Розробка технології довготривалого зберігання бактерій з використанням методу сорбційно-контактного зневоднення

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР “ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ”

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

УДК 636.09:579.62:57.082.5:57.086.14

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

РОЗРОБКА ТЕХНОЛОГІЇ ДОВГОТРИВАЛОГО ЗБЕРІГАННЯ БАКТЕРІЙ З ВИКОРИСТАННЯМ МЕТОДУ СОРБЦІЙНО-КОНТАКТНОГО ЗНЕВОДНЕННЯ

ПІНЧУК НАТАЛІЯ

ГРИГОРІВНА

Харків - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів Міністерства аграрної політики України.

Науковий керівник доктор ветеринарних наук, професор, академік Української академії аграрних наук Головко Анатолій Миколайович, Українська академія аграрних наук, віце-президент

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент Української академії аграрних наук

Завгородній Андрій Іванович, Національний науковий центр “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”, завідувач лабораторії вивчення туберкульозу;

доктор ветеринарних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки України, член-кореспондент Української академії аграрних наук Мандигра Микола Станіславович, Інститут епізоотології Української академії аграрних наук, директор.

Захист відбудеться 22 лютого 2008 р. о 9 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 у Національному науковому центрі “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за адресою: вул. Пушкінська, 83, м. Харків, 61023.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного наукового центру “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за адресою: вул. Пушкінська, 83, м. Харків, 61023.

Автореферат розісланий 18 січня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор ветеринарних наук, професор А. Ф. Бабкін

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Перед науково-дослідними та діагностичними мікробіологічними лабораторіями, діяльність яких спрямована на зберігання та підтримання штамів мікроорганізмів у високоактивному стані, стоїть надзвичайно важливе завдання - розробка таких методів і способів довготривалого зберігання мікроорганізмів, які б забезпечували максимальне збереження життєздатності та основних біологічних властивостей вихідних культур як на початкових етапах підготовки зразків, так і впродовж тривалого зберігання виготовлених зразків штамів мікроорганізмів.

Для вирішення зазначеного завдання необхідне розв'язання багатьох питань, основними з яких є вивчення механізмів кріопошкодження, кріозахисту і репарації біологічних об'єктів (Никитин Е. Е., Звягин И. В., 1971; Цуцаева А. А., 1987; Комагата К., 1988; Гордиенко Е. А., Пушкарь Н. С., 1994; Нежута А. А., Сербис Е. С., 2003). До того ж актуальними на сьогодні є і питання подальшого вдосконалення механізації і автоматизації процесів висушування; уточнення умов спрощення тривалого зберігання біопрепаратів; підвищення ефективності існуючого й експериментального обладнання, що розробляється на основі більш глибокого вивчення теоретичних основ теплофізичних процесів і молекулярних змін у біологічних матеріалах, а також підбору таких захисних середовищ, які б забезпечували стабільність висушених препаратів, не впливаючи на їх активність і специфічність (Белоус А. М., Цветков Ц. Д., 1985; Маслак А. А., Емельянов Н. И., 1987; Родичева Э. К., Медведева С. Е., 1996; Самуйленко А. Я., Нежута А. А., Еремец В. И., Токарик Э. Ф., 2003).

Численні дані літератури свідчать про те, що на сьогодні найбільш поширеним методом довготривалого зберігання бактерій є ліофільне висушування (Фатеева М. В., 1967; Герна Р., 1983; Сидякина Т. М., 1985; Нежута А. А., Токарик Э. Ф., Самуйленко А. Я., 2002). Хоча цей метод висушування і задовольняє дослідників за багатьма показниками висушеного матеріалу, проте він потребує багато часу для його здійснення, відпрацювання показників режиму висушування, таких як: термін, температура, тиск, а також визначення інгредієнтів захисного середовища та їх кількісний вміст. Крім того, одним із недоліків методу ліофільного висушування є необхідність у постійному технологічному обслуговуванні впродовж усього процесу висушування та технічному обслуговуванні сушильного агрегату, на якому проводиться цей процес. А значне зниження кількості життєздатних клітин (від 10 до 60 %) як на етапах ліофілізації, так і при тривалому зберіганні висушених зразків обмежує використання ліофільного висушування з метою довготермінового зберігання колекційних культур бактерій.

Наведені актуальні проблеми, які виникають при висушуванні мікроорганізмів, свідчать про необхідність розробки ефективного, щадного на всіх етапах висушування, з мінімальними інструментальними й енергетичними затратами методу, який можна ефективно використовувати для довготривалого зберігання колекційних культур бактерій. У зв'язку з цим на особливу увагу заслуговує достатньо простий, доступний та порівняно новий для біологічної промисловості метод сорбційно-контактного зневоднення.

У доступній вітчизняній науковій літературі даних про використання методу сорбційно-контактного зневоднення з метою довготривалого зберігання мікроорганізмів не представлено. Усі дані щодо застосування цього методу відносяться до наукових здобутків близького і далекого зарубіжжя (Простяков Е. А., Кольцов А. П., Евсеева С. Д. и др., 1993; Григоренко А. И., Махлай А. А., Колосков А. В., 1999; Муратов В. А., Козуб С. Н., Мурзина О. П., 1999; Смоленский В. И., Горева И. П., Руденко Т. В., 2001).

Вивчення даного питання відкриває шлях до розробки науково обґрунтованої технології довготривалого зберігання бактерій з використанням методу сорбційно-контактного зневоднення. Ці актуальні положення і визначили вибір напрямів наших досліджень та методи виконання роботи.

