Пластичні зміни нейронів гіпокампа при порушеннях мозкового кровотоку і шляхи їх корекції

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

УДК 612.822.56:616.831-005.4+615.21

ПЛАСТИЧНІ зміни нейронів гіпокампа при порушеннях мозкового кровотоку і шляхи ЇХ корекції

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ОСАДЧЕНКО ІРИНА ОЛЕКСІЇВНА

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі цитології Інституту фізіології ім.О.О. Богомольця НАН України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України, Скибо Галина Григорівна, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділу цитології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Квітницька-Рижова Тетяна Юріївна, Інститут геронтології АМН України, завідувач лабораторії морфології та цитології

доктор медичних наук, Луханіна Олена Павлівна, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, провідний науковий співробітник відділу фізіології головного мозку

Захист відбудеться “ 20 ” січня 2009 р. о “_14_” годині

На засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01601, м.Київ-24, вул. Богомольця, 4

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (01601, м.Київ-24, вул.Богомольця, 4).

Автореферат розісланий “ 10 ” грудня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

АНОТАЦІЯ

Осадченко І.О. Пластичні зміни нейронів гіпокампа при порушеннях мозкового кровотоку і шляхи їх корекції. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13. - фізіологія людини та тварин. - Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ - 2008.

Дисертація присвячена вивченню динаміки ішемічного ушкодження зони СА1 гіпокампа та нейропротекторної дії ароматичної амінокислоти L-фенілаланіну та водорозчинної форми кверцетину у щурів та монгольських піщанок. щур ішемічний нейропротекторний кверцетин

Ішемію мозку моделювали у щурів шляхом 4-х судинної оклюзії сонних та вертебральних артерій протягом 15 хвилин та 2-х судинної оклюзії сонних артерій у піщанок монгольських протягом 7 хвилин. Через 15 хв, 2 год, 1, 2, 3, 4 чи 7 діб після ішемії брали тканину гіпокампа для досліджень. До та після оклюзії проводили поведінкові тести на локомоторну активність та соматосенсорну чутливість.

Для аналізу брались лише ті тварини, у яких спостерігалися гіперактивна поведінка та соматосенсорний дефіцит через 1 добу після ішемії, що характерно для ішемічного ушкодження мозку. На ультрамікроскопічному рівні виявлені ранні зміни в структурній організації синаптичних терміналей: синаптичні контакти реагували першими на короткотривалу ішемію і в них з'являлись структурні зміни задовго до появи морфологічних ознак загибелі нейронів.

Встановлено, що L-Phe має виражений нейропротекторний ефект, що проявляється у зменшенні кількості загиблих нейронів в зоні СА1 гіпокампа після ішемії-реперфузії. Показано, що водорозчинний кверцетин збільшує кількість клітин зони СА1 гіпокампа, які виживали на 7 добу після короткотривалої ішемії. Отримані дані припускають потенційну можливість використання L-Phe і флавоноїда кверцетину як нейропротекторів при ішемічному ушкодженні мозку.

Ключові слова: ішемія мозку, синаптична пластичність, гіпокамп, L-фенілаланін, кверцетин, нейропротекція.

АННОТАЦИЯ

Осадченко И.А. Пластические изменения нейронов гиппокампа при нарушениях мозгового кровообращения и пути их коррекции. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13. - физиология человека и животных. - Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев - 2008.

Диссертация посвящена изучению динамики развития ишемического повреждения нейронов зоны СА1 гиппокампа, а также исследованию нейропротекторного действия ароматической аминокислоты L-фенилаланина (L-Phe), а также водорастворимой формы кверцетина (ВК) на модели кратковременной ишемии головного мозга у крыс и монгольских песчанок. Ишемию мозга моделировали у крыс путем 4-х сосудистой окклюзии сонных и вертебральных артерий в течение 15 минут и 2-х сосудистой окклюзии сонных артерий у песчанок монгольских в течение 7 минут. Через 15 минут, 2 часа, 1, 2, 3, 4 или 7 суток после ишемического эпизода брали ткань гиппокампа для дальнейших исследований. До и после окклюзии проводили поведенческий тест “открытое поле” на локомоторную активность и пробу на соматосенсорную чувствительность (adhesive removal test). Для дальнейшего анализа брали лишь тех животных, у которых наблюдались гиперактивное поведение и соматосенсорный дефицит через сутки после ишемии - такие временные нарушения в поведении экспериментальных животных характерны при ишемическом повреждении мозга.

Кратковременная ишемия мозга у крыс и песчанок приводила к отстроченному повреждению и гибели нейронов зоны СА1 гиппокампа, причем степень повреждения зависела как от длительности самого ишемического воздействия, так и от продолжительности периода после реперфузии.

Было показано, что в ранний постишемический период (15 мин и 2 часа реперфузии) синаптические контакты реагировали первыми на кратковременную ишемию и в них выявлялись структурные изменения задолго до появления морфологических признаков гибели нейронов. Было выявлено изменение формы и типов синаптических контактов с последующей отсроченной дегенерацией около 80% терминалей в stratum radiatum зоны СА1 гиппокампа.

Наблюдалось изменение соотношения типов синапсов в сторону увеличения количества перфорированных и множественных синаптических контактов по сравнению с контролем на фоне постепенного уменьшения общего количества синапсов. Считается, що перфорированные и множественные синапсы с большим постсинаптическим уплотнением (ПСУ), с измененной кривизной и большим количеством сайтов для освобождения медиатора, более эффективны для синаптической передачи по сравнению с простыми синапсами. Можно предположить, что увеличение количества перфорированных и мультисинапсов в ранние сроки после ишемии-реперфузии свидетельствует об адаптативных пластических изменениях синаптического аппарата.

Отмечалось достоверное уменьшение количества синаптических везикул (СВ) в пресинаптических терминалях с реорганизацией их пространственного распределения. Уже на 15 минуте реперфузии количество СВ уменьшалось, увеличивалось расстояние между везикулами, а также их удаленность от пресинаптической мембраны. Этот эффект был более выраженный на кластерах пулов СВ, находящихся в пределах 100 нм от активной зоны. Такие изменения могут указывать на повреждение процесса рециркуляции СВ и отражать проявления синаптической дисфункции после ишемического воздействия.

На 7 день постишемического периода наряду со снижением на 44% (по сравнению с контролем) количества СВ наблюдалось максимальное утолщение и диффузное расслоение ПСУ.

