Фізіологічні закономірності впливу окремих параметрів процесу кріоконсервації на запліднюючу здатність сперміїв кнура іn vivo

Размещено на http://www.allbest.ru

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ СВИНАРСТВА ім. О.В. КВАСНИЦЬКОГО УААН

БАЗаЛЕВиЧ Алла Володимирівна

УДК 612;014, 4. 636.4

ФІЗІОЛОГІЧНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ ВПЛИВУ ОКРЕМИХ ПАРАМЕТРІВ ПРОЦЕСУ КРІОКОНСЕРВАЦІЇ НА ЗАПЛІДНЮЮЧУ ЗДАТНІСТЬ СПЕРМІЇВ КНУРА ІN VIVO

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Полтава - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії фізіології Інституту свинарства ім. О.В. Квасницького Української академії аграрних наук

Науковий керівник: доктор біологічних наук, академік УААН, професор Коваленко Віктор Федорович Інститут свинарства ім. О.В. Квасницького УААН, завідувач лабораторією фізіології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, Бусенко Олександр Трохимович, Національний університет біоресурсів і природокористування України Кабінету Міністрів України, професор кафедри виробництва молока та яловичини

кандидат сільськогосподарських наук, Бондаренко Олена Миколаївна, Полтавська державна аграрна академія, доцент кафедри технології виробництва продукції тваринництва

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту свинарства ім. О.В. Квасницького УААН, м. Полтава, вул. Шведська Могила, 1.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради О.І. Підтереба

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У розвитку галузі свинарства найбільше значення має інтенсивність відтворення поголів'я, що неможливо вирішити без широкого застосування штучного осіменіння, у тім числі кріоконсервації сперми. Це дозволяє в короткі строки покращувати генотип поголів'я, замінити імпорт племінних кнурів імпортом замороженої сперми, виключити втрати імпортованих тварин, пов'язані з адаптацією до нового середовища, запобігти ризику завозу патогенної мікрофлори. Використання кріоконсервованої сперми забезпечує ритмічне одержання еякулятів від плідників, підвищуючи якість їх спермопродукції. Проте найважливішим результатом такої сперми є зберігання не тільки життєздатності гамет, а й геному тварин необмежений час при стабільній температурі -196 ^оС. Саме це і є методологічною основою зберігання і відновлення породного генофонду ex-situ (Зубець М.В. та ін., 2007), що має надзвичайно велике значення у селекційно-племінній роботі.

Сучасний стан кріоконсервації сперми кнура не сягає комерційного рівня, оскільки стандартне застосування 5-6 млрд. розморожених сперміїв не забезпечує такого багатопліддя свиноматок, як осіменіння нативною спермою, а після відтавання менше 40 % сперміїв зберігають інтактну мембрану, структурна і функціональна цілісність якої визначає результати заморожування (Peтa F.J et al., 2005). На даний час у ШО свиней використання кріоконсервованої сперми складає у світовому масштабі менше 1 % ( Wagner H.G, Tibier М, 2000). Вирішити проблемні питання кріоконсервації сперми кнура можливо лише через поглиблення знань фізіологічної реакції сперміїв на вплив окремих параметрів кожної фази технологічного процесу. При цьому оцінка їх життєздатності має бути не лише за лабораторним аналізом, але, головне, за результатом запліднення такою спермою свиноматок як найбільш об'єктивним і вирішальним показником. З цих позицій ми і підходили до вирішення поставлених завдань, маючи на увазі, що сьогодні надається особливе значення балансу між фундаментальними і прикладними дослідженнями у розвязанні головної проблеми - кріоконсервації сперми, яка визначає обєм національних кріобанків і їх маркетингову спроможність (Mazur P. et al., 2008).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є частиною планової наукової тематики лабораторії фізіології Інституту свинарства ім. О.В. Квасницького УААН (ІСв УААН); ”Розробити нові фізіолого-біохімічні методи підвищення конверсії корму та репродуктивної здатності свиней“ (№ держреєстрації 0101U003259); „Вивчити фізіологічні та біохімічні особливості харчотравлення та репродукції у свиней і розробити нові способи підвищення їх репродуктивності” (№ держреєстрації 0197U003277); „Розробити і впровадити новітні способи технології штучного осіменіння свиней та трансплантації ембріонів в умовах промислової технології” (№ держреєстрації 0106U004221).

