Диагностика инфекционных заболеваний у животных

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования Тульской области

ГПОУ ТО «Сельскохозяйственный колледж «Богородицкий»

имени И.А. Стебута»

К У Р С О В А Я Р А Б О Т А

По разделу 5 Диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных ПМ.02 Участие в диагностике и лечении заболеваний сельскохозяйственных животных

Специальность 36.02.01 Ветеринария

Тема: ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний у животных

Обучающаяся группы 11 классов 1 курса Князева Анна

Руководитель работы Савастьянова Л.М

Богородицк. 2016 г.

Содержание

Введение

1. История открытия ПЦР

2. Принцип ПЦР

3. Преимущества метода ПЦР

4. Ограничения метода ПЦР

5. ПЦР как экспресс-метод диагностики инфекционных заболеваний

6. Техника исполнения

6.1 Забор материала для ПЦР-исследования

6.2 Выделение ДНК из образцов

6.3 Проведение полимеразной цепной реакции

7. Применение методов ПЦР-диагностики в ветеринарии

7.1 Диагностика гриппа птиц

7.2 Диагностика хламидиозной инфекции у животных

7.3 Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота

7.4 Диагностика лейкоза кошек

7.5 Диагностика аденовироза и гепатита собак

Заключение

Список источников

Введение

ДНК-диагностика - это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования. ДНК-анализы широко применяются в диагностике инфекционных заболеваний, позволяя обнаруживать даже единичные микроорганизмы в организме человека.

ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самый распространенный из них - метод ПЦР (полимеразной цепной реакции, Polymerase chain reaction, PCR diagnostics) .

На сегодняшний день ПЦР -анализ является одной из наиболее распространенных и динамично развивающихся технологий лабораторной диагностики. Ежегодно на рынке появляется все больше тест-систем, предназначенных для выявления как возбудителей различных заболеваний, так и мутаций генов человека, животных и растений. Количество ПЦР-лабораторий неуклонно увеличивается, а ПЦР-анализ становится все более востребованным среди специалистов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой и хронической стадии, так и задолго до того, как заболевание может себя проявить. полимеразный цепной реакция инфекционный

Метод ПЦР был разработан в 1983 году Кэри Мюллисом, за что он был удостоен Нобелевской премии в 1993 году. Изначально метод использовался в основном для научных целей, но затем, разглядев его перспективность и эффективность, метод стали продвигать в практическую медицину.

За генетическую информацию в живом организме любого размера отвечает ДНК -- двухспиральная дезоксирибонуклеиновая кислота, состоящая из последовательности четырех нуклеотидов, которые принято обозначать буквами А (аденин), Г (гуанин), Т (тимидин) и Ц (цитозин). Одно из основных правил генетики - правило комплементарности, то есть нуклеотиды соседних спиралей ДНК соединяются только в определеном порядке: А с Т, Г с Ц, и никак иначе.

У каждого живого создания (бактерия, вирус, рыба, зверь) - своя ДНК, причем для выявления конкретного организма достаточно иметь лишь небольшой участок этого хранилища генетической информации. Некоторые виды микроорганизмов, например, вирус иммунодефицита человека, хранят генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте - РНК, но и ее фрагменты можно находить с помощью ПЦР.

Именно на обнаружении этого небольшого, но уникального для каждого отдельного организма участка и построен принцип ПЦР. Для каждого возбудителя создан свой специфический генетический детектор, эталонный фрагмент ДНК, который по принципу комплементарности точно обнаруживает «свой» фрагмент ДНК и запускает реакцию создания огромного количества его копий.

Один цикл ПЦР длится около трех минут, количество копий растет в геометрической прогрессии. Таким образом, за несколько часов количество фрагментов увеличивается в несколько миллиардов раз. Понятно, что теперь определить, какой возбудитель у данной конкретной инфекции, достаточно легко.

1. История открытия ПЦР

История открытия ПЦР-амплификации ДНК - блестящий пример эпохального изобретения, сделанного гениальным одиночкой; причем идея осенила изобретателя мгновенно и, как кажется, абсолютно непредсказуемо. Более того, свое авторство ему пришлось отстаивать (и удалось отстоять!) в нелегких сражениях.

Рис. 1. Кари Маллис, лауреат Нобилевской премии по химии (1993 год).

Если вкратце - дело было так. Весной 1983 года, в пятницу вечером, Кари Маллис, 39-летний химик-синтетик из мало кому тогда известной калифорнийской биотехнологической фирмы Cetus, направлялся после работы домой. По пути он размышлял о том, как повысить точность идентификации точечных мутаций в геномной ДНК с помощью недавно предложенного метода олигомерной рестрикции. Суть метода состояла в энзиматическом удлинении олигонуклеотида, наплавленного на участок ДНК, прилегающий к участку мутации. Если дезоксинуклеотиды («кирпичики», из которых построена ДНК) добавлять в реакцию не все сразу, а по одному, то удлинение олигонуклеотида будет происходить только тогда, когда добавляемый дезоксинуклеотид комплементарен участку мутации. Анализируя результаты реакции, можно было выявлять наличие конкретной мутации в данном гене. (Замены одного нуклеотида на другой в молекулах ДНК происходят часто и иногда приводят к тяжелым последствиям, поскольку они могут нарушать структуру гена или регуляцию его активности. Такие мутации для многих важных генов картируют - устанавливают их точное расположение, - а затем изучают их генетические и биохимические последствия.)