На протяжении первых суток после ишемии-реперфузии нейроны зоны СА1 гиппокампа поддерживали свою структурную целостность, но на ультраструктурном уровне были отмечены начальные изменения. Они проявлялись в просветлении цитоплазмы нейронов и в начальных проявлениях нарушений структуры митохондрий в виде расширения межкристных промежутков и просветления матрикса вследствие отека. Недостаток энергетического обеспечения нейронов, вызванный ишемией, приводил к нарушению белкового и липидного обменов, которое проявлялось в фрагментации и вакуолизации эндоплазматического ретикулума и накоплении гранул липофусцина в результате нарушения обмена ненасыщенных жирных кислот. На 3 сутки после ишемии-реперфузии прослеживалась активация микроглиальных клеток, которые скапливались около дегенерирующих нейронов и периваскулярно. В глиальных клетках отмечались активация лизосомального аппарата, локальный отек цитоплазмы; выявлялось участие микроглии в поглощении и расщеплении дегенерирующих остатков нейронов. Прослеживалась связь между степенью морфологических изменений нейрональных клеток и уровнем активации глиальных клеток. На более поздних этапах наблюдалось развитие дегенеративных изменений в нейронах и нейропиле гиппокампа с дальнейшим их нарастанием.

В исследованиях влияния ароматической аминокислоты L-фенилаланина на выживание нейронов зоны СА1 гиппокампа и их морфологию после ишемии-реперфузии мозга было установлено, что L-Phe оказывает выраженный нейропротекторный эффект, который проявлялся в значительном увеличении (примерно на 30%) количества неповрежденных пирамидных нейронов в зоне СА1 гиппокампа, выживших на 7-е сутки после кратковременной ишемии. Полученные данные допускают потенциальную возможность применения ароматической аминокислоты L-фенилаланина в медицинской практике при ишемическом повреждении мозга.

При изучении действия водорастворимого флавоноида кверцетина - корвитина, было показано уменьшение структурных повреждений в гиппокампе и увеличение количества пирамидных нейронов, которые выжили на 7 сутки после ишемии-реперфузии. Причем, более выраженный нейропротекторный эффект наблюдался при профилактическом применении кверцетина. (неповрежденных нейронов было почти в 4 рази більше, чем в группе ишемизированных животных).

Эти результаты свидетельствуют о целесообразности применения этого препарата с профилактической целью в группах больных с риском развития цереброваскулярных нарушений.

Ключевые слова: ишемия мозга, синаптическая пластичность, гиппокамп, L-фенилаланин, кверцетин, нейропротекция.

ANNOTATION

Osadchenko I.O. The plasticity changes in hippocampal neurons under blood circulation disturbances in brain and pathways of its corrections. - Manuscript.

The thesis for the defense of scientific degree of candidate of biology sciences in speciality 03.00.13. - human and animals physiology. - Bogomoletz Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv - 2008.

The thesis deals with the study of dynamics of ischemic damages in hippocampal CA1 area as well as neuroprotective effect of L-phenylalanin (L-phe) and water-soluble form of quercetine. A forebrain ischemia was performed using 4-vessel 15-min-long occlusion in rats and 2-vessel 7-min-long occlusion in gerbils with reperfusion that followed. The “open field” and adhesive removal tests were used to estimate a postischemic behavioral deficits in locomotor and somato-sensory activity. It was shown that for pyramidal neurons the degree of post-ischemic injury depends on the duration of both ischemic episode and reperfusion-reoxygenation period. An adaptive synaptic plasticity develops in the brain tissue briefly after the ischemic episode including, namely, the modification in spatial arrangement of synaptic vesicles, decrease in their numbers, increase in the proportion of perforated synapses and multiple synapse boutons etc. L-phe was shown to have a protective effect displayed in the decrease of injured and dead neurones after ischemia-reperfusion. Neuroprotective properties of quercetine were demonstrated in preventive and therapeutic regiments. Quercetin applied according to a preventive regiment had more pronounced neuroprotective effect. The data obtained allow to suggest the expediency to using L-phe and quercetin as neuroprotective drugs.

Key words: brain ischemia, hippocampal CA1 area, L-phenylalanine, quercetin, neuroprotection.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Судинні захворювання головного мозку залишаються однією з найгостріших медико-соціальних проблем. Вони наносять величезних економічних збитків суспільству, оскільки є основною причиною екстреної госпіталізації і тривалої інвалідизації населення.

В останні роки спостерігається зростання частоти гострих порушень мозкового кровообігу. У більшості країн інсульт займає 2-3 місце в структурі загальної смертності населення, в Україні - третє, поступаючись серцево-судинним та онкологічним захворюванням. Крім того, гострі порушення мозкового кровотоку несуть загрозу виникнення незворотніх структурних ушкоджень нервової тканини і ризику розвитку з часом деяких нейродегенеративних захворювань головного мозку, таких як хвороба Альцгеймера, хвороба Хангтинктона, епілепсія, розсіяний склероз та ін. (De Deyn, 1999; Mattson, 2002). Тому, церебральний інсульт є проблемою надзвичайної медичної та соціальної значущості і профілактика та лікування ішемічних ушкоджень мозку займають важливе місце серед актуальних проблем сучасної неврології та нейрохірургії.

Ішемічний інсульт розвивається внаслідок гострого порушення мозкового кровообігу, зумовленого гіпоперфузією та припиненням кровопостачання в певній ділянці мозку з формуванням зони некрозу - інфаркту (Hacke W., 2003). Протягом перших 6 годин після розвитку інсульту зону інфарктного ядра оточує ділянка, в якій структурна організація нейронів та глії зберігається при наявності дефекту функціональної активності. Цю частину ішемізованого мозку називають ішемічною напівтінню, або “пенумброю” (Willis T., 2003). Порушення функції нейронів у зоні пенумбри мають зворотній характер і здатні до відновлення протягом 1-6 годин (Віничук С.М., 2005). Протягом цього часу потрібно застосовувати фармакологічну корекцію, яка дасть змогу перервати каскад ушкоджуючих процесів у нейронах, забезпечити повернення їх до нормального стану та попередити відставлену нейрональну загибель. Обидві використані нами експериментальні моделі відображали процеси, що характерні для зони ішемічної “напівтіні” при інсульті.

Численні дослідження нейрональних ушкоджень, викликаних ішемією, перш за все сфокусовані на головних механізмах клітинної смерті і виживання. Досі недостатню увагу приділяли вивченню модифікацій нервових зв'язків і синаптичній морфології, які мають важливий вплив на клітинну функцію і виживання у ранньому постішемічному періоді.