Мета і завдання дослідження. Мета дослідження - розкрити окремі фізіологічні закономірності впливу різних параметрів технології кріоконсервації сперміїв кнура на їх функціональну активність (ФА) та запліднюючу здатність in vivo.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання: кріоконсервація кнур сперма запліднюючий

- дослідити ФА сперміїв у залежності від тривалості еквілібрації, режимів заморожування і розморожування, ступеня розбавлення і концентрації сперми, об'єму і товщини заморожуваного її зразка;

- виявити закономірності впливу на кріорезистентність сперміїв ендогенних факторів - породи і віку кнура та екзогенних - сезону року;

- визначити оптимальні строки, кратність і обєм cпермодози при ШО свиноматок і свинок заморожено-відталою спермою;

- визначити термін виживаності кріоконсервованих сперміїв у експульсованій маткою рідині;

- на підставі одержаних параметрів розробити схему cпрощеної технології кріоконсервації сперми кнура і визначити її зоотехнічну ефективність за результатами осіменіння свиноматок;

- проаналізувати відповідність нормі морфо-функціонального стану репродуктивного апарату свиноматок і їх нащадків обох статей одержаних із застосуванням кріоконсервованої сперми впродовж декількох відтворювальних циклів і поколінь підряд.

Об'єкт дослідження - кріоконсервація сперма сільськогосподарських тварин.

Предмет дослідження - фізіологічні закономірності впливу окремих параметрів процесу кріоконсервації на ФА і запліднюючу здатність сперміїв кнура in vivo.

Методи дослідження - загальноприйняті зоотехнічні, морфо-функціональні, фотоелектроколориметричні, мікроскопічні, біометричні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше здійснено комплексний аналіз фізіологічних закономірностей впливу окремих параметрів процесу кріоконсервації сперміїв кнура на їх ФА і запліднюючу здатність in vivo у сезонному і породному аспектах. Уперше визначено динаміку ФА і виживаність кріоконсервованих сперміїв у експульсованій маткою рідині і виявлено кореляційний зв'язок між цим показником і запліднюючою здатністю сперми конкретного кнура. Уперше визначено порівняльну ФА заморожено-відталих сперміїв in vitro і in vivo в залежності від тривалості періоду еквілібрації сперми. Поглиблено знання щодо впливу різних строків, кратності і доз ШО кріоконсервованою спермою на заплідненість свиноматок. Розкрито фізіологічні закономірності комплексного впливу ендогенних - породи і віку кнура та екзогенних - сезону року - факторів на кріорезистентність сперміїв. Уперше визначено ступінь відповідності видовій біологічній нормі морфо-функціональних показників репродуктивного апарату свиноматок і їх нащадків обох статей після осіменіння кріоконсервованою спермою впродовж кількох відтворювальних циклів і поколінь. Розроблено теоретичне обґрунтування підвищення репродуктивної здатності свиноматок за рахунок оптимізації комплексу умов кріоконсервації сперми і режиму ШО.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблено спрощену технологію кріоконсервації сперми кнура на підставі визначених фізіологічних закономірностей впливу окремих її параметрів на ФА і запліднюючу здатність сперміїв. Запропоновано оптимальний режим ШО свинок і свиноматок кріоконсервованою спермою. Комплексне застосування обох розробок забезпечило ефективність одержання у виробничих умовах 70% опоросів при багатоплідді 7,4 поросят і великоплідності 1,54 кг у середньому.

