Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ

УДК 575. 113. 636. 03

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

ПОЛІМОРФІЗМ ГЕНІВ, АСОЦІЙОВАНИХ З ГОСПОДАРСЬКО-ЦІННИМИ ОЗНАКАМИ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ

Копилова Катерина Вячеславівна

03.00.15 - Генетика

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті агроекології Української академії аграрних наук, м. Київ

Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук, професор

Глазко Тетяна Теодорівна,

Інститут агроекології УААН, завідувач відділу

молекулярно-генетичних досліджень

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Дуган Олексій Мартем'янович,

Національний технічний університет України,

“Київський політехнічний інститут”

Міністерства освіти і науки України, декан факультету

біотехнології і біотехніки

кандидат сільськогосподарських наук

Метлицька Олена Іванівна, Інститут свинарства

ім. О.В. Квасницького УААН,

старший науковий співробітник лабораторії генетики

Провідна установа: Інститут розведення і генетики тварин УААН, відділ генетики і біотехнології, с.Чубинське, Київська обл.

Захист відбудеться “ 11 ” травня 2006 р. о 11 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.371.01 Інституту агроекології УААН за адресою: 03142, м. Київ, вул. Метрологічна, 12

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології УААН, за адресою: 03142, м. Київ, вул. Метрологічна, 12.

Автореферат розісланий “ 10 ” квітня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат хімічних наук Л.І. Моклячук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним з важливих питань сучасної популяційної генетики є з'ясування наявності специфічних особливостей генетичної структури популяцій порід сільськогосподарських видів тварин та сортів культурних рослин.

Дослідження, проведені донедавна, в тваринництві були спрямовані на пошук головних генів кількісних ознак у спеціалізованих порід великої рогатої худоби. Однак, отриманні результати характеризуються неоднозначністю і потребують подальших досліджень. Картування таких генів є трудомістким і технічно складним процесом (Georges М., 1995; Steinmetz L., 2002). Альтернативним шляхом молекулярно-генетичного маркірування ознак продуктивності є вивчення поліморфізму генів, алельні варіанти яких впливають на прояв бажаного фенотипу. Наприклад, поліморфізм гену капа-казеїну пов'язаний з мінливістю господарсько-корисних ознак у великої рогатої худоби: його алельний варіант В асоційований з високим вмістом білку у молоці (Kuryl J., 2000; Глазко В.І., 2001; Сулимова Г.Е., 2002; Дымань Т.М., 2002). Молоко таких тварин бажано використовувати для виробництва високоякісних твердих сирів, що є економічно важливим селекційним критерієм для порід молочного напрямку продуктивності, від чого залежить рентабельність сироварних виробництв (Krzyzewski J., 1998; Gomezraya L., 1998; Sabour M., 1993; Winner P, 2000; Иолчев Б.С., 2002).

Дотепер, недостатньо дослідженими у відношенні наявності та поліморфізму генів, які відносяться до локусів кількісних ознак, є генофонди аборигенних порід, що може в перспективі використовуватися для вирішення завдань вітчизняної селекції. Крім того, залишається недослідженою генетична різноманітність таких генів в тій частині генофонду спеціалізованих порід, які розводять в Україні. В зв'язку з цим, нами був проведений аналіз поліморфізму генів, асоційованих з господарсько-корисними ознаками (CSN3, BLG, GH, LEP, PIT-1, MSTN) у порід великої рогатої худоби, які відрізняються за історією походження, напрямом продуктивності й умовами розведення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконувалися відповідно до науково-технічної програми робіт Інституту агроекології УААН "Теоретично обґрунтувати і розробити практичні заходи щодо екологобезпечного використання природно-ресурсного потенціалу агроландшафтів з метою забезпечення сталого розвитку аграрного виробництва і покращення якості умов життя людини" (№ ДР 0101U003298) підпрограми 3 “Теоретично обґрунтувати і застосувати на практиці методи сільськогосподарської біотехнології для цілеспрямованого формування сталих агроекосистем” (№ ДР 0101U003296).

Мета і завдання досліджень. Метою досліджень є аналіз й оцінка поліморфізму генів, асоційованих з господарсько-цінними ознаками, а також можливі фактори, що впливають на їх формування у різних порід великої рогатої худоби. Для реалізації поставленої мети в роботі вирішували наступні завдання:

- провести оцінку нуклеотидної еволюції господарсько-цінних генів у представників підродини Bovinae на прикладі гену капа-казеїну;

- вивчити внутрішньо-порідні особливості поліморфізму структурних генів і можливі фактори, що впливають на формування господарсько-цінних ознак;

- оцінити вплив еколого-географічних умов розведення великої рогатої худоби на поліморфізм генів кількісних ознак;

- порівняти особливості розподілу алельних варіантів генів капа-казеїну, бета-лактоглобуліну, гормону росту, лептину, гипофізарно-специфічного фактору транскрипції, міостатину у різних порід великої рогатої худоби;

Об'єкт досліджень: гени CSN3, BLG, GH, LEP, PIT-1, MSTN у великої рогатої худоби.

Предмет досліджень: специфічні особливості поліморфізму генів, асоційованих з господарсько-цінними ознаками в породах великої рогатої худоби.

