Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Характеристика українських ізолятів вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка

03.00.06 - вірусологія

Руднєва Тетяна Олександрівна

КИЇВ - 2009

Дисертація є рукописом.

Робота виконана на кафедрі вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, академік УААН, професор Бойко Анатолій Леонідович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Коваленко Олексій Григорович, Інститут мікробіології і вірусології ім.Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фітопатогенних вірусів.

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Зарицький Микола Макарович, Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН, м. Чернігів, завідувач сектору моніторингу та діагностики фітовірусів.

Захист дисертації відбудеться "20" жовтня 2009р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, пр. Глушкова 2, корпус 12, ауд.433.

Поштова адреса: 01601, м. Київ, вул. Володимирська,64.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ім. М. Максимовича Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська 58.

Автореферат розісланий " 9 " вересня 2009р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О.В. Молчанець

Загальна характеристика роботи

Предмет дослідження: діагностика ВЗКМО, біологічні, серологічні, молекулярні властивості та філогенетичний аналіз.

Методи дослідження. Електронна та флуоресцентна мікроскопія, імуноферментний аналіз, імуноелектроблотинг, імунодифузія в гелі по Ухтерлоні, електрофорез білків та нуклеїнових кислот, визначення точки температурної інактивації вірусу (ТТІ), біологічне тестування, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), сиквенс, статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше було встановлено серологічні, біологічні та молекулярні властивості вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка, ізольованого з тепличних рослин Cucumis sativus в Україні. Проведено філогенетичний аналіз трьох українських ізолятів вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка за геном капсидного білка та показано високу гомологію українських ізолятів ВЗКМО до російського ізоляту МС-1 (96%) та грецьких ізолятів CR-3 і CR-5 (94%). Оскільки спорідненість українських ізолятів ВЗКМО з нуклеотидними послідовностями інших відомих штамів та ізолятів вірусу є нижчою 90%, українські ізоляти, а також ізоляти МС-1, CR-3 і CR-5 можна віднести до окремого штаму ВЗКМО. Нуклеотидну послідовность капсидного білка ізоляту №3 ВЗКМО зареєстровано у світовому генетичному банку даних (GenBank) під номером FJ426406, що дає змогу використовувати їх у лабораторіях різних країн для порівняння з нуклеотидними послідовностями інших штамів ВЗКМО.

Практичне значення одержаних результатів. Українські ізоляти ВЗКМО поповнили колекцію вірусів кафедри вірусології і використовуються для подальшого порівняння їхніх властивостей з властивостями нововиділених ізолятів ВЗКМО та залучені як тест-об'єкти для вивчення вірусів рослин. Отримані високоспецифічні поліклональні кролячі антисироватки до вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка, з робочим розведенням 1: 8000 при титрі 1: 256000, можуть використовуватися в якості діагностикумів у непрямому ІФА для виявлення захворювань огірків на ВЗКМО у тепличних господарствах. Встановлено, що джерелом інфекції вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка в тепличних господарствах України є контамінований вірусом грунт. Передача ВЗКМО насіннєвим шляхом для тепличних господарств не встановлена, але така ймовірність існує, оскільки серед комерційного насіння огірків зафіксовано багато випадків контамінації ВЗКМО. Показано, що в Україні вірус зеленої крапчастої мозаїки огірка уражує лише рослини Cucumis sativus закритого грунту.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Інформаційних пошук, опрацювання літературних джерел, розробка схем експерименту, отримання експериментальних даних та їх попереднє узагальнення автором дисертації здійснено особисто. Формулювання мети і задач дослідження та заключний аналіз дослідження виконані за участю наукового керівника проф. А.Л. Бойка та проф. В.П. Поліщука. У дослідженнях властивостей вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка приймала участь к. б. н. Т.П. Шевченко. Здобувачем зібрана та проаналізована наукова література за темою дисертації, розроблено та удосконалено методичні підходи щодо виконання поставленої мети, одержано основні експериментальні дані, узагальнено отримані результати, проведено їх статистичну обробку.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та положення дисертації доповідались автором на: Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених "Шевченківська весна. Сучасний стан науки, досягнення проблеми та перспективи розвитку" (Київ, 2003); Міжнародній конференції молодих вчених, аспірантів та студентів по молекулярній біології та генетиці (Київ, 2003); 4 Всеукраїнській науковій конференції студентів та аспірантів "Біологічні дослідження молодих вчених на Україні" (Київ, 2004); Конференції молодих учених "Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології" (Ужгород, 2005); конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2005); 4 Міжнародній конференції "Біоресурси і віруси" (Київ, 2004); Міжнародній конференції "Стратегия и тактика защиты растений" (Минск, Республика Беларусь, 2006); 10-й Пущинській школі-конференції молодих вчених "Биология - наука 21 века" (Пущино, РФ, 2006); Міжнародній конференції до 70-річчя інституту захисту рослин (Костінброд, Болгарія, 2006); 3-й Міжнародній конференції аспірантів та молодих вчених "Молодь та поступ біології" (Львів, 2007); Міжнародній конференції "Біологічне різноманіття екосистем і сучасна стратегія захисту рослин" (Харків, 2007); V міжнародній конференції "Біоресурси і віруси" (Київ, 2007); Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених "Шевченківська весна. Сучасний стан науки, досягнення проблеми та перспективи розвитку" (Київ, 2008); 4-й Міжнародній конференції аспірантів та молодих вчених "Молодь та поступ біології" (Львів, 2008); Міжнародній конференції "Реакція рослин на стреси навколишнього середовища" (Єлена, Болгарія, 2008); 1 Міжнародній науковій конференції студентів, аспірантів та молодих учених "Фундаментальні та прикладні дослідження в біології" (Донецьк, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 22 наукові роботи (6 статей у фахових журналах, 16 - в тезах доповідей).