Розроблено методи прижиттєвого неінвазійного визначення терміну виживаності та збереження ФА заморожено-відталих сперміїв у репродуктивному тракті свиноматки і прогнозування одержання опоросів від ШО кріоконсервованою спермою. Пріоритетність створених методів підтверджується деклараційними патентами: Спосіб прогнозування ефективності осіменіння свиноматок заморожено-відталою спермою, № 39101, 2009; Спосіб неінвазійного визначення in vivo терміну виживання заморожено-відталих сперміїв у репродуктивному тракті свиноматки, № 39100, 2009.

Експериментальні матеріали щодо режиму осіменіння свинок і свиноматок збереженою при температурі + 16-18 єС спермою використані в процесі розробки «Інструкції із штучного осіменіння свиней» (2003).

Теоретичне обґрунтування підвищення репродуктивної здатності свиноматок за рахунок оптимізації комплексу умов кріоконсервації сперми і режиму ШО використовується у лекційних курсах з фізіології тварин і основ біотехнології тваринництва у Полтавській державній аграрній академії.

Особистий внесок здобувача. Обґрунтування напрямку досліджень і особливості методичного підходу розроблені разом з науковим керівником. Роботи з організації дослідів, одержанню еякулятів від кнурів та експериментальній розробці спрощеної технології кріоконсервації сперми кнура були проведені спільно зі співробітниками лабораторії фізіології ІСв УААН, що відбито у авторських публікаціях і патентах. Весь комплекс робіт з визначення впливу окремих параметрів процесу кріоконсервації на ФА і запліднюючу здатність сперміїв, комплекс робіт із визначення оптимального режиму ШО свиноматок і свинок кріоконсервованою спермою та дослідження одержаного приплоду, аналіз першоджерел і отриманого фактичного матеріалу, формування та обґрунтування висновків і пропозицій проведені особисто здобувачем.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи повідомлені, обговорені і схвалені на: розширених засіданнях вченої ради ІСв ім. О.В. Квасницького УААН (2003 - 2009 ); ХVIII з'їзді Українського фізіологічного товариства ім. І.П. Павлова -(1990 ), 17-21 вересня 1990р., Харків; конференції, присвяченій 50-річчю відкриття здатності сперміїв ссавців зберігати біологічну повноцінність і генетичну інформацію після заморожування, Київ, 1997 науково-практичній конференції, присвяченій 100- річчю з дня народження О.В. Квасницького (Полтава, 2000); науково- практичній конференції професорсько-викладацького складу та молодих вчених у Полтавській Державній аграрній академії (Полтава, 2007); конференції молодих вчених в інституті свинарства ім. О.В. Квасницького УААН (Полтава, 2008); міжнародній конференції з проблем свинарства (Миколаїв, 2008).

Публікації результатів досліджень. Основні матеріали досліджень опубліковані у 4 наукових статтях (з них 4 у фахових виданнях), 2 патентах, 2 тезах.

Структура і обсяг роботи. Дисертація викладена на 127 сторінках включає: вступ, огляд літератури, матеріали і методи досліджень, результати власних досліджень, аналіз і узагальнення результатів досліджень, висновки, практичні рекомендації. Містить 20 таблиць, 7 рисунків Список літератури налічує, 209 джерела, з яких 135 іноземних авторів (латиницею).

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження виконано впродовж 1991-2005 років у лабораторії фізіології і спеціалізованій станції по вирощуванню та оцінці кнурів-плідників (елевері) Інституту свинарства ім. О.В. Квасницького Української академії аграрних наук, а також в умовах свиноферми СТОВ ім. Воровського Полтавського району, Полтавської області.

В експериментах було використано 107 кнурів різних порід вітчизняної селекції: великої білої (ВБ), миргородської (М), полтавської мясної (ПМ) та червоно-поясої синтетичної лінії (ЧПСЛ) (тепер порода має назву червоно-білопояса ЧБП) та зарубіжної: ландраса (Л), дюрка (Д) та великої білої (ВБ), а також 245 свиноматок ВБ та ПМ. Досліджено 1033 еякуляти, 1269 зразків сперми та 110 ембріонів.