Велика увага в сучасній медицині приділяється пошуку ефективних нейропротекторних засобів, які здатні впливати на перебіг патологічних процесів у мозку. Розробляються фармакологічні препарати, які можуть впливати на основні патогенетичні механізми: глутаматну ексайтотоксичність, порушення іонного обміну, оксидативний стрес.

Серед речовин, які впливають на механізм глутаматної ексайтотоксичності, розглядають дію ароматичних амінокислот, зокрема, L-фенілаланіну (L-Phe). В дослідах in vitro було показано, що в ішемічних умовах L-Phe послаблює вивільненя глютамату і може виявляти нейропротекторний вплив частково через конкурентне зв'язування глутаматних рецепторів (Glushakov A.V., 2002, 2003; Kagiyama T., 2004), а частково завдяки антиоксидантним властивостям (Маляревський П.Ю., 2005). Однак досі невідомо, як L-Phe буде впливати на морфо-функціональний стан нейронів при ішемії мозку в цілісному організмі, тому цілком актуальним було провести дослідження можливого нейропротекторного впливу ароматичної амінокислоти L-Phe та її ендогенного галогенового деривату 3,5-дибром-L-тирозину (DBrT) на моделі in vivo.

Відомо, що біофлавоноїд кверцетин є одним з найпотужніших антиоксидантів, проявляє антирадикальну, мембраностабілізуючу дії, має властивості модулятора активності різноманітних ферментів, що беруть участь в деградації фосфоліпідів, впливають на вільнорадикальні процеси, відповідають за клітинний біосинтез оксиду азоту, протеіназ та ін. (Middleton E.Jr., 2000; Robak J., Gryglewski R., 1988). Враховуючи потужний вплив кверцетину на прооксидантно-антиоксидантний гомеостаз було доцільним вивчити можливу нейропротекторну дію цього препарату при експериментальній ішемії мозку.

Актуальними є питання детального вивчення динаміки розвитку ушкодження нейронів СА1 зони гіпокампа після ішемії-реперфузії мозку, які поряд з нейронами стріатума та кори мозку є дуже чутливими до нестачі кисню та глюкози, порівняно з іншими структурами мозку (Winkelmann E.R., 2006). Практичне значення цієї роботи полягає не тільки в розумінні процесів, що відбуваються з нервовою тканиною після ішемії-реперфузії, а і в дослідженні нейропротекторних властивостей ароматичних амінокислот та природного флавоноїда - кверцетину з можливістю подальшого використання їх у клінічних дослідженнях.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертації пов'язана з дослідженнями, які виконуються відділом цитології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: пошук ефективних засобів впливу на молекулярні механізми, які обумовлюють збудливість клітин та дослідження молекулярних механізмів проявів функціонування геному, що зумовлюють специфічність діяльності фізіологічних систем організму в нормі та при патології (№ державної реєстрації 0102U002472).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчити ступінь і динаміку розвитку ішемічного ушкодження нейронів гіпокампа та дослідити нейропротекторну дію ароматичних амінокислот та водорозчинної форми флавоноїда кверцетину (ВК) на моделі короткотривалої ішемії мозку.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1 - розробити експериментальні моделі ішемічного ушкодження мозку на щурах та піщанках для вивчення механізмів відстроченої загибелі нейронів після ішемії-реперфузії та для фармакологічної корекції ушкодження мозку;

2 - дослідити динаміку розвитку ушкодження нейронів зони СА1 гіпокампа в постішемічному періоді в залежності від тривалості ішемічного впливу та тривалості періоду після реперфузії;

3 - вивчити ультраструктурні характеристики синаптичної пластичності нейронів зони СА1 гіпокампа в ранньому постішемічному періоді;

4 - вивчити нейропротекторний вплив ароматичної амінокислоти L-Phe та її деривату DBrT на нейрони зони СА1 гіпокампа при експериментальній ішемії мозку;

5 - вивчити нейропротекторну дію водорозчинної форми кверцетину (ВК) на нейрони зони СА1 гіпокампа в умовах моделювання ішемічного ушкодження мозку.

Об'єкт дослідження: нейрони зони СА1 гіпокампа щурів і піщанок монгольських.

Предмет дослідження: пластичні зміни нейронів та їх синаптичного апарату в зоні СА1 гіпокампа після короткотривалої ішемії мозку; нейропротекторний вплив L-Phe, DBrT та водорозчинного кверцетину на нейрони зони СА1 гіпокампа в умовах моделювання ішемічного ушкодження мозку.

Методи дослідження. Для досягнення мети даної роботи було використано метод експериментальної короткотривалої ішемії головного мозку: 4-судинна оклюзія сонних та вертебральних артерій у щурів і 2-судинна оклюзія сонних артерій у монгольських піщанок. Для вивчення якісних і кількісних характеристик нейронів використовували світлову і електронну мікроскопії та методи морфометричного аналізу одержаних препаратів. Для узагальнення отриманих даних було використано статистичну обробку результатів за t-критерієм Стьюдента.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено морфологічні дослідження на світлооптичному та електронно-мікроскопічному рівнях динаміки постішемічних змін нейронів зони СА1 гіпокампа після 4-судинної оклюзії сонних та вертебральних артерій у щурів та 2-судинної оклюзії сонних артерій у монгольських піщанок. Вперше визначено залежність ступеню пошкодження нейронів гіпокампа від тривалості ішемії мозку та постішемічного періоду. Вперше проведено ультраструктурні дослідження пластичності нейронів та синаптичного апарату в зоні СА1 гіпокампа в ранньому постішемічному періоді. Вперше виявлено нейропротекторний вплив ароматичної амінокислоти L-фенілаланіну на нейрони зони СА1 гіпокампа після короткотривалої ішемії мозку. Вперше показано на моделі двосудинної оклюзії сонних артерій у піщанок, що водорозчинний кверцетин має виражені нейропротекторні властивості, а саме, при застосуванні препарату виявлено збільшення кількості пірамідних нейронів, які вижили на сьому добу після ішемії-реперфузії.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дослідження мають фундаментальне значення для поглиблення відомостей про механізми ішемічного ушкодження мозку. В прикладному аспекті одержані дані вказують на наявність нейропротекторних властивостей ароматичної амінокислоти L-фенілаланіну і водорозчинного кверцетину (корвітину); розширюють уяву про механізми їх дії на клітини мозку, а також припускають потенційну можливість використання L-фенілаланіну та кверцетину у клінічній практиці з метою запобігання ішемічних ушкоджень мозку.

