Удосконалення діагностики лейкозу великої рогатої худоби

Размещено на http://www.allbest.ru/

Українська академія аграрних наук

Національний науковий центр

Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини

УДК: 619:616.98:578.828.11:616-076

Удосконалення діагностики лейкозу великої рогатої худоби

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

Явніков Назар Валентинович

Харків 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному науковому центрі “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”, УААН.

Науковий керівник

доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН, заслужений діяч науки і техніки України Стегній Борис Тимофійович, ННЦ “ІЕКВМ”, директор.

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН Завірюха Анатолій Іванович, Інститут ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії бактеріології;

доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Мандигра Микола Станіславович, Інститут епізоотології УААН, директор.

Провідна установа

Національний аграрний університет Кабінету Міністрів України, кафедра мікробіології, вірусології і біотехнології, м. Київ.

Захист відбудеться “24” квітня 2007 року о 9 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в ННЦ “ІЕКВМ” за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ННЦ “ІЕКВМ” за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий 24 березня 2007 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор ветеринарних наук, професор Бабкін А. Ф.

лейкоз худоба діагностика антиген

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Лейкоз великої рогатої худоби -- широко розповсюджене хронічне захворювання сільськогосподарських тварин, яке спричиняється ретровірусом - вірусом лейкозу великої рогатої худоби (ВЛ ВРХ).

Численні публікації та дані офіційної ветеринарної статистики свідчать про те, що серед хронічних інфекційних захворювань великої рогатої худоби лейкоз за масовістю ураження тварин посідає одне з провідних місць (Ковалюшко В., 1996; Петров Н. И., 1997; Сюрин В. Н., 1998; Мандигра М. С., 2000; Бусол В. О., 2002).

До 1985 р. в Україні оздоровчі заходи щодо лейкозу великої рогатої худоби зводились до виявлення тварин з клініко-гематологічним проявом хвороби та подальшого їх забою. Однак, цей шлях не є радикальним і ефективним. Пошук альтернативних методів боротьби з лейкозом великої рогатої худоби призвів до розробки та використання засобів профілактики. Існують численні спроби щодо створення ефективних вакцин для профілактики лейкозу як в нашій країні, так і за кордоном (Altaner C., 1991; Daniel R. C. W., 1993; Завірюха А. І., 2004; Горбатенко С. К., 2005). Однак ізолювання інфікованих тварин від неінфікованих на підставі результатів серологічних досліджень залишається основним методом боротьби з цією хворобою в усьому світі.

В Україні оздоровчі заходи щодо лейкозу базуються на дослідженні сироваток крові від великої рогатої худоби за допомогою реакції імунодифузії (РІД) із наступним вилученням позитивно реагуючої худоби із загального стада. Але, як свідчать повідомлення Н. Б. Безовитова (1988) та Н. В. Воложанінової (2006), а також наші власні спостереження, у інфікованих тварин рівень антитіл суттєво коливається. В деяких випадках він може знижуватися нижче рівня чутливості РІД і в окремих тварин не підвищуватися тривалий період. При серологічному обстеженні такі тварини вважаються здоровими, залишаються у стаді і є джерелом збудника хвороби. Останнім часом для виявлення інфікованих тварин застосовують більш чутливу діагностичну реакцію -- імуноферментний аналіз (ІФА) (Klintevall K., 1995; Иванова Л. А, 1996; Сатаева А. Р., 1998; Воложанінова Н. В., 2005).

Проведення порівняльної оцінки методів діагностики лейкозу: ІФА, РІД та полімеразно-лацюгової реакції (ПЛР), розробка вітчизняної імуноферментної тест-системи та вивчення епізоотичної ситуації щодо лейкозу великої рогатої худоби в сучасних умовах має актуальне науково-практичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась в лабораторії вивчення лейкозу, лабораторії біохімії та лабораторії епізоотології Національного наукового центру “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” відповідно до науково-дослідної програми виконання завдання “Розробити на основі прогресивних технологій ефективну систему діагностики, терапії та профілактики хвороб, спільних для різних видів тварин” (2001-2005 рр., № держреєстрації 0101U001616).

Мета і завдання дослідженя. Метою досліджень було вивчення поширення лейкозу великої рогатої худоби та розробка імуноферментної тест-системи для діагностики лейкозу великої рогатої худоби. Основні завдання досліджень:

- вивчити епізоотичну ситуацію щодо лейкозу великої рогатої худоби в сучасних умовах;

- провести порівняльні дослідження різних методів діагностики лейкозу великої рогатої худоби (РІД, ІФА, ПЛР);

- відпрацювати режими культивування клітин FLK+BLV та концентрування культуральної рідини з метою отримання активного лейкозного антигену;

- виготовити очищені антигенні препарати, придатні для використання в імуноферментній реакції;

- отримати антивидові антитіла проти імуноглобулінів великої рогатої худоби, мічені пероксидазою хрону (кон'югат);

- провести випробування експериментального зразка розробленої ІФА тест-системи для виявлення антитіл до вірусу лейкозу в сироватках крові великої рогатої худоби.

Об'єкт дослідженя: вірус лейкозу великої рогатої худоби, здорові та інфіковані вірусом лейкозу великої рогатої худоби тварини, антитіла до ВЛ ВРХ.

Предмет дослідженя: епізоотична ситуація щодо лейкозу великої рогатої худоби, статистичні дані про поширення лейкозу великої рогатої худоби, методи діагностики лейкозу (ІФА, РІД та ПЛР).