Зв'язок роботи з іншими науковими програмами, планами та темами. Дисертаційна робота є складовою частиною досліджень відділу біотехнології і контролю якості бактеріальних препаратів Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів, які виконувалися згідно з тематичними планами науково-дослідних робіт: "Розробити методи підтримання та збереження у високоактивному стані колекційних культур мікроорганізмів (бактерій, вірусів, грибів), що знаходяться в установах ветеринарної медицини України з наступним впровадженням їх при промисловому виготовленні біопрепаратів" (2002-2003 рр., № державної реєстрації 0101U000542); "Розробити технологію контактного висушування штамів мікроорганізмів та біологічних препаратів" (2002-2004 рр., № державної реєстрації 0102U006737) та "Колекція штамів патогенних для тварин мікроорганізмів Національного центру штамів мікроорганізмів Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів" (2005-2006 рр., № державної реєстрації 0105U003218).

Мета та задачі досліджень. Метою роботи була розробка технології довготривалого зберігання бактерій різних видів із використанням методу сорбційно-контактного зневоднення та оцінка її ефективності.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

1. Провести підбір компонентів для сорбційно-контактного зневоднення бактерій і відпрацювати оптимальні режими поступового зневоднення бактеріальних клітин.

2. Вивчити вплив різних співвідношень адсорбенту з адсорбтивом на основні біологічні властивості мікроорганізмів та провести підбір оптимального їх співвідношення.

3. Провести підбір захисного стабілізувального середовища для бактерій різних видів.

4. Відпрацювати процес десорбції бактеріальних клітин з твердого носія та провести підбір оптимальних вихідних концентрацій бактеріальних суспензій для контактного зневоднення.

5. Провести порівняльне вивчення впливу контактного зневоднення та ліофілізації на ультраструктуру, життєздатність, культурально-морфологічні, тинкторіальні, біохімічні, антигенні й патогенні властивості бактерій різних видів.

Об'єкт дослідження: методи довготривалого зберігання мікроорганізмів: сорбційно-контактне зневоднення та ліофільне висушування.

Предмет дослідження: культури бактерій, висушені методами сорбційно-контактного зневоднення та ліофілізації, їх ультраструктура, рівень збереження життєздатності, культурально-морфологічні, тинкторіальні, біохімічні, антигенні та патогенні властивості, складові сорбційно-контактного зневоднення.

Методи дослідження. Робота виконана з використанням бактеріологічних, серологічних, електронно-мікроскопічних та статистичних методів досліджень.

Наукова новизна роботи. Уперше розроблено технологію довготривалого зберігання бактерій різних видів із використанням методу сорбційно-контактного зневоднення.

Підібрано набір складових, на основі яких розроблено сорбційно-дисперсійний модуль для контактного зневоднення штамів мікроорганізмів. Установлено оптимальні режими поступового зневоднення бактеріальних клітин.

Вивчено вплив процесу сорбційно-контактного зневоднення на основні біологічні властивості бактерій різних видів, їх ультраструктуру та рівень збереження життєздатності впродовж тривалого зберігання. Проведено порівняльне вивчення ефективності методів ліофільного висушування та контактного зневоднення.

Розроблено систему заходів щодо запобігання контамінації культур мікроорганізмів при проведенні контактного зневоднення та рекомендації по довготривалому збереженню бактерій з використанням методу сорбційно-контактного зневоднення для лабораторій ветеринарної медицини, депозитаріїв та науково-дослідних закладів. Наукова новизна проведених досліджень підтверджена деклараційним патентом (UA) на корисну модель № 5333 U; 7 C12N1/20, 15.03.05 р.

Практичне значення отриманих результатів. Практичне значення роботи полягає в тому, що запропонована технологія довготривалого зберігання бактерій забезпечує збереження основних біологічних властивостей бактерій, їх ультраструктури та високого рівня життєздатності як на стадіях приготування препаратів, так і впродовж їх довготривалого зберігання.

Запропонована технологія дозволяє виключити із технології тривалого зберігання бактерій енергоємне, дороге сублімаційне та холодильне обладнання, скоротити терміни отримання сухих препаратів високої якості (в 10 разів швидше порівняно з ліофільним висушуванням) та значно спростити технологічні прийоми висушування.

За результатами досліджень розроблено "Методичні рекомендації по довготривалому збереженню бактерій методом сорбційно-контактного зневоднення", які затверджені Науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України (протокол № 4 від 23 грудня 2004 року). Отримані результати досліджень упроваджені в науково-дослідних установах ветеринарної медицини, а також використовуються в навчальному процесі при підготовці спеціалістів і магістрів ветеринарної медицини аграрних ВНЗ України ІV рівня акредитації в процесі вивчення дисциплін "Мікробіологія", "Вірусологія", "Біотехнологія".

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача полягає в безпосередньому виконанні всього обсягу робіт за темою дисертації, а саме: аналізі літературних джерел, підборі методів і методик, здійсненні наукових експериментів, їх статистичної обробки й аналізу первинних даних, узагальненні результатів власних досліджень, формулюванні наукових положень і висновків, що підтверджується відповідною документацією. Програма наукових досліджень розроблялась разом з науковим керівником. Здобувач брав безпосередню участь у розробці методичних рекомендацій по довготривалому збереженню бактерій методом сорбційно-контактного зневоднення.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися, обговорювалися та отримали загальне схвалення на звітних сесіях вченої ради Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів упродовж 2002-2006 рр.; звітних сесіях Науково-методичної ради Державного департаменту ветеринарної медицини в 2002-2004 рр.; Міжнародній науково-практичній конференції "Актуальні проблеми ветеринарної медицини в умовах сучасного ведення тваринництва" (26 травня - 2 червня 2003 р., м. Феодосія, АР Крим); Всеукраїнській науковій конференції молодих вчених "Сучасні проблеми діагностики інфекційних хвороб тварин" (2-3 грудня 2003 р., м. Харків); II Міжнародному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини (3-4 серпня 2004 р., м. Київ).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 друкованих праць, з яких 3 - у фахових виданнях, перелік яких затверджено ВАК України; отримано деклараційний патент на корисну модель.

