Биохимические тесты и исследования животных

- во вторых, автоматизация позволяет снизить погрешность исследований (полная беспристрастность машин и постоянная прогнозируемая ошибка);

- в современных анализаторах зачастую блокируются методы биохимического исследования, что значительно повышает чувствительность и специфичность метода (например, автоматический хроматограф ВЭЖХ НР-1100, в котором сблокированы методы жидкостной хроматографии и УФ-детекции вещества);

- современные аналитические приборы управляются с помощью ПЭВМ, которая проводит не только расчет результатов, но и оценивает правильность и случайность полученных результатов. Для некоторых приборов возможна оценка результатов через интернет специалистами, разработавшими и производящими прибор. Они проводят его диагностику.

11.2 Особенности современных аналитических приборов

Второй составляющей прогресса лабораторной диагностики явилось развитие аналитической техники. Основными чертами развития явилось:

- автоматизация всех процессов проведения анализа, с одновременной унификацией и стандартизацией, как результат число проводимых исследований в единицу времени резко увеличилось, кроме того все это позволяет;

- блокирование методов исследования в одном комплексе, повышающее чувствительность метода (например хромотография и УФ детекция);

- создание аналитических систем, управляемых ПВЭМ, с использованием средств интернета, с одновременной оценкой правильности исследований.

11.3 Автоматизация и унификация биохимического исследования

Автоматизация всех процессов позволяет унифицировать проведение исследований. Унификация - это приведение к единым стандартам проведения определенных исследований. В рамках этого ранжируются методы пробоподготовки и исследования по чувствительности, специфичности и точности. А так же вырабатывается единая система проверки качества лабораторных исследований.

Унификация исследований позволяет вырабатывать нормативные значения по большому числу анализов за счет совпадения результатов исследований во многих лабораториях. Вводить постоянную корректировку норм.

11.3.1 Средства дозирования

В процессе анализа наиболее частой манипуляцией является отмеривание определенного количества раствора. Особенно актуально это в настоящее время, когда для постановки Ускорение этого процесса и стандартизация - очень важный момент во всем исследовании. В настоящее время для этих целей используются ряд автоматических и полуавтоматических дозирующих устройств.

группа устройств - это полуавтоматические дозаторы, пипетки и мокрошприцы.

Выделяют дозаторы фиксированного - рассчитанные на один объем отмериваемой жидкости и переменного объема - на разный объем жидкости. Кроме того, для работы в стандартных 96 луночных планшетах используют многоканальные дозаторы. Использование этих устройств чрезвычайно упростило постановку исследований. Расходные материалы (наконечники) являются стандартными и взаимозаменяемыми.

Дозаторы блокируются с резервуаром для реагентов и позволяют такие устройства отмеривать быстро и точно большое количество доз реактивов.

Дозаторы диспензеры разновидность последних устройств, однако они более миниатюрны и фиксируются в руке.

Наличие этих устройств позволяет дозировать объемы от 0,2 мкл до 10 - 25 мл.

группа устройств - это настольные автоматические дозирующие устройства, позволяющие отмеривать в пробирки нужное количество реагентов.

11.3.2 Роботизация биохимического исследования

Работу автоматической станции пробоотбора и постановки реакции можно посмотреть в следующем фильме (фильм ИФА).

11.3.3 Автоматизация гематологических исследований

В современных автоматических устройствах для гематологического анализа используются в основном два технологических принципа - кондуктометрический и оптический.

Основными параметрами, которые позволяют определять современные гематологические анализаторы, являются: количество лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, содержание гемоглобина, показатель гематокрита, объем форменных элементов, содержание гемоглобина в эритроците, лейкограмма.

Кондуктометрический принцип определения заключается в изменении сопротивления клетки в постоянном электрическом поле. Технология определения состоит в том, что фиксируется момент прохода через отверстие малого диаметра (апертуру) клеток крови. Для этого по обе стороны отверстия располагаются электроды с поданным на них напряжением. При протекании через отверстие чистого раствора электролита сопротивление в цепи мало, но в момент прохождения через апертуру клетки оно резко возрастает, что приводит к увеличению напряжения в цепи. Импульсы скачкообразного изменения напряжения фиксируются и подсчитываются специальным датчиком. Специальный прибор (дискриминатор) пропускает импульсы заранее заданной амплитуды, что позволяет регистрировать клетки в зависимости от их размера. О количестве однотипных частиц судят по числу импульсов, возникающих при прохождении клеток крови через апертуру строго определенного размера.

Оптический принцип определения в своей основе имеет измерение величины светопоглощение или свето-рассеивания (см. Оптические методы исследования). В анализаторах этого типа регистрируются электрооптические импульсы, возникающие при прохождении клеток крови в луче светового потока. Интенсивность импульса прямо пропорциональна размеру исследуемых частиц. Световой луч фокусируется на капилляр, через который проходят клетки, в результате чего происходит либо светопоглощение, либо светорассеяние светового потока. Величина светопоглощения или светорассеяния обусловлена размером, формой и структурой клеток крови.

