Соматичний ембріогенез та органогенез як основа біотехнології отримання і збереження багаторічних садових культур

Y. torrey

90

95

-

-

-

P. armeniaca

60

80

-

-

-

P. cerasifera,

P. domestica

60

95

-

-

-

A. deliciosa

90

95

-

-

100

F. sellowiana

60

90

-

-

40

Примітка. GI - ростовий індекс; ОІ - органогенетичний індекс; R - частота регенерації

Размещено на http://www.allbest.ru/

Попередні експерименти з підбору оптимальних температур для тривалого збереження експлантів ківі, абрикоса, аличі, троянди, орхідей і ломиноса в умовах іn vіtro показали, що серед досліджуваних культур найвищу життєздатність мали експланти ківі. Однак спосіб збереження експлантів в умовах іn vіtro тільки за рахунок регулювання температури та інтенсивності освітлення виявився малоефективним, оскільки більшість експлантів після депонування надто витягувалися і не були здатні до регенерації пагонів після перенесення до стандартних умов культивування.

Отже, далі був вивчений вплив кожного з ефекторів, і зіставлені одержані оптимальні показники, що дало змогу відпрацювати правильну стратегію в збереженні іn vіtro експлантів троянд, ломиноса, юки, орхідей, фейхоа, ківі, аличі, сливи та абрикоса.

У процесі досліджень показано, що при тривалому культивуванні всіх досліджуваних видів рослин на середовищах, що містять 15-90 г/л сахарози, ясно простежується тенденція зниження життєздатності експлантів при збільшенні періоду депонування та підвищення життєздатності при збільшенні концентрації сахарози в живильному середовищі. Встановлено, що на середовищах з концентрацією сахарози 90 г/л життєздатність експлантів троянд, орхідей, ломиноса, юки, фейхоа та ківі досягала 50-90%. Серед цих культур вищу життєздатність мали соматичні зародки ломиноса та протокорми цимбідіума. В експлантів юки відзначено низький рівень життєздатності (20-25%) порівняно з іншими досліджуваними видами та сортами рослин. Практично в усіх видів і сортів на середовищах з 60 і 90 г/л сахарози спостерігали утворення адвентивних бруньок і розвиток коренів. Крім того, при додаванні в середовища 90 г/л сахарози кінетика росту експлантів знижувалася в 2-3 рази порівняно з контролем залежно від виду та сорту рослини. Збільшення періоду депонування до 24 місяців дало змогу знизити кінетику росту експлантів троянди мініатюрної і зберігати мікропагони життєздатними. В експлантів ломиноса встановлено залежність кінетики росту від строків збереження та типу експланта, закладеного на депонування в умови іn vіtro.

Введення в живильні середовища маніту та сорбіту також знижувало кінетику розвитку експлантів і підвищувало життєздатність. Після 6-місячного депонування використання 60 мг/л маніту стабілізувало розвиток експлантів. Залежно від генотипу досліджуваної рослини життєздатність досягала 70-90%. Наявність у середовищі маніту збільшувало життєздатність мікропагонів мініатюрної троянди сорту Бебі Бантінг. Однак через 12 місяців депонування 20-30% експлантів досліджуваних культур були здатні розвиватися після перенесення до стандартних умов культивування.

Введення в живильне середовище ретарданта - хлор холін хлориду (ССС) значно підвищувало життєздатність експлантів порівняно з контролем. Проведений скринінг досліджуваних культур, що піддавалися впливу низьких позитивних температур і ретарданту ССС протягом 12 місяців, дав змогу виділити найбільш життєздатні культури. Встановлено, що при концентрації ССС 0,2-0,4 г/л кількість життєздатних експлантів у таких рослин як троянда, ломиніс, орхідея, юка, алича, слива, абрикос досягала 100%. Поряд з інгібуванням росту експлантів, ССС індукував ріст коренів у таких культур як троянда, ломиніс, юка, фейхоа і слива. Частота укорінення мікропагонів ломиноса у таких сортів, як Серенада Крима і Юность через 24 місяці депонування досягала 100%.

Спільне використання оптимальних концентрацій ССС і сахарози, показників інтенсивності освітлення і температури значно збільшило як період збереження в безпересадочній культурі, так і життєздатність експлантів досліджуваних культур. Це дало змогу нам уперше розробити спосіб мінімізації росту декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур в умовах іn vіtro, та створити генобанк цінної рослинної плазми. Цю біотехнологічну систему збереження рослин подано на рисунку 14.

Отже, на основі комплексного вивчення процесів соматичного ембріогенезу та органогенезу запропоновано біотехнологічну схему отримання та збереження цінних видів і сортів декоративних, субтропічних, кісточкових плодових і ефіроолійних рослин (рис. 15). В поданій на рисунку схемі, що складається з кількох системних блоків удалося розкрити регенераційний потенціал досліджуваних культур і продемонструвати основні фактори (індуктор, генотип, тип експланта та його походження, живильне середовище, фітогормони та їх концентрації, інтенсивність освітлення та температура), показати ступінь їх впливу на процеси соматичного ембріогенезу і органогенезу та відобразити кінцевий продукт - біотехнологічні системи розмноження, реципієнтні системи і системи збереження багаторічних рослин в умовах іn vіtro.