Метод неплохо работал на относительно короткой ДНК, когда исследуемый ген был уже выделен, то есть когда его доля в общей массе ДНК была сравнительно высокой. Однако при исследовании огромной по длине геномной ДНК чувствительность метода была явно недостаточной, ибо концентрация данного гена оставалась крайне низкой.

Маллис размышлял о том, как повысить чувствительность и специфичность этой реакции. Как он сам писал впоследствии, для того чтобы решить проблему, ему нужно было увеличить количество ДНК исследуемого гена. В мысленном эксперименте он увидел, что точность метода можно повысить, если в дополнительной пробирке провести аналогичную дополняющую реакцию, то есть наращивать олигонуклеотид с другой стороны мутации, используя еще один праймер, располагающийся на комплементарной цепи ДНК. Если данные двух этих экспериментов будут согласовываться, то, по крайней мере, вдвое надежней можно будет судить о наличии или отсутствии мутации в исследуемом участке гена.

Он крутил эту идею и так, и этак, и вдруг его осенила светлая мысль: если реакцию с двумя такими праймерами-олигонуклеотидами проводить не в двух, а в одной пробирке, то количество фрагмента ДНК, ограниченного олигонуклеотидами, увеличится вдвое. Если реакцию повторить - вчетверо! Если ее провести 20 раз (это несложно, поскольку один ее цикл занимает несколько минут) - количество окруженного олигонуклеотидами фрагмента возрастет в миллион раз. А если повторить реакцию 30 раз - в миллиард раз. Это означало, что теперь фрагменты геномной ДНК, в том числе и гены, можно будет выделять не за годы упорного и кропотливого труда, а всего за один день!

«Это изменило бы молекулярную биологию», - подумал тогда Маллис. Идея показалась ему настолько красивой, что он остановил машину, зашел в придорожный киоск, купил ручку, бумагу и стал подсчитывать, сколько же в придуманной им реакции получается ДНК. Все сходилось - метод должен работать и продуцировать огромные количества специфической ДНК. Одновременно Маллису стало мниться маловероятным, чтобы эта идея, теперь казавшаяся очевидной, уже не приходила в чью-либо голову. Чтобы найти ошибку в своем рассуждении, во время уик-энда Малис «исписал формулами все горизонтальные поверхности в своем загородном доме». И, как поведал позднее в Нобелевской лекции, все выходные промучился жесточайшими перепадами настроения от абсолютного восхищения мощью собственного интеллекта и своей удачливостью - и до полнейшего отчаяния при мысли о том, что где-то в рассуждениях он не видит очевидной ошибки. А она должна была присутствовать, ибо идея очевидна, ведь все этапы реакции по отдельности уже были опробованы тысячами молекулярных биологов и постепенно становились лабораторной рутиной.

В понедельник рано утром Маллис помчался на работу (что, как он сам отмечал, случалось с ним крайне редко), чтобы в библиотеке выяснить, не опубликовал ли кто-нибудь статьи на эту тему. Каковы же были его удивление и восторг, когда он понял, что ничего подобного в научной литературе еще описано не было!

И через несколько месяцев, а именно 16 декабря 1983 года, перепробовав со своим сотрудником и учеником Фредом Фалуной множество экспериментальных подходов, Кари Маллис осуществил первую успешную реакцию ПЦР - полимеразную цепную реакцию амплификации ДНК (по-английски - PCR, Polymerase Chain Reaction). И она действительно произвела революцию в современной молекулярной биологии. А вскоре нашла применение в областях, весьма далеких от академической науки.

2. Принцип ПЦР

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) является универсальным носителем генетической информации у всех существующих на Земле организмов (исключение - РНК-содержащие микроорганизмы). ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из соединенных последовательно нуклеотидов. Нити ДНК имеют противоположную направленность: 5'-концу одной нити соответствует 3'-конец второй нити. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться. В живой клетке этот процесс происходит следующим образом: с помощью специальных ферментов - гираз происходит расплетение спирали в том ее участке, где должна происходить репликация. Далее водородные связи, связывающие нити, разрываются и нити расходятся. Одна из цепей (“+” или смысловая) используется в качестве основной матрицы. Построение новой нити ДНК идет только в одном направлении - от 5'-конца к 3'-концу.

Рис. 2. Раскручивание цепи ДНК.

Этот процесс осуществляется по принципу комплиментарности ферментом ДНК-полимеразой. Для того чтобы фермент начал свою работу, требуется наличие стартового блока - небольшого начального двухцепочечного фрагмента. Стартовый блок образуется при взаимодействии небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК, называемого праймером, с комплиментарным участком соответствующей цепи родительской ДНК. Репликация одновременно идет и на второй нити ДНК (“-” или антисмысловой), только наращивание цепи происходит в обратном направлении.

Рис. 3. Исходные компоненты ПЦР.

В результате процесса репликации из одной молекулы ДНК образуется две молекулы ДНК, в которых одна нить от материнской молекулы ДНК, а вторая, дочерняя, вновь синтезированная. Таким образом, цикл репликации ДНК включает в себя три основные стадии: 1) расплетение спирали ДНК и расхождение нитей (денатурация); 2) присоединение праймеров; 3) достраивание цепи дочерней нити. В ПЦР эти процессы осуществляются в пробирке в циклическом режиме. Переход от одной стадии реакции к другой достигается изменением температуры инкубационной смеси. При нагревании раствора до 93-95оС происходит денатурация ДНК.



Рис.4. Первый цикл амплификации.