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 125 сторінках комп'ютерного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, основної частини (включає матеріали і методи досліджень, результати досліджень і їх обговорення), узагальнень, висновків, списку використаних джерел, що містить 168 джерел, з них 96 - закордонних авторів. Робота ілюстрована 6 таблицями та 46 рисунками.

Огляд літератури

Об'єктом досліджень є ізоляти вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка (ВЗКМО), виділені з рослин Cucumis sativus трьох тепличних господарств України: ізолят 1 був виділений із огірків сорту "Марінда" (СПК "Тепличний" Миколаївська обл.), ізолят 2 - із огірків сорту "Біанка" (ПП "Пектораль" Дніпропетровська обл.), ізолят 3 - із огірків сорту "Корольок" ("Кримтеплиця" Автономна республіка Крим).

Ідентифікацію вірусних ізолятів проводили за допомогою непрямого імуноферментного аналізу з діагностичними антисироватками на полістиролових плашках Labsystem. В якості антивидових антитіл (АТ) використовували антикролячі АТ, кон'юговані лужною фосфатазою (Dianova, Німеччина). Результати реєстрували на рідері Termo Labsystems Opsis MR (США) при довжинах хвиль 405/630 нм. Виділення ізолятів ВЗКМО з інфікованих рослин здійснювали за методикою [Атабеков И.Г., 1981]. Чистоту вірусних препаратів визначали спектрофотометрично за співвідношенням

D 260\ D 280 на спектрофотометрі СФ-26 (Люмам, Росія). Концентрацію вірусних препаратів визначали за методом Лоурі - Фоліна за загальноприйнятою методикою [Доссон Р., 1991]. Розміри вірусних часток ізолятів ВЗКМО визначали методом електронної мікроскопії. Контрастування високоочищених вірусних препаратів проводили 2% розчином уранілацетату ("Serva", Німеччина) протягом 2 хв. Препарати досліджували при інструментальному збільшенні 40 - 60 тис. раз на електронному мікроскопі ЕМ-125 (Суми, Україна). Для визначення молекулярних мас капсидних білків проводили електрофорез за Laemmli в 14% розділювальному і 5% концентрувальному поліакріламідному гелі. Використовували набір маркерних білків LMW (кДа): 14,2; 20,1; 30; 43; 67 ("Pharmacia", Швеція). Електрофорез проводили у комерційному апараті для вертикального електрофорезу ("Хійу Каллур", Латвія) при силі струму 40мА протягом 1,5 год. Фарбування здійснювали протягом ночі розчином кумасі блакитного R-250 ("Serva", Німеччина).