Структура та обсяг дисертації. Основний зміст дисертації викладено на 145 сторінках комп'ютерного тексту та ілюстровано 22 таблицями і 45 рисунками. Робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, обговорення результатів власних досліджень, висновків і практичних пропозицій виробництву, списку джерел літератури та додатків. Список літератури включає 236 найменувань джерел, серед яких 94 - іноземних авторів.

2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Роботу виконано у відділі біотехнології і контролю якості бактеріальних препаратів Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів упродовж 2002-2006 років.

У дослідах були використані паспортизовані штами бактерій різних таксономічних видів, отримані із Національного центру штамів мікроорганізмів ДНКІБШМ: 1) виробничий штам кишкової палички - Escherichia coli № 1084; 2) виробничий штам сальмонели - Salmonella cholerae suis № 9; 3) виробничий штам стрептокока - Streptococcus faecalis "Костянтинівський"; 4) тест-штам стафілокока - Staphylococcus aureus АТСС № 25923; 5) контрольно-виробничий штам збудника бешихи свиней - Erysipelothrix rhusiopathiae № 149; 6) тест-штам клостридії - Clostridium oedematiens 198 та 7) тест-штам Bacillus cereus АТСС 11778.

При проведенні досліджень з підбору складових для сорбційно-контактного зневоднення бактерій в експериментах були використані: 1) органічні (іонообмінні смоли марки КБ-4П-2 та КУ-2-8, які за своїми фізико-хімічними показниками відповідали вимогам і нормам ГОСТ 20298-74) та неорганічний (технічний силікагель марки МСКГ, фізико-хімічні показники якого відповідали вимогам і нормам ГОСТ 3956-76) адсорбенти; 2) дезагрегант-диспергатор біомаси (гідрофобний аеросил марки АМ 1-300); 3) посередники-зневоднювачі біомаси (лактоза та крохмаль).

Визначення залишкової вологості проводили згідно з ГОСТ 24061-80.

Підготовку культур до висушування здійснювали, використовуючи загальновідомі методики (Никитин Е. Е., Звягин И. В., 1971); підготовку спорової тест-культури Clostridium oedematiens 198 до висушування проводили згідно з ГОСТ 4483-2005.

У дослідах з підбору оптимальних захисних стабілізувальних середовищ для сорбційно-контактного зневоднення використовували комбіновані стабілізатори, до складу яких входили компоненти вуглеводного (сахароза, лактоза) і білкового (пептон із ступенем розщеплення 0,3, желатин, збиране молоко) походження, а також проводили дослідження щодо вивчення ефективності загальновідомих середовищ (Файбіча та "Mist Dessicans").

При вивченні ефективності сорбційно-контактного зневоднення бактерій як контрольний метод використовували ліофільне висушування. Ліофілізацію бактеріальних культур здійснювали на ліофільній установці LP 3 фірми Jouan (виробництво Франція) відповідно до "Методических рекомендаций по разработке режимов замораживания-высушивания биологических препаратов", 1981.

Ступінь збереження поверхневих структур і розмірів бактерій, висушених різними методами, через 24 місяці зберігання вивчали за допомогою електронної мікроскопії на електронному мікроскопі ПЕМ-125 К (виробництво м. Суми) при електронно-мікроскопічному збільшенні в 20 500 крат. Отримані негативи збільшували додатково фотографічно в 2 рази. Ультраструктуру бактерій досліджували методом негативного контрастування в секторі молекулярної біології та електронної мікроскопії ДНКІБШМ. Препарати фотографували на особливо контрастні діапозитивні фотопластинки (ГОСТ 10691-1-84).

Кількісний облік життєздатних клітин після висушування проводили методом граничних розведень одержаної суспензії в рідкому живильному середовищі з наступним висівом культур бактерій по 0,1 см3 з розведень 10-6, 10-7, 10-8 на тверді агаризовані середовища.

Культурально-біохімічні та патогенні властивості мікроорганізмів вивчали відповідно до загальноприйнятих методик, що представлені в довіднику під редакцією В. Я. Антонова (1971).

Стабільність антигенних властивостей Escherichia coli № 1084 визначали в динаміці, через 24 години, 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 місяців, після сорбційно-контактного зневоднення та ліофільного висушування в реакції аглютинації з аглютинувальною моновалентною О-колі сироваткою 0138 згідно з "Наставлением по применению агглютинирующих О-коли сывороток", 1980; Salmonella cholerae suis № 9 - у реакції аглютинації на предметному склі згідно з "Наставлением по применению наборов сывороток сальмонеллезных О-комплексных и монорецепторных О- и Н-агглютинирующих для экспресс-идентификации сальмонелл в РА на стекле", 1984; Streptococcus faecalis "Костянтинівський" - у реакції аглютинації з діагностичною сироваткою серогрупи Д згідно з "Методическими указаниями по лабораторной диагностике стрептококкоза животных", 1983; Erysipelothrix rhusiopathiae № 149 - у реакції аглютинації зі специфічною моносироваткою згідно з "Методическими указаниями по лабораторным исследованиям на рожу свиней", 1984.

Досліди з визначення стійкості контактно зневоднених бактерій під час їх десорбції з твердого носія здійснювали з використанням таких розчинів елюатів: дистильованої води, фізіологічного розчину, буферного фізіологічного розчину з додаванням 0,5 % розчину пептону, буферного фізіологічного розчину з додаванням 2 % інактивованої сироватки крові ВРХ, білково-цитратної води та середовища культивування.

Експериментальні дані статистично та математично обробляли методами варіаційної статистики за допомогою персонального комп'ютера з використанням програми “Microsoft Excel - 7,0” із обчисленням середнього арифметичного (M), стандартної помилки (m) і рівня вірогідності (р) за таблицею Стьюдента (Сюрин В. Н., 1966).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Підбір компонентів і оптимальних режимів для контактного зневоднення бактеріальних клітин. Результати досліджень засвідчили, що гранульована іонообмінна смола марки КБ-4П-2 забезпечувала зневоднення біоматеріалу до стану сухого сипкого порошку в 2 рази швидше порівняно із технічним силікагелем, тоді як у порівнянні зі швидкістю зневоднення адсорбентом КУ-2-8 - майже в 4 рази.