Для перехода к следующему этапу - присоединению или “отжигу” праймеров - инкубационную смесь охлаждают до 50-65оС. Далее смесь нагревают до 70-72оС - оптимум работы taq-ДНК-полимеразы - на этой стадии происходит достраивание новой нити ДНК. Далее цикл повторяется снова. Поскольку наращивание дочерних нитей ДНК должно идти одновременно на обеих цепях материнской ДНК, то для репликации второй цепи также требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера: один для “+”-цепи, второй для “-”-цепи.

Присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Длина такого фрагмента, который называется ампликоном, обычно составляет несколько сот нуклеотидов. Разработка праймеров для ПЦР является самым ответственным звеном в создании диагностикума. Требуется подобрать такой фрагмент молекулы ДНК, который бы отличался генетической консервативностью и присутствовал бы только у интересующего вида микроорганизмов или в исследуемом гене. При этом длина такого фрагмента должна составлять 15-30 нуклеотидов.

Рис. 5. Второй цикл амплификации.

Проделать эту работу помогают специальные компьютерные программы, использующие информацию о нуклеотидной последовательности известных микроорганизмов или генов. Получить подобную информацию можно из международных компьютерных банков данных (Gen bank, EMBL) через сеть Internet. Синтез праймера по заданной последовательности нуклеотидов не представляет технической сложности и осуществляется в автоматических синтезаторах. Остальные компоненты ПЦР: дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ) в эквивалентных концентрациях 200-500 мкм; магний, необходимый для работы taq-полимеразы (2-3 мМ); трис-HCl-буфер рН 6,8-7,8.

Рис. 6. Амплификатор

Сейчас реакция ПЦР-амплификации - рутинный и ежедневный инструмент в каждой молекулярно-биологической лаборатории. Применяя специфические олигонуклеотидные праймеры (все дело именно в этом), варианты метода теперь используют не только в молекулярной биологии и биотехнологии, но и в медицине (например, для идентификации микроба или вируса по его ДНК, для контроля излечения пациента от инфекционного заболевания, идентификации типа мутации в геномной ДНК при анализе наследственных заболеваний). Находит применение эта реакция и в криминалистике для идентификации личности по ДНК-содержащим жидкостям и тканям (модификацию исходного метода криминалисты назвали в стиле своей профессии - «геномная дактилоскопия»). Используется она и для установления отцовства, степени родства, популяционных исследований - словом, везде, где нужно установить для той или иной цели уникальную последовательность ДНК, опираясь на минимальное количество исходного ДНК-содержащего материала: капельку крови, мочи, соскоб с ткани, отдельный волос.

3. Преимущества метода ПЦР

1. Прямое определение наличия возбудителей. Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

2. Высокая специфичность. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от иммунологических методов анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

3. Высокая чувствительность. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-анализ обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-100 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - 103 -105 клеток).

4. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.

5. Высокая скорость получения результата анализа. Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-5 часов.

6. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.).

4. Ограничения метода ПЦР

1. Перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов;

2. Контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, т.к. в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации.

Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхности лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложноположительных результатов.

Как правило, определить источник контаминации бывает очень трудно и требует значительных затрат времени и средств. Накопленный к настоящему времени опыт работы лабораторий, использующих метод ПЦР для диагностики позволяет сформулировать основные требования к организации таких лабораторий и проведению самих анализов. Соблюдение данных требований позволяет исключить возможность контаминации и получения ложноположительных результатов.

5. ПЦР как экспресс-метод диагностики инфекционных заболеваний

В настоящее время максимально ранняя диагностика возбудителей инфекций является важнейшим принципом контроля за их распространением. Обнаружение и идентификация возбудителей инфекционных заболеваний животных и птиц представляет собой одну из наиболее важных задач ветеринарной бактериологии и вирусологии. Решение этой задачи обеспечивается богатым арсеналом методических приемов, - начиная от клинических методик вирусологического и бактериологического тестирования и кончая иммунохимическими и молекулярно - биологическими методами.

Некультивируемость микроорганизмов - главная причина, по которой культуральный метод все более и более теряет свои позиции по мере появления альтернативных подходов. При этом под некультивируемостью мы понимаем, как невозможность на современном уровне развития микробиологии подобрать условия культивирования для большинства микроорганизмов, существующих в природе (по некоторым данным эта цифра может достигать 99%), так и невозможность высеять хорошо культивируемый микроорганизм из какой-либо биологической среды, содержащей ингибиторы его размножения. Кроме того, целый ряд клинически важных бактериальных возбудителей животных может плохо культивироваться из-за широкого применения в современной ветеринарной лечебной практике антибиотиков широкого спектра действия. Помимо этого, для многих возбудителей культуральный метод представляет собой трудоемкую, длительную и дорогостоящую процедуру. В то же время традиционные серологические тесты: РСК, РДП, РГА, а порой и наиболее перспективные методы диагностики - иммуноферментный анализ (ИФА) и иммунноблотинг (ИБ), оказываются фактически неэффективными или принципиально неприемлемыми для выявления инфекционных возбудителей по причине, главным образом, их низкой чувствительности.

Особую диагностическую ценность ДНК-анализ приобретает при тех наследственных болезнях, при которых неизвестен биохимический дефект, лежащий в их основе, и которые поэтому не могут быть выявлены традиционными методами лабораторной диагностики. Кроме того, этот метод практически незаменим в тех случаях, когда патологический ген оказывает свое действие только в тканях, которые недоступны для исследования (мозг, печень). Ключом к расширению клинического применения достижений современной молекулярной генетики являются не только разработка методов рекомбинантной ДНК, но и значительное упрощение технологии проведения ДНК-анализа, повышение чувствительности, быстроты и надежности методов с их последующей автоматизацией. Остановимся теперь более подробно на основных этапах технологии анализа. Получение и хранение ДНК. Геномную ДНК выделяют с помощью многоступенчатых методов из тканей, содержащих ядерные клетки, в том числе из лимфоцитов периферической крови, лимфобластоидных клеточных линий, а также из амниоцитов и ворсин хориона плода, полученных путем биопсии. Кровь для исследования берут в количестве около 10 мл с антикоагулянтом: цитратом, глюкозоцитратным раствором (глюгициром) или ЭДТА.