ВИСНОВКИ

1.У результаті проведеного вивчення шляхів морфогенезу та особливостей регенерації рослин in vitro у багаторічних садових культур (ломиноса, каладіума, троянди, орхідей, фікуса, юки, зизифуса, ківі, хурми, фейхоа, аличі, сливи, абрикоса, мґяти котячої та гісопу) установлено загальні закономірності індукції і реалізації процесів соматичного ембріогенезу та органогенезу, що полягають у визначальній ролі типу експланта і його походження, генотипу, живильного середовища, концентрації фітогормону, температури та інтенсивності освітлення. Особливе значення для розвитку соматичних зародків має індуктор. На основі виявлених закономірностей процесів соматичного ембріогенезу та органогенезу створено та вдосконалено системи розмноження і збереження in vitro декоративних, субтропічних, кісточкових плодових і ефіроолійних культур для клонування видів і сортів, які важко розмножуються, розробки реципієнтних систем і створення генобанку цінної рослинної плазми.

2.Вперше визначено 4 шляхи реалізації морфогенетичного потенціалу органів і тканин різних сортів ломиноса. Для оцінки ступеня гетерогенності рослин ломиноса сорту Серенада Крима, отриманих у результаті реалізації експлантами різних шляхів регенерації, показано інформативні можливості молекулярно-генетичного маркера - ПЛР аналізу. Встановлено середній показник гетерогенності рослин, що склав 5,7%. При цьому виявлено, що регенеранти, одержані з соматичних зародків, які вступили до фази цвітіння, не відрізнялися за фенотипом від материнського сорту.

3.Вперше встановлено залежність індукції включення ембріогенного шляху розвитку в меристемних клітинах бічних, верхівкових бруньок і калюсу через прямий і непрямий соматичний ембріогенез від генотипу, концентрації БАП (2,22 мкМ) або зеатину (1,3 мкМ), температури (24 1С), інтенсивності освітлення (40 мкМ·м^-2·с^-1) та наявності індуктора, яким є соматичний зародок. Продемонстровано провідну роль індуктора в процесі соматичного ембріогенезу, частка впливу якого становила 50%.

4.Виявлено 7 морфологічних типів соматичних зародків ломиноса, з яких 4 здатні до формування повноцінних рослин.. Показано здатність первинних соматичних зародків досліджуваних сортів ломиноса до вторинного ембріогенезу. Продемонстровано високу частоту як первинного, так і вторинного ембріогенезу, що досягала 65-100% у сортів Нєвєста, Crіmson Star, Юность, Серенада Крима і Ай-Нор.

5. Уперше розроблено біотехнологічні системи отримання рослин ломиноса через прямий і непрямий соматичний ембріогенез (каулігенну ембріоїдогенію), і показано можливість масового клонального мікророзмноження окремих сортів на індукційному живильному середовищі.

6.Визначено основні фактори, що впливають на ефективність регенерації рослин каладіума та фікуса ліровидного через соматичний ембріогенез: час відбору експланта і введення його в умови іn vіtro, тип експланта та зона листкової пластинки, трофічний фактор (живильне середовище для каладіума - МС, для фікуса - КЛ) і концентрація цитокініну (0,89 мкМ БАП у фікуса ліровидного і 2,32 мкМ кинетину у каладіума).

7.Розроблено біотехнологічні системи соматичного ембріогенезу (фоліарної ембріоїдогенії) та органогенезу для каладіума та фікуса ліровидного. Установлено залежність підвищення ефективності мікророзмноження за рахунок використання різних способів регенерації рослин з експлантів листка.

8.Проведено порівняльне вивчення морфогенетичних потенцій органів і тканин ківі, зизифуса, хурми і фейхоа та показано високу регенераційну здатність листкових експлантів до адвентивного пагоноутворення. Визначено оптимальні концентрації фітогормонів, які індукують процес прямої регенерації мікропагонів із листкових експлантів ківі (8,90 мкМ БАП і 8,56 мкМ ІО_цК), зизифуса (3,0 мкМ ТДЗ), фейхоа (9,0 мкМ ТДЗ) та хурми (6,0 мкМ ТДЗ). В результаті прямої регенерації мікропагонів із сім'ядолей хурми отримано 99 нових селекційних форм. Установлено оптимальні концентрації ауксинів, що сприяють 100% укоріненню мікропагонів ківі, фейхоа, хурми та зизифуса. Вперше для ківі, зизифуса, фейхоа та хурми подано 5 різних шляхів регенерації рослин.

9.Установлено залежність прямої регенерації мікропагонів гісопу та м'яти котячої від генотипу, концентрації ТДЗ, кількості субкультивувань, розташування листкових дисків на живильному середовищі та інтенсивності освітлення. Визначено концентрації ТДЗ для гісопу - 6 мкМ та для м'яти котячої - 9 мкМ, застосування яких індукувало утворення мікропагонів у 70-90% листових дисків при адаксіальному розташуванні на середовищі. Максимальна кількість адвентивних бруньок і мікропагонів розвивалася з листкових експлантів досліджуваних культур, відібраних в умовах іn vіtro з мікропагонів після 4-5 пасажу при інтенсивності освітлення 25 мкМ м^-2 с^-1 (гісоп) і 37,5 мкМ м^-2 с^-1 (м'ята котяча).

10. Уперше розроблено реципієнтні системи зизифуса, ківі, хурми, фейхоа, м'яти котячої і гісопу для подальшого їх використання в селекції на продуктивність, адаптивність до несприятливих абіотичних факторів і стійкість до хвороб.

11. На основі визначення ростового індексу, частоти регенерації і органогенетичного індексу подано оптимальні експланти декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур для подальшого депонування в умовах іn vіtro.