Методи досліджень: ретроспективний епізоотологічний аналіз, вірусологічні, імунологічні, біохімічні, серологічні, статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Визначено тенденцію епізоотичного процесу щодо лейкозу великої рогатої худоби в Харківській області та в Україні в цілому, зокрема ураження цим захворюванням худоби, яка утримується у крупних господарствах та приватному секторі. Проведено порівняльну оцінку діагностичних методів: РІД, ІФА та ПЛР. Розроблено імуноферментну тест-систему для діагностики лейкозу великої рогатої худоби. Встановлено ефективність використання розробленої імуноферментної тест-системи для оздоровлення господарств від лейкозу великої рогатої худоби.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено “Методичні вказівки щодо оцінки результатів визначення антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ВРХ) методом імуноферментного аналізу”, які затверджено науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини МАП України (протокол № 1 від 12 грудня 2003 р.). Розроблено нормативну документацію на виготовлення та контролювання діагностичного набору “Тест-система імуноферментна “DIA-BLV-Ab” (ТУУ 24.4-24265186-723-2004).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено аналіз літературних даних за темою роботи; обґрунтовано напрямок та програму роботи; проведено епізоотологічні дослідження; розроблено схеми та методи проведення експериментів у лабораторних умовах; виконано експериментальні та аналітичні дослідження; проведено аналіз та узагальнення одержаних результатів; сформульовано висновки та практичні рекомендації; підготовлено нормативні документи.

Робота з очистки та концентрування вірусу лейкозу з використанням ультрацентрифуги проводилась спільно з к. б. н. О. Ю. Семенченком (Інститут проблем кріобіології та кріомедицини НАНУ). Електронно-мікроскопічні дослідження виконувались сумісно з к. б. н. М. В. Рєпіним (Інститут проблем кріобіології та кріомедицини НАНУ). Виготовлення антивидових кон'югатів проводили з к. б. н. С. А. Михайловою, аналіз отриманих хромотограм та електрофореграм проводили спільно з к. вет. н. О. В. Прохорятовою (ННЦ “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”). Результати цих досліджень знайшли відображення у спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації представлені та обговорені на засіданнях Вченої ради ННЦ “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” 2000-2005 рр. та на міжнародних науково-практичних конференціях: “ІЕКВМ -- 80 років на передовому рубежі ветеринарної науки” 15-19 жовтня 2002 р., м. Харків; “Сільськогосподарська мікробіологія: здобутки і проблеми” 15-16 квітня 2002 р., м. Чернігів; “Актуальні проблеми ветеринарної медицини в умовах сучасного ведення тваринництва” 26 травня-2 червня 2003 р., м. Феодосія; “Сучасні проблеми діагностики інфекційних захворювань тварин” 2-3 грудня 2003 р., м. Харків.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 7 наукових статей у фахових виданнях, перелік яких затверджено ВАК України; отримано деклараційний патент.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 135 сторінках друкованого тексту і складається з таких розділів: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновки, список використаної літератури, додатки. Роботу ілюстровано 26 рисунками та 15 таблицями. Список використаних літературних джерел включає 226 назв, в тому числі 104 зарубіжних авторів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Наукові дослідження виконані в 2000-2006 рр. у лабораторіях вивчення лейкозу, епізоотології і біохімії ННЦ “ІЕКВМ”. Епізоотичні дослідження щодо поширення лейкозу великої рогатої худоби в Харківській області виконувались на базі Харківської обласної державної лабораторії ветеринарної медицини. Міжлабораторні комісійні випробування імуноферментної тест-системи проводили в ННЦ “ІЕКВМ”.

Проби сироваток крові великої рогатої худоби отримували з неблагополучних щодо лейкозу господарств Харківської, Полтавської областей та АР Крим.

Для вирішення поставлених завдань з вивчення епізоотичної ситуації щодо лейкозу великої рогатої худоби було проаналізовано багаторічні дані ветеринарної звітності Міжнародного епізоотичного бюро (МЕБ), Державного департаменту ветеринарної медицини МАП України та Харківської обласної державної лабораторії ветеринарної медицини.

З метою вивчення тенденції поширення лейкозу великої рогатої худоби використовували загальноприйняті у ветеринарії методи досліджень (Джупина С. И., 1991, Ярчук Б. М. та ін., 2002).

Для оцінки епізоотичної ситуації визначали динаміку виявлення неблагополучних пунктів і хворих тварин. Використовуючи ці дані, визначали рівень інцидентності та інфікованості худоби ВЛ ВРХ. Оскільки середні значення коливань показників епізоотичного процесу не можна було використовувати, то їх оцінка проводилась за лінією загального тренду, яку було побудовано шляхом виправлення найменших квадратів.

Для оцінки інформативності створеної тест-системи була отримана контрольна панель сироваток, яка складалась з позитивних та негативних зразків. Ці зразки були відібрані з польових проб сироваток шляхом паралельного тестування їх за допомогою РІД та ІФА.

РІД проводили з використанням комерційного “Набору компонентів для діагностики лейкозу великої рогатої худоби методом РІД” виробництва ДП “Ветеринарна медицина” згідно настанови.

При постановці ІФА використовували комерційні імуноферментні тест-системи для детекції антитіл до вірусу лейкозу Synbiotics^® SERELISA BLV Ab Mono Indirect (Франція), Bommeli Diagnostics^® Leukotest (Швейцарія) та IDEXX^® HerdChek Anti-BLV-test (США). Постановку діагностичної процедури виконували згідно настанов по застосуванню.

Для детекції фрагментів генів ВЛ ВРХ використовували ПЛР з наступним електрофорезом продуктів ампліфікації в агарозному гелі. Як діагностичний матеріал використовували лімфоцити крові тварин. ПЛР проводили в реакційній суміші, об'ємом 50 мкл, під мінеральним маслом з використанням комерційного набору праймерів виробництва фірми Gene Pak^tm згідно протоколу виробника.

Для отримання антитіл до імуноглобулінів G великої рогатої худоби із сироватки крові великої рогатої худоби була виділена загальна фракція імуноглобулінів шляхом внесення ПЕГ-115 (м. м. 6 кД). Далі на колонці з ДЕАЕ-сефадексом А 50 були виділені Ig класу G. Отриманий препарат використовували для імунізації кролів, всього було щеплено 10 тварин. Кон'югацію отриманих антитіл із пероксидазою хрону здійснювали перйодатним методом (Nakane Y., 1987). Кінцевий продукт стабілізували додаванням 50 % гліцерину і 0,02 % мертіоляту натрію.