Инфекционная патология в ветеринарии охватывает широкий круг болезней, различных как по характеру течения (острые, хронические, латентные), степени распространения (от спорадических случаев до эпизоотии), так и по сложности их диагностики. Важное, а при некоторых болезнях решающее значение имеют серологические исследования, направленные на выявление антител, вырабатываемых организмом животного в ответ на внедрение инфекционного агента или вакцины. Несмотря на ряд достоинств, методы, основанные на этом принципе, обладают недостаточной чувствительностью и специфичностью. Существенный прорыв был сделан в последние годы, когда для диагностических целей привлекли методы генной инженерии и биотехнологии. Для диагностики инфекционных заболеваний наибольшее применение нашёл способ амплификации (умножения) нуклеиновых кислот: полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция, NASBA-метод и др. Активное развитие и внедрение метода ПЦР в диагностическую практику позволило продемонстрировать ос-новные достоинства и эффективность этой реакции, обнаружить недостатки и выработать подходы для их преодоления.

ПЦР в лабораторной диагностике инфекций характеризуется быстротой, непревзойдённой чувствительностью и высокой специфичностью, что позволяет обнаруживать микроорганизмы, присутствующие в очень низких концентрациях (1-10 возбудителей в пробе). При этом ДНК инфекционных агентов может быть достаточно эффективно экстрагирована из любой биологической жидкости или ткани, а также из проб объектов окружающей среды (почвы, воды и т.д.) и продуктов питания. Полимеразная цепная реакция эффективна при обнаружении бактериальных, грибковых, паразитарных и вирусных патогенов.

Одним словом, это метод, основанный на принципе амплификации, -- изолированного умножения гена или его определённого фрагмента. Амплификация -- один из способов выживания микроорганизмов и клеток животных в условиях действия противоопухолевых и противобактериальных препаратов. ПЦР позволяет проводить ана-логичный процесс in vitro, то есть в пробирке.

В настоящее время разработан ряд подходов, повышающих специфичность реакций. Часто с этой целью применяется так называемая «Nested PCR» (гнездовая ПЦР). Принцип данного метода заключается в использовании двух пар праймеров, одна из которых способна амплифицировать внутренний участок ампликона, полученного после первого раунда, с внешней парой праймеров. Применение гнездовой ПЦР имеет преимущества: высокая чувствительность методики; отсутствие необходимости использовать другие методы. К недостаткам относят перенос продуктов реакции из одной пробирки в другую, что существенно снижает концентрацию ингибиторов, а также приводит к появлению большого количества ложноположительных результатов вследствие перекрёстной контаминации проб продуктами амплификации.

В последние годы для повышения чувствительности и специфичности реакции используется «горячий старт». Суть его заключается в том, что прежде чем добавлять Taq-noлимеразу, реакционная смесь прогревается предварительно до 95° С. Это исключает возможность образования неспецифических фрагментов вследствие неспецифического отжига праймеров при температуре ниже оптимальной.

Механизм простой полимеразной цепной реакции непригоден для идентификации рибонуклеиновых кислот (РНК), так как Taq-noлимераза неспособна катализировать синтез ДНК на матрице РНК. Вместе с тем хорошо известно, что геномы многих вирусов состоят из молекул рибонуклеиновых кислот (РНК), и вследствие этого актуальна идентификация РНК-вирусов. Практически это решается с помощью нескольких приёмов, в частности использования дополнительного фермента -- РНК-зависимой ДНК-полимеразы -- обратной транскриптазы (RT -- reverse transcriptase). Реакция, катализируемая этим ферментом, приводит к образованию однонитевых фрагментов ДНК, используемых в дальнейшем в амплификации с помощьюTaq-полимеразы.

Как было отмечено выше, Taq-пoлимераза неспособна катализировать процесс обратной транскрипции, то есть синтез однонитевой ДНК на РНК-матрице. В 1991 году Маерсом и Гельфандом охарактеризован фермент ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, выделенной из другого экстремального термофила Thermusthermophilus (Tth-полиме-раза), который в присутствии ионов магния и хелаторов ионов марганца позволял ферменту катализировать обычную ДНК-зависимую ДНК-полимеразную реакцию. Этот фермент мог быть использован для одновременного синтеза комплиментарных однонитевых фрагментов ДНК и амплификации.

6. Техника исполнения

Следует отметить, что для получения достоверного результата ПЦР-анализа необходимым условием является соблюдение правил отбора, хранения и транспортировки клинического материала. Несмотря на то, что ПЦР является очень чувствительным методом, желательно наличие определенного количества возбудителя в пробе.

6.1 Забор материала для ПЦР-исследования

Взятие материала для ПЦР-исследования следует проводить в одноразовых неталькованных перчатках (так как тальк угнетает ПЦР). При взятии соскобов и смывов следует пользоваться одноразовыми стерильными зондами с повышенной адсорбцией (имеющими на конце щеточку), так как они отбирают оптимальное количество материала.