Формування груп піддослідних тварин здійснювали для кожної серії дослідів згідно конкретної мети та загальні схеми досліджень (Табл. 1).

У наших дослідженнях по вивченню ФА сперміїв одержували сперму від кнурів мануальним методом.

Досліджуючи сперму застосовували метод розділення еякуляту і терморезистентний тест (ТР-тест) який полягає в інкубації сперміїв при +38 ^оС впродовж 3 год. Визначення динаміки кріоконсервації сперми кнурів здійснювали за методикою В.Ф. Коваленка, Л.В. Бурлаченка (1980), використовуючи суцільний еякулят без відокремлення спермальної плазми. Для відпрацювання схеми спрощеного технологічного процесу використано кнури - аналоги за віком, породою, спермопродукцією та інтенсивністю статевого навантаження при стабільних умовах повноцінної годівлі і утримання. Якість спермопродукції оцінювали згідно з "Інструкцією зі штучного осіменіння свиней" (1976). ФА сперміїв виражали у відсотку поступально-рухливих гамет.

З метою визначення погодинного збору експульсованої маткою рідини протягом перших п'яти годин після штучного осіменіння свиноматки заморожено-відталою спермою, кожну погодинну порцію маткової рідини збирали у підігріті до +39 єС окремі посудини і рахували в ній кількість поступально-рухливих сперміїв. Це практично відбиває термін виживання сперміїв in vivo у репродуктивних шляхах свиноматки після її осіменіння.

Ефективність розробленої на підставі проведених досліджень спрощеної технології кріоконсервації сперми кнура визначили шляхом порівняння із запропонованою Всеросійським Інститутом тваринництва (ВІТ, Москва) як найбільш близької до нашої в технічному аспекті.

Таблиця 1.

Загальна схема досліджень

Для створення тотожних умов експерименту за обома методами, піддослідне поголів'я 20 свиноматок було розподілене на дві однакові групи.

Сперму, одержану від одного кнура, ділили на дві половини, одну з яких заморожували і розморожували за методом ВІТ і використовували у першій групі маток, а другу половину заморожували і розморожували за нашим методом і використовували у другій. Для обох методів було застосовано двократне ШО через 24 і 36 год. від початку рефлексу нерухомості мінімальною дозою 2 млрд. сперміїв з поступально-прямолінійним рухом.

Цифровий матеріал проведених досліджень оброблено за методами варіаційної статистики (Плохинський Н.А., 1969, Лакин Г.Ф., 1980) з використанням програми Microsoft Excel 2003 і комп'ютера AMD Atlon у середовищі Windows XP Professional.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Функціональна активність сперміїв у залежності від параметрів окремих фаз технології кріоконсервації. Визначення оптимальної тривалості фази еквілібрації показало однаково високий (від 80 до 85 %) відсоток поступально-рухливих сперміїв після закінчення фази еквілібрації для всіх варіантів її тривалості. Застосування ТР- тесту виявило вірогідне зниження цього показника у зразках, витриманих лише 1 год. при + 5 ^оС, і відсутність різниці у межах 2-5 год. еквілібрації (Табл. 2). Це свідчило про доцільність її обмеження 2-3 год., але застосування розробленого нами методу неінвазійного визначення терміну виживаності сперміїв у репродуктивному тракті свиноматки in vivo виявило тенденцію до негативного впливу скороченої до 2-х год. фази еквілібрації. В основі нашого методу - погодинне визначення відсотку живих функціонально активних сперміїв у експульсованій маткою рідині. Цей показник прямопропорційно корелює з результатом запліднення за показником опоросів (r= 0,69; р<0,05).

Таблиця 2

Функціональна активність сперміїв у залежності від тривалості еквілібрації, М±m, n=15

Примітка: тут і в наступних таблицях * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001.