Для встановлення кола рослин-хазяїв та типу реакції на рослинах-індикаторах для вірусних ізолятів проводили механічне ураження рослин у фазі двох справжніх листків за допомогою карборунду. РНК досліджуваних вірусних ізолятів виділяли методом фенольної екстракції. Якість препаратів РНК оцінювали за допомогою горизонтального електрофорезу у 0,8% агарозному гелі у 0,089М тріс-боратному буфері рН 8,0 з додаванням бромистого етидію в концентрації 0,5мкг/мл для візуалізації отриманих смуг РНК під ультрафіолетовим світлом. Точку температурної інактивації визначали за температури 96С, 98С і 99-100С. Вірусні зразки в концентрації 500 мкг/мл піддавали термічній обробці впродовж 10 хв на водяній бані за відповідної температури. Як контроль використовували непрогріті вірусні ізоляти. Для перевірки інфекційності рослини огірків уражували механічно, за допомогою карборунду у фазі двох справжніх листків. Флуоресцентну мікроскопію проводили за загальноприйнятою методикою [Hill S., 1984]. Вірусні включення виявляли за допомогою люмінісцентного мікроскопа ("Люмам", Росія). Специфічні поліклональні сироватки (АС) до ізолятів ВЗКМО отримували шляхом імунізації кролів. Імунізацію проводили в три етапи з тижневими інтервалами очищеним препаратом вірусу С=1 мг/мл. Реімунізацію тварин проводили через 30 днів після останньої імунізації. Титри отриманих сироваток визначали методом непрямого ІФА. Специфічність отриманих АС перевіряли за допомогою імуноелектроблотингу. Для визначення серологічної спорідненості виділених ізолятів проводили реакцію імунодифузії в гелі за Ухтерлоні у 0.8% розчині агарози в 0.01М PBS з додаванням азиду натрію. Реакцію проводили в пластикових чашках Петрі. Для кожного антигена (АГ) перевіряли взаємодію з власною сироваткою та двома гетерологічними. Для встановлення молекулярних властивостей ВЗКМО за допомогою комп'ютерної програми "Оліго-6" були підібрані праймери до ділянки РНК штаму CGMMV-W, яка кодує капсидний білок: лівий - 5'CAAATCGGAGGTTGGACTCT-3'; правий - 5'GTGTGCACCACCATCAGAAG-3'. У результаті проведення зворотньо-транскрипційної полімеразної ланцюгової реакції було отримано продукти ампліфікації розміром 620 п. н. Візуалізація результатів здійснювалася

за допомогою горизонтального електрофорезу в 1.2% - ному агарозному гелі.

Після попереднього виділення ампліфікованих ділянок ДНК з гелю (з використанням Qiagen Gel Purification Kit) проводили їхнє секвенування (використовуючи аналізатор Applied Biosystems 3730 DNA) на кафедрі біохімії Оксфордського університету Великобританія. Порівняння ділянок нуклеотидного сиквенсу кДНК капсидних білків українських ізолятів між собою та з такими ж відомих штамів та ізолятів ВЗКМО, а також побудова філогенетичних дерев на основі ступеня гомології нуклеотидних послідовностей капсидного білка проводилася за допомогою комп'ютерної програми DNA STAR MegAlign за методами: Clustal W та Clustal V. Послідовності штамів та ізолятів ВЗКМО було взято з бази даних GenBank (http://www.ncbi. nlm. nih.gov).

Розділ 6. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

6.1 Відбір зразків Cucumis sativus з різних тепличних господарств України. Відбір зразків рослин Cucumis sativus проводили з таких тепличних господарств України: СПК "Тепличний" Миколаївської обл. (ізолят 1), ПП "Пектораль" Дніпропетровської обл. (ізолят 2) та "Кримтеплиця" Автономної республіки Крим (ізолят 3). Вибір саме цих областей пов'язаний з майже одночасним спалахом вірусної інфекції у тепличних господарствах даних областей. Симптоми системної вірусної інфекції на рослинах огірків в усіх господарствах були подібними. На листковій пластинці вони проявлялися у вигляді мозаїки, з чергуванням темно-зеленого і світло-зеленого забарвлення листкової пластинки, а також пухирчастого темно-зеленого здуття. На плодах огірків вірус викликав появу темно-зелених плям різного розміру, бугристі нарости та деформацію.

Часто при вірусному ураженні спостерігалося масове в'янення рослин огірків У деяких випадках хворі рослини значно відставали у рості та втрачали квітконос у період бутонізації.