Під час вивчення показників життєздатності бактерій, зневоднених органічними адсорбентами КБ-4П-2 та КУ-2-8, а також неорганічним - технічним силікагелем марки МСКГ нами було встановлено, що найвищий відсоток життєздатних бактерій у процесі зневоднення та впродовж 9 місяців зберігання відзначався при використанні як наповнювача-зневоднювача біомаси органічного адсорбенту марки КБ-4П-2.

Аналіз отриманих результатів засвідчив, що втрата життєздатних бактерій кишкової палички на етапах процесу зневоднення катіонітом КБ-4П-2 становила 31,6 %, сальмонел - 35,0 %, стрептококів - 25,8 %, у той час як при застосуванні як наповнювача-зневоднювача біомаси адсорбенту КУ-2-8 досліджувані показники були вірогідно вищими і відповідно становили 44,0; 46,2 та 28,0 %. При використанні ж неорганічного адсорбенту відсоток загиблих бактерій порівняно із показниками, отриманими при застосуванні катіоніту КУ-2-8, був вірогідно нижчим, однак порівняно вищим за показники, отримані при зневодненні біоматеріалу катіонітом КБ-4П-2 (Escherichia coli № 1084 - 34,4 %, Salmonella cholerae suis № 9 - 38,0 %). Винятками були висушені зразки Streptococcus faecalis "Костянтинівський" - 23,2 %. Аналогічну картину відмічали і через 9 місяців зберігання досліджуваних зразків. Однак титр життєздатних клітин контактно зневоднених стрептококів технічним силікагелем на кінець терміну спостереження знизився і був вірогідно нижчим за показники, отримані при використанні як адсорбенту іонообмінної смоли КБ-4П-2, відповідно (50,4±2,5) та (63,8±2,7) %.

Незважаючи на достатньо високі показники життєздатності контактно зневоднених бактерій, технологія довготривалого зберігання мікроорганізмів з використанням методу сорбційно-контактного зневоднення потребувала подальшого вдосконалення.

З цією метою в технологію висушування бактеріальної суспензії було додатково введено такі складові, як дезагрегант-диспергатор біомаси (гідрофобний аеросил марки АМ-1-300) та посередник-зневоднювач (лактоза), що дозволило суттєво підвищити кількість життєздатних мікробних клітин в 1 г сухого препарату в процесі зневоднення та при наступному тривалому зберіганні препаратів. Власне в контрольних зразках відсоток життєздатних бактерій кишкової палички в готовому препараті становив (68,4±5,8) %; сальмонел - (65,0±4,1) % та стрептококів - (74,2±3,9) %, тоді як уведення етапів обробки гранул смоли гідрофобним аеросилом та додавання як посередника-зневоднювача лактози дозволило суттєво підвищити кількість життєздатних мікробних клітин відповідно до (91,6±2,1); (90,5±3,8) та (95,0±3,1) %. Порівняльний аналіз результатів досліджень через 9 місяців зберігання засвідчив аналогічне збереження характеру динаміки змін. У контрольних зразках титр життєздатних клітин до кінця терміну спостереження в середньому знизився на 45 %, у той час як у дослідних - лише на 16 %.

При відпрацюванні оптимальних режимів висушування встановлено, що введення в технологію сорбційно-контактного зневоднення бактеріальних клітин етапу рівномірного перерозподілу вологи з наступним інтенсивним, гомогенним перемішуванням бактеріальної суспензії забезпечило практично повне збереження життєздатності на етапах процесу дегідратації клітин і при наступному тривалому зберіганні висушених зразків. Як правило, втрата бактеріальних клітин у процесі зневоднення в середньому становила 2-3 %, тоді як у контрольних зразках - 5-10 %. До того ж при порівнянні з контрольними зразками спостерігалось збільшення відсотка життєздатних бактерій упродовж тривалого зберігання в 1,5-2 рази (табл. 1). Різниця значень наведених показників вірогідна за Р < 0,001 відносно значень відповідних показників у контрольних зразках.

Таблиця 1 Збереження життєздатності бактерій, висушених при різних режимах (М±m; n=6)

Вивчення впливу різних співвідношень адсорбенту з адсорбтивом на основні біологічні властивості мікроорганізмів та проведення підбору оптимального їх співвідношення. Важливою умовою ефективного висушування мікроорганізмів методом сорбційно-контактного зневоднення є оптимальний, індивідуальний підбір співвідношення адсорбенту з біоматеріалом. Оптимально підібране співвідношення дозволяє повністю перерозподілити "вільну" вологу від біомаси на наповнювач і міцно зв'язати її, забезпечуючи високу стійкість отриманого препарату.

За зовнішнім виглядом біоматеріал, висушений у співвідношеннях 4, 5, 6 та 7 масових часток адсорбенту до 1-ї масової частки адсорбтиву, було отримано у вигляді сухого, сипкого, полідисперсного білого порошку, без сторонніх домішок, конгломератів і цвілі, тоді як зразки, висушені в співвідношенні 3:1, мали вигляд вогкуватого, не сипкого, полідисперсного порошку світло-жовтого кольору, який не відповідав вимогам до контактно зневоднених препаратів.

Перевірка відповідності морфологічних властивостей штамів засвідчила, що під час зберігання зразків, висушених у різних співвідношеннях адсорбенту до адсорбтиву, впродовж 2 років у більшості видів бактерій вони відповідали паспортним даним. Винятками були бактерії збудника бешихи свиней, висушені в співвідношеннях 3:1, 5:1, 6:1 і 7:1. Як правило, у полі зору мікроскопа більшою чи меншою мірою спостерігали наявність інволюційних форм. Крім того, було відмічено загальну закономірність для всіх висушених препаратів у співвідношеннях 6:1 і 7:1 - нерівномірне розміщення та значні скупчення бактерій у полі зору мікроскопа.