Антиген ВЛ ВРХ отримували шляхом культивування клітинної культури FLK+BLV. Клітини вирощували у вигляді моношару за стаціонарних умов культивування. У якості живильного середовища для клітин FLK+BLV використовували комерційні штучні живильні середовища Ігла та 199 у співвідношені 1:1, до яких додавали 10 % різних сироваток крові, а саме: нативної сироватки крові великої рогатої худоби без антитіл до ВЛ ВРХ, сироваток крові коней, овець, новонароджених телят та аглобулінової сироватки великої рогатої худоби. Дві останні сироватки отримані нами.

Після перевірки активності отриманих антигенів у РІД із специфічною лейкозною сироваткою, вони були використані для подальшої очистки ультрацентрифугуванням, яке проводили в два етапи: перший -- центрифугування крізь шар 20-30 %_го розчину сахарози, другий -- у лінійному градієнті густини сахарози 15-60 %. Розведені вірусні препарати нашаровували на сахарозну “подушку” та піддавали центрифугуванню 60 хвилин при 17 000 об./хв. (35 000 g). Осад ресуспендували в буферному розчині та нашаровували на сахарозний градієнт, центрифугували 180 хвилин при 25 000 об./хв. (65 000 g).

До частини отриманого очищеного антигену вносили детергент Тритон Х_100 до кінцевої концентрації 1 %. Суміш витримували 60 хвилин за температури 22 єС. Після інкубації цей матеріал наносили на колонку з Sephadex G_25, попередньо урівноважену карбонатно-бікарбонатним буфером (рН 9,2). Цей же буфер використовували як елюючий. Матеріал, що виходив, сканували крізь оптичний монітор з довжиною хвилі 280 нм.

Для отримання глікопротеїдної фракції ВЛ ВРХ до вірусної суспензії вносили Тритон Х_100 до кінцевої концентрації 0,8 % та інкубували за температури 4 єС протягом 16 годин. Після інкубації вірусний препарат центрифугували при 1 000 g 5 хвилин, надосад фільтрували крізь мембрани “Millipore” з діаметром пір 0,65 мкм. Антигенну суміш подавали перистальтичним насосом до хроматографічної колонки з Toyopearl 40_55 F, яка попередньо була відкалібрована розчинами білків з відомою молекулярною вагою, урівноваженою ТСЕ буфером з додаванням 0,1 % Тритон Х_100. Матеріал, що виходив із колонки, сканували крізь проточний спектрофотометр з довжиною хвилі 280 нм. Фракція, молекулярна вага якої була в межах від 40 до 60 кД, була використана для постановки ІФА.

Рекомбінантні білки p24 і gp51, надані д. б. н. Н. Я.Співаком (АТЗТ НВК “Діапроф-Мед”), були отримані експресією відповідних ділянок векторної плазміди, клонування та трансформацію якої у Escherihia coli проводили за методом Дж. Самбрук (Sambrook J., 1989).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Стан епізоотичної ситуації щодо лейкозу великої рогатої худоби у світі. Встановлено, що лейкоз має значне та нерівномірне поширення у світі. Ця хвороба, згідно МЕБ, реєструється на всіх населених континентах. Найбільш розповсюджена вона в Європі, де щорічно захворювання на лейкоз реєструють в 21-24 країнах, та Америці -- у 16-23 країнах. В Азії, згідно звітів МЕБ, більшість країн благополучні щодо лейкозу. Найменш з'ясована епізоотична ситуація в Африці, де за період 1999-2004 рр. з 53 країн континенту щорічно надають статистичну інформацію від 9 до 25 країн. Стаціонарно неблагополучна щодо лейкозу великої рогатої худоби Австралія та Нова Зеландія. Благополучними вважаються майже всі острівні території Океанії. Результати проведеного аналізу свідчать, що поширеність захворювання на Європейському континенті нерівномірне: з 15 країн, яких офіційно визнано оздоровленими, 13 належать до країн-членів ЄС. У країнах Східної Європи (Бєларусь, Латвія, Литва, Молдова, Росія, Україна, Естонія) за період спостереження зареєстровано більшість випадків захворювання на лейкоз великої рогатої худоби -- від 66,2 до 92,3 % офіційно зареєстрованих загальносвітових випадків лейкозу.

Основним методом оздоровлення від лейкозу та недопущення занесення збудника до благополучних територій у світі є лабораторні діагностичні дослідження з подальшою ізоляцією інфікованих тварин. Вакцинація при лейкозі має обмежене використання. За період наших досліджень експериментальні щеплення проти лейкозу великої рогатої худоби застосовували в трьох неблагополучних країнах (Бразилії, Бахрейні та Україні). У країнах, оздоровлених від лейкозу великої рогатої худоби, вакцинацію не використовували.

Вивчення тенденції епізоотичного процесу щодо лейкозу великої рогатої худоби в Україні. В Україні за період з 1994 по 2005 рр., згідно з даними Державного департаменту ветеринарної медицини МАП України, виявлено 3 773 190 хворих на лейкоз тварин, зареєстровано 7 782 неблагополучних пунктів. На 31.12.2004 р. вважались благополучними щодо лейкозу п'ять областей західного та північно-західного регіонів України: Закарпатська -- благополучна з 1995 р., Івано-Франківська -- з 1997 р., Волинська -- з 1999 р., Рівненська -- з 2000 р., Чернівецька -- з 2003 р. Інші 19 областей та АР Крим стаціонарно неблагополучні щодо цієї хвороби.