Отже, метод оцінки in vivo ФА відталих сперміїв у рідині, експульсованій маткою свині після ШО, уточнює результат оцінки сперми in vitro і вибір тривалості фази еквілібрації, і може бути застосований для прогнозування опоросу після осіменіння кріоконсервованою спермою.

Вплив швидкості заморожування, ступеня розбавлення сперми і концентрації сперміїв на їх ФА було визначено за трьох режимів швидкості зниження температури від +5 ^оС до -196 ^оС: повільний -50,25 ^оС/хв., помірний 100,5 єС/хв. і швидкий 301,5 ^оС/хв. - при одночасному застосуванні 4-х варіантів концентрації сперміїв і 5-ти рівнів розбавлення сперми. Виявлено, по-перше, різко негативний вплив повільного темпу заморожування і сприятливий - найбільш швидкого; по-друге - істотне зниження ФА сперміїв із збільшенням ступеня розбавлення сперми, незалежно від темпу зниження температури. Незалежно від концентрації сперміїв, швидкість зниження температури 301,5 ^оС/хв. забезпечує максимальний рівень їх ФА, але оптимальною для цього режиму є концентрація 0,10 млрд/мл (Табл.3). Зі зростанням ступеня розбавлення еякуляту, ФА сперміїв знижується, і цей феномен, з нашого погляду, пояснюється зменшенням концентрації спермальної плазми, яка, як відомо, захищає їх від кріопошкодження. Максимальний відсоток поступально-рухливих з них, за результатами ТР- тесту, відповідає мінімальному ступеню розбавлення 1:1 (Табл.4). Існує тенденція до позитивного зв'язку між пошкоджуючим впливом надмірного розбавлення сперми перед заморожуванням та підвищенням швидкості заморожування від 50,25 ^оС/хв. до 301,5 ^оС/хв.

Таблиця 3

Вплив режиму заморожування і концентрації сперміїв на їх функціональну активність, М±m, n=15

Примітка: вірогідність подана порівняно з мінімальною концентрацією 0,02млрд/ смі

Градієнт зниження цього показника наприкінці інкубації набуває наступного вигляду: повільний режим lim 97,6-63,5 %; помірний lim 92,2-58,2%; швидкий lim 92,0-49,7 % прямолінійно-рухливих сперміїв. Цей феномен підтверджує негативний вплив зменшення концентрації спермальної плазми, тому можна вважати, що оптимальним для збереження її кріозахисної властивості є розбавлення суцільного еякуляту у співвідношенні з розбавником 1:1.

Таблиця 4

Функціональна активність сперміїв залежно від ступеня розбавлення сперми і режимів заморожування, М±m, n=15

Примітка: вірогідність погодинної різниці у порівнянні з мінімальним розбавленням (1:1)

Одержані результати пов'язуємо з високою інтенсивністю застосованого нами режиму заморожування і відсутністю у нашій технологічній схемі загальноприйнятого ступінчатого охолодження сперми до -5 ^оС, замість чого після охолодження її від +38 ^оC до +5 ^оС витримували при цій температурі 3 год., і після цього відразу заморожували до -196 ^оС у швидкому режимі.

Кріостійкість сперміїв при заморожуванні різних об'ємів сперми. За умов великого об'єму еякуляту без попереднього видалення плазми доцільно заморожувати відносно більші об'єми сперми з метою скорочення робочого часу.

Дослідження ФА сперміїв, заморожених у гранулах об'ємом 0,5 смі і брикетах різного об'єму і товщини показало, що незалежно від об'єму заморожуваної порції еякуляту, ФА сперміїв зменшується паралельно зі збільшенням товщини шару сперми (Табл. 5).

У дослідах із заморожування сперми на фторопластовій пластині в гранулах об'ємом 0,5 і 1,0 смі і брикетах об'ємом 5, 10, 15, 20 і 25 смі, але при однаковій товщині заморожуваного шару-3мм, встановлено, що за таких умов об'єм порції заморожуваної сперми не впливає на ФА сперміїв.