Oсобистий внесок здобувача. При виконанні роботи здобувачем проведений науковий пошук та обґрунтування напрямку досліджень, самостійно проведені експериментальні дослідження на тваринах, морфологічна та морфометрична обробка матеріалу, статистична обробка та аналіз отриманих даних. Планування експерименту, інтерпретація отриманих даних і формулювання висновків проведено спільно із науковим керівником. У проведенні хронічних експериментів брали участь співробітники відділу цитології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації слухали та обговорювали на: II Міжнародній науковій конференціі «Мікроциркуляція та її вікові зміни» (Київ, 2002); IV Международной Конференции по Функциональной Нейроморфологии «Колосовские чтения - 2002» (Санкт-Петербург, Россия, 2002); Міжнародній конференції «ASTROECO-2002 (Hypoxia. Ecology)» (Terskol, Russia, 2002); Пленумі наукового товариства патофізіологів України (Одеса, 2002); ІІІ національному конгресі анатомів, гістологів, ембріологів та топографоанатомів України (Київ, 2002); Науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження М.І. Зазибіна (Київ, 2004); Науково-практичній конференції «Гістологія на сучасному етапі розвитку науки» (Тернопіль, 2004); Всеукраїнській конференції з міжнародним представництвом «Нейроендокринні і імунні механізми регуляції гомеостазу в нормі та патології» (Запоріжжя, 2005); конференції Українського товариства нейронаук з міжнародною участю, присвяченій 75-річчю Донецького державного медичного університету ім. М. Горького, (Донецьк, 2005); 5^th International symposium on experimental and clinical neurobiology (Tatranska Lomnica, Slovak Republic, 2005); Международной конференції по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения-2006» (Санкт-Петербург, 2006); I національному конгресі «Інсульт та судинно-мозкові захворювання» (Київ., 2006); IV Національному конгресі АГЕТ України (Сімферополь, 2006); 5th European neuroscience meeting FENS Forum (Відень, Австрія, 2006); International Biophysics Workshop «Academician Radoslav K. Andjus» on Imaging in Neurosciences and Beyond (Sveti Stefan, Montenegro, 2006); IV Міжнародному міждисциплінарному конгресі «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2008); 6^th FENS Forum of European Neuroscience (Geneva, Switzerland, 2008); Научной конференції з міжнародною участю «Високогірна гіпоксія і геном» (Терскол, Кабардино-Балкарія, Росія, 2008).

Публікації. Результати дисертації викладені в 30 публікаціях: статті - 12, тези конференцій, симпозіумів - 18.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 142 сторінках і складається зі змісту, переліку умовних скорочень, вступу, розділів: огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень, аналіз і узагальнення результатів дослідження; висновків та списку використаних літературних джерел. Робота ілюстрована 35 рисунками, з яких 2 таблиці і 42 мікрофотографії. Перелік використаної літератури містить 269 посилань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження

У дослідженнях використовували дві моделі церебральної ішемії: 4-х судинну оклюзію сонних та вертебральних артерій у щурів і 2-х судинну оклюзію сонних артерій у монгольських піщанок. Усі експерименти виконані з дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях (European convention, Strasburg, 1986). Експерименти проведені на 65 самцях щурів (3-4 місяці, вагою 250-300 г) та 75 статевозрілих (6-7 місяців, вагою 60 - 100 г) самцях піщанок монгольських (Meriones unguiculatus).

Короткотривалу ішемію мозку у щурів викликали шляхом 4-судинної оклюзії артерій, що живлять мозок (4CO), за методом Pulsinelli W.A. (1979). Щурів наркотизували каліпсолом (75 мг/кг) і через вентральний розріз по середній лінії шиї ізолювали обидві загальні сонні артерії. Під кожну артерію підводили лігатуру без переривання кровотоку, розріз зашивали. Після цього тварин фіксували в стереотаксичному апараті і робили другий розріз позаду потиличної кістки завдовжки 1 см над С1 - С2 хребцями. Параспинальні м'язи відділяли від кісток у напрямку від середньої лінії і, використовуючи операційний мікроскоп, розкривали правий і лівий криловидні отвори у першому шийному хребці. Голку електрокаутера діаметром 0,5 мм вводили в ці отвори і каутеризували по черзі обидві вертебральні артерії, перериваючи кровопостачання головного мозку через ці артерії на весь подальший час. Наступного дня тварин знерухомлювали ефіром, знімали шов з переднього шийного розрізу і накладали атравматичні затискачі на загальні сонні артерії. Через 10, 15 або 20 хвилин затискачі знімали і кровотік в сонних артеріях відновлювався (реперфузія). Несправжньооперовані (контрольні) щури були піддані тим же хірургічним втручанням, окрім каутеризації вертебральних і оклюзії cонних артерій. Післяопераційну рану засипали порошком стрептоциду, зашивали шовним матеріалом і обробляли шкіру 5% спиртовим розчином йоду. Матеріал для подальших морфологічних досліджень брали через 1, 2, 3, 4 чи 7 діб постішемічного періоду. У деяких серіях досліджень тривалість періоду реперфузії складала 15 хвилин і 2 години.

У піщанок короткотривалу ішемію мозку викликали оклюзією обох загальних сонних артерій (2СО). Даний вид тварин широко застосовують у світових наукових дослідженнях, оскільки у будові кровоносної системи головного мозку піщанок є специфічні особливості. Через недорозвинуте Вілізієве коло для створення моделі ішемії мозку цілком достатньо перетискання обох загальних сонних артерій без необхідності припинення кровотоку по хребцевих артеріях [Kato R., 1990]. Для оперативного втручання тварин попередньо наркотизували внутрішньом'язовим введенням каліпсолу (75 мг/кг) та ксилазину (2 мг/кг), робили поперечний розтин шкіри на шиї, тупе розшарування підшкірно-жирової тканини та м'язів з подальшим відпрепаруванням обох загальних сонних артерій. За допомогою атравматичних мікрозатискачів перетискували обидві загальні сонні артерії протягом 5, 7 чи 10 хвилин з наступним відновленням кровотоку (реперфузія). Післяопераційну рану обробляли порошком стрептоциду, зашивали шовним матеріалом і обробляли шкіру розчином йоду. Забір матеріалу для морфологічних досліджень робили на 1-шу та 7-му добу після оклюзії сонних артерій.