В зависимости от типа анализаторов они делятся на полуавтоматические, где подготовка пробы к исследованию (ее разбавление соответствующими растворами) производится вручную и полностью автоматические, где все эта процедура проводятся в автоматическом режиме.

К приборам, работающим на принципе кондуктометрии, относятся такие гематологические автоанализаторы как Cobis Micros18, МД-11-18, System 9120 и др. Все они позволяют анализировать до 20 параметров крови.

К приборам, использующим оптический принцип детекции относятся гематологические анализаторы серии Techuicon (Н-1, Н-2, Н-3).

11.4 Характеристики и особенности некоторых современных методов исследования, используемых в ветеринарной биохимической практике

В семидесятых годах (1966-1969 гг.) были опубликованы первые сообщения о возможности присоединения к белкам молекул фермантов.

В основе метода лежит взаимодействие между ат и аг, один из которых метится ферментной меткой. Одной из причин широко в настоящее время распространения данного метода, то что он наряду с точностью и специфичностью поддается автоматизации.

11.4.1 ИФА

Широкое распространение метод ИФА получил при определении антител против бактериальных и вирусных антигенов. Метод ИФА можно широко использовать для обнаружения специфических антигенов возбудителей тех же заболеваний, а также самых различных химических соединений, которые могут выступать в качестве антигенов или гаптенов-антибиотиков, гормональных препаратов, микотоксинов, пестицидов и др.

Методы ИФА могут быть разделены на гетерогенные (твердофазные, ELISA) и гомогенные (EMJT) отличающиеся по принципу проведения анализа. Гетерогенные методы ИФА основаны на использовании антигенов и антител, иммобилизованных на нерастворимых носителях (как правило пластик).

Гомогенные методы основаны на эффекте модуляции антителами активности фермента (или кофактора) используемого в качестве метки антигена.

В настоящее время разработано много вариантов ИФА-анализа. Среди этих методов можно выделить 2 типа: это методы последовательного (или неконкурентного) анализа и конкурентного анализа.

Метод неконкурентного анализа связан с осуществлением двухстадийного процесса. На первой стадии антитела адсорбированные на нерастворимом носителе взаимодействуют с антигеном. Не связавшиеся компоненты отмывают и затем добавляют раствор, содержащий антитела, конъюгированные с ферментом. Вторая стадия процесса также завершается отмывкой не связавшихся компонентов реакционной смеси после чего в систему вводят соответствующий субстрат для осуществления индикаторной ферментативной реакции.

При конкурентном гетерогенном анализе присутствующие в реакционной среде одновременно связанные и несвязанные с ферментативной меткой антигены (гаптены) вступают в конкурентное взаимодействие с иммобилизованными на твердом носителе антителами. После инкубации избыток не связавшихся компонентов отмывают и в систему добавляют соответствующий субстрат.

Вторым этапом является внесение в лунки планшета с адсорбировавшими антителами определяемого соединения (антигена) и раствора коньюгата, представляющего собой молекулы антигена, химически меченые молекулами фермента. В течение некоторого периода инкубации происходит адсорбция как меченых, так и немеченых антигенов. Поэтому после отмывки буферным раствором на поверхности носителя останутся как меченые, так немеченые (определяемые) антигены, соотношение которых зависит от исходной концентрации антигенов определяемого раствора.

Четвертым этапом является добавление в лунки планшета фиксирующего реагента прекращающего ферментативную реакцию.

Фильм.

11.4.2 ПЦР

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была открыта в 1983 г. и с тех пор стала одним из наиболее широко используемых методов молекулярной биологии для проведения научных и практических исследований. ПЦР - это процесс, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить нужную молекулу ДНК в исследуемой пробе в присутствии миллионов других молекул. Метод основан на амплификации определенных участков ДНК, в результате чего за короткое время (1,5-2 часа) происходит увеличение количества специфических фрагментов ДНК в сотни миллионов раз.

ПЦР может выявлять участок ДНК который принадлежит вирусу или определенной мутации, при условии, что последовательность нуклеотидов этого участка известна.

Для проведения ПЦР-анализа не требуется культивированного инфекционного агента. Выявление специфического участка ДНК методом ПЦР прямо указывает на присутствие возбудителя. Вся процедура с момента приготовления пробы до электрофоретического анализа полученных в ПЦР фрагментов занимает 4-6 часов и позволяет анализировать до 20 проб в течение одного рабочего дня.

ПЦР позволяет анализировать

ПЦР позволяет выявить штаммы вируса циркулирующего в стаде. Т.е. можно отличить вакцинный штамм от полевого и т.д.

11.4.3 ИК фотометрия

В ИК диапазоне можно исследовать твердые вещества, что нашло практическое использование при зоотехническом анализе корма В настоящее время этот метод воплощен в семействе кормовых анализаторов, проводящих общий зоотехнический анализ корма до 10 - 15 показателей: общая питательность, обменная энергия, переваримый протеин, влажность, содержания кальция, фосфора, поваренной соли и т.д. в кормах. Этот процесс занимает около 3 мин. На одну пробу.

Размещено на Allbest.ru