12. Установлено найважливіші фактори, що впливають на тривалість збереження в умовах іn vіtro експлантів досліджуваних рослин: генотип, температура (51С), інтенсивність освітлення (1,25-3,75 мкМ м^-2 с^-1), склад живильного середовища (Ѕ МС, В5, КЛ, Кнудсона С), концентрації ретарданту та осмотика. Виявлено залежність зміни кінетики росту експланта та його життєздатності від концентрації сахарози, маніту, сорбіту, АБК і ССС у середовищі для депонування. Показано, що спільне використання 90 г/л сахарози і 0,4 г/л ССС дає змогу зберігати експланти життєздатними в безпересадочній культурі протягом 12-24 місяців.

13. Розроблено спосіб мінімізації росту рослин при низьких позитивних температурах в умовах іn vіtro і на його основі створено генобанк цінних видів і сортів декоративних, кісточкових і субтропічних плодових культур у вигляді повільно зростаючих колекцій, поданий 27 сортами троянди, 3 видами орхідей, 1 видом юки, 9 сортами ломиніса, 4 сортами і 2 гібридами ківі, 2 формами фейхоа, 2 сортами аличі, 1 сортом абрикоса та 10 сортами сливи.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1.Розроблені способи прямого соматичного ембріогенезу та органогенезу ломиноса, каладіума і фікуса ліровидного рекомендується використовувати для масового розмноження цінних сортів, як реципієнтні системи та для збереження рослин в умовах іn vіtro.

2.Розроблену систему непрямого соматичного ембріогенезу каладіума пропонується застосовувати в створенні нових селекційних форм.

3.Подані реципієнтні системи зизифуса, хурми, фейхоа, ківі, м'яти котячої і гісопу на основі прямої регенерації мікропагонів з листкових експлантів рекомендується використовувати для генетичної трансформації і впливу селективного агента.

4.Розроблений спосіб регенерації рослин із сім'ядолей незрілих зародків субтропічних плодових культур рекомендується використовувати для подолання постгамної несумісності при одержанні міжсортових і міжвидових гібридів.

5.Пропонується використовувати для створення генобанку рослинної плазми у вигляді повільно зростаючих колекцій іn vіtro розроблений спосіб мінімізації росту декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Митрофанова О.В., Славгородская-Курпиева, Митрофанова И.В., Лукичева Л.А. Диагностика вирусных болезней и биотехнологические приемы получения безвирусного посадочного материала косточковых плодовых культур. - Ялта: Издательство Крымпресс, 2000. - 45 с. (брошюра). (Здобувачем написано 4 розділ і підготовлено публікацію до друку).

2. Митрофанова О.В., Зленко И.Л., Митрофанова И.В., Иванова Н.Н. Об условиях пролиферации протокормов цимбидиума // Бюлл. Никит. ботан. сада. - 1990. - Вып. 72. - С. 105-111. (Здобувачем проведене планування експерименту, підібрані оптимальні живильні середовища, отримані рослини з протокормів, результати зведені до таблиць і графіків).

3. Митрофанова И.В. Микроклональное размножение субтропических и тропических плодовых культур (обзор литературы) // Труды Никит. ботан. сада. - 1997. - Т. 119. - С. 63-95.

4. Пандей Д.К., Митрофанова И.В. Сравнительное изучение особенностей морфогенеза индийского (Zizyphus mauritiana Lam.) и китайского (Zizyphus jujuba Mill.) зизифусов в условиях in vitro // Труды Никит. ботан. сада. - 1997. - Т. 119. - С. 127-143. (Дисертантом сплановано дослідження і виконано частину робіт, пов`язаних із культивуванням вегетативних бруньок і мікропагонів зизифусу китайського, разом із співавтором проаналізовано результати досліджень і підготовлено статтю до публікації).

5. Митрофанова И.В., Казас А.Н., Хохлов С.Ю. Особенности клонального микроразмножения хурмы // Бюлл. Никит. ботан. сада. - 1998. - Вып. 80. - С. 153-158. (Здобувачем виконано роботи щодо планування експерименту, оптимізації умов культивування, отримання рослин в умовах in vitro і підготовки статті до друку).

6. Митрофанова О.В., Митрофанова И.В., Смыков А.В., Лесникова Н.П. Методы биотехнологии в селекции и размножении субтропических и косточковых плодовых культур // Труды Никит. ботан. сада. - 1999. - Т. 118. - С. 189-199. (Дисертантом проведено основні експерименти, підготовлено і написано частину роботи, пов`язану з біотехнологічними методами розмноження субтропічних і кісточкових плодових культур).

7. Митрофанова И.В. Прямая регенерация микропобегов из листовых дисков киви (Actinidia

deliciosa (Chev.) Liang, Ferguson) в условиях in vitro // Інтродукція рослин. - 2000. - № 1. - С. 157-158.

8. Mitrofanova I., Ivanova N. Using of leaf discs for direct regeneration of issope plants // Horticulture and Vegetable Growing: Scientific works Lithuanian Inst. Hort. and Lithuanian Univ. Agr. - 2000. - Vol. 19, N 3, Part 1. - P. 427-433. (Безпосередньо здобувачем проведено експериментальну роботу, статистичну обробку матеріалу, написання статті і підготовка її до друку виконані із співавтором).

9. Mitrofanova I.V., Mitrofanova O.V. Using broad genetic diversity and in vitro culture to enhance of breeding of some subtropical fruit plants // Acta Hort. - 2000. - N 538. - P. 169-172. (Здобувачем складено загальну схему дослідження, проведено основні експерименти, спільно зі співавтором підготовлено публікацію до друку).