Симптоми, що проявлялися на рослинах огірків тепличних господарств були подібними до симптомів, які викликають віруси, що уражують гарбузові культури. До таких вірусів належить вірус огіркової мозаїки, вірус зеленої крапчастої мозаїки огірка, вірус мозаїки кавуна 2, вірус жовтої мозаїки цукіні, вірус некрозу огірка та багато інших. Характерною особливістю даних вірусів є їх вузька спеціалізація по відношенню до рослин родини гарбузових. Але подібність прояву симптомів на рослинах не дозволяє чітко визначити вид вірусу. Тому подальші дослідження було сфокусовано на встановленні видової приналежності виявлених вірусних ізолятів різними методами.

6.2 Ідентифікація вірусних ізолятів

Ідентифікація вірусних ізолятів імуноферментним аналізом. На першому етапі досліджень проводили імуноферментний аналіз уражених зразків огірка за допомогою діагностичних антивірусних сироваток до ВЗКМО, ВОМ та ВТМ, наданими проф. Т. Кьонне (Асершлебен, Німеччина). Вибір саме цих антисироваток зумовлений, по-перше, високою специфічністю даних вірусів по відношенню до рослин Cucumis sativus закритого грунту, а по-друге, їх циркуляцією у закритому грунті та агроценозах нашої країни у 60-70-ті роки. Для постановки ІФА використовували гомогенат вірусінфікованого рослинного матеріалу. За результатами аналізу, досліджувані ізоляти добре реагували з антисироваткою до ВЗКМО, тоді як реакції з антисироватками до ВОМ та ВТМ не спостерігалось.

Отже, отримані дані дозволяють попередньо віднести три ізоляти (1, 2 та 3) до вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка роду Tobamovirus.

Встановлення чистоти та концентрації виділених ізолятів. Наступним етапом було виділення та очистка вірусних препаратів, які викорисовували для подальшого дослідження їхніх властивостей. Стосовно чистоти отриманих препаратів, то порівняння отриманих значень оптичної густини D260 та D280 та їхнього відношення рівного 1,38 з табличними показниками для даного вірусу (1,38), показало, що виділені препарати є чистими, отже, не містять чужорідних білків та нуклеїнових кислот. Концентрація білка в очищених препаратах ізолятів ВЗКМО становила 14 мг/мл - для ізоляту 1, 12 мг/мл - для ізоляту 2 та 16 мг/мл - для ізоляту 3.

Морфологічна характеристика ізолятів ВЗКМО. З метою підтвердження приналежності виділених ізолятів до вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка подальші дослідження було сфокусовано на вивченні морфологічних та фізичних властивостей цих ізолятів. За допомогою електронномікроскопічних досліджень в очищених, концентрованих препаратах усіх трьох ізолятів, було виявлено паличкоподібні віріони розміром 280-300 х15 нм.

Згідно з літературними даними, такі розміри вірусних часток характерні для вірусів роду Tobamovirus, який об'єднує в собі значну кількість вірусів, але лише п'ять з них здатні уражувати рослини родини гарбузових (Cucurbitaceae). Це вірус тютюнової мозаїки (ВТМ), вірус зеленої крапчастої мозаїки огірка (ВЗКМО), вірус зеленої крапчастої мозаїки Кіурі (ВЗКМК), вірус зеленої крапчастої мозаїки цукіні (ВЗКМЦ) та вірус крапчастої мозаїки плодів огірка (ВКМПО). Довжина вірусних часток для 5-ти вірусів однакова і становить 300 нм. Що стосується діаметра, то тільки у ВЗКМО та ВЗКМК він становить 15 нм, а у ВТМ, ВЗКМЦ та ВКМПО - 18 нм. Отже, грунтуючись на різниці в розмірах вірусних часток, виділені вірусні ізоляти було віднесено до роду Tobamovirus, а саме: до вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка.

Електрофоретичні дослідження капсидних білків вірусних ізолятів. Для визначення молекулярних мас капсидних білків ізолятів було проведено електрофорез білків в ПААГ за Laemmli. Електрофоретичні дослідження виявили в білкових препаратах один структурний компонент з молекулярною масою 17±0,5 кДа характерний для всіх трьох ізолятів.

Молекулярна маса капсидного білка 17,2 ± 0,5 кДа є характерною для вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка, тобто дані електрофорезу підтверджують, що виділені українські ізоляти належать до ВЗКМО.

Отже, згідно з результатами ІФА, електронномікроскопічних та електрофоретичних досліджень, вірусні ізоляти, виділені з рослин Cucumis sativus трьох тепличних господарств України, належать до вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка роду Tobamovirus.