Методи досліджень. В роботі використовували наступні методи: ампліфікація фрагментів ДНК в ПЛР з наступним рестриктним аналізом (метод ПЛP-ПДРФ); методи статистичної обробки експериментальних даних із застосуванням сучасних комп'ютерних програм.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведена комплексна оцінка за шістьма генами, асоційованими з господарсько-цінними ознаками, у семи порід великої рогатої худоби. Встановлено, що у видів підродини Bovinae в 4-му екзоні гену капа-казеїну частота несинонімічних замін вище, ніж синонімічних (0.045 проти 0.036). Відзначена висока швидкість еволюції нуклеотидної послідовності на цій ділянці. Виявлено, що амінокислотна послідовність капа-казеїну у двох видів Bos taurus та Bos indicus ідентична за винятком однієї заміни в позиції 148, що відповідає алельному варіанту В капа-казеїну у великої рогатої худоби. Одержані нові дані про генетичну структуру тварин сірої української, бурої карпатської, червоної польської, галовейської, білоголової української, якутської, голштинської порід великої рогатої худоби за розподілом алельних варіантів генів CSN3, BLG, GH, LEP, PIT-1, MSTN, що дає додаткове уявлення про особливості їх генофонду, специфіка якого визначається селекційною роботою в популяціях тварин відповідного напрямку продуктивності.

Практичне значення одержаних результатів. Аналіз генофонду досліджених порід великої рогатої худоби за розподілом алельних варіантів генів CSN3, BLG, GH, LEP, PIT-1, MSTN вказує на те, що аборигенні породи відзначаються оригінальною генетичною структурою, яка відповідає специфіці цих порід за господарсько-корисними ознаками. Використання результатів генетичного аналізу порід великої рогатої худоби дає можливість підвищити ефективність селекційного процесу шляхом добору і підбору, який спрямований на відтворення бажаних генотипів тварин, що дозволяє інтенсифікувати селекційний процес і підвищити темпи консолідації порід.

Особистий внесок здобувача. Полягає в аналізі літературних джерел, разом з керівником визначені основні напрямки та методи досліджень. Безпосередньо дисертантом проведенні експериментальні дослідження згідно обраних методик, оцінка та статистична обробка, інтерпретація і узагальнення всього обсягу одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представленні на “Научной генетической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Р. Жебрака и 70-летию образования кафедры генетики в Московской сельскохозяйственной академии имени К.А. Тимирязева” (Москва, 2002); Всеукраїнській конференції молодих вчених “Засади сталого розвитку аграрної галузі” (Київ, 2002); конференції молодих вчених і спеціалістів України “Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні” (Київ, 2002); 2-ой конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова, посвященной 115-летию со дня рождения акад. Н.И. Вавилова (Москва, 2003); ”Conference for young scientists, Phd students and students on molecular biology and genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine” (Київ, 2003), на засіданнях відділу молекулярно-генетичних досліджень та щорічних аспірантських звітах Інституту агроекології УААН.

Публікації. Результати досліджень за темою дисертаційної роботи викладені у 12-ти наукових працях, у тому числі 5-х статтях у фахових виданнях, 7-и наукових збірниках, матеріалах і тезах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 121 сторінці комп'ютерного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів дослідження та їх обговорень, висновків та пропозицій виробництву. Список літератури складається з 200 джерел, у тому числі 140 закордонних авторів. Дисертація містить 21 таблицю і 8 рисунків.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Молекулярно-генетичні дослідження виконувалися на зразках крові тварин 7 порід великої рогатої худоби, які були відібрані під час комплексних експедицій Інституту агроекології УААН у різні регіони України, а також з архіву експериментального банку довгострокового збереження відділу молекулярно-генетичних досліджень інституту. Загальний обсяг досліджень представлено у таблиці 1.

Таблиця 1

Загальний обсяг досліджень

Породи і господарства	Проаналізовано голів (n)	Кількість проведених аналізів ДНК
1. Сіра українська (“Асканія - Нова” , Херсонська обл.; “Черга”, Алтайський край )	57	627
2. Бура карпатська (“Нижні ворота”, Закарпатська обл.)	33	363
3. Білоголова українська (“Антоніни” Хмельницька обл.)	35	385
4. Якутська (“Черга”, Алтайський край )	34	334
5. Галовейська (“Черга”, Алтайський край )	40	440
6 Червона польська (ім. Шевченка, ТОВ Тарасівка, ім. Котовського Тернопільської обл.; дослідне господарство інституту генетики та розведення тварин, Польща )	207	660
7. Голштинська порода (ТОВ “Агрофірма Київська”, Київська обл.)	119	1320
Разом	525	4129

Оцінку поліморфізму досліджуваних генів проводили методом ПЛР-ПДРФ (Grodziker T., 1974; Alexander G., 1988; Сулимова Г.Е., 1992, 2002.). Геномну ДНК виділяли з периферійної крові тварин за методикою (Маниатис Т. и др., 1984; Зинов'єва Н.А., 2002). Для проведення полімеразної ланцюгової реакції в роботі використовували реакційну суміш об'ємом 10 мкл: H2O - 4.3 мкл, Буфер- PCR 5-х (15 м Мg-1.0 мол) - 2.0 мкл; DNTP суміш 10-х (2мМ кожного) - 0.8 мкл; два праймера ( 70 нг кожного) - 0.8 мкл; Taq-полімеразу (1мол/1000 U) - 0.1 мкл; ДНК 50-100 нг - 2.0 мкл.