При вивченні епізоотичної ситуації інформативним є визначення таких показників інтенсивності епізоотичного процесу, як інцидентність та інфікованість. У 1994 р. показник інцидентності був мінімальним та становив 0,95 %, впродовж чотирьох наступних років він зростав і досяг у 1998 р. 4,54 %. Паралельно з підвищенням інцидентності зростала інфікованість худоби вірусом лейкозу (рис. 1). Максимальний рівень інфікованості було зафіксовано у 1999 р. -- 4,31 %, що у 4,7 рази вище в порівнянні з початком спостережень. З 1999 р. спостерігалось зниження показника інцидентності, а в подальшому було зафіксовано зниження рівня інфікованості худоби вірусом лейкозу. У 2005 р. інфікованість становила 1,06 %, що в 4,1 рази менше в порівнянні з максимальним підйомом (1998-1999 рр.), а інцидентнісь зменшилась до 1,58 %, тобто в 2,9 рази.

Рис. 1 Динаміка інфікованості та інцидентності щодо лейкозу в Україні



Слід зазначити, що за період наших досліджень в Харківській області, як і в цілому в Україні, зменшилась кількість худоби, яка утримувалась у господарствах всіх форм власності, що викликало зміну кількості серологічних досліджень, які проводили у ветеринарних лабораторіях області. Так у 1992 р. було проведено 713 009 серологічних досліджень за допомогою РІД. На той час загальна кількість худоби в господарствах області становила 1 148 019 тварин. У 2001 р. було досліджено 476 438 проб за допомогою РІД (поголів'я становило 342 023 тварин), у 2005 р. було досліджено 214 148 проб сироваток (поголів'я -- 156 357). Тобто, в період з 1992 по 2005 рр. кожен рік серологічно досліджувалась різна частка від загального поголів'я худоби області. У зв'язку з цим, при аналізі ступеня ураженості худоби на лейкоз використовували показник кількості отримання позитивних результатів при серологічній діагностиці (модифікований індекс превалентності за Джупина С. И., 1991). Рівень позитивних результатів, отриманих при серологічних обстеженнях худоби, яка належить господарствам Харківської області, у 1992 р. становив 12 % (рис. 2). У наступному році рівень превалентності зріс до 16,2 %, а у 1994 р. відмічали зниження цього показника 12,2 %. З 1994 по 2002 рр. рівень позитивних результатів при серологічній діагностиці лейкозу знаходився в межах 11,7-14,1 %. Винятком були два роки: 1995 р., в якому рівень позитивних результатів при серологічній діагностиці лейкозу знизився до 9,3 %, та 1996 р., коли 15,2 % досліджуваних проб сироваток виявились РІД_позитивними. У 2003 р. рівень превалентності знизився до 9,8 %, а в кінці спостереження показник серопозитивності було зафіксовано на рівні 6,2 %.

З наведених на рис. 2 даних видно, що за направленістю до зниження лінія загального тренду та рівень превалентності співпадають, що свідчить про поступове зниження напруженості епізоотичного процесу щодо лейкозу великої рогатої худоби в Харківській області.

Рис. 2 Динаміка виявлення позитивно реагуючих тварин у господарствах Харківської області

Серед худоби, яка утримується в господарствах Харківської області, зменшилась абсолютна кількість виявлених тварин зі зміною показників крові, характерної для гематологічної стадії лейкозу великої рогатої худоби, з 4102 випадків у 1992 р. до 632 -- у 2005 р. Проте відносна частота прояву гематологічної форми лейкозу не зменшилась, а навіть збільшилась. У 1992 р., в середньому, на 10 000 тварин зареєстровано 36 випадків гематологічної форми лейкозу великої рогатої худоби (рис. 3), а в 2005 р. -- 41. З 1992 по 1996 рр. показник захворюваності на гематологічну форму був досить стабільним та знаходився в межах від 36 до 40 випадків на 10 000 тварин.

Значне зростання показника захворюваності на гематологічну форму лейкозу над лінією загального тренду спостерігали в 1997, 2001 і 2003 рр., коли частота реєстрування тварин хворих на гематологічну форму лейкозу зростала до 45, 48 і 56 випадків на 10 000 тварин відповідно. Лінія тренду захворюваності гематологічною формою лейкозу вказує на тенденцію до зростання частоти прояву цього захворювання, що обумовлено приростом показників захворюваності на гематологічну форму лейкозу у 1997, 2001 та 2003 рр., та більш високим показником захворюваності наприкінці спостереження, ніж на початку.

Рис. 3 Динаміка захворюваності великої рогатої худоби на лейкоз з гематологічним проявом хвороби у господарствах різних форм власності Харківської області

Рівень лейкозної серопозитивності серед худоби, яка належить мешканцям Харківської області, у 1992 р. становив 11,9 % (рис. 4). Протягом наступних трьох років спостерігали зниження рівня позитивних результатів, отриманих за допомогою РІД. У 1995 р. при серологічному обстеженні тварин приватного сектору було виявлено 9,0 % позитивних результатів. У 1996 р. кількість позитивних результатів РІД зросла до 11,6 % і протягом наступних чотирьох років цей показник знаходився вище лінії загального тренду. З 2001 р. спостерігалось щорічне зниження рівня серопозитивності, за винятком 2002 р. У 2005 р. рівень превалентності був найнижчий -- 5,4 %, що у 2,2 рази менше ніж на початку дослідження та у 2,3 рази в порівнянні з максимумом.

Лінія загального тренду позитивних результатів при постановці РІД із пробами сироваток крові від тварин приватного сектору мала напрямок до зниження.

При порівнянні результатів серологічного обстеження великої рогатої худоби, яка знаходиться в особистій власності громадян та в господарствах, встановлено, що в період дослідження рівень серопозитивності за відповідний рік був нижчим серед худоби приватного сектору (рис. 2 і 4). Між рівнем серопозитивності худоби, яка утримується в особистих подвір'ях та господарствах, існує позитивна кореляція (r = 0,55), що свідчить про схожість епізоотичних процесів в господарствах та приватному секторі Харківської області.

