216 п.н. У корів спостерігався один амплікон розміром у 216 п.н., а у бугаїв два фрагменти розміром 173 п.н. та 216 п.н. (рис. 12). Із 12 протестованих ембріонів великої рогатої худоби вісім мали по одному фрагменту розміром 216 п.н., що вказує на їх жіночу стать і чотири ембріони мали по 2 фрагменти розміром в 216 п.н. і 173 п.н., тобто чоловічої статі.

ПЕРСПЕКТИВИ РОЗВИТКУ ГЕНЕТИЧНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ РАННЬОГО ЕМБРІОГЕНЕЗУ IN VITRO В ПЛЕМІННОМУ ТВАРИННИЦТВІ УКРАЇНИ

Ефективне впровадження в практику племінного тваринництва України сучасних методів генетичного моніторингу, клітинної і генетичної інженерії потребує поглиблення наукових досліджень для виявлення закономірностей і розкриття механізмів генетичних перетворень на популяційному, індивідуальному і клітинному рівнях.

Перспективним напрямом генетичних досліджень на клітинному рівні є методи аналізу in vitro раннього ембріонального розвитку. Концептуальні і деякі методологічні підходи до розвитку цього напряму та результати практичної їх реалізації окреслені в наукових публікаціях, виступах на конференціях, симпозіумах і узагальнені в дисертаційній роботі, де висвітлена роль і показано місце методів генетики розвитку в системі біотехнологічної селекції сільськогосподарських тварин.

Ми вважаємо, що в найближчій перспективі ці методи покликані сприяти вирішенню низки завдань щодо поглиблення генотипової оцінки тварин, збереження і раціонального використання їх генофонду, конструювання бажаних генотипів і їх масового відтворення. У цьому плані в лабораторії клітинної інженерії Інституту розведення і генетики тварин УААН започатковано комплекс досліджень. Зокрема, під час встановлення морфогенетичних закономірностей мейотичних змін хроматину ооцитів корів та свиней, аналізу особливостей реалізації генетичної інформації за період розвитку в умовах in vitro до стадій, які передують імплантації, нами розроблено методологію і експериментально відпрацьовано перспективні напрямки практичного використання цих підходів для перетворення генофонду порід, з метою послідовного підвищення їх генетичного потенціалу і одночасно збереження генофонду неконкурентоспроможних племінних ресурсів.

...