Для ампліфікації фрагментів досліджуваних генів використовували наступні праймери: для гену CSN3 (5' GAAAТСCCТАССАТCAАТACC- 3' та 5' ССАTСTАС СTАGTTТAGATG- 3') (Eggen E., 1989, Pinder S., 1991); BLG (5' GTG CTGGACACCGACTACAAAAAG-3' та 5` GCTCCCGGTATATGACCACCCTCT-3' (Medrano J., 1990); GH (5' GСTGСTССTGАGGGСССTТС-3' та 5' GСGGСGGСАСТTСАTGАССС-3') (Napolitano F., 2001); LEP (5' GТСАССАGGА CААТGАСАТ-3'; та 5' АGСССАGGААТGААGТССАА- 3') (Pomp D., 1997); PIT-1 (5' CAAТ GAGААAGТTGGТGC-3' та 5' TСTGСАTTCGAGATGCTC-3' ) (Moody D., 1996); MSTN (5' TCTAGGAGAGATTTTGGGCTT- 3' і 5' TGGGTATGAGGATACTTTTGC- 3') (Grobet L., 1997). Для аналізу поліморфізму структурних генів CSN3, BLG, GH, PIT-1, LEP використовували рестриктази, підібрані до кожного гену, крім MSTN, який можна типувати відразу після проведення ПЛР- аналізу (Grobet L., 1997) (табл.2).

Таблиця 2

Рестриктази, які використовували у роботі

Ген	Довжина ампліфікованого фрагменту, п.н.	Рестриктази, використані для кожного гена
CSN3	273	Hind III
BLG	247	Hae III
GH.	223	AluI.
LEP	1820	SauЗАI
PIT-1	1355	HinfI
MSTN	196	-

Продукти рестрикції розділяли методом електрофорезу у 2-% агарозному гелі. Візуалізацію проводили на трансілюмінаторі в УФ світлі при довжині хвилі 380 нм після забарвлення гелю етидієм бромидом. Розміри ДНК - продуктів визначали за допомогою маркеру молекулярних мас: Ladder Lov Range, DNA Ladder 0.1 kb.

Статистична обробка експериментальних даних. Статистичну вірогідність розраховували методами математичної статистики і біометрії (ч2, критерій Фішера) (Плохинский Н.А., 1969; Животовский Л.А., 1991), а також за допомогою комп'ютерних програм “BIOSIS-1”, “Statistica” (Swofford D., 1982); відмінності за частотами синонімічних та несинонімічних замін розраховували за допомогою методу (Nei - Gojobori, 1986; Jukes - Cantor, 1969).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Нуклеотидна еволюція господарсько-цінних генів на прикладі капа-казеїну. З метою вивчення наявності ефектів позитивної селекції за 4-м екзоном гену капа-казеїну, ми порівняли частоти синонімічних та несинонімічних замін на цій ділянці у різних видів родини Bovidae.

Порівняльний аналіз синонімічних та несинонімічних замін на цій ділянці у різних видів показав, що різниця варіює як усередині однієї підродини, так і між підродинами. При дослідженні амінокислотного складу білку виявляється, що лише у видів Bovinae кількість несинонімічних замін вище ніж синонімічних: 0.045 проти 0.036, відповідно. В усіх інших досліджених випадках кількість синонімічних замін виявилася вища ніж несинонімічних (табл.3). Розходження у швидкості дивергенції цієї ділянки виявилися сумарно статистично вірогідним лише між видами підродин Bovinae і Caprinae, що вказує на високу швидкість амінокислотних замін в білку після еволюційного розходження цих підродин. Виявлено, що амінокислотна послідовність капа-казеїну (екзон 4) у двох видів Bos taurus та Bos indicus є ідентичною за винятком однієї заміни в позиції 148 у Bos taurus, що відповідає алельному варіанту В капа-казеїну великої рогатої худоби.

Таблиця 3

Співвідношення синонімічних та несинонімічних замін у різних родин за геном капа-казеїну (Nei-Gojobori)

Родини	Екзон IV	Білок пара-казеїн (PKC)	C домен
	dN	DS	DN	DS	DN	dS
Bovinae	0.045	0.036	0.020	0.022	0.109	0.103
Caprinae	0.018	0.022	0.010	0.024	0.025	0.048
Odocoileinae	0.018	0.030	0.018	0.027	0.031	0.024
Cervinae	0.014	0.017	0.016	0.040	0.017	0.000

Усереднене відношення синонімічних та несинонімічних замін виявилося приблизно однаковим за параказеїновим білком для всіх таксонів. Еволюційні зміни виявлялися лише в С кінцевому домені, та саме в ньому спостерігається найбільш висока швидкість нуклеотидної еволюції між видами підродини Bovinae. Таким чином, тільки частина капа-казеїну (С домен) і лише у видів підродини Bovinae характеризується наявністю позитивної селекції (високою швидкістю накопичення несинонімічних замін), що може бути пов'язано з впливом штучного добору на більшість досліджених представників підродини Вovinae.

Аналіз генетичної структури за генами, асоційованими з господарсько - корисними ознаками у червоної польської породи. Однією з умов збереження аборигенних порід є виявлення породо-специфічних рис їх генофондів, а також оцінка внутрішньо-породної генетичної різноманітності. Щоб оцінити своєрідність генофонду червоної польської худоби, в роботі виконаний порівняльний аналіз розподілу алельних варіантів генів CSN3, BLG, PIT-I, GH, LEP і MSTN, асоційованих з господарсько-корисними ознаками у тварин з різних господарств (табл. 4).