Для оцінки наявності ішемічного ушкодження мозку перед моделюванням ішемії та після 1 доби реперфузії проводили тест “відкрите поле”, який оцінював локомоторну активність, та робили пробу на тактильну чутливість (Ishibashi S., 2006; Katsumata N., 2006, Сhen J., 2001). Суть тесту “відкрите поле” полягала в тому, що тварини, які мали ішемічне ушкодження мозку, знаходячись в тестовій камері, проявляли локомоторну гіперактивність порівняно з контрольними. Підлога тестової камери була поділена на квадрати, підраховували кількість квадратів, які перетинала тварина протягом 5 хвилин. Cоматосенсорний дефіцит визначали по збільшенню часу зняття твариною тестового стимулу. У ролі білатерального тактильного стимулу використовували адгезивні (липкі зі зворотньої сторони) паперові клаптики діаметром 6 мм, які прикріплювали до обох передніх лап в дистально-радіальній ділянці зап'ясть. Реєстрували час до усунення (зняття) кожного подразника з передніх лап. Тварин, у яких не виявляли порушення вищенаведених поведінкових реакцій, не брали для подальшого дослідження.

Для проведення структурних та ультраструктурних досліджень тканини гіпокампа тварин (контрольних та з ішемією) наркотизували внутрішньом'язовим введенням каліпсолу (75 мг/кг) та інгаляційно - ефіром. Фіксацію тканини у піщанок та щурів проводили методом транскардіальної перфузії фіксуючим розчином, який містив 4% параформальдегіду і 2,5% глютаральдегіду на 0,1 М фосфатному буфері, рН 7,4. Фронтальні зрізи виділеного гіпокампа завтовшки 400 мкм обробляли за загальноприйнятими для електронномікроскопічних досліджень методиками і заливали в епоксидні смоли (Epon - Araldit). Напівтонкі зрізи, забарвлені толуідиновим синім та крезилвіолетом, вивчали на світлооптичному рівні та проводили морфометричний аналіз одержаних препаратів за допомогою комп'ютерної системи аналізу зображень Image Tool та BIOQUANT (R&M Biometrics, USA). Підраховували відносну кількість ушкоджених, загиблих та неушкоджених нейронів в зоні СА1 гіпокампа на 1 мм довжини пірамідного шару (Kirino T, 2000) в різні строки після ішемії порівняно з контролем.

Ультратонкі зрізи середньої третини stratum radiatum зони СА1 гіпокампа, товщиною 50 - 70 нм, контрастовані в уранілацетаті і цитраті свинцю, вивчали в електронному мікроскопі JEM-100 CX (Японія). На мікрофотографіях, отриманих з електронного мікроскопу із збільшенням х 10000, за допомогою комп'ютерної програми UTHSCSA ImageTool (версія 3, Університет Техасу, Сан Антоніо, США) підраховували загальну кількість асиметричних аксо-шипикових синапсів та їх типів на одиницю площі. Площа мікрознімку була лімітована рамкою 36 m². Загальна площа, що була проаналізована для кожної експериментальної групи, складала 1080-1440 m².

Проводили кількісний та просторовий, з використанням методу визначення відстані до найближчого сусіда (Nikonenko A.G., 2004), аналіз розподілу синаптичних везикул в терміналях і аналіз кривизни синапсів. Крім того, на зрізах вимірювали довжину і товщину профілів постсинаптичного ущільнення (ПСУ), а також діаметр мітохондрій і дендритів (350-570 мітохондрій і 100 дендритів у кожній групі).

Для вивчення нейропротекторної дії ароматичних амінокислот готували 12 мМ розчин L-фенілаланіну (L-Phe) та 3,5-дибром-L-тирозину (DBrT) - ендогенного галогенового деривату ароматичної амінокислоти L-Phe на фізіологічному розчині і вводили тваринам по 0.5 мл інтраперитонеально перед початком ішемії та одразу після початку реперфузії мозку і потім дозовано 8 разів по 0.25 мл протягом наступних двох годин, імітуючи тривалу крапельну інфузію розчинів препаратів (Kagiyama T., 2004). Підраховували відносну кількість неушкоджених нейронів в зоні СА1 гіпокампа на 1 мм довжини пірамідного шару після ішемії та після ішемії із застосуванням L-Phe, порівняно з контролем.

У дослідженнях, присвячених вивченню нейропротекторної дії водорозчинного кверцетину (ВК) - корвітину, препарат вводили інтраперитонеально по схемі, у разовій дозі 50 мг/кг маси тіла тварини (у перерахунку 5 мг/кг кверцетину). Підраховували відносну кількість нейронів, що вижили (неушкоджених) в зоні СА1 гіпокампа на 1 мм довжини пірамідного шару після ішемії та після ішемії із застосуванням ВК, порівняно з контролем.

Статистичну обробку цифрових даних проводили за t-критерієм Стьюдента, відмінності вважалися достовірними при р<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Серед структур головного мозку найчутливішими до нестачі кисню поряд з корою півкуль та стріатумом є гіпокамп, а саме його СА1 зона. Об'єктом наших досліджень був обраний гіпокамп - структура мозку, яка відповідальна за процеси формування пам'яті і навчання (Winkelmann E.R., 2006). Відомо, що після ішемічного ушкодження мозку спостерігається порушення неврологічних функцій у експериментальних тварин (Katsuta K., 2003). Тому, для оцінки наявності ішемічного ушкодження мозку проводили тести на локомоторну активність та пробу на тактильну чутливість у піщанок перед моделюванням ішемії та після реперфузії протягом постішемічного періоду (Ishibashi S., 2006; Katsumata N., 2006, Сhen J., 2001).

У наших експериментах гіперактивна поведінка ішемізованих тварин сягала свого максимуму через 24 години після оклюзії і поступово зменшувалася протягом постоклюзійного періоду. На 7 добу локомоторна активність оперованих тварин дорівнювала показникам контрольних (несправжньооперованих ) тварин.

Можливо, це відбувається за рахунок потенціювання синтезу АРР (білка-попередника амілоїда) (Yam P.S., 1997) надлишком глютамату, який вивільнюється під час ішемічного впливу. Було показано, що накопичення АРР в гіпокампі призводить до порушення синаптичної передачі пірамідних нейронів зони СА1, яке спричиняє локомоторну гіперактивність (Katsumata N., 2006).

Після ішемічного ушкодження мозку спостерігалось порушення соматосенсорних функцій, про що свідчило збільшення часу, протягом якого тварина знімала тестовий подразник (“липучку”).