Соскобы и смывы со слизистых оболочек носа, ротовой полости, влагалища, конъюнктивы отбирают в одноразовые пластиковые микропробирки - эппендорфы - объемом 1,5 мл, в которые разлито по 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Желательно не использовать зонды с ватными наконечниками. Следует также избегать отламывания кончика зонда в пробирку с физиологическим раствором, так как это затрудняет дальнейшую обработку и повышает риск перекрестной контаминации проб. Для получения необходимого количества материала достаточно вращать зонд в пробирке в течение 1-2 минут, избегая разбрызгивания жидкости. Проба должна быть мутной на вид, а при отстаивании в ней должен образовываться небольшой осадок.

Забор крови проводят одноразовой иглой в одноразовый шприц или в стеклянную пробирку без антикоагулянта. При заборе в шприц, кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую стеклянную пробирку. Возможно использование вакуумных систем («Vacuette») для забора крови. Для исследования можно предоставить сыворотку крови: пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 минут до полного образования сгустка, затем центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 10 минут и переносят в количестве не менее 1 мл в стерильные эппендорфы объемом 1,5 мл.

Сперму отбирают в стерильные одноразовые пробирки или флаконы.

Моча. Отбирают первую порцию утренней мочи в количестве не менее 20-40 мл в стерильный сухой флакон или пробирку.

Фекалии. Отбирают пробы массой 1-3 грамма из предварительно продезинфицированного и вымытого лотка, одноразовыми лопаточками переносят в стерильный флакон.

Кусочки пораженных органов от павших животных отбирают в стерильные одноразовые контейнеры или в чистые стеклянные или пластиковые емкости.

Следует строго соблюдать температурные режимы хранения и транспортирования отобранного материала. Транспортирование осуществляют в термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом. При хранении материала более суток его необходимо заморозить при Т минус 20°С.

6.2 Выделение ДНК из образцов

Способ выделения ДНК зависит как от вида определяемого возбудителя, так и от вида клинического образца. В случае соскоба эпителиальных клеток, клеточного осадка мочи широкую распространенность получил метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении лизирующего агента, содержащего раствор гуанидина, сорбции ДНК на сорбенте, многократной отмывки и ресорбции ДНК буферным раствором. В случае обработки сыворотки, плазмы или цельной крови обычно используется метод фенольной экстракции. Метод включает депротеинизацию фенолом/хлороформом с последующим осаждением ДНК (или РНК) этанолом илиизо-пропанолом.Обработка производится в микроцентрифужных пробирках типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл. Время обработки составляет 1,5?2 часа. Детально способ выделения ДНК/РНК из образцов описывается в инструкции по использованию соответствующих наборов реагентов.

6.3 Проведение полимеразной цепной реакции

Определенное количество образца из обработанной клинической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 0,2 или 0,5 мл. В эту же пробирку добавляется амплификационная смесь, состоящая из воды, ПЦР-буфера, раствора дНТФ, раствора праймеров и раствора Taq-полимеразы(добавляется в смесь в последнюю очередь). Как правило, объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Затем в каждую пробирку добавляется одна капля минерального масла для предотвращения испарения реакционной смеси в процессе амплификации. Пробирки переносятся в программируемый термостат (амплификатор) и проводится амплификация в автоматическом режиме по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции. Время проведения реакции в зависимости от заданной программы составляет 2?3 часа. Параллельно с опытными пробами ставятся контрольные: положительный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала клинического образца вносится контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя. Отрицательный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата ДНК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемой ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК или клеток возбудителя вследствие контаминации и исключить учет ложноположительных результатов.

Некоторые тест-системы допускают осуществление одновременного определения нескольких инфекций в одной реакции амплификации, если для определяемых инфекций совпадают программы проведения реакции. Следует, однако, отметить, что в этом случае чувствительность реакции уменьшается пропорционально разбавлению. Поэтому, рекомендуется одновременно определять не более трех инфекций за одну реакцию.

Количество циклов амплификации и температурный режим указаны в инструкции к используемой тест-системе. Обычно число циклов выбирается в диапазоне от 30 до 40. Проведение более 40 циклов амплификации нежелательно, так как при этом значительно увеличивается количество неспецифических продуктов

7. Применение методов ПЦР-диагностики в ветеринарии

7.1 Диагностика гриппа птиц

Среди методов лабораторной диагностики гриппа птиц наиболее эффективным считается метод полимеразной цепной реакции. Используя праймеры к НА, NA и М-генам различных субтипов вируса гриппа, Zhang W. и Evans D.N. (1991 г.) впервые продемонстрировали возможность детекции вирусов. Однако исследования были выполнены на музейных штаммах.

Главными преимуществами ПЦР в сравнении с методами культурального подхода являются его более высокая чувствительность, быстрота и безопасность для персонала. При сравнении с серологическими методами ПЦР существенно выигрывает, поскольку позволяет выявлять вирусы гриппа на самых ранних стадиях, задолго до появления антител.

Кроме явных диагностических преимуществ, его дополняют методом секвенирования ДНК, и тогда он является универсальным молекулярно-генетическим подходом к определению большинства биологических свойств вирусов гриппа птиц, позволяющим выявлять родство циркулирующих штаммов, предсказывать его опасность для человека и эффективность противовирусной терапии.

Рис. 7. Взятие материала для ПЦР-диагностики гриппа птиц.

7.2 Диагностика хламидиозной инфекции у животных

Хламидиозная инфекция широко распространена практически среди всех видов млекопитающих и наносит существенный экономический ущерб различным отраслям животноводства, вызывая гибель животных, патологию их воспроизводительных органов, аборты, рождение мёртвого или нежизнеспособного приплода.