Таблиця 4

Частота алельних варіантів генів CSN3, BLG, LEP, MSTN, PIT-I, GH в популяціях великої рогатої худоби червоної польської породи

Господарства	Гени
	CSN3	BLG	LEP	MSTN	GH	PIT-1
ім. Шевченка (n -30)	a-0.803 b-0.197	a-0.148 b-0.852*	a-0.777 b-0.111 с-0.111	а-1.000 b-0.000	l-0.833 v-0.167	a-0.296* b-0.704
Тарасівка (n - 30)	a-0.673** b-0.327	a-0.185 b-0.815	a-0.785 b-0.102 с-0.103*	а-1.000 b-0.000	l-0.750 v-0.250	a-0.250 b-0.750
ім. Котовського (n - 60)	a-0.615*** b-0.385	a-0.279*** b-0.721	a-0.833 b-0.042 с-0.125	а-1.000 b-0.000	l-0.679*** v-0.321	a-0.260 b-0.740
ІГРТ (Польща) (n - 87)	a-0.626** b-0.374	a-0.460*** b-0.540*	a-0.747 b-0.098 с-0.155*	a-0.956 b-0.046	l-0.638*** v-0.362	a-0.207* b-0.793

Примітка: * - (р<0,05); ** - (р<0,01); *** - (р<0,001)

Алельні варіанти досліджених генів варіювали у тварин із різних господарств залежно від селекційного тиску. Так, за геном LEP, рідкісний алельний варіант С був присутній у всіх чотирьох групах тварин. У українському господарстві Тарасівка його частота статистично вірогідно була нижче (р<0.05), ніж у польської групи тварин. За геном CSN3 частота А алельного варіанта у тварин з господарства ім. Шевченка була статистично вірогідно вища порівняно з тваринами інших господарств (р<0.01, р<0.001 ). За алелем А гена BLG вірогідну різницю виявили між тваринами з господарств ім. Шевченка та ім. Котовського, а також між групами тварин з господарства ім. Шевченка та ІГРТ (р<0.001). Частота В алельного варіанту у тварин з господарства ім. Шевченка була вірогідно вище (р<0.01) ніж у тварин з господарства ІГРТ. Цей алель пов'язують з високим вмістом казеїнових білків та підвищеним вмістом в молоці жиру (Medrano J. 1995). За геном GH вірогідно вища частота алельного варіанта L спостерігалась у тварин з господарства ім. Шевченка (р<0.001) при порівнянні з тваринами господарств ім. Котовського і ІГРТ. За геном PIT-I частота алельного варіанту А, асоційованого з надоєм молока (Di Stasio L., 2002; Renaville R., 1997), виявилася вірогідно вища у тварин з господарства ім. Шевченка (р<0.05) при порівнянні з тваринами, що відтворюються в Польщі. Отримані дані вказують на те, що більш високою присутністю цінних із селекційної точки зору алельних варіантів із досліджених генів, характеризується група тварин одного з господарств України (ім. Шевченка, Тернопільської області). Така внутрішньо-порідна диференціація між групами тварин червоної польської породи з різних господарств обумовлена тим, що в одному з них (господарство ім. Шевченка) селекція на підвищену молочну продуктивність більш інтенсивна. Це підтверджується і тим фактом, що в господарстві ім. Шевченка середній надій молока складав біля 4 тис.кг, а в господарстві Тарасівка - 2.5 тис.кг

Аналіз поліморфізму генів в популяціях тварин, що розводяться в різних еколого-географічних умовах. Щоб з'ясувати, чи залежить розподіл алельних варіантів за досліджуваними генами CSN3, BLG, PIT-I, GH, LEP та MSTN від еколого-географічних умов розведення тварин, проведений порівняльний аналіз генетичної структури двох груп червоної польської породи (ІГРТ, Польща (1-група) та господарство “Тарасівка”, Тернопільська обл. (2-група)) і двох груп сірої української породи, які розводять в різних еколого-географічних умовах (“Асканія-Нова”, Херсонська обл. та “Черга”, Росія). В результаті аналізу двох груп великої рогатої худоби червоної польської породи отримані наступні дані (табл.5.).

Частота алельного варіанту А за геном CSN3 в 1 - й групі тварин складала (0.626), В (0.374), а в 2 -й групі А (0.673) та В (0.327), відповідно. За геном гормону росту, бажаний в селекційним відношенні алель GH - L спостерігався в 1 - й групі з частотою 0.638, а в 2 - й - 0.750. Для гену PIT-1 виявилася незначна перевага варіанту В, асоційованого з підвищеним вмістом жиру в молоці (Renaville R., 2000), - 0.793 в першій групі проти 0.750 другій групі.

Таблиця 5

Розподіл алельних частот генів у групах тварин червоної польської породи, що розводяться в різних еколого-географічних умовах

Гени	1- група	2 - група
СSN3	A-0.626 / B-0.374	A-0.673 / B-0.327
BLG	A-0.460 / B-0.540**	A-0.185 / B-0.815**
GH	L-0.638 / V-0.362	L-0.750 / V-0.250
Pit-I	A-0.207 / B-0.793	A-0.250 / B-0.750
LEP	A-0.747 / B-0.098 / C-0.155	A-0.785 / B-0.102 / C-0.103
MSTN	N - 0.956 / del11-0.046	N-1.000

Примітка : **- різниця вірогідна р< 0.01

За геном лептину з найбільшою частотою зустрічався алельний варіант A, що асоційований з підвищеним виходом молока. Його частота у тварин, які відтворюються в господарстві Тарасівка, складала 0.785, що незначно перевищувало цей показник в групі тварин з ІГРТ - 0.747. Рідкісний алельний варіант C за геном лептину був виявлений як у тварин з ІГРТ (частота його складала 0.155), так і в групі тварин господарства Тарасівка з частотою 0.103. В цілому дві розглянуті групи мають схожий рисунок розподілу алельних варіантів досліджених генів. Незначні відмінності спостерігаються лише за генами GH та MSTN. Частота алельного варіанта В за геном BLG була вище у 2 - й групі, ніж у тварин, що розводяться в Польщі і дорівнювала 0.815 та 0.540, відповідно (р<0.01). Це можна пояснити різними підходами при веденні селекційного процесу, а саме відбором тварин за ознаками молочної продуктивності.

Результати розподілу алельних варіантів генів, які асоційовані з господарсько-корисними ознаками, у двох груп сірої української породи (табл. 6).