Аналіз отриманих результатів засвідчив, що оптимальним співвідношенням адсорбент : адсорбтив, яке забезпечило в процесі зберігання дослідних зразків повне збереження основних біологічних властивостей та високий рівень життєздатності, для бактерій кишкової палички, сальмонел, стрептококів та стафілококів було 5:1, для бактерій збудника бешихи свиней і клостридій - 4:1, тоді як для Bacillus cereus оптимальними були співвідношення - 4:1 та 5:1.

Показово й те, що препарати із залишковою вологістю вище 13,0 % і нижче 10,0 % не володіли достатньо високою стійкістю та характеризувались зменшенням біологічної активності та відсотка живих бактеріальних клітин до кінця терміну спостереження (через 2 роки).

Підбір ефективних захисних стабілізувальних середовищ для сорбційно-контактного зневоднення. З метою зниження ступеня прояву видових особливостей щодо стійкості бактерій до дії зневоднення нами було проведено індивідуальний підбір оптимально ефективного захисного стабілізувального середовища для різних видів бактерій, яке забезпечило максимальне збереження біологічної активності досліджуваних мікроорганізмів при тривалому їх зберіганні. Так, для бактерій кишкової палички та сальмонел оптимальним захисним середовищем упродовж 24 місяців зберігання було середовище, до складу якого входили сахароза, глутамат натрію, тіосечовина, пептон. Через 2 роки зберігання титр життєздатних клітин Escherichia coli № 1084 становив (85,6±2,2) % і Salmonella cholerae suis № 9 відповідно - (82,5±4,2) %. Найвищий відсоток життєздатних бактерій упродовж 2 років зберігання в Streptococcus faecalis "Костянтинівський" - (87,6±2,8) %, Staphylococcus aureus АТСС - (84,8±3,3) % та тест-штаму Bacillus cereus - (86,0±4,3) % спостерігався при зневодненні мікроорганізмів із додаванням сахарозо-желатинового стабілізатора, тим часом як для Clostridium oedematiens 198 оптимальними були два захисні середовища - сахарозо-желатинове та середовище Файбіча. Найвищий рівень збереження життєздатних клітин штамом збудника бешихи свиней (75,3±4,0) % реєстрували при додаванні як стабілізувального агента компонентів вуглеводного і білкового походження - сахарозо-пептон-желатинового середовища.

Відпрацювання процесу десорбції бактеріальних клітин з твердого носія із збереженням високої активності висушених препаратів. Як відомо, процес регідратації має пошкоджуючу дію на клітини і робить необхідним застосування ефективного розчину елюату для збереження вихідної активності мікроорганізмів упродовж періоду десорбції бактеріальних клітин із твердого носія. Ураховуючи сказане вище, наступним етапом наших досліджень було вивчення впливу різних елюатів на стійкість контактно зневоднених бактерій під час їх десорбції з твердого носія та підбір найбільш ефективного розчину елюату для бактерій різних видів.

Результати досліджень засвідчили, що практично стовідсоткової життєздатності бактерій кишкової палички в процесі десорбції з твердого носія можна досягти, використавши як елюат БФР із додаванням 2 % інактивованої сироватки крові ВРХ - (1,97Ч109±0,18) мікр. кл./г сухого препарату. Рівень збереження життєздатності стафілококів був вірогідно однаковим при десорбції біоматеріалу з твердого носія БФР із додаванням 0,5 % пептону, БФР із додаванням 2 % сироватки крові ВРХ та середовищем культивування і відповідно становив 1,96Ч109 мікр. кл. Збереження максимальної кількості життєздатних клітин збудника бешихи свиней у процесі десорбції стало можливим при застосуванні як елюат середовища культивування - МПБ Хоттінгера, збагаченого сироваткою крові коней та розчином глюкози - (1,92Ч109±0,15) мікр. кл. Однаково ефективними регідратаційними розчинами для бактерій тест-штаму Bacillus cereus були фізіологічний розчин, БФР із додаванням 0,5 % пептону та БФР із додаванням 2 % сироватки крові ВРХ - життєздатність при цьому становила 1,97Ч109 мікробних клітин на 1 г сухого препарату.

Підбір оптимальних вихідних концентрацій бактеріальних суспензій для контактного зневоднення. У результаті експериментальних досліджень нами було встановлено прямо пропорційну залежність щодо збереження рівня життєздатності контактно зневодненими штамами бактерій від вихідної концентрації мікробних клітин у суспензії впродовж тривалого зберігання. Так, у суспензіях, які містили 2Ч109 мікробних клітин на 1 г сухого препарату, через 2 роки після сорбційно-контактного зневоднення збереглось майже в 1,5 рази більше живих бактерій, ніж у суспензіях із концентрацією клітин 1Ч109, а саме: 85,6 % мікробних клітин кишкової палички проти 74,8 %; 82,5 % мікробних клітин сальмонел проти 68,0 %; 75,3 % мікробних клітин збудника бешихи свиней проти 56,0 %; 87,6 % стрептококів проти 79,0 %; 84,8 % мікробних клітин стафілококів проти 74,0 %; 86,0 % мікробних клітин Bacillus cereus проти 76,0 % мікр. кл./г сухого препарату.

Аналогічну картину спостерігали і при обліку кількості життєздатних бактерій через 2 роки після ліофільного висушування - 76,0 % мікробних клітин кишкової палички проти 56,0 %; 67,4 % мікробних клітин сальмонел проти 52,6 %; 53,5 % клітин збудника бешихи свиней проти 32,8 %; 88,5 % стрептококів проти 79,0 %; 77,8 % стафілококів проти 64,9 %; 80,0 % клітин Bacillus cereus проти 66,2 % мікробних клітин/см3.

Більше того, установлено, що в процесі ліофілізації та в перші 3 місяці після висушування спостерігалось більш інтенсивне відмирання бактеріальних клітин порівняно з кількістю життєздатних бактерій у контактно зневоднених зразках.