Больные животные часто становятся источником инфекции работников хозяйств, что приводит к возникновению эпидемических вспышек. Распространённость возбудителей хламидиозов в природе среди диких животных и особенно птиц представляет постоянную угрозу спорадических заболеваний для людей, профессионально не занятых в сельском хозяйстве.

Длительное время общепризнанным эталоном для прямых методов выявления хламидий считается выделение возбудителя в культуре клеток. Однако метод имеет недостатки, существенно затрудняющие его широкое использование в практической ветеринарии. Прежде всего высокий риск инфицирования персонала, а следовательно, необходимость проведения работ по выделению возбудителя в специальной режимной лаборатории.

Кроме того, культуральный метод трудоёмок и занимает много времени. Несмотря на то, что для высева патогена подходит практически любой материал от инфицированного животного, успех исследования во многом зависит от скорости транспортировки проб в лабораторию и соблюдения условий доставки образцов (специальные транспортные среды, охлаждение, добавление антибиотиков, предварительная очистка материала от токсичных веществ и т.д.).

С учётом этих недостатков были разработаны альтернативные тесты, такие, как определение антигена методами иммуноферментного анализа (ИФА), прямой иммунофлуоресценции (МФА), а также экспресс-методами.

Вместе с тем для ИФА-детекции антигенов так же, как и для культурального метода, характерны низкая чувствительность и специфичность. Учитывая, что при проведении метода иммунофлуоресценции для достоверного выявления хламидий необходимо обнаружить определённое число элементарных телец во всём исследуемом образце, чувствительность анализа зависит от опыта работы лаборанта.

В настоящее время одним из наиболее перспективных следует считать метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для диагностики хламидиозов человека и животных он был впервые применён в 1989 году. Это быстрый и надёжный диагноз, своевременная эффективная терапия и научно обоснованная профилактика. Дополнительная информация о разновидности возбудителя, легко получаемая методом ПЦР, позволит проводить эпидемиологический контроль и предотвращать распространение опасных штаммов хламидий.

Мазки из глаз обычно используются для выделения, но организмы могут также быть обнаружены в мазках из влагалища, абортированных тканей и прямой кишки, хотя они редко используются для диагностики. Поскольку, организм является внутриклеточным, необходимо получить хорошее качество мазков из глаз, которые включают клетки коньюнктивы. Другие техники для демонстрации организма менее чувствительны и менее надежны, в сравнении с PCR. Тесты на хламидийный антиген, основанные на выявлении группоспецифичного антигена, с использованием ELISA или схожих технологий доступны. Также возможно окрашивание смывов с коньюнктивы по методу Гимза для выявления включений, но эта техника очень ненадежна для диагностики, поскольку хламидийные включения могут быть спутаны с другими базофильными включениями.



Рис. 8. Взятие мазка из глаз кошки для проведения ПЦР-диагностики на хлимидийные инфекции.

7.3 Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота

Среди инфекционных болезней животных туберкулёз крупного рогатого скота занимает особое место. Туберкулёз своеобразен тем, что долгие годы может протекать в латентной форме, не проявляя клинических признаков, не влияя на продуктивность и жизнедеятельность животных. Туберкулёз легко и быстро распространяется среди поголовья крупного рогатого скота, но искореняется с большим трудом. Резервуар инфекции так разнообразен и обширен, что мероприятия по борьбе с туберкулёзом крупного рогатого скота не могут ограничиться только этим видом животных, а должны охватить всех домашних и диких животных, а также объекты в нашей среды. Против туберкулёза нет достаточно эффективных средств лечения и специфической профилактики. Поэтому важнейшим звеном в проведении профилактических и оздоровительных мероприятий является своевременное и точное выявление больных туберкулёзом животных

Сегодня основным массовым и доступным в ветеринарной практике методом прижизненной диагностики туберкулёза является внутрикожная туберкулиновая проба с применением ППД-туберкулина для млекопитающих. Однако данный тест имеет известные недостатки: длительный срок выявления заболевания; возбудитель туберкулёза при посеве патолого-анатомического материала растёт медленно; колонии микобактерий туберкулёза бычьего вида появляются только через 20-60 дней, а птичьего -- через 15-30 дней посева. При адаптации к питательной среде скорость роста может возрастать.

При диагностике туберкулёза ПЦР-метод применяют в случае получения положительных результатов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяйствах. Кровь всех животных анализируют при введении туберкулина. Также полимеразную цепную реакцию целесообразно применять при изучении патматериала от убитых животных для диагностики и идентификации культур М. Bovis и М. Tuberculosis с другими видами микобактерий.

В заключение следует отметить, результаты ПЦР-анализа, как и другие диагностические тесты in vitro, необходимо рассматривать с учётом данных, полученных традиционными методами.

Для рационального использования ПЦР в клинической практике нужно определить её место, учитывая специфику поставленных задач и экономическое обоснование для решения тех или иных проблем.

Для ПЦР-исследований используются тест-системы: «МТБ-КОМ» и «МТБ-KOM-FRT» производства ФГУ ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (ЦНИИЭ), «Тест-система для выявления и дифференциации возбудителей туберкулёза M.bovis и M.tuberculosis» производства НПО НАРВАК (НАРВАК), «ДиаГен-Mycobacteria» производства ЗАО ЛАГИС (ЛАГИС), «GenePak DNA PCR test Mtu+bo» производства ООО Компания БИОКОМ (БИОКОМ), «Тест-система для выявления и дифференциации возбудителей туберкулёза M.bovis и M.tuberculosis» производства Института молекулярной генетики РАН (ИМГ). Использование ПЦР-диагностики туберкулеза крупного рогатого скота значительно сокращает временные затраты в сравнении с традиционными методами диагностики этого заболевания.