Таблиця 5

Функціональна активність сперміїв у залежності від об'єму і товщини шару заморожуваної сперми, M±m, n=15

Таким чином, важливим фактором збереження ФА сперміїв є мінімальна товщина заморожуваного зразка, враховуючи відстань між серцевиною заморожуваного шару сперми і його поверхнею.

Взаємозв'язок функціональної активності сперміїв з параметрами фази відтавання визначали за умов відпрацьованого оптимального режиму заморожування сперми. Найбільш ефективним виявилось миттєве (4 сек.) розморожування зі швидкістю 3510 ^оС/ хв. шляхом занурювання заморожених зразків товщиною не більше 3 мм у ГХЦ розбавнику з температурою +70 ^оС у відношенні об'єму середовища до сперми 2:1. Порівняння різних параметрів температури, застосованої для розморожування, демонструє вірогідну (р<0,05) залежність ФА сперміїв від цього показника. Такий взаємозв'язок має кореляційний характер (з = 0,935): з підвищенням температури від +18 до +70 ^оС зростає відсоток функціонально-активних сперміїв, а подальше її збільшення приводить до зниження ФА.

Ця закономірність проявляється за умов як оптимальної концентрації сперміїв, так і оптимального розбавлення сперми перед заморожуванням (Табл. 6). На підставі одержаних даних зроблено висновок про відповідність температури розморожування +70 ^оС зі швидкістю 3510 ^оС/хв. оптимальному рівню для нецентрифугованої сперми кнура.

Закономірність оптимізації режиму розморожування була нами встановлена за умов швидкості зниження температури 301,5 ^оС/хв., певної концентрації (0,1 млрд/смі) сперміїв і розбавлення сперми (1:1). Це дало підставу включити такі параметри у розроблювану схему спрощеної технології кріоконсервації сперми кнура.

Таблиця 6

Функціональна активність сперміїв після фази розморожування, М±m, n=15

Одержаний результат і аналіз джерел літератури свідчать про те, що головним пошкоджуючим фактором для сперміїв є не рівень температури заморожування або розморожування, а тривалість її дії. Ці дані підтверджують висновок Hernandez М. et al., (2007) про можливість підвищити виживання сперміїв шляхом прискорення швидкості розморожування до 1200-1800 ^оС/ хв. Наша ж методика відзначається надвисокою швидкістю (3510 ^оСхв.) наростання температури сперми у ГХЦ середовищі.

Кріорезистентність сперміїв кнурів різних генотипів вітчизняної та зарубіжної селекції у віковому і сезонному аспектах. Спермопродукція кнурців різних порід у віці 5 місяців істотно різнилася за всіма дослідженими показниками. Найбільшим об'ємом еякуляту характеризувались кнурці великої білої породи, найменшим - червоної-білопоясої (Табл. 7).

Але за концентрацією сперміїв вірогідно вищі показники були у кнурців полтавської м'ясної та миргородської породи, в той час, як велика біла мала найнижчі. Мінімальною кріорезистентністю (33,55±3,09 % поступально-рухливих сперміїв після розморожування) відзначалися кнурці полтавської м'ясної породи, а максимальною - 63,0±2,04 % - великої білої. Проте в процесі статевого дозрівання відбувались істотні зміни кількісних і якісних показників спермопродукції: у 12-місячних кнурів найбільший об'єм еякуляту був у полтавської м'ясної породи, мінімальний - у червоної-білопоясої. Показники кріорезистентності сперміїв 12-місячних кнурів вітчизняної селекції також були пов'язані з їх генотипом: вищою резистентністю відзначалась миргородська порода - ФА сперміїв якої склала за ТР- тестом 62,38±1,2 %, в той час, як відповідні показники решти порід були на рівні 50 %.