Розробка системи заходів щодо запобігання контамінації культур бактерій при проведенні контактного зневоднення. Установлено, що важливою умовою успішного здійснення сорбційно-контактного зневоднення мікроорганізмів є правильно організована система забезпечення якості на основі комплексу заходів щодо запобігання контамінації під час підготовки складових до висушування і при безпосередньому проведенні процесу зневоднення, виконанні правил зневоднення та контролю якості сухого препарату.

На основі проведених досліджень нами було розроблено систему заходів щодо запобігання контамінації культур бактерій при проведенні контактного зневоднення, яка включає: підготовку лабораторного посуду, гумових пробок, алюмінієвих ковпачків до фасування й укупорювання; перевірку на стерильність живильних і захисного стабілізувального середовищ; контроль на стерильність складових зневоднення; контроль на контамінацію бактеріальної суспензії сторонньою бактеріальною та грибковою мікрофлорою; підготовку приміщення, інструментів і обладнання до зневоднення.

Установлено, що найбільша ймовірність контамінації бактеріальної суспензії під час здійснення сорбційно-контактного зневоднення відмічалась у результаті недотримання режиму стерилізації сорбційно-дисперсійного модуля та забруднення складових зневоднення внаслідок порушення норм та вимог під час обробки та підготовки обладнання і приміщення. З метою забезпечення більш надійної ізоляції робочої зони від сторонніх мікроорганізмів замість боксових кімнат за можливості рекомендується використовувати настільні або ламінарні бокси.

Натомість, варто зазначити, що дотримання комплексу заходів під час підготовки приміщення, обладнання та складових до сорбційно-контактного зневоднення попередить ймовірність контамінації бактеріальної суспензії в процесі зневоднення та сприятиме забезпеченню високої якості готового препарату.

Порівняльне вивчення в динаміці рівня збереження життєздатності після сорбційно-контактного зневоднення та ліофілізації. З метою визначення якості проведеного сорбційно-контактного зневоднення колекційних культур бактерій було здійснено облік життєздатних клітин у суспензії відразу після висушування (через 24 години), через 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 місяців.

Проаналізувавши результати досліджень, нами було встановлено, що втрата життєздатних бактерій після сорбційно-контактного зневоднення наприкінці терміну спостереження (через 2 роки) в середньому становила близько 15-25 % (табл. 2).

Таблиця 2 Динаміка життєздатності бактерій після контактного зневоднення (М±m; n=6)

Примітка: різниця значень наведених показників вірогідна за Р < 0,001; * = 0,01 < Р < 0,001 відносно значень відповідних показників до висушування

Вважаємо за необхідне відзначити, що достовірний аналіз ефективності сорбційно-контактного зневоднення неможливий без порівняльної оцінки життєздатності бактерій з іншим методом висушування (в даному випадку з ліофілізацією) (табл. 3).

Порівняльний аналіз результатів досліджень засвідчив, що через 2 роки після сорбційно-контактного зневоднення життєздатність бактерій кишкової палички становила (1,71Ч109±0,13) мікр. кл./г сухого препарату, тоді як після ліофільного висушування - (1,52Ч109±0,05) мікр. кл./см3; Salm. ch. suis № 9 - (1,65Ч109±0,22) мікр. кл./г, відповідно проти (1,34Ч109±0,09) мікр. кл./см3; стафілококів - (1,70Ч109±0,09) мікр. кл./г проти (1,55Ч109±0,05) мікр. кл./см3; а Bacillus cereus АТСС - (1,72Ч109±0,06) мікр. кл./г проти (1,60Ч109±0,12) мікр. кл./см3, при вихідній концентрації 2Ч109 мікр. кл./см3.

Особливо яскраво виражена відмінність у збереженні життєздатності в збудника бешихи свиней, висушеного різними методами. Відтак, життєздатність контактно зневоднених бактерій наприкінці терміну спостереження становила (1,51Ч109±0,06) мікр. кл./г сухого препарату, тоді як ліофільно висушених - (1,07Ч109±0,16) мікр. кл./см3, що у відсотковому відношенні відповідно становить - 75,3 % життєздатних бактерій проти 53,5 %. Винятками були контактно зневоднені стрептококи із вихідною концентрацією бактеріальних клітин у суспензії 2 млрд мікр. кл./г сухого препарату. Як показав аналіз, рівень збереження життєздатних бактерій наприкінці терміну спостереження становив (1,75Ч109±0,21) мікр. кл./г препарату, тим часом як ліофільно висушених - (1,77Ч109±0,13) мікр. кл./см3.

Отже, результати аналізу збереження життєздатності ліофільно висушених бактерій засвідчили, що через 24 місяці зберігання втрата життєздатних мікроорганізмів у середньому становила від 15 до 45 %, що майже в 1,5-2 рази більше порівняно із показниками, отриманими після сорбційно-контактного зневоднення.

Таблиця 3 Динаміка життєздатності бактерій після ліофільного висушування (М±m; n=6)

Примітка: різниця значень наведених показників вірогідна за Р < 0,001; * = 0,01 < Р < 0,001 відносно значень відповідних показників до висушування

З метою визначення швидкості переходу культури, висушеної різними методами, із стану анабіозу до лаг-фази і фази експоненційного росту було здійснено визначення інтенсивності накопичення бактеріальної маси Streptococcus faecalis "Костянтинівським" і Er. rusiopathiae № 149. Інтенсивність розмноження контактно зневоднених бактерій порівнювали зі швидкістю накопичення бактеріальної маси ліофільно висушеними мікроорганізмами.