7.4 Диагностика лейкоза кошек

Вирус лейкемии кошек (FeLV) относится к г-ретровирусам, распространенных по всему миру. Впервые возбудитель был обнаружен с помощью электронной микроскопии в 1964 году [Jarrett et al., 1964 ]. К заболеванию кроме домашних кошек восприимчивы и дикие представители этого семейства, включая европейскую и иберийскую рысь.

Все ретровирусы, в том числе и вирус лейкоза (FeLV), являются РНК-содержащими и при репликации проходят стадию обратной транскрипции в ДНК, которая обычно интегрируется в геном клетки хозяина с помощью фермента интегразы [Temin & Mizutani, 1970]. Интегрированная ДНК называется провирусом. После того, как произошла обратная транскрипция, начинается синтез вирусных белков и сборка вирионов вблизи клеточной мембраны, а затем почкование вируса из клетки [Coffin, 1979]. Заражение клетки ретровирусом, как правило, не приводит к ее гибели.

Геном FeLV состоит из трех основных генов:

ENV - кодирует гликопротеин gp70 и трансмембранный белок p15;

POL - ген, кодирующий обратную транскриптазу, протеазу и интегразу, и группу специфических антигенов;

GAG - кодирует структурные белки вируса, включая p27 [Coffin, 1979].

Помимо, так называемого экзогенного вируса, у домашних кошек есть две формы эндогенных ретровирусов - эндогенный вирус лейкемии enFeLV [Soe et al., 1983] и вирус RD114 [Sarma et al., 1973].

Первый (enFeLV), как полагают, возник сотни тысяч лет назад от кошек, которые охотились на мышей, инфицированных мышиным вирусом лейкемии (MuLV), который был способен встроиться в геном клеток хищника. В результате этого вирус MuLV наследуется всеми потомками. Количество вируса enFeLV варьируется у разных пород кошек, в том числе у диких животных, и является постоянным явлением [Tandon et al., 2007]. Геном enFeLV не является полным и поэтому репликации вируса не происходит [Soe et al., 1983].

Вирус RD114 - это вирус приматов, возник сотни тысяч лет назад от предков кошек, которые охотились на ранних приматов, инфицированных этим вирусом [Barbacid с соавт., 1977]. Кошачьи клетки не восприимчивы к вирусу RD114, поэтому он не имеет патогенного потенциала для кошек.

Существует четыре подтипа вируса FeLV: A, B, C и T [Anderson et al., 2000; Russell & Jarrett, 1978], каждый из которых поражает определенный тип клеток, хотя иммунологически все подтипы тесно связаны. Подтип А распространен повсеместно. Подтип B произошел в результате рекомбинации вирусов FeLV и enFeLV. Подтип C является результатом мутации гена ENV, а подтип T имеет тропизм к Т-лимфоцитам.

Вирус лейкоза FeLV не долго может существовать вне организма хозяина и легко разрушается дезинфицирующими средствами, мылом, нагреванием и высушиванием. Передача вируса посредством контакта маловероятна. Вирус может недолго сохраняться во влажных условиях при комнатной температуре, так что есть возможность ятрогенной передачи через загрязненные иглы, хирургические инструменты или при переливании крови.

Так как каждая клетка кошки содержит от 12 до 15 копий генетического материала эндогенных вирусов FeLV, оказалось довольно трудно определить последовательности, специфичные для экзогенного провируса [Jackson et al., 1996]. Значение метода ПЦР в значительной степени возросло с появлением ПЦР в реальном времени, которая позволяет проводить количественный анализ провируса [Hofmann-Lehmann et al., 2001]. ПЦР анализ имеет самую высокую аналитическую и диагностическую чувствительностью с учетом того, что все лабораторные исследования выполняются в соответствии со всеми требованиями и в надлежащих условиях.

Проведение ПЦР для выявления провируса может быть полезным у кошек с отрицательным иммунохроматографическим тестом.

Выявление вирусной РНК стало новым аспектом в диагностике лейкоза [Tandon et al., 2005]. С помощью этого теста возможно обнаружить и провести количественный анализ вирусной РНК в цельной крови, сыворотке, плазме, слюне или фекалиях. Выявление РНК в ПЦР не дает ту же информацию, что и определение ДНК провируса. Достаточно много кошек, иммунная система которых преодолела виремию, но, тем не менее, они будут положительными на наличие провируса. У таких животных РНК вируса не будет определяться в крови, слюне и фекалиях [Gomes-Keller et al., 2006a]. Обнаружение вирусной РНК является надежным показателем вирусемии.

В большинстве случаев ПЦР анализ проводится индивидуально. Тем не менее, в определенных условиях, когда стоимость анализа высока, например, для тотального тестирования кошек в питомнике, можно использовать ПЦР для исследования объединенных проб, так как тест достаточно чувствителен для выявления одной инфицированной кошки в 30-ти объединенных пробах [Gomes-Keller et al., 2006b].

Рис. 9. Взятие материала для ПЦР-исследования на лейкоз кошек.

7.5 Диагностика аденовироза и гепатита собак

Инфекционный гепатит (вызываемый аденовирусом типа 1 (CAV-1) - острая контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, воспалением слизистых дыхательного и пищеварительного тракта, печени, и нарушением функции центральной нервной системы. Болеют собаки, лисы, койоты, волки, другие дикие собачьи, медведи. Обезьяны и человек могут быть скрытыми носителями вируса и источником заражения.