Таблиця 7

Динаміка кількісних і якісних показників спермо продукції у кнурців різних порід у залежності від їх віку, М±m

Кількісні і якісні показники спермопродукції дорослих кнурів трьох порід англійської селекції були навіть дещо вищі за показники кнурів 5 порід вітчизняної селекції: обєм еякуляту від 131,7 до 258,0 смі і від 116,2 до 211,5 смі, відповідно концентрація сперміїв 0,18-0,24 і 0,15-0,21 млрд/смі (табл. 7 та 8) Проте, кріостійкість сперміїв кнурів англійської селекції була надзвичайно низькою. Так, якщо після еквілібрації відсоток поступально-рухливих сперміїв був майже на тому ж рівні, що і в нативному еякуляті, то після відтавання сперми він різко знизився (Табл. 8). Максимальний показник ФА сперміїв у кнурів вітчизняної селекції (миргородська порода) був на рівні 63,4 %, тоді як у англійської складав лише 27,5 % (ландрас), тобто нижче у 2,3 рази. Що стосується аналогічного мінімального показника, то у кнурів англійської селекції він був у 2,5 рази нижчий , ніж у вітчизняних; низькою була і ФА сперміїв за ТР-тестом.

Таблиця 8

Спермопродукція і кріостійкість сперміїв статевозрілих кнурів англійської селекції , М±m

Сезонні зміни якості сперми визначали у різних генотипів кнурів. Найбільш стабільними ці показники були у плідників миргородської породи, особливо у літній сезон (Табл. 9). Спермопродукція плідників породи дюрок, навпаки, характеризувалась негативним впливом літнього сезону: ФА сперміїв у свіжоодержаному еякуляті знижувалась на 2,11 % порівняно із зимовим, тоді як у миргородських кнурів, навпаки, зростала на 8,25 %, а ТР-тест відносно залишався стабільний.

Таким чином, рівень спермопродукції і стійкість сперміїв залежить від сезону року та генотипу кнура.

Визначення оптимального режиму ШО кріоконсервованою спермою. Дослід з визначення строків і кратності ШО кріоконсервованою спермою проведено у виробничих умовах свиноферми СТОВ ім. Воровського Полтавського району на поголів'ї 31 свинки і 27 свиноматок ПМ породи. Після однократного осіменіння ремонтних свинок 1-ї групи через 12 год. від початку рефлексу нерухомості, запліднення не відбулося. Зі збільшенням інтервалу до 24 і 36 год. у ІІ- й і ІІІ- й групах свиноматок при однократному осіменінні, заплідненість за результатами опоросів складала 20 % і 40 %, відповідно. Однак двократне осіменіння через 24 і 36 год., тобто безпосередньо перед початком овуляції і в передовуляторний період, забезпечило 66 % опоросів у свинок і 70 % - у свиноматок при багатоплідді від 8,3 до 12,5 поросят і середній великоплідності 1,46 кг.

Таблиця 9.

Сезонна динаміка якості сперми кнурів порід вітчизняної селекції, M+m

У досліді з визначення доз кріоконсервованої сперми, що містила 30-50% поступально-рухливих сперміїв через 3 год ТР-тесту, використано 27 ремонтних свинок і 14 основних свиноматок, поділених на групи за величиною введеної спермодози. У ремонтних свинок доза у 2 млрд. таких сперміїв забезпечила 75 % опоросів, а доза у 6 млрд. сперміїв - 71,4 % опоросів. Осіменіння основних свиноматок дозою 6 млрд. сперміїв забезпечило 75,0 % опоросів, що було невірогідним підвищенням (р>0,05) порівняно з дозою 2 млрд.-70,0 %, відповідно. Таким чином, запропонована спрощена технологія кріоконсервації дозволяє одержати 70-75 % опоросів за умов двократного осіменіння через 24 і 36 год. від початку рефлексу нерухомості в дозі 2 млрд сперміїв, ФА яких не нижче 30 % після 3 год. ТР-тесту.