Під час порівняння інтенсивності накопичення бактеріальної маси контактно зневодненими та ліофільно висушеними стрептококами отримано практично ідентичні результати - за оптимальних умов культивування на МПБ бактеріальна суспензія з первинною концентрацією 10 мікр. кл./см3 досягла максимуму в обох випадках через 500 хвилин. Визначена концентрація при цьому становила 1Ч109 мікр. кл./см3. Водночас результати визначення швидкості накопичення бактеріальної маси контактно зневодненим та ліофільно висушеним штамом збудника бешихи свиней № 149 певною мірою відрізнялись між собою (рис.1).

Установлено, що за оптимальних умов культивування на МПБ Хоттінгера, збагаченого сироваткою крові коней та розчином глюкози, бактеріальна суспензія з первинною концентрацією 20 мікр. кл./см3 після сорбційно-контактного зневоднення здатна швидше досягати максимуму - через 36 годин, тоді як після ліофільного висушування накопичення бакмаси припинилось лише через 40 годин. Концентрація мікробних клітин при цьому становила (1,88Ч109±0,16) мікр. кл./см3 і відповідно (1,56Ч109±0,29) мікр. кл./см3 при (0,01 < Р < 0,001).

Рис. 1 Динаміка накопичення бактеріальної маси ліофільно та контактно висушеним штамом збудника бешихи свиней.

Дослідження впливу різних методів довготривалого зберігання бактерій на їх ультраструктуру та морфологічні властивості. При аналізі результатів мікроскопії проб, отриманих із культур контактно та ліофільно висушених бактерій, відзначено відповідність тинкторіальних і морфологічних характеристик штамів паспортним даним упродовж 2 років зберігання. зневоднення бактеріальний адсорбент мікроорганізм

Результати електронно-мікроскопічних досліджень засвідчили, що в зависях контактно зневоднених бактерій та контрольних пробах основу популяції становили клітини переважно нормальної форми зі збереженою внутрішньою структурою та цілісною бактеріальною оболонкою. До того ж у контактно зневоднених пробах спостерігалось утворення компактних скупчень, в яких бактерії навколо себе утворювали аморфний приклітинний шар. Тим часом як у зависях бактерій після ліофільного висушування (Escherichia coli № 1084 та Salm. cholerae suis № 9) поряд із клітинами нормальної форми та будови зустрічались поодинокі, неправильної форми клітини з ділянками лізису та зморщуванням бактеріальної оболонки. На відміну від паличкоподібних, у зависях грампозитивних кокоподібних бактерій (стафілококів та стрептококів) і споротвірних культурах негативного впливу ліофілізації на ультраструктуру клітин не було зафіксовано. У контрольних зависях, контактно зневоднених та ліофільно висушених пробах в основному відмічались клітини зі збереженням нормальних контурів і цілісності бактеріальних оболонок без деформації і руйнування внутрішньої структури.

Порівняльне вивчення впливу контактного зневоднення та ліофілізації на культурально-біохімічні, антигенні й патогенні властивості бактерій різних видів. При порівняльному аналізі методів ліофільного висушування і контактного зневоднення за показником збереження культурально-біохімічних властивостей були встановлені незначні відмінності між ними, які стосувались в основному інтенсивності утворення кишковою паличкою металевого блиску на середовищі Ендо, швидкості знебарвлення стрептококами метиленового синього в молоці та збереження здатності кислото- та газоутворення впродовж довготривалого зберігання висушених препаратів.

Установлено, що контактно зневоднені бактерії кишкової палички на середовищі Ендо мали здатність давати майже 100 % КУО з інтенсивно вираженим металевим блиском, тоді як ліофільно висушені - лише 82,7 %.

Відзначено, що ліофільно висушені бактерії кишкової палички в процесі зберігання втратили здатність ферментувати глюкозу з утворенням газу, відновлення якої відбувалось лише після проведення 3-5 пасажів на живильних середовищах. Контактно зневоднені бактерії в процесі зберігання цієї здатності не втратили і за своїми характеристиками відповідали паспортним даним.

Однак здатність знебарвлювати Str. faecalis "Костянтинівським" метиленовий синій у молоці через 2 роки зберігання була незначною мірою вищою в ліофільно висушених бактерій. Як показав аналіз, через 24 години після висушування дегідрогеназна активність ліофільно висушених і контактно зневоднених стрептококів була однаковою і становила 8,00 секунд, проте через 2 роки зберігання зазначена здатність у контактно зневоднених бактерій дещо знизилась і становила 10,00 секунд відповідно проти 9,80 секунд.

Установлено, що процеси ліофілізації та сорбційно-контактного зневоднення не викликали негативних змін з боку антигенної активності бактерій, стабілізуючи її тривалий період (упродовж 2 років зберігання). Виняток становив ліофільно висушений штам кишкової палички, в якого в процесі зберігання було відмічено вірогідне зниження антигенної активності до (10,3±0,32) lоg2, у той час як після контактного зневоднення антигенна активність культури через 2 роки зберігання практично не знизилась і становила (11,3±0,24) lоg2, відносно вихідної - 11,64 lg2.

Аналіз та узагальнення отриманих результатів засвідчили про повне збереження контактно зневодненими та ліофільно висушеними бактеріями різних видів патогенних та імуногенних властивостей упродовж 2 років зберігання.

Розробка та відпрацювання технології довготривалого зберігання бактерій з використанням методу сорбційно-контактного зневоднення. Спираючись на отримані результати досліджень, нами було розроблено та відпрацьовано технологію довготривалого зберігання бактерій з використанням методу сорбційно-контактного зневоднення, яка включає такі основні етапи:

- підготовчі та допоміжні роботи, спрямовані переважно на запобігання контамінації культур бактерій при проведенні сорбційно-контактного зневоднення (підготовка лабораторного посуду, гумових пробок, алюмінієвих ковпачків до фасування й укупорювання; підготовка приміщення, інструментів і обладнання (лабораторного шарового барабану, ламінарного боксу); виготовлення та перевірка на стерильність живильних і захисного стабілізувального середовищ; контроль на стерильність складових зневоднення);

- основні технологічні (приготування до зневоднення сорбційно-дисперсійного модуля; отримання бактеріальної суспензії; визначення біологічної активності культур; додавання оптимального захисного стабілізувального середовища; сорбційно-контактне зневоднення біоматеріалу; укупорювання, етикетування та зберігання препаратів при температурі (4±2)0 С; десорбція бактеріальних клітин з твердого носія з наступним відновленням культури оптимальним живильним середовищем);

- контроль готової продукції за показниками якості: зовнішній вигляд; залишкова вологість; контамінація сторонньою бактеріальною і грибковою мікрофлорою, типовість культури; кількість живих мікробних клітин в 1 г сухого препарату.