Рис. 4 Динаміка виявлення позитивно реагуючих тварин приватного сектору Харківської області

Дослідження чутливості та специфічності різних методів діагностики лейкозу великої рогатої худоби. При дослідженні 152 польових проб РІД_негативних сироваток крові методом ІФА з використанням закордонних комерційних тест-систем, отримано 32 позитивних результати. Тобто, при дослідженні проб сироваток крові методом ІФА виявили на 21,0 % більше позитивно реагуючих тварин, ніж за допомогою РІД. У дослідженні двох серій позитивної контрольної сироватки з “Наборів компонентів для діагностики лейкозу методом РІД”, виробництва ДП “Ветеринарна медицина”, 16 польових позитивних сироваток та 9 з 10 слабо позитивних сироваток, отримано позитивні результати за допомогою ІФА, що свідчить про специфічність цього методу. При порівнянні серологічних методів діагностики з ПЛР провірусну ДНК ВЛ ВРХ було виділено в трьох пробах від 29 тварин, які були тестовані як ІФА_негативні. А в результаті дослідження матеріалу від восьми ІФА_позитивних тварин методом ПЛР діагноз було підтверджено в двох випадках.

Таким чином, було встановлено більш високу чутливість та специфічність ІФА_діагностики в порівнянні з традиційною РІД. Результати ПЛР не збіглись з даними серологічних діагностичних досліджень.

Розробка та випробовування імуноферментної системи для діагностики лейкозу. Були проведені досліди з одержання компонентів ІФА_діагностичної системи: антигенів, контрольних сироваток, кон'югатів та буферних розчинів для проведення реакції. Після імунізації кролів були отримані антисироватки проти IgG великої рогатої худоби, з яких виділені Ig класу G. Імуноглобуліні були з'єднані з пероксидазою хрону, титр отриманого кон'югату становив 1:800.

Встановлено, що при культивуванні клітинної культури FLK+BLV протягом 7-11 діб у культуральному середовищі з додаванням аглобулінової сироватки крові великої рогатої худоби, було отримано активний антиген ВЛ ВРХ, титр якого в РІД становив 1:2. При вивченні накопичення рівня антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби в залежності від характеристики сироватки крові у культуральному середовищі встановлено, що більш активний антиген було отримано при додаванні сироватки крові коней (титр в РІД -- 1:2,4) та сироватки крові безмолозивних телят (титр в РІД -- 1:2,2), а нижчий -- при використанні сироватки крові овець (титр в РІД -- 1:1,6). Серед різних методів концентрування вірусної культуральної рідини (осаджування поліетиленгліколем, висолювання сірчанокислим амонієм, фракціювання на розподільчому апараті “АР-2-15” та кріоконцентрація) оптимальним було визнано осадження антигену вірусу лейкозу шляхом додавання ПЕГ_115 у концентрації 11 %. Цей метод відрізнявся високою технологічністю та давав можливість одержувати найбільш активний антиген.

З метою визначення білкового складу отриманого вірусного препарату з плавучою густиною 1,176 г/см³ було проведено електрофорез (ЕФ) у поліакріламідному гелі з додаванням додецилсульфату натрію. За даними ЕФ, антиген до ультрацентрифугування містив п'ять білків з молекулярною масою 24-67 кД. Білок з молекулярною масою 67 кД відповідав молекулярній масі альбуміну сироватки крові. Інші білки мали молекулярну масу 55, 49 та 24 кД. Перші два білки за молекулярною масою збігалися з головним глікопротеїдом ВЛ ВРХ, третій належав до основного внутрішнього поліпептиду. У вірусному препараті після центрифугування були виявлені білки з молекулярною масою 55 та 49 кД, також був присутній білок з молекулярною масою 62 кД, який за масою відносять до альбумінової фракції, внутрішній поліпептид (р24) був відсутній.

Для встановлення активності та специфічності очищених вірусних препаратів проводили титрування з контрольними негативними та позитивними сироватками. Визначали титр антигенів та показник P/N (співвідношення відносної оптичної густини позитивних сироваток до негативних).

При узагальненні результатів залежності специфічності отриманих антигенних фракцій від їх плавучої густини встановлено, що максимальне значення P/N було зафіксовано при використанні антигенів, які мали плавучу густину у градієнті сахарози від 1,143 до 1,182 г/см³ (рис. 5).

При постановці ІФА антигени, з якими було зафіксовано найбільше значення P/N, були використані для проведення імуноферментної реакції з сироватками контрольної панелі, по завершенню якої визначали значення S/P (співвідношення відносної оптичної густини досліджуваних сироваток до позитивного контролю). Розроблені нами діагностичні системи, в якості антигену яких використовували очищені препарати ВЛ ВРХ, показали їх недостатню специфічність. Рівень специфічності було підвищено завдяки обробці антигену детергентом, співвідношення P/N було зареєстровано на рівні 9,2 в порівнянні з P/N 5,15 у разі застосування необробленого детергентом антигену (табл. 1).

Рис. 5 Залежність специфічності імуноферментної реакції від плавучої густини антигенів

Таблиця 1

Визначення впливу обробки антигену детергентом на активність та специфічність імуноферментної реакції

Показники активності і специфічності	Антиген, оброблений детергентом	Антиген, необроблений детергентом
Робочий титр антигену, log2	6,96	9,32
Робочий титр сироватки, log2	6,64	6,64
Оптична густина позитивних контролів, M±m	0,138±0,003	0,067±0,004
Оптична густина негативних контролів, M±m	0,015±0,001	0,028±0,003
Співвідношення P/N	9,2*	5,15*

Примітки:Р оптична густина позитивних контрольних сироваток;

N оптична густина негативних контрольних сироваток;* Р < 0,01.



Виділений з культуральної вірусної рідини антиген з молекулярною вагою 40-60 кД виявився найбільш специфічним, при проведені ІФА середній показник S/P негативних сироваток становив 0,37, а позитивних -- 1,05 (табл. 2).