ген поліморфізм рогатий худоба

Таблиця 6

Розподіл алельних частот генів у тварин сірої української породи

Гени	Господарства
	“Асканія-Нова”	“Черга”
CSN3	А-0.692 / В-0.307	А-0.600 / В-0.400
BLG	А-0.327 / В-0.676	А-0.355 / В-0.645
GH	L-0.733 / V-0.267	L-0.700 / V-0.300
PIT-I	А-0.714 / В-0.286	А-0.750 / В-0.250
LEP	А-0.888/ В-0.111	А-0.720 / В-0.280
MSTN	N-1 / nt812 (del11)-0	N-1 / nt812 (del11)-0

Представлені в таблиці 6 результати вказують на те, що частоти алельних варіантів досліджених генів в двох групах тварин сірої української породи з різних еколого-географічних регіонів практично не відрізняються. На підставі отриманих результатів ми робимо висновок про те, що вірогідна різниця між частотами BLG-A алелів у тварин двох груп червоної польської породи пояснюється лише селективним тиском. В цілому, розподіл алельних варіантів генів, асоційованих з господарські корисними ознаками, не залежить від впливу еколого-географічних факторів.

Порівняльний аналіз розподілу алельних варіантів структурних генів у різних порід великої рогатої худоби. З метою вивчення особливостей поліморфізму генів, асоційованих з господарсько корисними ознаками, нами був виконаний порівняльний аналіз розподілу алельних варіантів у однієї спеціалізованої і шести аборигенних порід великої рогатої худоби (табл.7).

Таблиця 7

Розподіл алельних частот структурних генів у різних порід великої рогатої худоби

Породи	Гени, алельні частоти
	CSN3	BLG	LEP	MSTN	GH	PIT-1
Сіра українська	n - 46 a-0.663 b-0.370	n - 46 a-0.336 b-0.664	n - 44 a-0.806 b-0.194 c-0.000***	n - 57 a-1,000 b-0.000*	n - 51 l-0.706 v-0.294	n - 48 a-0.730*** b-0.270
Бура карпатська	n - 30 a-0.500*** b-0.500	n - 31 a-0.500 b-0.500	n - 28 а-0.750 b-0.250 c-0.000***	n - 33 a-1.000 b-0.000*	n - 28 l-0.740 v-0.260	n - 29 a-0.450 b-0.540
Білоголова українська	n - 30 a-0.766 b-0.234	n - 30 a-0.450 b-0.550	n - 30 a-0.700 b-0.300 c-0.000***	n - 35 a-1.000 b-0.000*	n - 24 l-0.520 v-0.470	n - 28 a-0.590 b-0.410
Якутська	n - 29 a- 0.638 b- 0.362	n - 27 a-0.240 b-0.760	n - 24 a-0.625 b-0.279 с-0.096	n - 30 a-1.000 b-0.000*	n - 25 l- 0.720 v- 0.280	n - 30 a-0.670 b-0.330
Галовейська	n - 30 a- 0.710 b- 0.290	n - 30 a-0.090*** b-0.910	n - 22 a-0.730 b-0.090 с-0.180***	n - 37 a-0.963 b-0.037*	n - 32 l- 0.530 v- 0.470
Червона польська	n - 180 a-.0.620 b-0.380	n - 193 a-0.326*** b-0.674***	n - 136 a-0.776 b-0.080 с-0.144***	n - 207 a-0.980 b-0.020	n - 190 l-0.658 v-0.342	n - 118 a-0.240*** b-0.760
Голштинська	n - 112 a-0.843*** b-0.157	n - 113 a-0.601 b-0.399***	n - 110 a-0.873 b-0.127 c-0.000***	n - 120 a-1.000 b-0.000*	n - 110 l-0.754 v-0.246	n - 97 a-0.500 b-0.500

Примітка: * - (р<0.05); ** - (р<0.01); *** - (р<0.001)

За геном CSN3 (рис.1) частота алельного варіанту А, асоційованого з підвищеним загальним надоєм, була найвищою у представників голштинської породи і складала 0.843. Частота цього алелю серед представників аборигенних порід була найвищою у білоголової української породи (0.766), що може бути пов'язано із селекцією даної породи на молочну продуктивність. Найнижча частота CSN3-А алелю характерна для представників бурої карпатської породи і з високою вірогідністю відрізнялася від тварин голштинської породи (p<0.001). Тварини галовейської, сірої української, якутської і червоної польської порід займали проміжне положення за цим показником (0.710, 0.663, 0.638, 0.620, відповідно). Частота алельного варіанта В за геном CSN3 виявилася найбільш високою у тварин бурої карпатської породи - 0.500, у білоголової української та галовейської порід вона складала 0.234 і 0.290 відповідно, а найменша частота спостерігалася у тварин голштинської породи - 0.157. Статистично вірогідні відмінності були виявлені за цим геном між частотою В- алельного варіанта у бурої карпатської та голштинської порід, (р<0.001).

За геном BLG для всіх аборигенних порід спостерігалась переважна кількість тварин з генотипом ВВ (високо вірогідне відхилення розподілу генотипів від теоретично очікуваного за критерієм ч2- квадрат, p<0.001), а для представників голштинської породи - АВ (p<0.001).