Ріст і розвиток потомства, одержаного від використання кріоконсервованої сперми. Заплідненість свинок і ембріональна виживаність у них після використання сперміїв 2-річного терміну зберігання при -196 °С була перевірена на поголів'ї 15 свинок, які також походили від використання кріоконсервованої сперми (Табл. 10). Після осіменіння свинки були забиті у такі терміни: 9-12, 17-22 і 24-27 дні вагітності, що відповідало передімплантаційному періоду і першій та другій половині плацентації. З дослідної групи свинок поросними виявились 12 голів, або 80 % від загальної кількості. Виявлено підвищену ембріональну смертність наприкінці плацентації (54,1 %), але запліднююча здатність сперміїв тривалого терміну зберігання в рідкому азоті та загальні показники багатопліддя були у межах вікової і видової норми.

Таблиця 10

Запліднююча здатність і ембріональна виживаність після використання сперміїв 2-річного терміну зберігання при температурі -196 °С, М±m

Досліджено також потомство першого покоління, одержане від використання кріоконсервованої сперми, а саме 65 гнізд (544 поросят), одержаних від 111 свиноматок, що їх осіменили двократно, через 24 і 36 год. від початку охоти, дозою у 2 млрд. сперміїв, серед яких було 30-50 % поступально-рухливих після 3 год. ТР-тесту. Опоросилося 58,6 % свиноматок. Їх багатоплідність становила: 8-9 поросят у 23,1 % свиноматок; 10-11 поросят у 15,4 %; 12-14 і більше у 20 %. Отже, 58,5 % маток мали стандартні для породи показники багатоплідності.

Привертають увагу високі показники маси новонароджених поросят. Навіть у багатоплідних гніздах у75 % випадків вона склала - від 1,3 до 1,8 кг, а в середньому - 1,5 кг. У межах норми були показники становлення статевої функції у потомства (F1), одержаного в результаті осіменіння їх матерів кріоконсервованою спермою. Свинки (F2), одержані від застосування кріоконсервованої сперми, характеризувались нормальним розвитком як репродуктивного апарату, так і організму в цілому.

Порівняльна характеристика ефективністі спрощеної технології кріоконсервації сперми кнура. Характеристику технологічного процесу і ефективності застосування нашого методу кріоконсервації було порівняно з найбільш відомим у 80-90-х рр. методом Всесоюзного інституту тваринництва (Милованов В.К. та ін., 1974). Співставлення проведено як за витратою часу на робочі процедури, так і за ефективністю осіменіння свиноматок.

Порівняння тривалості окремих процедур за обома методами свідчить про практично однакову витрату часу на їх штатні процедури охолодження, еквілібрації і заморожування сперми - близько 6 год. Але така оцінка не враховує численних додаткових робочих маніпуляцій, яких за нашим методом 5, а за методом ВІТ - 11, зокрема тривала процедура розділення фаз відталого еякуляту. Порівнюючи відтворювальну здатність свиноматок, запліднених спермою, кріоконсервованою за двома методами, при використані запропонованого нами варіанту, встановлено тенденцію до підвищення заплідненості (70 % проти 60 %) і багатоплідності (7,4 проти 6,9 поросят) свиноматок.

Таким чином, запропонована спрощена технологія кріоконсервації сперми кнура, розроблена на підставі визначених у системах in vitro та in vivo фізіологічних взаємозв'язків між динамікою температурних параметрів і функціональною активністю сперміїв, за основними виробничими показниками не поступається методу, розробленому у ВІТ, а за придатністю для здійснення її у виробничих умовах істотно переважає останній.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення проблеми застосування у свинарстві кріоконсервованої сперми на підставі розкритих фізіологічних закономірностей впливу окремих параметрів технології кріоконсервації на функціональну активність і запліднюючу здатність сперміїв кнура у сезонному і породному аспектах у комплексі з розробленим режимом штучного осіменіння свиноматок.

1. Провідну роль у негативному впливі процесу кріоконсервації на функціональну активність і, в цілому, виживаність сперміїв кнура відіграє не так рівень температурного параметру, як термін тривалості, у фазах заморожування і розморожування сперми. Між динамікою підвищення температури розморожування і збереженістю сперміями фун...