Для сорбційно-контактного зневоднення колекційних штамів бактерій рекомендовано застосовувати гранульовану іонообмінну смолу марки КБ-4П-2 в Na+ - формі з розміром гранул 160-630 мкм, концентрацією іона водню не менше 8,0 од. рН, залишковою вологістю менше 1 % і коефіцієнтом набрякання не нижче 4,4. Перед початком зневоднення бактеріальної суспензії на поверхню гранул іонообмінної смоли необхідно нанести дезагрегант-диспергатор біомаси - гідрофобний аеросил марки АМ-1-300 в кількості 2 %, а також як посередник-зневоднювач - лактозу, не менше 15 % від маси адсорбенту.

Змішування наповнювача-зневоднювача з дезагрегантом-диспергатором і посередником-зневоднювачем, а також модифікованого таким чином наповнювача-зневоднювача з біомасою, проводять у лабораторному шаровому барабані.

Важливо зазначити, що для кожного таксономічного виду бактерій необхідно здійснювати індивідуальний підбір співвідношення адсорбенту з адсорбтивом (найчастіше це 4:1 та 5:1).

За зовнішнім виглядом контактно зневоднений препарат повинен являти собою сухий, сипкий, полідисперсний білий порошок, без сторонніх домішок, конгломератів і цвілі; бути вільним від сторонньої бактеріальної і грибкової мікрофлори та типовим за морфологічними характеристиками; відповідати після сорбційно-контактного зневоднення встановленим для даного виду бактерій паспортним даним. Залишкова вологість контактно зневоднених препаратів має бути в межах 10-13 %.

Рекомендовано препарати, що зберігались в умовах холодильника (4±2)0 С, витримувати при кімнатній температурі впродовж 40-60 хвилин, потім готувати наважку масою 1,0 г, яку розчиняють 99 см3 охолодженим до температури (4±2)0 С стерильним розчином елюату, оптимально підібраним для кожного таксономічного виду бактерій. Після цього суспензію необхідно ретельно перемішати і відстояти впродовж 5 хвилин. Подальше відновлення культури здійснюють з використанням оптимального живильного середовища.

Як правило, втрата життєздатних клітин у процесі сорбційно-контактного зневоднення біоматеріалу не повинна перевищувати 3-5 %.

За результатами проведених досліджень рекомендовано для різних видів бактерій, висушених методом сорбційно-контактного зневоднення, термін зберігання - не менше ніж 2 роки за оптимальних умов (при температурі 4±20 С).

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі теоретично узагальнено і практично обґрунтовано ефективність застосування технології довготривалого зберігання бактерій з використанням методу сорбційно-контактного зневоднення в лабораторіях ветеринарної медицини, депозитаріях та науково-дослідних установах з метою довготривалого зберігання бактерій різних видів. Установлено, що контактне зневоднення бактерій має технологічні переваги, мінімальне інструментальне забезпечення, а також щадний режим висушування, за рахунок чого забезпечується збереження біологічних властивостей та структури мікроорганізмів. Розроблено систему заходів щодо запобігання контамінації культур бактерій при проведенні контактного зневоднення.

Підібраний набір складових для сорбційно-дисперсійного модуля, до складу якого входять: наповнювач-зневоднювач біомаси - гранульована іонообмінна смола марки КБ-4П-2, дезагрегант-диспергатор біомаси - гідрофобний аеросил марки АМ-1-300 і посередник-зневоднювач - лактоза та відпрацьований режим поступового зневоднення бактеріальних клітин забезпечують високий рівень життєздатності бактерій (кишкової палички - (98,0±1,6) %; сальмонел - (98,0±2,0) %; стрептококів - (98,5±1,4) %) як на етапах зневоднення, так і в процесі тривалого зберігання, відповідно Escherichia coli № 1084 - (83,6±3,6) %; Salmonella cholerae suis № 9 - (78,5±4,1) %; Streptococcus faecalis "Костянтинівський" - (85,8±2,6) %.

Співвідношення адсорбенту до адсорбтиву 4:1-5:1 забезпечує повне збереження біологічних властивостей та високий рівень життєздатності мікроорганізмів і практично не відрізняється для різних видів бактерій (E. сoli, Salm. ch. suis, Str. faecalis, Staph. aureus - 5:1, Er. rhusiopathiae, Cl. oedematiens - 4:1, а для Bacillus cereus оптимальними були співвідношення 4:1 та 5:1).

Ефективність довготривалого зберігання бактерій, висушених методом сорбційно-контактного зневоднення, залежить від захисного стабілізувального середовища, використання якого необхідно здійснювати з урахуванням видових особливостей бактерій. Так, найкращий рівень збереження життєздатних клітин Escherichia coli № 1084 (85,6±2,2) % і Salmonella cholerae suis № 9 (82,5±4,2) % забезпечує середовище, до складу якого входять: сахароза, тіосечовина, глутамат натрію та пептон; Streptococcus faecalis "Костянтинівський" (87,6±2,8) %, Staphylococcus aureus АТСС (84,8±3,3) % та тест-штаму Bacillus cereus АТСС (86,0±4,3) % - сахарозо-желатинове середовище; Clostridium oedematiens 198 - сахарозо-желатинове та середовище Файбіча; Erysipelothrix rhusiopathiae № 149 (75,3±4,0) % - сахарозо-пептон-желатинове середовище.