Аденовироз (вызываемый вирусом типа 2 (CAV-2) -- болезнь собак, протекающая как острая респираторная инфекция. Дикие собачьи являются резервуаром вируса. Возбудитель - собачий аденовирус-2, родственный аденовирусу-1, вызывающему инфекционный гепатит.

Тест система “Аденовир” предназначена для выявления ДНК аденовируса плотоядных первого типа, вызывающего гепатит плотоядных и ДНК аденовируса плотоядных второго типа, вызывающих аденовироз собак методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Позволяет не только выявлять, но и дифференцировать возбудители на CAV-1 и CAV-2.

Для исследования используют смывы с конъюнктивы, выделения из носа фекалии и кровь. Вирус в наибольшей концентрации находится в выделениях с конъюнктивы и слизистой носовой полости в первую неделю заболевания, а так же в каловых массах, при наличии расстройств желудочно-кишечного тракта.

В дальнейшем рекомендуется исследование крови, где содержание вируса более длительно и стабильно. Исследование крови позволяет выявлять животных -- вирусоносителей и хронические формы гепатита, которые могут привести к циррозу.

Таким образом, прижизненная диагностика гепатита плотоядных при остром и сверхостром течении болезни возможна только при применении ПЦР. Кроме того, выявление CAV-1, возможное только с помощью ПЦР, помогает определить причину поражения печени у хронически больных животных.

Рис. 10. Взятие материала для ПЦР-диагностики на аденовироз собак.

Заключение

В настоящее время диагностика инфекционных заболеваний животных в ветеринарии остается острой проблемой. Поскольку традиционные, классически рекомендуемые в учебниках и методических пособиях иммунологические реакции(РСКА, РИФ итд) остаются малодоступными и не нашли широкого применения в ветеринарной среде, то в арсенале выбора средств для диагностики у рядового ветеринарного врача образовался некий вакуум. Фактически зачастую работа по диагностике и лечению вирусных и бактериальных инфекций строится на основании одних лишь клинических проявления того или иного заболевания и личного опыта врача. При этом молодым врачам-недавним выпускникам ветеринарной академии или иных вет ВУЗов, приходится особенно сложно при постановке диагноза. Разумеется, рассчитывать на стопроцентную эффективность терапии в таких условиях невозможно. Но с появлением такого диагностического инструмента как ПЦР ситуация может быть радикально изменена в лучшую сторону, поскольку каждый ветврач и молодой и опытный может теперь или сформировать или скорректировать проводимое лечение, получив точный диагноз.

При проведении ПЦР-анализа ведется поиск такого фрагмента ДНК инфекции, который специфичен только для данного микроорганизма. Это значит, что этот фрагмент ДНК "особенный" - он встречается только у этого микроба (или группы родственных микробов), но не встречается ни у одного другого микроба.

Сама полимеразная цепная реакция используется для того, чтобы найденный фрагмент размножить, клонировать: чтобы однозначно "увидеть" эти фрагменты ДНК, к окончанию реакции их должно быть не мене 1012 фрагментов.

Использование метода ПЦР позволило провести дифференциацию условно-патогенных и патогенных штаммов в связи с их раз личной локализацией в организме и отличить состояние носительства от заболевания. Таким образом, данные проведенного исследования говорят о целесообразности использования метода ПЦР для постановки окончательного диагноза.

Список источников

1. Медикус.ру: http://www.medicus.ru/venereology/specialist/ispolzovanie-polimeraznoj-cepnoj-reakcii-pcr-v-klinicheskoj-praktike-22468.phtml

2. Ветклуб: http://www.vetclub.ru/content/view/43/5

3. Поводок: http://www.povodok.ru/care/rescuer/

4. Сайт ветеринара Васильева Александра Васильевича: http://veter96.ru/htmlpages/Show/zabolevaniya/infekcionnye-zabolevaniya/infekciya--chlamydophila-felis2

5. Вяянанен П. Диагностика хламидийных инфекций. В сб.: Диагностика и лечение хламидийных инфекций. М., 1987.

6. Ветеринарка.ру: http://www.veterinarka.ru/for-vet/pcr-diagnostika-virusnyh-i-bakterialnyh-infekcij-domashnih-zhivotnyh.html

7. Ж. «Химия и жизнь» №8, 2006, Телков М.В.: Кари Маллис, изобретатель ПЦР

8. Википедия: https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9C%D1%83%D0%BB%D0%BB%D0%B8%D1%81,_%D0%9A%D1%8D%D1%80%D0%B8

9. Медикал.ру: http://www.medicalj.ru/diacrisis/d-immunology/1018-pcr-diagnostika-analiz-na-infekcii

10. Лабораторная диагностика: http://www.ld.ru/PCR/ilist-4208.html

11. Ж. «Птицеводтво» № 4, 2009, Возможность применения ПЦР в ветеринарии

12. Бессарабов Б.Ф., Вашутин А.А., Воронин Е.С. и др.; Под ред. Сидорчука А.А. -- М.: КолосС, 2007.

13. Кондрахин И.П Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики, М.: КолосС, 2004.

14. Медведева М.А.: Клиническая ветеринарная лабораторная диагностика. Справочник для ветеринарных врачей под ред. Корнеева О.А., М.: Аквариум-Принт, 2013.

15. Институт генных технологий: http://www.igtech.ru/services/pcr-diagnostika/pcr-diagnostika/

Размещено на Allbest.ru

...