6.3 Біологічна характеристика ізолятів ВЗКМО

Встановлення кола рослин-хазяїв. Для встановлення кола рослин-хазяїв трьох українських ізолятів ВЗКМО було проведено ураження огірків, кабачків, кавунів, цукіні та патісонів різних сортів.

На огірках сорту "Джерело" і "Хела F1" всі три ізоляти викликали симптоми деформації листків та системної мозаїки, а на кавуні сорту "Фотон" - біла мозаїка у вигляді білих розводів, зупинка росту рослин; молоді листки дрібні, але деформація листків відсутня.

Симптоми на рослинах Cucumis sativus та Citrullus lanatus були однаковими для всіх трьох ізолятів. На патісоні "Білий", цукіні "Золотинка", кабачках "Білоплідний" симптоми вірусного ураження не проявлялися у жодному випадку для всіх трьох ізолятів. Отримані результати підтверджують, що рослинами-хазяями для даних ізолятів є огірки та кавуни, що узгоджується з літературними даними.

Встановлення кола рослин-індикаторів. Зважаючи на те, що вірус зеленої крапчастої мозаїки огірка є вузько спеціалізованим, коло рослин-індикаторів у нього дуже обмежене і залежить від штаму вірусу. За результатами проведених досліджень, на Cucumis sativus всі три ізоляти викликають системну реакцію у вигляді темно-зеленого пухирчатого здуття листкової пластинки через три тижні після інфікування рослин. На Nicotiana tabacum cv "Samsun"приблизно через місяць після ураження на верхівкових листках розвивалася мозаїка у вигляді темно-зеленого здуття листкової пластинки на фоні її просвітління. Стосовно Datura stramonium, Chenopodium hybridum та Petunia hybrida не спостерігалося жодного прояву симптомів трьох ізолятів ВЗКМО. Оскільки всі три українські ізоляти ВЗКМО мають однакове коло рослин-хазяїв та рослин-індикаторів і викликають однакові симптоми на даних рослинах, можна припустити, що досліджувані ізоляти належать до одного і того ж штаму ВЗКМО.

6.4 Фізико-хімічна характеристика ізолятів ВЗКМО. Однією з важливих фізичних критеріїв вірусу є точка його температурної інактивації (TTI), за якої вірус, при певній температурній експозиції, втрачає біологічну активність. Це обумовлено пошкодженням теплочутливих ділянок у гені РНК-залежної-РНК-полімерази, внаслідок чого вона втрачає свої ферментативні властивості і реплікація вірусу не відбувається. Так, для ВЗКМО TTI в залежності від штаму варіює в межах 86 - 100єС. Оскільки ТТІ різниться не тільки у різних видів вірусів, а й у їхніх штамів, було цікаво встановити, за якої температури відбувається інактивація українських ізолятів ВЗКМО. Саме за різницею показників точки температурної інактивації можна визначити чи належать ізоляти до одного штаму вірусу, чи є різними штамами.

У результаті проведених досліджень було встановлено, що на рослинах огірків, інокульованих обробленими температурами 96С або 98С та необробленими очищеними вірусними ізолятами, спостерігалися симптоми у вигляді потемніння жилок листка на фоні просвітління листкової пластинки, а також зморшкуватість листкової пластинки.

Відсутність симптомів на рослині при ураженні її вірусом вказує на втрату біологічної активності вірусу, тобто його здатності до репродукції у клітинах. Необхідно відмітити той факт, що усі три ізоляти втрачали біологічну активність при температурі 99 - 100С. При температурах 96С і при 98С всі три ізоляти індукували однакові симптоми на рослинах огірка. Тобто, дані ізоляти належать до одного штаму вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка.

При визначенні TTI було проведено флуоресцентну мікроскопію та електрофорез білків. У полі зору для термооброблених при температурі 96С, 98С та термонеоброблених ізолятів на зрізі міжжилкового епідермісу листка спостерігались яскравооранжеві скупчення вірусних включень. Що стосується інтактної рослини огірка, яка використовувалась як контроль - вірусні включення були відсутні.

Методом електрофорезу білків було показано наявність у гомогенаті рослин, попередньо уражених обробленим температурами 96С і 98С та необробленими температурою ізолятами, капсидного білка Мr=17 кДа для всіх вірусних ізолятів.