Таблиця 2

Результати постановки імуноферментної реакції при використанні антигену, обробленого детергентом, та фракції з молекулярною масою 40-60 кД з сироватками контрольної панелі

Показники активності і специфічності	Антигенний препарат
	Антиген, оброблений детергентом	Фракції з м. м. 40-60 кД
Середня оптична густина негативних сироваток, M±m S/P	0,288±0,015 0,58	0,225±0,011 0,37
Середня оптична густина позитивних сироваток, M±m S/P	0,576±0,010 1,17	0,644±0,008 1,05

Примітки: S -- оптична густина досліджуваних сироваток;

Р -- оптична густина позитивних контрольних сироваток.

Різниця між оптичною густиною негативних та позитивних сироваток при використанні культуральних антигенів була меншою, ніж при постановці ІФА з комерційними тест-системами зарубіжного виробництва.

Високочутливий та специфічний ІФА-набір для детекції антитіл до вірусу лейкозу було виготовлено з рекомбінантними антигенами р24 та gp51, який отримав комерційну назву “DIA-BLV-Ab”. При постановці імуноферментної реакції з сироватками контрольної панелі середня оптична густина негативних сироваток становила 0,111±0,043 ВОО, позитивних -- 0,884±0,201 ВОО.

Під час комісійних випробовувань тест-системи досліджено проби сироваток крові, які попередньо були перевірені за допомогою імпортного імуноферментного діагностичного набору. Всього було досліджено 40 зразків, з яких 7 були РІД-позитивними, 27 -- РІД-негативними, 6 --- з невстановленим в РІД статусом. Після проведення досліджень з використанням тест-систем виробництва фірми “IDEXX” (США) встановлено, що: всі 7 РІД-позитивних сироваток за результатом імуноферментної реакції були охарактеризовані як позитивні; з 6 сироваток, з невстановленим у РІД статусом, в ІФА виявились позитивними 5; з 27 РІД-негативних сироваток 23 виявились негативними в ІФА, а 4 -- позитивними.

При використанні набору “DIA-BLV-Ab” отримали такі результати: з 16 специфічних сироваток усі проби виявились позитивними, коефіцієнт чутливості становив 100 %; з 24 негативних сироваток результат був підтверджений у 23 проб сироваток, 1 проба виявилась позитивною, коефіцієнт специфічності становив 96,0 %.

Для визначення придатності тест-системи “DIA-BLV-Ab” в системі заходів з оздоровлення від лейкозу в неблагополучному господарстві було сформовано групу з 40 тварин, від яких щомісячно протягом 4 місяців відбирали проби крові для серологічних досліджень. У господарстві проводились оздоровчі заходи щодо лейкозу. Всіх РІД-позитивних тварин вилучали із основного стада, далі від цих тварин відбирали проби крові для гематологічних досліджень. Серологічного обстеження такої худоби не проводили, тому кількість проб постійно змінювалась. У другому дослідженні було тестовано 36 проб сироваток, у третьому -- 33, у четвертому -- 29.

При першому дослідженні в РІД було виявлено 5 тварин, що реагували позитивно (серопозитивність становила 12,5 %), в ІФА -- 8 тварин (20 %). У другому досліді РІД-позитивними виявились 2 проби (5,6 %), ІФА_позитивними -- 10 проб (27,7 %). При третьому дослідженні, антитіла до ВЛ ВРХ в РІД виявили у 4 тварин (12,1 %), в ІФА -- у 10 (30,3 %), в четвертому -- в РІД -- 2 проби виявились позитивними (6,9 %), в ІФА -- 6 проб (20,7 %) (рис. 6).

Рис. 6 Результати серологічних досліджень

Із 17 тварин, у сироватках крові яких були виявлені антитіла до ВЛ ВРХ методом ІФА, у 7 випадках позитивні результати були отримані в РІД та ІФА одночасно, у 6 -- антитіла в ІФА були виявлені раніше, ніж в РІД. У 4 тварин антитіла до вірусу лейкозу були виявлені тільки методом ІФА, при досліджені за допомогою РІД ці тварини були негативні протягом всього періоду досліджень.

При проведенні виробничих випробовувань на базі Харківської державної обласної лабораторії ветеринарної медицини з використанням тест-системи “DIA-BLV-Ab” було досліджено 6 364 проб сироваток крові великої рогатої худоби, отримано 1 584 позитивних результатів, що складає 24,9 %. У разі застосування РІД для дослідження сироваток цієї ж групи рівень серопозитивності становив 6,0 %. Тобто при застосуванні ІФА виявлено на 18,9 % більше позитивних тварин, ніж при використанні РІД.

Результати проведених епізоотологічних досліджень свідчать, що лейкоз великої рогатої худоби є широко розповсюдженим захворюванням як у світі, так і в Україні. З 1999-2000 рр. показники інтенсивності епізоотичного процесу при лейкозі в Україні мають тенденцію до зниження. В Харківській області стійке зниження рівня превалентності спостерігається з 2003 р. Відносна частота прояву гематологічної форми цього захворювання серед худоби в Харківській області має тенденцію до зростання, що може свідчити про тривале утримування в господарствах РІД-позитивної худоби.

Завдяки більшій чутливості, імуноферментний метод діагностики лейкозу має перевагу над традиційною РІД-діагностикою. Імуноферментна тест-система на основі рекомбінантних білків є найбільш перспективною.

ВИСНОВКИ

1. На підставі аналізу епізоотичної ситуації щодо лейкозу великої рогатої худоби у світі та в Україні зокрема, визначені основні особливості та тенденції розвитку епізоотичного процесу в сучасних умовах. Розроблено та впроваджено у практику діагностичний набір “DIA-BLV-Ab” для виявлення антитіл до антигенів вірусу лейкозу великої рогатої худоби імуноферментним методом та затверджено нормативно-технічну документацію на “Тест-систему імуноферментну “DIA_BLV_Ab”.