Таке порушення поведінкових реакцій особливим чином корелює із загибеллю нейронів зони СА1 гіпокампа і може бути використане як важливий діагностичний фактор наявності пошкодження гіпокампа після експериментального ішемічного епізоду (Mileson B.E., 1998).

Анатомічною особливістю гіпокампа є розташування в зоні СА1 пірамідних нейронів, соми яких згруповані в пірамідному шарі завширшки з 3-5 клітин. Середній діаметр нейронів цієї зони складає близько 40 нм. Тіла їх мають велике світле округле ядро з добре розрізнюваними одним чи двома ядерцями та вузьку смужку дещо темнішої цитоплазми навколо ядра. Крім того, на поперечних зрізах гіпокампа видно чітко окреслені апікальні дендрити у поздовжньому розрізі, орієнтовані паралельно у радіальному напрямку, а тіла нейронів зосереджені у вигляді довгої вузької смужки в пірамідному шарі, що дає можливість аналізувати та підраховувати кількість тіл нейронів на одиницю довжини пірамідного шару (Kirino T., 2000).

Експериментально було встановлено, що у контрольних піщанок структура пірамідного шару в зоні СА1 гіпокампа ні якісно, ні кількісно не відрізнялась від цієї ж зони у контрольних щурів.

Для проведення аналізу ступеня ішемічного ушкодження тканини гіпокампа у щурів створювали ішемію мозку тривалістю 10, 15 та 20 хвилин і аналізували пошкоджуючу дію ішемії на 1, 2, 3, 6 та 7 добу після оклюзії. У деяких серіях досліджень тривалість періоду реперфузії складала 15 хвилин і 2 години. Експериментальним шляхом було встановлено, що 15-хв артеріальна оклюзія у щурів призводила до відстроченого і поступового (з 3-ої по 7-му добу) збільшення кількості пошкоджених та загиблих пірамідних нейронів в зоні СА1 гіпокампа.

Для проведення аналізу ступеня ішемічного ушкодження тканини гіпокампа у піщанок монгольських створювали ішемію мозку іншої тривалості, ніж у щурів, 5, 7 та 10 хвилин. Аналізували пошкоджуючу дію ішемії на 1, 3 та 7 добу після оклюзії. На сьому добу після 5-хвилинної оклюзії ішемічний вплив на нейрони СА1 зони був виражений нерівномірно і у деяких тварин був незначний. В деяких ділянках зони СА1 були осередки або скупчення некротично ушкоджених клітин, що вказувало на нерівномірність пошкодження цієї зони при даній тривалості ішемії. Ділянки зі скупченнями некротично ушкоджених клітин мали менше рядів клітин, що може свідчити про потоншення пірамідного шару внаслідок загибелі нейронів. В радіальному шарі СА1 зони навпроти неушкоджених нейронів спостерігали відповідні їм неушкоджені дендрити, а навпроти некротизованих нейронів відповідні їм апікальні дендрити були відсутні.

У всіх досліджених групах тварин, яких піддавали ішемічному впливу, на зрізах гіпокампа підраховували кількість лише неушкоджених клітин. У групі тварин після 5-хв ішемії середня кількість неушкоджених клітин на 1 мм довжини СА1 зони становила 63% від контролю. При 10-хвилинному терміні оклюзії виявлено, що структурні зміни були максимальними і виявлялись вже на першу добу у вигляді набряку пірамідних нейронів всіх зон у гіпокампі; а до 3-ї доби відбувалась загибель більшості нейронів в зоні СА1. Після оклюзії протягом 7 хвилин виявлялась відстрочена на кілька діб (4-7) загибель нейронівка корелювала з активацією як астроцитів, так і мікрогліальних клітин.

В результаті вивчення динаміки розвитку відстроченого ушкодження та загибелі нейронів зони СА1 гіпокампа (Padosch S.A., 2003) на обох використаних моделях було встановлено, що, незважаючи на різну тривалість ішемічного епізоду (15 хвилин у щурів та 7 хвилин у піщанок), характер клітинного ушкодження був однаковим і залежав від тривалості оклюзії та періоду після реперфузії. Обидві моделі становили собою модель відстроченої нейрональної смерті, що викликалась ішемією і є характерною для зони пенумбри при інсульті (Dirnagl U., 1999; Kirino T., 2000).

За допомогою електронно-мікроскопічних досліджень були виявлені помірні зміни в пірамідних нейронах зони СА1 гіпокампа вже на першу добу після 15-хвилинної 4СО. Ці зміни проявлялись у просвітленні цитоплазми нейронів внаслідок їх набрякання та у початкових проявах порушень структури мітохондрій у вигляді розширення міжкристних проміжків та просвітлення матриксу внаслідок набряку. Спостерігалось розширення цистерн ендоплазматичного ретикулуму з подальшим наростанням його вакуолізації, поява численних мембранних структур неправильної форми в дендритах і терміналях СА1 зони. Недостатність енергетичного забезпечення нейронів, викликана ішемією, призводила до порушення білкового та ліпідного обмінів, що виявлялось у фрагментації та вакуолізації ендоплазматичного ретикулуму та накопиченні гранул ліпофусцину внаслідок порушення обміну ненасичених жирних кислот.

Зі збільшенням постішемічного терміну з третьої по сьому добу в нейронах наростали явища деструкції - вакуолізація цитоплазми, значна осміофілія ядра та цитоплазми. Мембрани, як плазматичні, так і цитоплазматичні, руйнувались, відбувався лізіс органел, і такі некробіотичні зміни призводили до загибелі нейронів. З третьої доби чітко прослідковувалась активація мікрогліальних клітин, які концентрувались навколо дегенеруючих нейронів та периваскулярно. В гліальних клітинах відмічались активація лізосомального апарату, локальний набряк цитоплазми, чітко виявлялась участь мікроглії в поглинанні та розщепленні дегенеруючих залишків нейронів. На сьому добу постішемічного періоду зустрічались також апоптотичні зміни нейронів у вигляді фрагментації ядер з утворенням апоптотичних тілець. В мікросудинах виявлявся прогресуючий з часом периваскулярний набряк структур, що складають гематоенцефалічний барьєр, головним чином, астроцитарних відростків.

В ішемізованій тканині гіпокампа була відмічена пластична відповідь, яка включала синаптичну реконструкцію. Аналіз постішемічних ультраструктурних змін асиметричних аксо-шипикових синапсів в середній третині stratum radiatum СА1 зони гіпокампа показав наступне: щільність синаптичних контактів зменшувалась таким чином, що спостерігалась втрата біля 65% їх кількості і тільки біля 20% від контрольної синаптичної популяції зберігали нормальну ультраструктуру на 7 день після ішемії-реперфузії.