10. Митрофанова О.В., Митрофанова И.В. Состояние и перспективы биотехнологических исследований садовых культур на юге Украины // Садівництво: Міжвідомчий тематичний науковий збірник. - 2000. - Вип. 50. - С. 296-281. (Дисертантом на основі виконаних досліджень підготовлені матеріали з біотехнології одержання декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур, подані попередні результати зі збереження рослин при низьких позитивних температурах).

11. Mitrofanova O., Lesnikova N., Mitrofanova I., Vogegov S. Application of biotechnology methods for obtaining the valuable cultivars of stone fruits // Horticulture and Vegetable Growing: Scientific works Lithuanian Inst. Hort. and Lithuanian Univ. Agr. - 2000. - Vol. 19, N 3, Part 1. - P. 367-374. (Здобувачем сплановано експеримент, проведені аналіз одержаних результатів).

12. Митрофанова О.В., Митрофанова И.В. Изучение вирусов цветочных культур и эффективные методы оздоровления растений in vitro // Вісник Київського Національного Університету ім. Т. Шевченка. Серія Біологія. - 2001. - Вип. 35. - С. 47-53. (Дисертантом сплановано і частково проведено методичні роботи з розмноження оздоровленого рослинного матеріалу квіткових культур, підготовлено публікацію до друку).

13. Кондратенко О.В., Митрофанова И.В. Особенности клонального микроразмножения двух сортов миниатюрных роз // Бюл. Никит. ботан. сада. - 2002. - Вып. 86. - С. 38-40. (Здобувачем проведено керування роботою, здійснено контроль за фітогормональним складом живильного середовища, отримано основні результати експериментів і здійснено редагування статті).

14. Mitrofanova I.V., Movchan O.P., Shishkin V.A., Mitrofanov V.I. Gene-pool collection in Nikitsky Botanical Gardens - National Scientific Center // Bull. State Nikitsky Bot. Gardens. - 2002. - N 85. - P. 30-33. (Дисертантом сплановано і проведено експерименти з депонування експлантів в умовах in vitro, підготовлено публікацію до друку).

15. Mitrofanova I.V., Yezhov V.N. Plant regeneration of Clematis L. through somatic embryogenesis in vitro // Bull. State Nikitsky Bot. Gardens. - 2002. - N 86. - P. 16-19. (Здобувачем проведено планування експерименту, опрацьовано етап введення експлантів ломиноса до умов in vitro, розроблено спосіб непрямого соматичного ембріогенезу, спільно із співавтором підготовлено матеріал до друку).

16. Кондратенко О.Н., Митрофанова И.В. Влияние различных концентраций витаминов на рост и развитие растений фейхоа (Feijoa sellowiana Berg.) в культуре in vitro // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия Биология. - 2003. - Т. 16 (55), № 2. - С. 98-102. (Дисертантом здійснено контроль за проведенням усіх етапів дослідження, запропоновано необхідність оптимізації експерименту, отримано основні результати досліджень).

17. Митрофанова И.В. Регенерация in vitro микропобегов из вегетативных почек зизифуса китайского (Zizyphus jujube Mill.) и физические факторы культивирования // Бюлл. Никит. ботан. сада. - 2003. - Вып. 87. - С. 63-66.

18. Митрофанова И.В. Особенности микроразмножения гемарии разноцветной и доссинии в условиях in vitro // Біологічний вісник. - 2003. - Т. 7, № 1 - 2. - С. 43-45.

19. Митрофанова И.В., Галаев А.В., Сиволап Ю.М. Исследование молекулярно-генетической гетерогенности растений клематиса (Clematis L.), полученных путем органогенеза и соматического эмбриогенеза in vitro // Цитология и генетика. - 2003. - № 6. - С. 12-16. (Здобувачем на основі розроблених ним біотехнологічних систем одержано рослини ломиноса, спільно зі співавторами проведено ПЛР-аналіз і підготовлено статтю до публікації).

20. Митрофанова І.В., Кондратенко О.В. Збереження в культурі in vitro мініатюрних троянд // Бюлл. Никит. ботан. сада. - 2004. - Вып. 90. - С. 77-80. (Дисертантом проведене планування експерименту, отримання рослин in vitro, розроблено метод збереження експлантів при низьких позитивних температурах, проведено редагування статті, підготовка її до друку).

21. Mitrofanova I.V, Mitrofanova O.V. Development of recipient system of woody subtropical plants in vitro // Acta Universitatis Latveiensis. Biology. - 2004. - Vol. 676. - P. 189-196. (Здобувачем розроблено способи регенерації субтропічних рослин, проведено аналіз результатів, спільно зі співавтором підготовлено статтю до публікації).

22. Mitrofanova I.V. Influence of carbohydrates and physical factors of cultivation on formation of Cymbidium hybridum and Cymbidium minima protocorms in vitro // Bull. State Nikitsky Bot. Gardens. - 2005. - N 91. - P. 126-130.

23. Митрофанова И.В., Работягов В.Д., Иванова Н.Н. Сравнительное изучение прямой регенерации микропобегов котовника и иссопа in vitro с целью пополнения генофонда // Бюлл. Никит. ботан. сада. - 2006. - Вып. 92. - С. 5-9. (Дисертантом сплановано дослідження, безпосередньо проведено експерименти, розроблено біотехнологічний підхід у створенні реципієнтних систем ефіроолійних рослин, проаналізовано результати досліджень і відредаговано публікацію).