6.5 Серологічна характеристика ізолятів ВЗКМО. Після ідентифікації вірусу нами було отримано діагностичні кролячі антисироватки (АС) до українських ізолятів ВЗКМО. Критеріями якості АС вважали титр та специфічність до відповідних антигенів.

Титри та робоче розведення антисироваток встановлювали методом непрямого ІФА. Так, робоче розведеня для 1-го ізоляту (Миколаївська обл.) при титрі 1: 512000 становило 1: 4000; для 2-го ізоляту (Дніпропетровська обл.) при титрі 1: 256000 - 1: 8000, а до 3-го ізоляту (Автономна Республіка Крим) при титрі 1: 256000 - 1: 8000 (рис.8.).

Специфічність отриманих антисироваток визначали методом імуноелектроблотингу. При взаємодії ізоляту 1 ВЗКМО з гомологічними АТ та при взаємодії ізоляту 2 ВЗКМО з гомологічними АТ на нітроцелюлозній мембрані спостерігались чіткі смуги по одній для кожного ізоляту, що за молекулярною масою відповідали капсидному білку ВЗКМО. При взаємодії здорового соку огірка з АТ до кожного ізоляту ВЗКМО утворення смуг не спостерігалось у жодному випадку, що свідчить про відсутність реакції даних АТ з рослинними білками, а отже, про специфічність по відношенню до ізолятів ВЗКМО.

У подальшому для встановлення серологічної спорідненості трьох ізолятів ВЗКМО було проведено перехресну реакцію імунодифузії в гелі за Ухтерлоні. Отримані лінії преципітації у всіх випадках утворювали кільце навколо лунки з АГ, що вказує на те, що досліджувані ізоляти належать до одного і того ж штаму ВЗКМО.

Отримані результати дозволяють припустити, що всі три ізолята відносяться до одного штаму ВЗКМО, оскільки полоски преципітації при взаємодії антигенів з гомологічними та гетерологічними антисироватками були повністю злиті у кожному з випадків і не утворювали шпор. Це характерно для вірусів, які мають спільні антигенні детермінанти, тобто для споріднених у серологічному відношенні вірусів.

6.6 Молекулярна характеристика ізолятів ВЗКМО. Оскільки капсидний білок є найбільш вивченим, то було цікавим проаналізувати ступінь дивергенції всередині групи ВЗКМО саме по його нуклеотидній послідовності. Для встановлення молекулярних особливостей ВЗКМО було підібрано праймери до ділянки, що кодує капсидний білок вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка штаму CGMMV-W:

лівий - 5'CAAATCGGAGGTTGGACTCT-3';

правий - 5'GTGTGCACCACCATCAGAAG-3'

У результаті проведення зворотньо-транскрипційної полімеразної ланцюгової реакції було отримано продукти ампліфікації розміром 620 п. н. Як позитивний контроль ПЛР використовували ДНК фага лямбда. Наступним етапом нашої роботи було секвенування кДНК українських ізолятів вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка. Секвеновані нуклеотидні послідовності капсидного білка трьох українських ізолятів були співставлені різними методами за допомогою комп'ютерної програми DNA Star. Послідовності штамів та ізолятів ВЗКМО було взято з бази даних GenBank (http://www.ncbi. nlm. nih.gov). На сьогодні для вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка в базі даних GenBank наявні нуклеотидні послідовності 4 штамів та 12 ізолятів. При порівнянні ділянок нуклеотидного сиквенсу кДНК гену капсидного білка українських ізолятів (1, 2 та 3) ВЗКМО між собою методом ClustalW встановлено, що гомологія становить 95%. За літературними даними, якщо процент гомології нуклеотидних послідовностей вірусів становить 90% і більше, то вони є ізолятами одного штаму. А якщо менше 90% - то це різні штами одного вірусу. Тобто, отримані результати дозволяють говорити про належність усіх трьох українських ізолятів до одного штаму.

Наступним етапом досліджень було порівняння нуклеотидних послідовностей українських ізолятів з уже описаними в літературі нуклеотидними послідовностями штамів та ізолятів ВЗКМО. Виявилося, що дуже високий процент гомології - 96% українські ізоляти мають з російським огірковим ізолятом МС-1. Можна припустити, що і українські, і російський ізоляти належать до одного штаму ВЗКМО. Також дуже близькими за гомологією нуклеотидної послідовності були грецькі кавунові ізоляти CR-3 та CR-5. У даному разі процент гомології з українськими ізолятами становив 94%. Зважаючи на такий значний процент гомології у нуклеотидній послідовності гена капсидного білка українських ізолятів з російським та двома грецькими ізолятами, доцільно було б віднести всі ці ізоляти до одного і того ж штаму.