Частота алельного варіанту В за геном BLG виявилася найбільш високою у тварин галовейської породи - 0.910, а найбільш низькою у представників голштинської породи - 0.399 (різниця вірогідна, p<0.001). У тварин сірої української породи цей варіант був виявлений з частотою 0.664, у якутської породи частота алельного варіанта B складала 0.760, червоної польської - 0.674, білоголової української - 0.550. Частота алелю А, асоційованого з високим надоєм молока (Mariani P., 1979), виявилася найбільш високою у тварин голштинської породи - 0.601, а найбільш низькою у галовейської породи - 0.090 (p<0.001). Для тварин бурої карпатської породи різниця між наявністю варіантів А і В не спостерігалася, а їх частота складала 0.500. Статистично вірогідні відмінності виявлені за цим геном між А- алельним варіантом у галовейської та червоної польської порід (р<0.001), а також у червоної польської і голштинської порід між частотою В-алельного варіанту (р<0.001). Це може бути зв'язано з селекційною роботою, яка проводилася з галовейською породою і була спрямована на підвищення м'ясної продуктивності.

Частота алельного варіанту А за геном LEP (рис.2) найбільш висока серед аборигенних порід у тварин сірої української породи -0.806 та червоної польської порід - 0.776, а у бурої карпатської та білоголової української порід частота цього алелю була майже однакова: 0.750 та 0.700, у якутської - 0.625. Крім цього, у представників якутської, червоної польської та галовейської порід спостерігався рідкісний варіант генотипу АС, асоційований з високою жирністю молока (Haegeman A.,2000). Частота алельного варіанту С була наступною: у тварин галовейської породи - 0.180, червоної польської - 0.144, а якутської - 0.096 (відмінність від частот розподілу у інших порід достовірна). Статистично вірогідні відмінності були виявлені за цим геном між частотою С- алельного варіанта у галовейської та червоної польської порід (р<0.001).

У тварин білоголової української та галовейської порід в порівнянні з іншими породами, за геном GH (рис.3) спостерігалась перевага тварин з генотипом LV. Для тварин червоної польської і голштинської порід виявилася характерною присутність генотипу LL (p<0.001, критерій ч2), що пов'язано з такими показниками молочної продуктивності, як жирність молока і загальний надій (Lucy M., 1993). За геном GH, частота аллельного варіанта L складала у тварин якутської породи 0.720, бурої карпатської породи - 0.740, у сірої української - 0.706, білоголової української - 0.520, червоної польської - 0,658, а у тварин голштинської породи - 0.754.

При дослідженні гену PIT-1 для таких аборигенних порід як білоголова українська і якутська виявилася характерною перевага тварин з генотипом АА (відхилення від теоретично очікуваного розподілу генотипів вірогідно, p<0.001; p<0.01 відповідно). Найбільша частота алельного варіанта A спостерігалась у представників сірої української породи і дорівнювала 0.730, що високо вірогідно відрізняється від цього показника у тварин червоної польської породи - 0.240 (p<0.001). У тварин інших порід частоти були розподілені таким чином: у якутської - 0.670, білоголової української - 0.590, бурої карпатської - 0.450 (рис.4).

За геном MSTN (рис.5) було виявлено два генотипи у тварин червоної польської та галовейської порід - АА (продукт ПЛР складав 196 п.н.) та АВ (196 та 185 п.н.) - nt821 (del11), що обумовлює м'язову гіпертрофію.

Проведений аналіз поліморфних генів, асоційованих з ознаками молочної і м'ясної продуктивності, довів, що найбільш сприятливим сполученням цінних алельних варіантів з селекційної точки зору характеризуються тварини бурої карпатської породи. Це твердження є справедливим як щодо гену BLG, так і для CSN3, GH та PIT-1, алельні варіанти яких впливають на прояв ознак молочної продуктивності. Наявність у бурої карпатської породи алельного варіанта В гену CSN3, асоційованого з високим вмістом білка в молоці (молоко від таких тварин використовується у виробництві твердих сирів високої якості (Klauzinska M., 2000; Сулимова Г.Е., 2002), співпадає з відносно високою частотою алельного варіанта А за геном Blg, асоційованого з високим надоєм молока (Medrano J., 1995). Таким чином, бура карпатська порода за розподілом алельних варіантів генів білків молока має унікальний генофонд і потужний генетичний потенціал щодо молочної продуктивності, а тварини якутської і галовейської порід відрізняються генофондом характерним для порід м'ясного напрямку продуктивності за розподілом алелій. У них спостерігається підвищена частота алельних варіантів генів, що асоційовані з високим приростом живої маси після народження.

Результати аналізу взаємозв'язків між розподілом алельних варіантів генів та даними щодо загального надою і вмісту жиру в молоці в стадах тварин підтверджують відповідність нами отриманих результатів за розподілом частот алельних варіантів генів, яки асоційовані з показниками продуктивності.

Таким чином, отримані дані вказують на те, що розподіл алельних варіантів досліджених генів, можна розглядати як додаткові характеристики породи, а їх розподіл визначається особливостями селекційної роботи, що проводиться з кожною породою окремо, відповідно до її належності визначеного напрямку продуктивності.

ВИСНОВКИ

1. Розподіл алельних варіантів генів CSN3, BLG, GH, LEP, PIT-1, MSTN, асоційованих з господарсько-корисними ознаками, може розглядатися як породна характеристика, яка дає додаткове уявлення щодо особливостей генетичної структури, яка притаманна кожній породі відповідно її напрямку продуктивності.

2. Встановлено, що тільки у видів підродини Bovinae частота несинонімічних замін вище, ніж синонімічних (0.045 проти 0.036), що підтверджує високу швидкість нуклеотидної еволюції у 4-му екзоні гену капа-казеїну (С-кінцевий домен). Амінокислотна послідовність капа-казеїну в цій ділянці у двох видів Bos taurus та Bos indicus ідентична за винятком однієї заміни в позиції 148 у Bos taurus, що відповідає алельному варіанту В капа-казеїну великої рогатої худоби.