24. Митрофанова И.В., Соколов О.И., Митрофанова О.В., Иванова Н.Н. Пути реализации морфогенетического потенциала каладиума (Caladium hortulanum Birdsey.) и цветной каллы (Zantedeschia hybrida) в условиях in vitro // Біологічний вісник. - 2006. - Т. 10, № 1. - С. 64-67. (Здобувачем проведено основні експерименти з вивчення морфогенетичних потенцій органів і тканин досліджуваних культур, спільно із співавторами підготовлено постійні препарати та проведено гістологічний аналіз на флуоресцентному мікроскопі, проаналізовано результати і підготовлено статтю до друку).

25. Пат. на винахід 61018 A Україна, МПК 7 А01Н4/00. Спосіб прямої регенерації мікропагонів з листкових експлантів Actinidia deliciosa (Chev.) Liang, Ferguson в культурі in vitro: Пат. на винахід 61018 A Україна, МПК 7 А01Н4/00 / Митрофанова І.В., Іванова Н.М. (Україна). - № 20021210668; Заявлено 27.12.2002 р.; Надрук. 15.10.2003 р., Бюл. 10. (Дисертантом заплановано і проведено всі експерименти, підготовлено всі матеріали для патенту, проведено редакційну правку).

26. Пат. на винахід 68595 Україна, МПК 7 А01Н4/00. Спосіб регенерації адвентивних мікропагонів Hyssopus officinalis L. в умовах in vitro: Пат. на винахід 68595 Україна, МПК 7 А01Н4/00 / Митрофанова І.В., Іванова Н.М., Митрофанова О.В. (Україна). - № 2003087613; Заявлено 12.08.2003 р.; Надрук. 15.06.2006 р., Бюл. 6. (Здобувачем на основі його багаторічних досліджень підготовлено матеріал для написання патенту, проведено його редакційну правку).

27. Mitrofanova I., Mitrofanova O. Special features of somatic embryogenesis and plant regeneration of Clematis in vitro // Propagation of Ornamental Plants - IPPS / Eds. Iv. Iliev, P. Zelev, I. Tzvetkov. - Sofia: SEEK & SHARE: Balkanpress. - 2000. - P. 70-75. (Дисертантом заплановано і проведено всі експерименти, визначено оптимальні умови для одержання соматичних зародків, спільно зі співавтором підготовлено матеріал для публікації).

28. Митрофанова И.В. Использование биотехнологических методов в создании медленно растущих коллекций ценного растительного генофонда // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. Укр. т-ва генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова / За ред. М.В. Роїка. - Київ: Логос, 2006. - Т. 3. - С. 613-618.

29. Митрофанова И.В., Иванова Н.Н. Влияние углеводов на образование протокормов и ауксинов в процессе ризогенеза цимбидиума в культуре in vitro // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. II конф. (29 июня - 1 июля 1993 г., г. Москва, Россия). - Москва, 1993. - С. 49.

30. Митрофанова И.В., Виджешвар П., Мязина Л.Ф. Регенерация микропобегов из листовых эксплантов Actinidia deliciosa Planch. // Проблемы дендрологии, садоводства и цветоводства: Тез. докл. междунар. конф. молодых ученых (25-27 сентября 1995 г., г. Ялта). - Ялта, 1995. - С. 107.

31. Митрофанова И.В., Митрофанова О.В. Роль фитогормонов в регуляции процессов морфогенеза субтропических плодовых культур in vitro // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. III междунар. конф. (27-29 июня 1995 г., г. Москва, Россия). - Москва, 1995. - С. 216.

32. Митрофанова И.В., Работягов В.Д., Аксенов Ю.В. Морфогенез и регенерация растений котовника in vitro // Переработка лекарственного сырья и производство фитопрепаратов для медицины и сельского хозяйства: Тез. докл. междунар. науч.-практ. конф. (5-6 сентября 1996 г., Алматы, Казахстан). - Алматы, 1996. - С. 75.

33. Mitrofanova I.V., Ivanova N.N., Rabotyagov V.D., Zilbervarg I.R., Shenfish N.R. Special features of the genus Nepeta's plants morphogenesis and regeneration in vitro // Problems and perspectives of biotechnology development in ornamental gardening and horticulture: Abstracts Intl. Conf. (25-26 September 1997, Yalta, Ukraine). - Yalta, 1997. - P. 67.

34. Mitrofanova I.V., Kin E.V., Mitrofanova O.V., Donushkina E.A. Obtaining of somatic embryos in tissue culture of Clematis L // In vitro Plant Cell Biology, Biotechnology and Germplasm Preservation: Abstracts VII Intl. Conf. (25-28 November 1997, Moscow, Russia). - Moscow, 1997. - P. 136.

35. Mitrofanova I.V., Myazina L.F., Litvinova T.V., Khokhlov S.Yu. Micropropagation of subtropical horticultural plants in vitro for the purposes of selection and preservation of valuable genotypes // Problems and perspectives of biotechnology development in ornamental gardening and horticulture: Abstracts Intl. Conf. (25-26 September 1997, Yalta, Ukraine). - Yalta, 1997. - P. 76.

36. Mitrofanova I.V., Mitrofanova O.V. Somatic embryogenesis and plant regeneration of Clematis L. in vitro // Plant Biotechnology: Abstracts II Intl. Symp. (4-8 October 1998, Kyiv, Ukraine). - Kyiv, 1998. - P. 87.