2. Лейкоз великої рогатої худоби має значне поширення у світі, захворювання тварин зареєстровано в 46,9 % країн та адміністративних територій. Найбільша кількість випадків спостерігалась у країнах Східної Європи, де протягом 1999-2004 рр. виявляли від 66,2 до 92,3 % від загальносвітової кількості тварин, інфікованих вірусом лейкозу.

3. Динаміка епізоотичного процесу щодо лейкозу великої рогатої худоби в Україні з 1994 р. до 1998-1999 рр. характеризувалась збільшенням рівня інцидентності (до 4,54 %) та інфікованості (до 4,31 %) тварин з подальшим поступовим зниженням цих показників. У 2005 р. інцидентність становила 1,29 %, інфікованість -- 1,06 %.

4. Встановлено, що перебіг лейкозу великої рогатої худоби в господарствах Харківської області характеризувався зменшенням серопозитивності до збудника хвороби з 12 % у 1992 р. до 6,2 % -- у 2005 р., а у приватному секторі цей показник зменшився з 8,2 до 5,4 %. На цьому фоні спостерігалася тенденція до підвищення відносної кількості тварин, хворих на гематологічну форму лейкозу, з 36 до 41 випадків на 10 000 тварин.

5. Серед виготовлених і досліджених антигенів, які були одержані на основі клітинної культури FLK+ВLV та очищені і сконцентровані з використанням різних методів (ПЕГ, сірчанокислий амоній, кріоконцентрування, осадження на фільтрувальних мембранах та ультрацентрифугування), найбільш активними та специфічними при використанні в імуноферментному аналізі виявились антигені з плавучою густиною у лінійному градієнті сахарози від 1,143 до 1,182 г/см³.

6. Обробка очищеного вірусного препарату детергентом Тритон Х_100 підвищувала специфічність антигену в ІФА. Відношення оптичної густини позитивних контрольних сироваток до оптичної густини негативних контрольних сироваток було у 1,8 рази вище при використанні антигену, який було оброблено детергентом.

7. Для очистки культуральних антигенів найефективнішим методом виявилася колонкова хроматографія. При використанні фракції антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби з молекулярною масою 40-60 кД отримано середнє значення відношення оптичної густини досліджуваних сироваток до оптичної густини позитивного контролю на рівні 0,37 для негативних сироваток і 1,05 -- для позитивних.

8. Найбільш виражену специфічність та чутливість імуноферментної реакції встановлено при використанні імуносорбенту з рекомбінантними антигенами р24 та gp51. Під час комісійних випробувань діагностичної системи специфічність набору “DIA-BLV-Ab” була 96,0 %, а чутливість -- 100 %.

9. Розроблено тест-систему, яка дозволяє виявляти на 7,5-22,1 % більше серопозитивних тварин при досліджені польових проб сироваток крові, ніж при застосуванні РІД.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. Методичні вказівки щодо оцінки результатів визначення антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ВРХ) методом імуноферментного аналізу, затверджені науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини МАП України (протокол № 1 від 12 грудня 2003 р.).

2. ТУ У 24.4-24265186-723-2004 “Тест-система імуноферментна “DIA_BLV_Ab”, ведені в дію з 24 листопада 2004 р.

СПИСОК ОСНОВНИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Концентрирование и очистка вируса лейкоза крупного рогатого скота / Б. Т. Стегний, Н. В. Явников, С. К. Горбатенко, С. А. Михайлова, В. С. Антонов, А. Ю. Семенченко // Вет. медицина: Міжвід. тематич. наук. зб. - Х., 2002. - Вип. 80. - С. 579-583. (Дисертантом проведені всі експериментальні дослідження, обробка даних та частково їх узагальнення).

2. Влияние обработки детергентом антигена лейкоза крупного рогатого скота на его иммунологические свойства / Б. Т. Стегний, Н. В. Явников, С. А. Михайлова, Н. Я. Спивак, Е. В. Резуненко // Вет. медицина: Міжвід. тематич. наук. зб. - Х., 2003. - Вип. 81. - С. 333-338. (Дисертантом проведені всі експериментальні дослідження, обробка даних та частково їх узагальнення).

3. Явніков Н. В. Порівняння серологічного та молекулярно-генетичного методів діагностики лейкозу великої рогатої худоби // Вет. медицина: Міжвід. тематич. наук. зб. - Х., 2004. - Вип. 83. - С. 262-266.

4. Тест-система для діагностики лейкозу великої рогатої худоби / Б. Т. Стегній, Н. В. Явніков, С. К. Горбатенко, С. А. Михайлова, В. С. Антонов, Л. П. Кальченко // Вісн. аграр. науки. - 2002. - № 12. - С. 32-34. (Дисертантом одержана більшість експериментальних даних та проведено їх узагальнення).

5. Оцінка методів концентрування і очищення культурального вірусу лейкозу великої рогатої худоби / Б. Т. Стегній, О. В. Прохорятова, В. В. Кіприч, А. В. Коновалов, Н. В. Явніков, О. Ю. Семенченко // Вісн. аграр. науки. - 2004. - № 12. - С. 36-39. (Дисертантом проведено очищення антигенів вірусу лейкозу з використанням методу хроматографії та проведено узагальнення експериментальних даних).

6. Явніков Н. В., Прохорятова О. В., Мягкіх Н. В. Епізоотологія лейкозу великої рогатої худоби в господарствах Харківської області // Вісн. Сумськ. держ. аграр. ун-ту. - 2005. - № 1-2 (13-14). - С. 148-150. (Дисертантом проведено збір епізоотологічних даних щодо лейкозу великої рогатої худоби в господарствах Харківської області, здійснена статистична обробка і узагальнення одержаних результатів).