Що стосується всіх інших штамів та ізолятів ВЗКМО, то відносно українських ізолятів процент гомології був невисокий і становив 89% і менше, що свідчить про значну відмінність у їхніх нуклеотидних послідовностях.

6.7 Поширення ВЗКМО по території України та встановлення шляхів його передачі. За період з 2001 по 2008 рр. було проведено дослідження поширення ВЗКМО по території України. Обстежено тепличні господарства 10 та поля 7 регіонів України на наявність антигенів ВЗКМО в культурі огірка. ВЗКМО було зафіксовано у наступних регіонах України: в Автономній республіці Крим, в Дніпропетровській, Миколаївській, Сумській, Черкаській та Харківській областях. Стосовно ВЗКМО у інших представників родини Cucurbitaceae, то його не було знайдено в польових умовах на рослинах кабачків, цукіні, динь, кавунів та гарбузів. Тобто, за результатами проведених досліджень, на території України ВЗКМО уражує лише огірки закритого грунту.

Такі результати наштовхнули нас на думку, що, ймовірно, широке розповсюдження цього вірусу у тепличних господарствах пов'язане, перш за все, зі шляхами його передачі. Так, ВЗКМО добре передається насінням: вірус міститься на верхній частині плівки насіння і передача його потомству відбувається внаслідок механічного травмування тканини паростків, завдяки чому інфекція потрапляє у рослину. Ще одним і не менш ефективним джерелом вірусної інфекції є ґрунтовий розчин, враховуючи те, що вірус стійкий до умов навколишнього середовища. Особливості шляхів передачі та фізичні властивості вірусу разом з недотриманням санітарних норм і призводить до масового ураження рослин у теплицях і, як наслідок, значної втрати товарної продукції.

Відтак для встановлення джерела інфекції ВЗКМО у тепличних господарствах було проведено перевірку ґрунту, в якому вирощували рослини, та насіння, з якого вирощували рослини, на можливість їх контамінації ВЗКМО. Окрім того, було перевірено різне насіння комерційних сортів як огірків так і інших представників даної родини на контамінацію його вірусом зеленої крапчастої мозаїки огірка.

Перевірка ґрунту та насіння з тепличних господарств на наявність ВЗКМО. Для перевірки припущення про ґрунтову передачу ВЗКМО було відібрано ґрунт з двох тепличних господарств України - Дніпропетровської області та Автономної республіки Крим. В обох випадках грунт виявився вірусінфікованим. Перевірка насіння ж на присутність антигенів ВЗКМО не дала жодного позитивного результату на присутність антигенів ВЗКМО. Таким чином, можна вважати, що ґрунт є основним і найбільш небезпечним джерелом поширення вірусу. Однак було доцільно провести більш широку перевірку сортів насіння, які використовуються у тепличних господарствах. Тому нами було протестовано різні сорти комерційного насіння на предмет вірусоносійства та, як наслідок, джерела розповсюдження інфекції.

Перевірка комерційних сортів насіння Cucumis sativus на контамінацію його ВЗКМО. Вірусні антигени виявляли методом непрямого ІФА з використанням діагностичної антисироватки до ВЗКМО (Асершлебен, Німеччина). До досліду було залучено 43 сорти насіння дев'яти різних фірм: ТМ "Насіння України", агрофірма "Елітсортнасіння", Агроцентр, ТМ "Екола", "Тирас", "Світ насіння", "Флора маркет", "Шість соток" та насіння Сквирської дослідно-селекційної станції. У результаті досліджень було встановлено, що 28% серед перевіреного насіння інфіковане ВЗКМО.

Результати ІФА були підтверджені методом електронної мікроскопії: у полі зору мікроскопа спостерігались паличкоподібні віріони розміром 280-300х15 нм, що співпадали за розмірами та морфологією з вірусом зеленої крапчастої мозаїки огірка.

Таким чином встановлено, що на сьогодні, комерційне вірусінфіковане насіння може бути, цілком ймовірно, причиною появи вірусного захворювання як на рослинах тепличних господарств, так і на рослинах відкритого грунту та є не менш небезпечним джерелом інфекції ВЗКМО, ніж грунт.

ізолят вірус зелена крапчаста мозаїка

Висновки