3. Для червоної польської породи характерна присутність алельних варіантів генів, пов'язаних з показниками продуктивності (CSN3-В (0.380), BLG -В(0.674), GH -V (0.342).

4. Для тварин галовейської породи характерна наявність алельних варіантів генів, які пов'язані з показниками м'ясної продуктивності (V-0.470) за геном GH, (А-0.730) за геном LEP, та виявлена мутація nt812(del11) за геном MSTN (В-0.037).

5. Встановлено, що із селекційної точки зору найбільш цінним співвідношенням алелів генів, що асоційовані з надоєм і вмістом білка в молоці: BLG (А-0.500), CSN3 (В-0.500), та PIT-1 (В-0.540) характеризуються тварини бурої карпатської породи.

6. Розподіл алельних варіантів генів CSN3, BLG, LEP, GH, PIT-1, MSTN не залежить від еколого-географічних умов розведення тварин.

7. Застосування методу ПЛР-ПДРФ дає можливість прискорити та збільшити точність селекційної роботи, що безпосередньо зв'язано з виробництвом якісної сільськогосподарської продукції.

Пропозиції виробництву

Отримані дані щодо наявності у великої рогатої худоби алельних варіантів генів, які асоційовані з господарсько-корисними ознаками, рекомендовано враховувати в селекційній роботі з породами відповідного напрямку продуктивності.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Иванченко (Копылова) Е.В., Глазко Г.В., Глазко В.И. Нуклеотидная эволюция хозяйственно-ценных генов на примере каппа-казеина // Доповіді Національної Академії наук України. - 2002. -№ 10. - С.155-159 (аналіз результатів, участь у написанні статті).

2. Глазко В.І Иванченко (Копилова) К.В., Облап Р.В. Глазко Г.В. Молекулярно-генетичні маркери селекційної роботи і стійкості, щодо чинників екологічного стресу // Вісник аграрної науки. - 2002. - № 11.- С. 17 (проведення експериментальних досліджень щодо генів, асоційованих з господарсько корисними ознаками, статистична обробка, аналіз одержаних результатів, участь у написанні статті).

3. Иванченко (Копилова) Е.В., Глазко Т.Т., Глазко В.И., Ковальова О.А. Характеристика генофонду червоної польської породи // Вісник аграрної науки. - 2004.- № 2.- С. 25 (проведення експериментальних досліджень щодо генів, асоційованих з господарсько корисними ознаками, статистична обробка, аналіз результатів, участь у написанні статті).

4. Иванченко (Копилова) Е.В., Ковалева О.В., Глазко Т.Т., Глазко В.И. Комплексный анализ генофондов красной польской породы воспроизводимых в Польше и Украине // Агроекологічний журнал. - 2004. - № 2. С. 14-20 (проведення експериментальних досліджень щодо генів, асоційованих з господарсько корисними ознаками, статистична обробка, аналіз результатів, участь у написанні статті).

5. Копылова Е.В., Глазко В.И. RFLP полиморфизм хозяйственно-ценных генов у аутохтонных пород крупного рогатого скота Украины и России // Вісник Полтавської державної академії. - 2005. - №1.- С. 84-89 (проведення експериментальних досліджень щодо генів, асоційованих з господарсько-цінними ознаками, аналіз власних результатів, участь у написанні статті).

6. Иванченко (Копылова) Е.В. Полиморфизм генов-“кандидатов” контроля хозяйственно ценных признаков у галловейской породы крупного рогатого скота // Фактори експериментальної еволюції організмів. Збірник наукових праць.- 2002.- т.2.- С.344-348.

7. Иванченко (Копылова) Е. В. Характеристика хозяйственно-ценных генов пород крупного рогатого скота Украины и России // Матеріали всеукраїнської конференції молодих вчених “Засади сталого розвитку аграрної галузі”. - Київ, 2002. - С.66-67.

8. Иванченко (Копылова) Е.В., Глазко В.И. PCR-RFLP хозяйственно-ценных генов у крупного рогатого скота Украины и России // Международная научная конференция "Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных". - Москва, 2002. - С.133-134 (проведення експериментальних досліджень щодо генів, асоційованих з господарсько-цінними ознаками, аналіз власних результатів, участь у написанні статті).

9. Глазко В.И., Иванченко (Копылова) Е.В., Облап Р.В., Глазко Г.В. Молекулярно - генетические маркеры селекционной работы и устойчивости к факторам экологического стресса // Матеріали міжнародної наукової конференції “Сталий розвиток агроекосистем”.- Вінниця, 2002. - С.128-129 (проведення експериментальних досліджень щодо генів, асоційованих з господарсько-цінними ознаками, статистична обробка, аналіз власних результатів, участь у написанні статті).

10. Ivanchenko (Kopylova) K. Allele distribution on economical valuable genes in red polish cattle breed from Ukraine and Poland // Conference for young scientists, phd and students on molecular biology and genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine“. - Кyev, 2003. - P. 163.

11. Иванченко (Копылова) Е.В., Облап Р.В., Глазко В.И. Полиморфизм хозяйственно-ценных генов (бета-лактоглобулин, каппа-казеин) у аутохтонных пород Украины // Материалы научной генетической конференции.- Москва, 2002 .- С. 126-128 (проведення експериментальних досліджень, обробка та аналіз власних результатів, участь у написанні статті).

12. Иванченко (Копылова) Е.В., Глазко В.И. ДНК-маркеры хозяйственно-ценных признаков крупного рогатого скота Украины и России. // Материалы 2-ой конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова, посвященной 115-и летию со дня рождения акад. Н.И. Вавилова. Актуальные проблемы генетики (20-21 февраля).- Москва, 2003. - т.1.- С.330-331 (проведення експериментальних досліджень, обробка та аналіз власних результатів, участь у написанні статті).