7. Порівняльна діагностика лейкозу великої рогатої худоби методами ІФА та РІД / Б. Т. Стегній, Н. В. Явніков, В. І. Цимбал, Н. Я. Співак // Вет. медицина: Міжвід. тематич. наук. зб. - Х., 2006. - Вип. 86. - С. 340-343. (Дисертантом проведені серологічні дослідження та проведено узагальнення експериментальних даних).

8. Деклараційний патент 5806 Україна, МПК G01N33/53. Спосіб імуноферментного визначення антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби / Б. Т. Стегній, Н. В. Явніков, С. А. Михайлова, В. С. Антонов (Україна). - № 20040807158; Заявл. 30.08.04; Опубл. 15.03.05; Бюл. № 3. - 2 с.

АНОТАЦІЇ

Явніков Н. В. Удосконалення діагностики лейкозу великої рогатої худоби. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія. ННЦ “Інститут експериментальної та клінічної ветеринарної медицини”, Харків, 2007.

Дисертація присвячена вивченню епізоотичної ситуації та розробці імуноферментної тест-системи для діагностики лейкозу великої рогатої худоби. Встановлено значне та нерівномірне поширення лейкозу великої рогатої худоби у світі, більшість країн з розвинутим тваринництвом промислового типу є неблагополучними щодо цієї хвороби. Серед 15 країн, які шляхом проведення оздоровчих заходів досягли епізоотичного благополуччя, 13 належать до Європейського Союзу, більша частка офіційно зареєстрованих випадків захворювання на лейкоз припадає на країни Східної Європи. Показано, що в Україні епізоотична ситуація загострилася з 1995 р. та має тенденцію до покращення з 1998-1999 рр., а безпосередньо в Харківський області стійке зниження рівня превалентності спостерігається з 2003 р. У роботі показано більш високу чутливість імуноферментної діагностики лейкозу у порівнянні з традиційною реакцією імунодифузії, обґрунтовано необхідність розробки вітчизняної імуноферментної тест-системи. Створено діагностичний набір, який відповідав вимогам чутливості та специфічності, з використанням як антигену рекомбінантних білків р24 та gp51 вірусу лейкозу великої рогатої худоби. Під час проведення комісійних випробовувань розробленої тест-системи специфічність набору дорівнювала 96,0 %, чутливість -- 100 %. При проведенні серійних діагностичних досліджень проб сироваток крові великої рогатої худоби за допомогою розробленого набору виявлено на 7,5-22,1 % більше серопозитивних тварин, ніж при застосуванні реакції імунодифузії.

Ключові слова: лейкоз великої рогатої худоби, вірус лейкозу великої рогатої худоби, імуноферментний аналіз, епізоотична ситуація щодо лейкозу великої рогатої худоби.

Явников Н. В. Усовершенствование диагностики лейкоза крупного рогатого скота. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 - ветеринарная микробиология и вирусология. ННЦ “Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины”, Харьков, 2007.

Диссертация посвящена изучению эпизоотической ситуации и разработке иммуноферментной тест-системы для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и при этом заболевании. Установлено значительное и неравномерное распространение лейкоза крупного рогатого скота в мире, большинство стран с развитым животноводством промышленного типа неблагополучны по этому заболеванию, среди 15 государств, в которых оздоровительные мероприятия завершились достижением эпизоотического благополучия, 13 являются членами Европейского Союза, большинство официально зарегистрированных случаев заболевания лейкозом приходится на страны Восточной Европы. Показано, что в Украине эпизоотическая ситуация ухудшилась с 1995 г. и имеет тенденцию к улучшению с 1998-1999 гг. Непосредственно в Харьковской области стойкое снижение уровня превалентности наблюдали с 2003 г. В работе показана более высокая чувствительность иммуноферментной диагностики лейкоза в сравнении с традиционной реакцией иммунодифузии, обоснована необходимость разработки отечественной иммуноферментной тест-системы. Разработан диагностический набор, отвечающий требованиям чувствительности и специфичности, с использованием в качестве антигена рекомбинантных белков р24 и gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота. Во время комиссионных испытаний разработанной тест-системы специфичность набора составила 96,0 %, чувствительность -- 100 %. При проведении серийных диагностических исследований проб сывороток крови крупного рогатого скота с использованием разработанного набора выявлено на
7,5-22,1 % больше серопозитивних животных, чем при применении реакции иммунодиффузии.

Ключевые слова: лейкоз крупного рогатого скота, вирус лейкоза крупного рогатого скота, иммуноферментный анализ, эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота.

Yavnikov N.V. Improvement of cattle leukosis diagnostics.- Manuscript.

Thesis for the defense of Ph.D. thesis, speciality 16.00.03 - veterinary microbiology and virology, National Scientific Center “Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine”, Kharkiv, 2007

Dissertation is devoted to the development of immune-enzyme test-system for cattle leucosis diagnostics and investigation of epizootiс situation at this disease. There was determined considerable and uneven spread of cattle leucosis in the world, most countries with the developed stock-raising of industrial type are trouble as to this disease. Among 15 of sanified states 13 are the members of European Union, most officially registered cases of leucosis were in the countries of East Europe. It was shown, that in Ukraine and Kharkiv region epizootic situation became worse in the second half the 90^th, and has a tendency to the improvement from the beginning of 2000. Higher sensitivity of immune-enzyme diagnostics of leucosis in comparison with traditional reaction of immunodiffusion has been shown in the work. Necessity of the development of domestically produced ELISA test system has been founded. Diagnostic kit, which meets requirements of sensitivity and specificity, was produced with the use recombinant albumen p24 and gp51 BLV as anigene.

During the tests of the developed test-system there was determined specificity of the kit at the level 96.0%, sensitivity - 100%.

At conducting of serial diagnostic tests of caw blood serum, using the developed kit, there was detected 7.5-22.1% more seropositive animals as at use of the reaction of immunodiffusion.

Key words: cattle leucosis, cattle leucosis virus, immune-enzyme analysis, epizootic situation as to cattle leucosis.

Размещено на Allbest.ru

...