Наші дослідження показали, що синаптичні контакти першими реагували на короткочасну ішемію і трансформувалися задовго до появи явних морфологічних ознак клітинної смерті. Ішемічний епізод став причиною ранніх, яскраво виражених структурних модифікацій типів синаптичних контактів. Вже на 15 хвилині реперфузії спостерігалось збільшення кількості перфорованих і множинних синаптичних контактів порівняно з контролем. Вважається, що перфоровані синапси і мультисинапси з більшим постсинаптичним ущільненням (ПСУ), зі зміненою кривизною і більшою кількістю сайтів для звільнення медіатора є більш ефективними для синаптичної передачі, ніж прості (Jourdain P., 2002; Edwards F.A, 1999). Перфорація синапсів також корелює з реактивним синаптогенезом, підтверджуючи припущення, що після пошкодження деяка кількість синапсів збільшує свою ефективність (Marrone and Petit, 2002). Тому можливо припустити, що збільшення кількості перфорованих контактів і мультисинапсів в ранні строки після ішемії-реперфузії свідчить про адаптивні пластичні зміни синаптичного апарату.

Крім того, спостерігались зміни форми синапсів, а саме, удвічі збільшувалась кількість увігнутих синапсів, що може пояснюватись збільшенням кривизни активної зони синапса в результаті включення збільшеної кількості мембран синаптичних везикул у пресинаптичну мембрану внаслідок підвищеного виділення нейротрансмітера у відповідь на короткотривалу ішемію (Martone M.E., 1999). Разом з тим, кількість опуклих контактів не змінювалась. Через 2 години після ішемії кількість перфорованих синапсів і множинних синаптичних контактів ще збільшувалась, а кількість увігнутих синапсів була максимальною. Через 24 години після ішемії кількість перфорованих синапсів була максимальною, а увігнутих синапсів було в 3 рази більше, ніж у контролі.

На 7-му добу після ішемії кількість перфорованих синапсів і мультисинапсів знижувалась майже до контрольних значень, що корелювало зі зниженням кількості увігнутих контактів. Спостерігалось збільшення кількості опуклих контактів, що, можливо, пов'язане з деструктивними процесами в постсинаптичних закінченнях і їх значним набряканням.

Короткотривала ішемія викликала достовірне зменшення кількості синаптичних везикул (СВ) усередині пресинаптичних терміналей та реорганізацію їх просторового розподілу. Також спостерігались зміни параметрів (товщини і довжини) постсинаптичного ущільнення (ПСУ) вже після 15-хв терміну реперфузії, які залишались значними і через 2 години. Після 24 годинного терміну реперфузії кількість СВ продовжувала знижуватись: вони були більш віддалені від активної зони і ставали менш згрупованими, тобто, зростала відстань між ними. Цей ефект був більш виражений на кластерах пулів СВ, які знаходились у межах 100 нм від активної зони.

Є дані, що після короткочасної ішемії змінюється рівень експресії або рівень фосфорилювання протеїнів синаптичних везикул (SNAP-25, synapsin, synaptotagmins, mint1), які приймають участь у регуляції синаптичної передачі і циклу СВ. Ці зміни пов'язують з ушкодженням синаптичної функціії (Bolay H., 2002; Jung Y.J., 2004; Yokota N., 2001; Ishimaru H., 2001; Nishimura H., 2000; NakajimaY., 2001). Відзначене нами зменшення кількості СВ, а також їх перегрупування усередині терміналей може вказувати на ушкодження процесу рециркуляції СВ та відображати прояви синаптичної дисфункції після ішемічного впливу.

На 7 добу постішемічного періоду поряд зі зниженням кількості СВ на 44% від контролю спостерігалось максимальне потовщення і дифузне розшарування ПСУ. Доведено, що викликане ішемією збільшення внутрішньоклітинного кальцію і продукція вільних радикалів активує протеази і, в результаті, руйнує білки, зв'язані з ПСУ. Крім того, відщеплені білки можуть агрегуватись і змінювати структуру ПСУ, роблячи його більш диффузним [Liu C.L., 2004], що і спостерігалось в наших дослідженнях.

Можна припустити, що відмічені нами ранні ультраструктурні зміни в синапсах після ішемії-реперфузії створюють сигнал, який прогресивно розповсюджується ретроградно від синапсів до клітинного тіла [Martone M.E., 1999] і там, з часом, викликає чи сприяє виникненню відстроченої нейрональної смерті в постішемічному періоді.

Для вивчення можливості запобігання відстроченій загибелі клітин шляхом фармакологічної корекції була обрана модель 2СО оклюзії на піщанках з тривалістю ішемічного впливу 7 хвилин. Морфологічний контроль виживання нейронів здійснювався на 7 добу після ішемії, оскільки саме в цей строк (7 діб) спостерігається найбільш виражена пошкоджуюча дія ішемії на нейрони гіпокампа.

Тваринам, у яких моделювали ішемічне ураження мозку, вводили L-Phe або DBrT. На 7-му добу після ішемії-реперфузії у групі тварин без введення ароматичних амінокислот в зоні СА1 спостерігалась масова загибель нейронів, неушкодженими залишались лише 10% клітин порівняно з контролем. Після введення L-Phe було виявлено збільшення кількості пірамідних нейронів, які виживали на сьому добу після ішемії (на 27,5 % більше, в порівнянні з попередньою групою). Неушкоджені нервові клітини у тварин, яким вводили L-Phe, мали чітко виражені плазматичну та ядерну мембрани, наявність ядерець, апікальних дендритів. Сома нейронів мала дещо більші розміри, що може свідчити про їх набрякання. Однак, при введенні L-Phe ця уразлива до ішемії зона гіпокампа структурно була більше збереженою.

Інша картина спостерігалась при введенні DBrT: близько 15% нейронів були ушкодженими, решта клітин загинули. Така негативна дія DBrT на виживання нейронів при ішемії може бути пов'язана із поганою розчинністю цієї сполуки і застосуванням для її покращення значної кількості лугу.