Копилова К.В. Поліморфізм генів, асоційованих з господарсько-цінними ознаками великої рогатої худоби. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут агроекології УААН, Київ, 2006.

В роботі встановлено, що тільки у видів підродини Bovinae частота несинонімічних замін вище, ніж синонімічних. Амінокислотна послідовність капа-казеїну у 4-му экзоні у двох видів Bos taurus та Bos indicus ідентична, за винятком однієї заміни в позиції 148 у Bos tauru. Це відповідає алельному варіанту В капа-казеїну у великої рогатої худоби. Для тварин червоної польської породи виявлена наявність цінних алельних варіантів за генами (CSN3, BLG, GH),а для тварин галовейської породи - за генами GH, LEP, MSTN, які пов'язані з показниками м'ясної продуктивності. Найбільш цінним співвідношенням алельних варіантів генів BLG, CSN3, GH, PIT-1 характеризуються тварини бурої карпатської породи. Розподіл алельних варіантів генів визначається особливостями формування генофонду кожної породи відповідно до її напрямку продуктивності і не залежить від еколого-географічних умов розведення. Застосування методу ПЛР-ПДРФ дає можливість прискорити та збільшити точність селекційної роботи, яка безпосередньо зв'язана з підвищенням якості сільськогосподарської продукції. Отримані дані рекомендується враховувати в селекційній роботі з породами відповідного напрямку продуктивності.

Ключові слова: велика рогата худоба, генофонд, поліморфізм генів, господарсько-корисні ознаки, ДНК-маркери.

Копылова К.В. Полиморфизм генов, ассоциированных с хозяйственно-ценными признаками крупного рогатого скота. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.15- генетика. - Институт агроэкологии УААН, Киев, 2006.

До сих пор генофонды пород крупного рогатого скота, которые разводят на территории Украины, остаются, недостаточно изучены, в отношении полиморфизма генов, ассоциированных хозяйственно-полезными признаками генов, что в перспективе можно будет использовать для решения различных селекционных задач.

В связи с этим, был проведен анализ полиморфизма шести генов (CSN3, BLG, GH, LEP, PIT-1, MSTN) у ряда пород крупного рогатого скота, которые отличаются по истории происхождения, направлению продуктивности и условиям разведения. Впервые установлено, что у видов подсемейства Bovinae частота встречаемости несинонимичных замен заметно выше, чем синонимичных 0.045 и 0.036 в 4-м экзоне гена каппа-казеина. Выявлено, что аминокислотная последовательность гена каппа-казеина в том же участке у двух близкородственных видов Bos taurus и Bos indicus идентична за исключением одной замены в позиции 148 в Bos taurus, это соответствует аллельному варианту В гена каппа-казеина у крупного рогатого скота. Анализ распределения аллельных вариантов генов, ассоциированных с хозяйственно - полезными признаками у животных красной польской породы показал, что для данной породы характерно присутствие ценных аллельных вариантов генов, связанных с показателями молочной CSN3-В (0.380), BLG -В (0.674) и мясной продуктивности GH -V (0.342), LEP-А (0.776), MSTN - В (0.020). Для животных галловейской породы обнаружено наличие аллельных вариантов ассоциированных с показателями мясной продуктивности GH (V-0.470), LEP (А-0.730), MSTN (В-0.037). Наиболее ценным сочетанием аллельных вариантов с селекционной точки зрения, характеризуются животные бурой карпатской породы BLG (А-0.500), CSN3 (В-0.500) и PIT-1 (В-0.540).

Полученные данные указывают на то, что распределение аллельных вариантов генов определяется особенностями искусственного отбора проводимого с каждой породой в соответствии с ее принадлежностью к определенному направлению продуктивности и не зависит от эколого-географических условий разведения животных. Использование результатов по генетическому анализу пород крупного рогатого скота, полученных в работе и применение метода ПЦР-ПДРФ дает возможность увеличить точность и эффективность селекционной работы, путем отбора и подбора родительских пар, которая направлена на получения желательных генотипов животных, что позволяет ускорить селекционный процесс, и делает возможным увеличить темпы консолидации пород. Полученные данные диссертационной работы рекомендуется учитывать в селекционной работе с породами конкретного направления продуктивности.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, генофонд, полиморфизм генов, хозяйственно-ценные признаки, ДНК-маркеры.

Kopylova K.V. Polymorphism of genes associated with economical characters of cattle. - Manuscript.

Thesis for the degree of Candidate of Agricultural Sciences in Speciality 03.00.15 - Genetics. - Institute of Agroecology of Ukrainian Academy of Agrarian Sciences, Kyiv, 2006.

A higher frequency of nonsynonymic substitutions relative to that of synonymic ones has been established only in species of the subfamily Bovinae. The amino acid sequences of kappa-casein in exon 4 are identical in the two species Bos taurus and Bos indicus, except for one substitution in position 148 in Bos taurus, which corresponds to allele variant B of kappa-casein in cattle. Valuable allele variants of genes (CSN3, BLG, GH) have been revealed in Polish Red individuals. Peculiarities of artificial selection applied to a breed irrespective of its determined direction of productivity underlie the distribution of allele variants of genes which does not depend on eco-geographical conditions of breeding. Allele variants of genes GH, LEP and MSTN are typical of Galloway individuals and associated with indices of meat productivity. Carpathian Brown is distinguished for the most desired combination of allele variants BLG, CSN3, GH and PIT-1

Key words: cattle, genofond, polymorphism genes, economical characters, DNA -marker.

Размещено на Allbest.ru

...