37. Mitrofanova I.V., Zilbervarg I.R., Mitrofanova O.V., Ivanova N.N., Rabotyagov V.D., Blume Ya.B. Special features of micropropagation and obtainment of the new nep and issope selection forms in vitro // Plant Biotechnology: Abstracts II Intl. Symp. (4-8 October 1998, Kyiv, Ukraine). - Kyiv, 1998. - P. 158.

38. Mitrofanova O.V., Mitrofanova I.V. Viruses of subtropical and stone fruit cultures and biotechnological receptions of plants improvement // Bioresourses and viruses: Abstracts II Intl. Conf. (7-10 September 1998, Kyiv, Ukraine). - Kyiv, 1998. - P. 200.

39. Mitrofanova O.V., Mitrofanova I.V., Smikov A.V. Biotechnology in ornamental gardening and horticulture breeding programs // Plant Biotechnology: Abstracts II Intl. Symp. (4-8 October 1998, Kyiv, Ukraine). - Kyiv, 1998. - P. 88.

40. Mitrofanova I.V. Plant regeneration via somatic embryogenesis in Clematis L. // Materials 7^th Intl. Meeting of Young Scientists in Horticulture, Lednice, Czech Republic, 14-16 September 1999. - Lednice, 1999. - P. 335-338.

41. Mitrofanova I.V., Mitrofanova O.V. Obtainment of a genetic diversity and using of culture in vitro in breeding of some subtropical fruit plants // Fruit Breeding and Genetics: Abstracts Intl. Symp. of the EUCARPIA (6-10 September 1999, Dresden, Germany). - Dresden, 1999. - P. A22.

42. Zilbervarg I.R., Mitrofanova I.V. Features of morphogenesis in organ and tissue culture of nep and issope // Materials 7 Intl. Conf. of Young Scientists in Horticulture, Lednice, Czech Republic, 14-16 September 1999. - Lednice, 1999. - P. 263-267.

43. Mitrofanova I.V., Mitrofanova O.V., Lesnikova N.P. Gene-bank of plants in vitro in Nikita Botanical Garden (Yalta, Ukraine) // Plant Physiology and Biochemistry: Abstracts 12^th Congress of the FESPP (21-25 August 2000, Budapest, Hungary). - Paris: ELSEVIER, 2000. - Vol. 38. - S. 19.

44. Mitrofanova I., Kondratenko O. Special features of embryo development in vitro of some subtropical fruits // Plant Embryology: Abstracts X Intl. Conf. (5-8 September 2001, Nitra, Slovak Republic). - Nitra, 2001. - P. 137.

45. Karpov P.A., Mitrofanova I.V. Approaches in micropropagation in vitro of some arboreal monocotyledon plants with find expression in apical domination // Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources: Abstracts Intl. Symp. (26-30 May 2002, Yalta, Ukraine). - Yalta, 2002. - P. 32-33.

46. Kondratenko O.V., Mitrofanova I.V. Features of miniature roses clonal micropropagation // Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources: Abstracts Intl. Symp. (26-30 May 2002, Yalta, Ukraine). - Yalta, 2002. - P. 34.

47. Mitrofanova I.V. Plant biotechnology in Nikitsky Botanical Garden - National Scientific Center // Abstracts II Ukrainian-Bulgarian Workshop on Plant Biotechnology, Yalta, Ukraine, 29 May - 1 June 2002. - Yalta, 2002. - P. 20.

48. Mitrofanova I.V., Lesnikova N.P., Shishkin V.A. Conservation in vitro of plant genetic resources in Nikitsky Botanical Gardens (Yalta, Ukraine) // Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources: Abstracts Intl. Symp. (26-31 May 2002, Yalta, Ukraine). - Yalta, 2002. - P. 60-61.

49. Mitrofanova I.V., Yezhov V.N. In vitro propagation of Clematis L. through somatic embryogenesis // Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources: Abstracts Intl. Symp. (26-30 May 2002, Yalta, Ukraine). - Yalta, 2002. - P. 22.

50. Кондратенко О.Н., Митрофанова И.В. Особенности клонального микроразмножения Feijoa sellowiana Berg. в условиях in vitro // Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений: Тез. докл. II междунар. конф. молодых ученых (19-23 мая 2003 г., г. Харьков). - Харьков, 2003. - С. 51.

51. Митрофанова И.В. Минимализация роста декоративных растений под воздействием химических факторов в культуре in vitro // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: Тез. докл. VIII Междунар. конф. (9-13 сентября 2003 г., г. Саратов, Россия). - Саратов, 2003. - С. 202.

52. Митрофанова И.В., Галаев А.В., Сиволап Ю.М. Оценка полиморфизма сомаклонов клематиса (Clematis L.), полученных в условиях in vitro // Геном растений: Тез. докл. IV междунар. конф. (10-13 июня 2003 г., г. Одесса). - Одесса, 2003. - С. 28.

53. Митрофанова И.В., Попкова Л.Л., Митрофанова О.В. Микроразмножение драгоценных орхидей в культуре in vitro // Геном растений: Тез. докл. IV междунар. конф. (10-13 июня 2003 г., г. Одесса). - Одесса, 2003. - С. 66.

54. Мовчан О.П., Митрофанова И.В., Клименко З.К. Изучение регенерационной способности органов и тканей розы садовой при введении в культуру in vitro // Актуальные вопросы современного естествознания - 2003: Тез. докл. Всеукраинской конф. молодых ученых (11-13 апреля 2003 г., г. Симферополь).- Симферополь, 2003. - С. 62.