Позитивний вплив L-Phe на виживання пірамідних нейронів в умовах експериментальної моделі ішемії мозку можна пояснити його властивістю зв'язуватися з NMDA-рецепторами (через гліциновий сайт), з конкуренцією за глутамат-зв'язуючий сайт AMPA/каїнатних рецепторів, а також зі здатністю L-Phe ослаблювати вивільнення глутамату та його антиоксидантною дією (Glushakov A.V., 2002, 2003; Kagiyama T., 2004; Yarotskyy V., 2005; Martynyuk A.E., 2005). Саме ці особливості L-Phe можуть приймати участь у попередженні цитотоксичного впливу надлишку збуджуючих амінокислот, зокрема глутамату, на структури мозку, що може обумовлювати його нейропротекторну дію при ішемії мозку.

У останні десятиріччя продовжується інтенсивний пошук нейропротекторних засобів з антиоксидантними і мембранопротекторними властивостями, якомога менш токсичних, і, разом з цим, близьких по дії до природних. Нещодавно було виявлено, що група рослинних сполук, об'єднаних загальною назвою флавоноїди, має значний антиоксидантний потенціал; їх відносять до природних біологічно активних фенольних сполук, які знайдені в багатьох продуктах рослинного походження. Природний флавоноїд кверцетин, який має найбільш потужну антиоксидантну та антирадикальну дію серед флавоноїдних сполук, має також властивості модулятора активності ферментів, що беруть участь в деградації фосфоліпідів, впливають на вільнорадикальні процеси та відповідають за клітинний біосинтез оксиду азоту, протеіназ та ін. (Middleton E.Jr., 2000).

Для дослідження нейропротекторного впливу кверцетину нами було використано водорозчинну форму кверцетину (ВК), створену українськими вченими (О.О.Мойбенко, Ю.М.Колчин, Н.П.Максютіна, О.М Пархоменко та М.А.Мохорт, 1998), яку застосовують для внутрішньовенного введення хворим людям як кардіопротектор.

Оцінку нейропротекторної дії ВК на пірамідні нейрони зони СА1 гіпокампа проводили через сім діб після ішемії-реперфузії на піщанках монгольських.

У групі тварин з ішемією на сьому добу на перший план виходили некротичні зміни нейронів. Лише незначна частина клітин (9,8 %) в зоні СА1 гіпокампа у ішемізованих тварин виглядала неушкодженою, тобто ці клітини мали добре вирізнюване ядро, цитоплазму, хоча виглядали дещо набряклими. Кількість їх складала 20±6 клітин на 1 мм довжини пірамідного шару.

У тварин експериментальних груп, яким вводили ВК протягом 6 діб після ішемії, виявлено збільшення у 3 рази кількості пірамідних нейронів, які виживали на сьому добу після ішемії. Кращі результати були отримані при застосуванні препарату до (профілактично) та після ішемії: кількість неушкоджених нейронів зростала до 80±9 клітин на 1 мм довжини зони СА1, що було майже в 4 рази більше, ніж у групі ішемізованих тварин.

Проведені дослідження свідчать про досить ефективний нейпротекторний вплив ВК при ішемії-реперфузії мозку. Той факт, що більш виражена протекторна дія виявляється при додатковому профілактичному введенні ВК, дозволяє припустити, що більший ефект у лікувальній практиці може виявитися при застосуванні цього препарату з профілактичною метою в групах хворих з ризиком розвитку цереброваскулярних порушень.

Механізми впливу ВК на процеси, що відбуваються при ішемічному ушкодженні мозку, пов'язують з його структурними особливостями. Відомо (Дадали Ю.В., 2000), що наявність у структурі флавоноіда глікозидного залишку спричиняє погану його розчинність у воді та біологічних рідинах організму, утруднює доступ флавоноїда до ліпідів мембран. Внаслідок відсутності у будові ВК глікозидного залишку, він активно усуває продукти пероксидації, захищаючи ліпіди клітинних мембран від пошкодження. Cтупінь антирадикальної активності залежить також від кількості вільних фенольних гідроксильних груп у молекулі. Наявність 5 гідроксильних груп у кверцетині визначає його спроможність виступати у якості відновлювача (донора водню) стосовно вільних радикалів з утворенням більш стабільних флавоноксильних сполук, що призводить до переривання ланцюгової реакції перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) (Кравченко Л.В., 2003). ВК блокує індуцибельну NO-синтазу і таким чином захищає тканину мозку від несприятливого впливу пероксинітриту (Cho S.Y., 2003).

Вважають, що короткотривала ішемія мозку індукує експресію ММП-9 (матриксних металопротеїназ) в гіпокампі, що призводить до загибелі пірамідних нейронів (Lee S.R., 2004) і є дані, що кверцетин інгібує ферментативну активність ММП (Cho J.Y., 2006).

Протизапальну дію кверцетину пов'язують з його здатністю пригнічувати прозапальні міогензалежні протеїнкіназні шляхи (MAPкіназні), такі як JNK (Cho S.Y., 2003; Ishikawa Y., 2000; Wang L., 2002). Крім того, кверцетин інгібує інші кінази, такі як сАМР-залежну кіназу, протеїнкіназу С і кальмодулін-залежну кіназу (Formica J.V., Regelson W., 1995).

Враховуючи багатогранність корисних фармакологічних властивостей кверцетину, його природне походження і здатність впливати одночасно на декілька основних патогенетичних механізмів, що запускаються при ішемічному ушкодженні мозку, можна припустити потенційну можливість використання водорозчинного кверцетину у медичній практиці з метою запобігання ішемічних ушкоджень мозку.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі представлено результати морфо-функціональних досліджень динаміки розвитку ішемічного ушкодження нейронів СА1 зони гіпокампа та нейропротекторної дії ароматичних амінокислот та водорозчинної форми флавоноїда кверцетину на моделях короткочасної ішемії мозку у щурів та піщанок монгольських.

1. Короткочасна експериментальна ішемія мозку, що викликалася 4-х судинною оклюзією у щурів і 2-х судинною оклюзією у піщанок, призводила до відстроченого ушкодження та загибелі нейронів зони СА1 гіпокампа. Ступінь ушкождення залежав як від тривалості самого ішемічного впливу, так і від тривалості періоду після реперфузіі. Ішемічне ушкодження мозку приводило до порушення поведінкових реакцій тварин.

2. Виявлено, що динаміка відсроченого ушкодження та загибелі нейронів зони СА1 гіпокампа мала однаковий характер в обох використаних моделях: 15-хвилинній оклюзії на щурах та 7-хвилинній оклюзії у піщанок. Обидві моделі відображали процеси, характерні для зони ішемічної “напівтіні” при інсульті.