55. Mitrofanova I. Development of direct and indirect regeneration in vitro of woody subtropical plants // Plant Biotechnology: Progress and Development: Abstracts 5^th Intl. Symp. (7-13 September 2003, Stara Lesna, Slovak Republic). - Stara Lesna, 2003. - P.44.

56. Lesnikova-Sedoshenko N., Mitrofanova I., Gorina V. Embryoculture and obtaining of new forms in Prunus armeniaca L. // Plant Tissue Culture: From Theory to Practice: Abstracts Intl. Conf. of Baltic States (27-28 May 2004, Salaspils, Latvia). - Salaspils, 2004. - P. 27.

57. Mitrofanova I. The effect of carbohydrates concentration and physical factors on in vitro morphogenesis of Cymbidium hybridum and Cymbidium minima // Growth and Development of Plants. Theoretical and Practical Problems: Abstracts Intl. Sci. Conf. (7-9 June 2004, Babtai, Lithuania). - Babtai, 2004. - P. 59.

58. Mitrofanova I.V., Galaev A.V., Sivolap Yu.M. Somatic embryogenesis in Clematis L. and study of molecular-genetic heterogeneity of obtained in vitro somaclones // Biotech Approaches to Engineering plant growth: Materials Ukranian-U.K. Workshop on Plant Biotechnology (14-16 March 2004, Yalta, Ukraine). - Yalta, 2004. - P. 30-33.

59. Mitrofanova I., Mitrofanova O. Development of recipient system of subtropical woody plants in vitro for future genetic transformation // Plant Tissue Culture: From Theory to Practice: Abstracts Intl. Conf. of Baltic States (27-28 May 2004, Salaspils, Latvia). - Salaspils, 2004. - P. 21.

60. Mitrofanova O., Mitrofanova I. Virus diseases of tropical orchids and the way to clean up of plants // Plant Tissue Culture: From Theory to Practice: Abstracts Intl. Conf. of Baltic States (27-28 May 2004, Salaspils, Latvia). - Salaspils, 2004. - P. 41.

61. Митрофанова И.В., Ежов В.Н., Митрофанова О.В., Иванова Н.Н., Мовчан О.П. Создание в условиях in vitro коллекций ценного растительного генофонда в Никитском ботаническом саду - Национальном научном центре (Ялта, Украина) // Ботанические сады как центры сохранения биоразнообразия и рационального использования растительных ресурсов: Материалы междунар. конф., посвященной 60-летию Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН (5-7 июля 2005 г., г. Москва, Россия). - Москва, 2005. - С. 349-351.

Анотація

Митрофанова І.В. Соматичний ембріогенез та органогенез як основа біотехнології отримання і збереження багаторічних садових культур. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за фахом 03.00.20 - біотехнологія. - Нікітський ботанічний сад - Національній науковий центр УААН, Ялта, 2007.

Дисертаційну роботу присвячено розробленню ефективних біотехнологічних систем одержання та збереження декоративних, субтропічних і кісточкових плодових, ефіроолійних рослин на основі вивчення особливостей соматичного ембріогенезу та органогенезу цих культур в умовах in vitro.

Досліджено процеси соматичного ембріогенезу у ломиноса, каладіума та фікуса ліровидного паралельно з пошуком комплексу оптимальних факторів, що регулюють утворення незиготичних зародків і виявленням закономірностей розвитку ембріоїдів. Підтверджено висунуту нами гіпотезу про важливість ролі “індуктора” у соматичному ембріогенезі ломиноса. В результаті вивчення молекулярно-генетичної гетерогенності рослин ломиноса нами встановлені особливості мінливості геному при різних способах регенерації in vitro. Вперше розроблено високоефективні біотехнологічні системи одержання рослин ломиноса, каладіума та фікуса ліровидного через соматичний ембріогенез та органогенез, де в якості компетентних експлантів було використано вегетативні бруньки та листя.

Проведено порівняльне вивчення морфогенетичних потенцій органів і тканин ківі, зизифуса, хурми та фейхоа і показано високу регенераційну здатність листкових експлантів до адвентивного пагоноутворення. Запропоновано комплекс умов для регенерації рослин м'яти котячої та гісопу з листкових дисків. Уперше створено реципієнтні системи in vitro для зизифуса, хурми, фейхоа, ківі, м'яти котячої та гісопу.

Вперше визначено оптимальні експланти декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур для подальшого депонування в умовах in vitro. Встановлено найважливіші фактори, що впливають на тривалість збереження в умовах in vitro експлантів досліджуваних рослин. Розроблено спосіб мінімізації росту рослин в умовах in vitro і на його основі створено генобанк цінних видів і сортів декоративних, кісточкових і субтропічних плодових культур у вигляді повільно зростаючих колекцій.

Ключові слова: ломиніс, каладіум, фікус ліровидний, зизифус, ківі, фейхоа, хурма, м'ята котяча, гісоп, троянда, орхідея, юка, абрикос, слива, алича, соматичний ембріогенез, органогенез, реципієнтна система, депонування, in vitro

Аннотация

Митрофанова И.В. Соматический эмбриогенез и органогенез как основа биотехнологии получения и сохранения многолетних садовых культур. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. - Никитский ботанический сад - Национальный научный центр УААН, Ялта, 2007.

Диссертационная работа посвящена разработке эффективных биотехнологических систем получения и сохранения декоративных, субтропических и косточковых плодовых, эфиромасличных растений на основе изучения особенностей соматического эмбриогенеза и органогенеза этих культур.

Исследованы процессы соматического эмбриогенеза у клематиса, каладиума и фикуса лировидного, параллельно с поиском комплекса оптимальных факторов, регулирующих образование незиготических зародышей и выявлением закономерностей развития эмбриоидов. Отработаны этапы введения эксплантов в условия in vitro, индукции формирования эмбриогенных структур, развития соматических зародышей, вторичного эмбриогенеза, получения растений и их адаптации in vivo. Подтверждена, выдвинутая нами, гипотеза о важности роли “индуктора” в соматическом эмбриогенезе клематиса. Установлена зависимость включения эмбриогенного пути развития в меристемных клетках боковых и верхушечных почек клематиса от генотипа, “индуктора”, концентрации БАП (2,22 мкМ), температуры (24 1С), интенсивности освещения 40 мкМ·м^-2·с^-1. Показано, что наиболее эффективно функционировала биотехнологическая система у клематисов групп Ланугиноза и Жакмана. В результате изучения молекулярно-генетической гетерогенности растений клематиса нами установлены особенности изменчивости генома при различных способах регенерации in vitro. Средний показатель гетерогенности растений клематиса составил 5,7%. Однако, все растения, доведенные до цветения не отличались по фенотипу от исходного. На основании полученных результатов впервые разработаны высокоэффективные биотехнологические системы получения растений клематиса, каладиума и фикуса лировидного через соматический эмбриогенез и органогенез, где в качестве компетентных эксплантов были использованы вегетативные почки и листья.

В результате проведенных многолетних исследований, впервые разработаны реципиентные системы in vitro для зизифуса, хурмы, фейхоа, киви. Подобраны условия культивирования, необходимые для реализации процесса регенерации растений из листовых эксплантов и семядолей.

Предложен комплекс условий для регенерации растений котовника и иссопа из листовых дисков и впервые разработана реципиентная система in vitro для этих культур. Определены концентрации ТДЗ для иссопа - 6 мкМ, для котовника - 9 мкМ, применение которых индуцировало образование микропобегов у 70-90% листовых дисков при адаксиальном расположении на среде.

Впервые определены оптимальные экспланты декоративных, субтропических и косточковых плодовых культур для дальнейшего депонирования в условиях in vitro на основе ростового индекса, частоты регенерации и органогенетического индекса. Установлены важнейшие факторы, влияющие на длительность сохранения в условиях in vitro эксплантов исследуемых растений: генотип, температура (51С), интенсивность освещения (1,25-3,75 мкМ м^-2 с^-1), состав питательной среды (Ѕ МС, В5, КЛ, Кнудсона С), концентрации ретарданта (0,4 г/л ССС) и осмотика (90 г/л сахарозы). Показано, что совместное использование всех эффекторов позволяет сохранять экспланты жизнеспособными в беспересадочной культуре на протяжении 12-24 месяцев. Разработан способ минимизации роста растений при низких положительных температурах в условиях in vitro и на его основе создан генобанк ценных видов и сортов декоративных, косточковых и субтропических плодовых культур в виде медленно растущих коллекций.

Ключевые слова: клематис, каладиум, фикус лировидный, зизифус, киви, фейхоа, хурма, котовник, иссоп, роза, орхидея, юкка, абрикос, слива, алыча, соматический эмбриогенез, органогенез, реципиентная система, депонирование, in vitro

Summary

Mitrofanova I.V. Somatic embryogenesis and organogenesis as a basis of obtaining and preservation of perennial horticultural plants. - Manuscript.

Thesis for Doctor of Science degree in Biology (Dr. Sci. Biol.), speciality 03.00.20 - biotechnology. - Nikitsky Botanical Gardens - National Scientific Center. Ukrainian Academy of Agricultural Science, Yalta, 2007.

This dissertation is devoted to development of effective biotechnological systems of obtaining and preservation of ornamental plants, subtropical and stone fruits, essential oil plants based on study of features of somatic embryogenesis and organogenesis of these cultures.

The processes of somatic embryogenesis in clematis, caladium and lyrate fig were investigated, with search of a complex of the optimal factors regulated formation of non-zygotic embryoids and revealing of laws of embryoids development. The stages of explants introduction in conditions in vitro, induction of embryogenic structures formation, development of somatic embryoids, secondary embryogenesis, obtaining of plants and their acclimatization in vivo were fulfilled. High effective biotechnological systems of ornamental plants obtaining through somatic embryogenesis and organogenesis were developed for the first time, where as competent explants the vegetative buds and leaves were used.

The culture conditions, which are necessary for realization of process of direct plant regeneration from leaf disks in subtropical and essential oil plants, were determined and recipient system for zizyphus, kiwi, persimmon, feijoa, nep and hyssop was created.

The major factors influencing on duration of preservation of explants of ornamental plants, subtropical and stone fruits in conditions in vitro were established. The method of minimization of plants growth in vitro at low positive temperatures was developed and genepool collection of valuable species and cultivars was created.

Kew words: clematis, caladium, lyrate fig, zizyphus, kiwi, feijoa, persimmon, nep, hyssop, rose, orchids, yucca, apricot, plum, sweet plum, somatic embryogenesis, organogenesis, recipient system, preservation, in vitro

Підписано до друку 23.07.2007 г. Формат 60х84 1/16.

Папір типографський. Друк цифровий.

Умов. друк. арк. 1,9. Тираж 100 прим. Замовлення № 0-39.

Інформаційно-видавницький відділ

Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського