Производство аминокислот

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГБОУ ВПО Уральский государственный аграрный университет

Технологический факультет

Контрольная работа

по дисциплине Основы биотехнологии переработки сельскохозяйственной продукции

Выполнил студент 4 курса ГСП

заочного образования по направлению

«Технология производства и переработки

сельскохозяйственной продукции»

Зубарева Татьяна Владимировна

Проверила: к.б.н.,доцент

А.А. Баранова

Екатеринбург 2014г

Общая характеристика аминокислот и основных способов их получения

Среди наиболее важных для промышленности метаболитов можно выделить, прежде всего, аминокислоты, находящие применение во многих сферах производства: 1) в качестве пищевых добавок, например, лизином, триптофаном и треонином обогащают растительные белки, а метионин включают в блюда из сои; 2) в роли усилителей вкуса; 3) в медицине (лекарственные препараты, смеси для парентерального питания), а некоторые аналоги аминокислот используют в лечении психических заболеваний; 4) в химической и фармацевтической промышленности аминокислоты широко используют как предшественники в производстве детергенов, полиаминокислот, полиуретана и т.п.; 5) в сельском хозяйстве (кормовые балансирующие добавки).

Возможны три способа промышленного получения незаменимых аминокислот: гидролиз белков растительного и животного происхождения, химический и микробиологический синтез.

Более 60% всех производимых промышленностью чистых препаратов аминокислот получают путем микробиологического синтеза. На втором месте по объему производства находится химический синтез. Основным недостатком химического синтеза является получение смеси аминокислот, состоящей из изомеров, относящихся как к D- так и к L-ряду, тогда как биологической активностью в организме человека и животных обладают лишь L-изомеры, а D-изомеры аминокислот не перерабатываются их ферментными системами, кроме того, некоторые из них токсичны для человека и животных. Исключением в этом отношении является аминокислота метионин, у которой биологически активными являются как D, так и L-изомеры, в связи, с чем данная аминокислота производится преимущественно путем химического синтеза.

Технологии получения аминокислот за счет гидролиза белков экономически менее выгодны, поэтому они не получили широкого распространения.

Микробиологический способ производства аминокислот, дающий в настоящее время самые высокие технико-экономические показатели по сравнению с другими методами, включает не только биосинтез аминокислот высокоактивными штаммами-продуцентами (способными накапливать в культуральной жидкости не менее 60 г/л синтезируемой аминокислоты), но и технологические операции по получению различных товарных форм. При микробиологическом синтезе образуются только L-аминокислоты.

На всех этапах технологического процесса за время, прошедшее с момента его первой практической реализации в СССР (конец 60-х годов), был достигнут значительный прогресс:

- исследован широкий спектр сырьевых источников (меласса тростниковая и свеклосахарная, сахар-сырец, глюкозный сироп, фуражное зерно);

- расширена номенклатура производимых аминокислот (лизин, триптофан, глутаминовая кислота, лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин);

-освоены полупериодический, отъемно-доливной и непрерывный процессы биосинтеза аминокислот;

- разработаны математические модели и алгоритмы оптимального управления процессом биосинтеза аминокислот;

- освоено использование мембранных методов при выделении аминокислот;

- предложено применение энергосберегающих методов при получении готовых препаратов;

- достигнута экологическая безопасность производства аминокислот;

- подготовлены исходные данные на разработку АСУ ТП производства кристаллических аминокислот и их кормовых концентратов.

Достигнутые к настоящему моменту в лабораторных условиях показатели обеспечивают при наличии инвестиций создание конкурентоспособных производств перечисленных выше аминокислот. Унификация биотехнологии аминокислот позволяет производить их на типовой модульной технологической линии.

Чаще всего для микробиологического синтеза аминокислот используют ауксотрофные мутантные штаммы, которые получают обычными методами селекции или генной инженерии. С помощью мутагенных факторов у таких ауксотрофных штаммов индуцируется мутация, в результате которой прекращается или ингибируется синтез одного из продуктов, оказывающих регуляторное воздействие на ферментные системы, катализирующие образование данной аминокислоты, в результате чего концентрация этой аминокислоты в клетках мутанта и в культуральной жидкости повышается.

На основе культивирования микроорганизмов с целью получения чистых препаратов аминокислот применяют промышленные технологии, включающие одно- и двухступенчатый синтез аминокислот.

При одноступенчатом синтезе в промышленных культиваторах выращивают ауксотрофные регуляторные мутанты, являющиеся сверхпродуцентами тех или иных аминокислот. После завершения рабочего цикла их выращивания культуральную жидкость отделяют от клеток микроорганизмов, сгущают и получают из нее товарный продукт с высокой концентрацией синтезированной микробами аминокислоты.

В процессе двухступенчатого синтеза аминокислоты вначале получают ее предшественник (часто наиболее дешевым химическим синтезом), а затем с помощью ферментов, вырабатываемых микроорганизмами, превращают предшественник в аминокислоту, при этом образуется только L-изомеры. В качестве источника фермента могут быть использованы либо суспензия клеток микроорганизмов, либо полученный после разрушения этих клеток ферментный раствор.

Продуценты аминокислот

Как уже отмечалось выше, в качестве продуцентов аминокислот используют генетически измененные штаммы, обладающие способностью к сверхсинтезу аминокислот. Наиболее лучшими продуцентами аминокислот являются ауксотрофные мутанты, т.е. микроорганизмы, лишенные целого ряда ферментных систем, поэтому они очень требовательны к составу питательной среды, в которой должно присутствовать большое количество факторов роста. В качестве продуцентов аминокислот используют грамположительные бесспоровые бактерии рода Corynebacterium, рода Brevibacterium, рода Micrococcus.

Продуцирование аминокислот осуществляется внутри бактериальной клетки в виде свободных аминокислот, которые затем выделяют в окружающую среду. Наибольшее накопление аминокислот происходит в середине экспоненциальной фазы роста.

Производство аминокислот с помощью ауксотрофных мутантов

Секретом большинства производственных процессов с участием микроорганизмов является изменение условий среды: за счет этого и достигается синтез избыточных количеств желаемого продукта. Необходимого дисбаланса метаболизма добиваются путем эмпирического изменения следующих факторов: концентрация субстрата, рН, концентрации продукта или путем установления критических уровней содержания веществ (ионов металлов, органических добавок) в среде.

Секретом большинства производственных процессов с участием микроорганизмов является изменение условий среды: за счет этого и достигается синтез избыточных количеств желаемого продукта. Необходимого дисбаланса метаболизма добиваются путем эмпирического изменения следующих факторов: концентрация субстрата, рН, концентрации продукта или путем установления критических уровней содержания веществ (ионов металлов, органических добавок) в среде.

При переводе биологических процессов образования аминокислот на коммерческую основу были выработаны новые способы желаемых изменений метаболизма у организмов-продуцентов, направленных на увеличение выхода промежуточных продуктов, образование которых в иных условиях находится под строгим метаболическим контролем.

Для производства аминокислот бактерии стали использовать с начала 50-х гг., при этом штаммы бактерий постоянно улучшали генетическими методами, выделяя ауксотрофные мутанты и мутанты с измененными регуляторными свойствами. Для обеспечения образования аминокислот в больших количествах, в любом случае необходимо изменить систему регуляции обмена веществ: для этого можно либо стимулировать потребление субстрата на некоторых путях биосинтеза и выделение аминокислот в среду, либо подавить побочные реакции и процессы деградации аминокислот.

Производство таких аминокислот, как L-глутамат, L-валин и другие, при участии диких штаммов бактерий основано либо на использовании присущих этим бактериям особенностей метаболизма, либо на стимуляции образования аминокислот в ответ на изменение условий внешней среды.

Образовывать аминокислоты способны бактерии многих родов, причем они настолько продуктивны, что промышленное производство аминокислот становится рентабельным. Например, виды Corynebacterium или Brevibacterium, выращиваемые на углеродном сырье, на этиловом спирте или ацетате при наличии достаточного количества биотина в питательной среде способны синтезировать до 30 г/л глутамата. Для накопления этой аминокислоты важным условием является полное или частичное подавление активности б-кетоглутаратдегидрогеназы. Образование продукта увеличивается при добавлении в-лактамных антибиотиков, ПАВ и жирных кислот. Путем изменения условий среды процесс ферментации, в ходе которого образуется L-глутамат, может быть переключен на синтез L-глутамина или L-пролина. При высокой концентрации биотина и ионов аммония создаются благоприятные условия для образования L-пролина, а при больших концентрациях ионов аммония и цинка в слабо кислой среде усиливается синтез L-глутамина.

Ауксотрофные мутанты не могут образовывать ингибиторы метаболического пути, работающие по принципу отрицательной обратной связи, т.к. у них отсутствует определенная ключевая ферментативная реакция, поэтому при выращивании мутантного штамма в среде с минимальной концентрацией необходимого питательного ингредиента они способны образовывать избыточные количества вещества-предшественника.

Ауксотрофные мутанты находят применение и в тех случаях, когда необходимо синтезировать соединения являющиеся конечными продуктами разветвленных цепей метаболических реакций, так, например, L-аспартат является общим предшественником для L-лизина, L-треонина, L-метионина и L-изолейцина. Первая реакция в процессе образования этих аминокислот катализируется аспартокиназой, активность, которой может быть ингибирована по механизму отрицательной обратной связи при совместном действии L-лизина, L-треонина. У мутантов ауксотрофных по гомосерину или треонину (метионину) существенно уменьшается внутриклеточная концентрация L-треонина, что снимает блокаду с аспартокиназы и позволяет клеткам накапливать L-лизин.

Ауксотрофные мутанты способны накапливать конечные продукты неразветвленных путей биосинтеза. В таких случаях приходится отбирать мутанты с частично нарушенной регуляцией биосинтеза, что позволяет получить повышенный выход конечного продукта. Такие мутанты называются регуляторными, их отбирают по устойчивости к аналогам аминокислот или среди ревертантов ауксотрофов. В основе использования аналогов аминокислот лежит сходство с природными аминокислотами. Они ингибируют рост бактерий, но этот эффект может быть уменьшен путем добавления соответствующей аминокислоты. Таким образом, аналоги выступают в роли искусственных, работающих по принципу отрицательной обратной связи, ингибиторов ферментов, обеспечивающих биосинтез природных аминокислот и одновременно подавляют процесс включения их в белки. Появление мутантов, устойчивых к этим мощным ингибиторам, означает, что регуляторные ферменты соответствующего пути обмена становятся у них нечувствительными к аналогу. Для увеличения выхода можно воспользоваться как ауксотрофией, так и дефектами регуляции одновременно. Так, у Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum сверхпродукции L-треонина не наблюдается, т.к. не происходит сочетанного ингибирования по механизму отрицательной обратной связи аспартокиназы L-треонином, и L-лизином, а L-треонин ингибирует гомосеридегидрогеназу. Мутант, устойчивый к аналогу треонина синтезирует в избыточном количестве треонин, т.к. его ферменты ингибированные этой аминокислотой, десенсибилизированы. Гомосеридегидрогеназа и киназа, принимающие участие в синтезе треонина также «выключаются» L-метиокином, и поэтому ауксотрофы по метионину образуют L-треонин с еще большим выходом.

Регуляторные мутанты можно получить путем трансдукции: проводя отбор мутаций, вызывающих полное рассогласование регуляторных механизмов, а затем объединяя эти признаки путем трансдукции. Таким способом у одного штамма последовательно может быть закреплена устойчивость к нескольким аналогам.

Этапы биотехнологического получения глутаминовой кислоты

Продуцентами глутаминовой кислоты являются дрожжи и микроскопические грибы.

Стадии производства глутаминовой кислоты:

1. Приготовление питательной среды: в ее составе должны обязательно присутствовать источники углерода, т.е. глюкоза, крахмал и т.п., источники азота - мочевина, соли аммония или жидкий аммиак и др., биостимуляторы, витамины (биотин), кукурузный экстракт, экстракт кормовых дрожжей, пептон, сульфаты магния, марганца и железа.

2. Производственное культивирование: условия культивирования - рН 7,8 - 8, температура 28-30 °C, хорошая аэрация.

3. Освобождение целевого продукта из биомассы методом центрифугирования.

4. Концентрирование культуральной жидкости в выпарном аппарате до 40 -50 % АСВ (абсолютно сухого вещества).

5. Кристаллизация и последующее подкисление целевого продукта до рН 3,2 и охлаждение его до 15 °C.

Микробиологический синтез лизина

Общая характеристика лизина.

Лизин - алифатическая аминокислота (незаменимая аминокислота) с выраженными свойствами основания, имеющая молекулярную формулу: C6H14ClN2O2. Внешний вид: бесцветные кристаллы или белый порошок. Температура плавления: 224 °С. Лизин относится к числу соединений, которые живые организмы не производят самостоятельно, и должны получать в готовом виде для синтеза собственных структурных и функциональных белков. Источником лизина являются микроорганизмы и растения. При недостатке лизина наблюдается замедление роста и развития живых организмов.

Производство лизина для кормовых целей.

Требования к аминокислотам для животных хорошо определены в различных рекомендациях (в частности, в США это рекомендации NRC - National Research Council). Требования варьируются в зависимости от видов животных и их возраста. Чтобы удовлетворять требованиям аминокислоты должны поставляться в кормах или в виде протеинов, или в кристаллическом виде. Путём сравнения требований к реально присутствующим в кормах аминокислот можно получить последовательность ограничивающих аминокислот. В таблице ниже приведены ограничивающие аминокислоты в кормах для свиней и бройлеров, составленные из кукурузы (или зерна) и соевого шрота:

Последовательность ограничивающих аминокислот.

	Первая	Вторая	Третья
Растущая свинья	Лизин	Треонин	Триптофан
Бройлер	Метионин	Лизин	Треонин

Кристаллические аминокислоты должны быть добавлены в корм, когда количество содержащегося протеина в них уменьшается, а это в свою очередь является основной причиной почему метионин и лизин гидрохлорид изначально использовались в кормах. Теперь с использованием более экономичного источника треонина и триптофана использование аминокислот вошло в новую эру, в которой преодолены барьеры 2-й и 3-й ограничивающих аминокислот.

Вклад в поставку протеина.

Животноводство может быть определено как индустрия, производящая протеины большей стоимости из менее дорогих источников протеина (растительные протеины, такие, например, как соевый шрот). Чтобы отвечать растущему спросу на протеин во всём мире необходимо увеличить эффективность переработки протеинов из кормов в мясо. Аминокислоты для кормов в настоящее время играют важную роль в улучшении производства животного протеина и вклада в его растущие поставки.

Например, вклад лизина в поставки протеина может быть оценён таким образом: простейшие выражения ниже иллюстрируют замену источника протеина (соевого шрота) на фуражное зерно (или кукурузу) и лизин. 50 кг/Mт соевого шрота равно 48.5 кг/Mт кукурузы + 1.5 кг/Mт лизина. Такая замена позволяет на 2 % уменьшить уровень протеина в кормах. Это выражение означает, что 1 тонна лизина может сохранить 33 тонны соевого шрота. Оценочное использование лизина в мире составляет 550000 тонн/год, что соответствует сбережению 18 миллионов тонн соевого шрота, что равняется практически половине соевого шрота производимого в США (38 миллионов тонн в 2000 году)

Также надо решить, как с максимальной эффективностью использовать землю для поставок пищи. Для этого можно интерпретировать выражение выше следующим способом, чтобы показать, как лизин может улучшить эффективность утилизации культивируемых областей.

В расчётах принимается:

- Соя = 80 % соевого шрота;

- Кукуруза = 60 % кукурузного крахмала;

- Кукурузный крахмал = 50 % лизина.

Сравнение возделываемой земли требуемой для соевого шрота, кукурузы и лизина.

	Требуемая возделываемая площадь, в гектарах
Соевый шрот 50 Мт	24.0
Кукуруза 48.5 Мт	5.6
Лизин 1.5 Мт	0.6
Кукуруза + лизин	6.2

Эти значения показывают, что возделываемая площадь земли для производства 48.5 Мт кукурузы и 1.5 Мт L-лизина гидрохлорида занимают только четверть (1/4 часть) площади, занимаемой соей для 50 Мт соевого шрота.

Введение 2-го и 3-го пределов аминокислот может ещё более уменьшить использование бесценных источников протеина и возделываемых земель, требующихся для их производства. Для растущих свиней уменьшение объёмов использования соевого шрота будет около 100 кг/тонну корма в формулах с лизином, треонином и триптофаном, что в 2 раза больше количества для кормов только с лизином.

Краткая история лизиновой промышленности

Итак, наиболее дешевым и освоенным способом получения лизина является микробиологический метод. Впервые такое производство было налажено в Японии в середине 50-х гг.; затем в Голландии, потом в США, хотя эта страна меньше других нуждается в синтетической аминокислоте, т.к. выращивает много богатой лизином сои. Кстати, именно чтобы освободится от засилья американской сои, страны ЕЭС организовали крупную промышленную фирму «Евролизин». В нашей стране лизиновая промышленность родилась в 70-х гг. ХХ в.

Лизин можно получать и химическим путем - из капролактама, но этот процесс является сложным, многостадийным и дорогим; кроме того, он недостаточно эффективен еще и потому, что половина готового продукта - не L-лизин, а его оптический D-изомер, который не усваивается организмами, а разделить их очень трудно и дорого.

Из микроорганизмов лизин синтезируют бактерии, актиномицеты, сине-зеленые водоросли и т.п. Но нормально растущая клетка «вырабатывает» очень немного лизина, только для собственных нужд. В начале 50-х гг. японские ученые С. Киносита, К. Накаяма и С. Китада получили мутантные штаммы бактерий, способных к сверхсинтезу лизина; они вырабатывали немного больше аминокислоты, чем нужно им самим. Поначалу максимальная концентрация ее достигла 20 г в 1 л культуральной жидкости, а сейчас получены штаммы, способные вырабатывать до 60 г/л и более аминокислоты.

В настоящее время высокопродуктивные штаммы научились получать во многих лабораториях мира. Нормальные микроорганизмы облучают ультрафиолетовым светом, быстрыми нейтронами или обрабатывают этиленимином, а затем из возникших под действием этих агентов мутантных штаммов селекционеры отбирают наиболее «работоспособные».

У нас первые сверхпродуценты лизина вырастили в Институте биохимии им. А.Н. Баха АН СССР, но от лабораторных опытов до промышленного производства аминокислоты путь был не близким.

В СССР проблемой промышленного получения лизина занимались две группы ученых. Одна возникла в недрах Института атомной энергии им. И.В. Курчатова, где существовала лаборатория, которая изучала биологическое действие различных доз облучения; в ней работали биологи, биохимики, микробиологи и генетики. В числе других дел здесь велся также поиск микроорганизмов-продуцентов аминокислот, в том числе и лизина. Руководил работой лаборатории С.И. Алиханян. Было организовано и небольшое опытное производство этой аминокислоты на заводе антибиотиков в молдавском городе Унгены.

Другая группа работала в Латвии, в Институте микробиологии им. А. Кирхенштейна под руководством академика АН Латвийской ССР М.Е. Бекера. Программы работ были разные. В Латвии собирались делать более простой в изготовлении кормовой концентрат лизина (ККЛ), а курчатовцы - кристаллический препарат, т.к. С.И. Алиханян настаивал на производстве именно этого препарата, считая, что на ККЛ не следует зря тратить время и деньги, ссылаясь при этом на успехи японцев в этой области.

Главмикробиопром решил построить два одинаковых по мощности завода - для кормового концентрата лизина в Латвийском городе Ливаны и для кристаллической аминокислоты в Чаренцаване (Армения), чтобы сравнить предлагаемые технологии.

Проектная мощность Ливанского биохимического завода на 1980 г. была перекрыта, он выпускал около 2000 т ККЛ в год вместо запланированных 1000 т. В Чаренцаване делали 100000 т кристаллического лизина в год, остальная продукция - ККЛ.

Общая характеристика методов получения лизина

аминокислота продуцент ауксотрофный лизин

Вначале оба препарата готовили по одинаковой технологии. Микроорганизмы, которые вырабатывают лизин, растят в ферментерах на питательной среде, состоящей в основном из соединений азота и углеводов, например, мелассы (отход сахарной промышленности) и солей аммония. Нарабатываемая бактериями аминокислота накапливается в культуральной жидкости. Дальнейшую переработку ее ведут одним из двух способов.

По одной технологии жидкость пропускают через ионообменные колонки, адсорбировавшийся на ионообменной смоле лизин вымывают и кристаллизуют. В результате получается кристаллический лизин, мелкий белый порошок, содержащий более 95 % аминокислоты, но себестоимость получаемого таким образом препарата высокая, кроме того, не до конца отработана технология утилизации отходов данного производства, именно поэтому Чаренцаванский завод и получал небольшое количество лизина.

Большую часть продукции в Чаренцаване и на других лизиновых предприятиях страны готовят по другой технологии: культуральную жидкость выпаривают, а потом сушат с наполнителем, например пшеничными отрубями и получают, таким образом, ККЛ, серовато-коричневый порошок или гранулы. Он содержит от 7 до 15 % аминокислоты, не так уж и много, зато стоит намного дешевле кристаллического препарата. Этим способом нельзя наработать более концентрированный продукт, т.к. без наполнителя образуется очень гигроскопичный порошок, который трудно хранить и применять.

Проблема заключается в том, что в нашей стране не производятся специализированные высокопроизводительные сушилки для ККЛ, поэтому вместо сухого препарата заводы частично делают жидкий концентрат лизина (ЖКЛ), т.е. просто выпаривают культуральную жидкость. В ЖКЛ также содержится около 7 % аминокислот, и это неплохая кормовая добавка, но перевозить ее на дальние расстояния затруднительно - быстро портится, поэтому заводы продают ЖКЛ близлежащим хозяйствам. ЖКЛ подмешивают к силосу или к гидролизным дрожжам, и животные от такого корма растут очень хорошо.

Микробиологи, кроме того, научились получать и более концентрированные препараты, но данная технология еще не переведена на уровень промышленного масштаба. Новая, усовершенствованная технология получения лизина создана во ВНИИ генетика усилиями нескольких лабораторий.

Культуральную жидкость, как и в производстве кристаллического лизина, пропускают через ионообменные колонны; затем вымытую аминокислоту не кристаллизуют, а ее раствор просто сушат, но без наполнителя (он не нужен, потому что в данном случае порошок получается негигроскопичным). Готовый препарат содержит до 70 % лизина.

Решена проблема и с отходами. В них ведь попадает вся биомасса - клетки бактерий, т.е. в основном белок; отходы сушат и делают из них отличную белковую добавку к кормам, а раз технология обходится без отходов, производство можно перевести на замкнутый цикл. И еще одно преимущество: по предложенному в институте способу завод может работать на различном сырье, т.е. когда сезон переработки сахара закончится, и мелассы больше не будет, микроорганизмам дадут взамен уксусную кислоту; а эту пищу, они усваивают гораздо эффективнее, чем мелассу.

Трудности лизинового производства

Лизииновое производство - новое производство, следовательно, возникает необходимость создания: сырьевой базы, оборудования, подготовка кадров; отработка с потребителем наиболее эффективных товарных форм продукта и способов его применения. Кроме того, индустриальное производство может быть устойчивым в том случае, если не только строго регламентируется технологический режим, но и обеспечивается необходимая стандартность сырья. В микробиологическом производстве это особенно важно, т.к. в данном случае одним из основных факторов служит адаптация микроорганизмов к питательной среде.

Меласса - хороший природный комплекс питательных веществ, но она не поддается строгой стандартизации. Возможно, различными приемами свести до минимума отклонения состава сырья от оптимума, но это усложняет работу. У мелассы есть еще одна особенность: ее можно непосредственно скармливать скоту. Поэтому поставки промышленности этого сырья из года в год неустойчивы и к тому же подвержены сезонным колебаниям.

В качестве наиболее перспективного сырья была испытана синтетическая уксусная кислота. Это стандартный, поддающийся химическому контролю продукт. На тех же мощностях он позволяет получать по существу, вдвое больше лизина, чем на основе мелассы.

Синтез лизина необходимо вести в стерильных условиях, т.е. попадание в систему любой чужеродной микрофлоры должно быть исключено, т.к. при попадании посторонней микрофлоры в ферментер, происходит ее быстрое размножение, вследствие чего она оттесняет от «кормушки» продуценты лизина, что приводит к прекращению его синтеза. Поддерживать стерильные условия в лаборатории не трудно, но в условиях промышленного производства довольно сложно: необходимо очень надежное оборудование, но в отличие от других отраслей микробиологи не имеют своего микробиологического машиностроения, поэтому им приходится довольствоваться оборудованием, предназначенным для других целей; с точки зрения микробиологии оно чаще всего несовершенно. Прежде всего, это относится к ферментерам и другой аппаратуре, позаимствованной у химиков, ее трудно очищать и стерилизовать. Сложность связана и с несовершенством редукторов для мешалок, которые выдерживают не более десятка процессов ферментации. Многие установки так и работают без мешалок, что значительно уменьшает выход лизина.

Трудность микробиологического производства лизина также связана с контрольно-измерительными приборами. Большинство датчиков, которыми снабжают лизиновое производство, не выдерживают режима стерилизации. Отсутствуют приборы для определения концентрации кислорода в культуральной жидкости, поэтому трудно подобрать оптимальный режим аэрации.

Производству кристаллического лизина не хватает ионообменных смол, кроме того, испытывается недостаток в пеногасителях. При культивировании микроорганизмов с целью синтеза лизина выделяется большое количество тепла и образуется пена, если с ней не бороться, то с отработанным воздухом может «уйти» вся культуральная жидкость. Без пеногасителей производительность ферментеров снижается на 60 %. Раньше для цели пеногашения использовали рыбий или кашалотовый жир, хотя конечно сейчас уже никто таких пеногасителей не производит, была найдена замена - синтетический пеногаситель - пропинол Б-400, но химическая промышленность снабжает им микробиологов нерегулярно, и производят его в недостаточном количестве.

Еще одно «узкое» место - лизиновая наука. В Москве (в 80-х гг.) всеми работами, связанными с лизином - селекцией высокопродуктивных штаммов, изучением их физиологии, оптимизацией процессов ферментации, созданием удовлетворительных товарных форм препарата, а также вопросами утилизации отходов и охраны окружающей среды, созданием оборудования, приборов и автоматики занимались примерно 30 человек, а в масштабах всей страны - не более 100. На каждую проблему, таким образом, приходится по 2 - 3 человека, а иногда и по «полчеловека»: один специалист ведет две темы. Основная трудность состоит в том, что у специалистов по лизину не было опытного производства, т.е. промежуточного звена между лабораторией и заводом.

Схема микробиологического синтеза лизина

В основу производства положены технологии с использованием одноступенчатого микробиологического синтеза, которые включают промышленное культивирование ауксотрофных мутантов бактерий из рода Corynebacterium, способных к синтезу лизина. Обычно у диких штаммов, из которых получены ауксотрофные мутанты, сверхсинтеза лизина не наблюдается, т.к. у них действуют механизмы саморегуляции. В клетках бактерий лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты через ряд промежуточных этапов, связанных с образованием полуальдегида аспарагиновой кислоты, дигидропиколиновой кислоты и б‚е-диаминопимелиновой кислоты, являющейся непосредственным предшественником лизина. Полуальдегид аспарагиновой кислоты является также одним из предшественников в синтезе аминокислот - треонина, метионина и изолейцина.

Процесс синтеза аминокислот (лизина, треонина, метионина, изолейцина) начинается фосфорилированием аспарагиновой кислоты с участием аллостерического фермента аспартаткиназы, активность которого ингибируется совместным действием двух аминокислот - лизина и треонина, если они накапливаются в клетках бактерий в избыточной концентрации. Если понизить концентрацию одной из этих аминокислот, то синтез другой будет осуществляться даже при условии, когда она накапливается в довольно высокой концентрации.

Для снятия регуляции синтеза лизина необходимо прекратить образование треонина на стадии превращения полуальдегида аспарагиновой кислоты в гомосерин, катализируемое ферментом гомосериндегидрогеназой, что достигается посредством мутагенеза. Опыты показывают, что мутантные клетки, не образующие гомосериндегидрогеназы, при их культивировании на искусственной питательной среде обеспечивают высокий выход лизина. Дефицитные аминокислоты, которые не синтезируются мутантными клетками (гомосерин, треонин, метионин), вводятся в состав питательной среды в таком количестве, чтобы они не были регуляторами синтеза лизина.

В процессе приготовления питательной среды для культивирования производственных штаммов ауксотрофных мутантов, обладающих способностью к сверхсинтезу аминокислоты лизина, в качестве источника углерода используют смеси, включающие уксусную кислоту и свекловичную мелассу, в качестве источника азота - соли аммония, мочевину, кукурузный экстракт, гидролизаты дрожжей. Кроме дефицитных аминокислот, которые не синтезируются клетками мутантов, в питательную среду также добавляют необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов микро- и макроэлементы, витамины (биотин, витамин В и др.). В процессе культивирования микроорганизмов обеспечивается подача стерильного воздуха с помощью специальных турбинных мешалок, а для предотвращения вспенивания субстрата и клеточной суспензии в среду культивирования добавляют пеногасители.

Посевной материал, предназначенный для промышленной ферментации, вначале выращивается в посевных аппаратах при 28 - 32 °C, рН 7 - 7,2 в течение 18 - 24 ч, а затем полученная суспензия клеток подается в производственные ферментеры объемом 50 - 100 м3, в которых поддерживается постоянный режим аэрации, необходимое давление, контроль за всеми компонентами и параметрами среды. Время ферментации составляет 55 - 72 ч. Накопление в культуральной жидкости лизина начинается через 25 - 30 ч после начала выращивания промышленной культуры и к концу ферментации достигает 40 - 50 г/л. Культуральную жидкость отделяют от культуры клеток продуцента фильтрованием и используют для получения лизина. На основе промышленной культуры бактерий, синтезирующих лизин, было организовано производство нескольких видов товарной продукции: жидкий концентрат лизина (ЖКЛ), сухой кормовой концентрат лизина (ККЛ), высококонцентрированные кормовые и высокоочищенные кристаллические препараты для пищевой и медицинской промышленности.

Для получения сухого кормового концентрата лизина ЖКЛ сушат горячим воздухом на распылительной сушилке при 90 °С до влажности препарата 4 - 8 %. Высушенный таким образом препарат содержит 15 - 20 % монохлоргидрата лизина, 15 - 17 % белков, 14 % аминокислот, витамины группы В, минеральные вещества. В целях снижения гигроскопичности препарата в него добавляют наполнители: мясокостную муку, негашеную известь, бентонит, пшеничные отруби. Полученную в результате тщательного перемешивания пасту высушивают на вальцово-ленточной сушилке и гранулируют. Гранулированный препарат ККЛ негигроскопичен, содержит 7 - 10 % лизина.

Для получения очищенного высококонцентрированного препарата лизина культуральную жидкость после фильтрования подкисляют соляной кислотой до рН 1,6 - 2. Образовавшийся в результате взаимодействия с соляной кислотой раствор монохлоргидрата лизина направляют на колонки с катионитом, где происходит сорбция аминокислоты и отделение ее от культуральной жидкости. Затем проводят десорбцию аминокислоты путем элюирования 0,5 -5 %-ным раствором аммиака. Элюат выпаривают под вакуумом при 60 °C до концентрации сухого вещества 30 -50 %, после чего подкисленный соляной кислотой раствор монохлоргидрата высушивают. Путем перекристаллизации полученной соли можно получить препараты с содержанием монохлоргидрата лизина в количестве 97 - 98 %.

В процессе производства лизина кроме основного продукта применение также находят и побочные продукты и отходы. После отделения культуральной жидкости в осадке остаются клетки бактерий-продуцентов, фосфаты и другие компоненты питательной среды, которые после высушивания могут быть использованы в качестве кормовой белковой добавки.

Технологические стоки и промывные воды после выделения монохлоргидрата лизина, содержащие в растворенном состоянии аминокислоты, другие ценные компоненты культуральной жидкости, остаточный лизин, объединяют и полученную смесь упаривают, а затем высушивают с наполнителем до влажности 10 %, в результате получают кормовой препарат с высоким содержанием белков (до 40 %) и незаменимых аминокислот.

Химико-энзиматический способ получения лизина

В ряде стран (Японии, США и др.) для получения лизина применяется химико-энзиматический метод, позволяющий создать высокоэффективные технологии, сочетающие в себе достоинства химического и микробиологического синтеза. Эти технологии основаны на ферментативной конверсии в лизин б-амино-е-капролактама, который получают химическим методом из циклогексана.

Схема химико-энзиматического синтеза лизина:

Циклогексан ® D, L-капролактам ® L-лизин.

В результате химического синтеза образуется рацемическая смесь D- и L-капролактама, которая направляется в реактор с ферментом гидролазой б-амино-е-капролактама, который катализирует превращение L-капролактама в L-лизин. D-изомер капролактама затем превращается в L-изомер с помощью специфической рацемазы. При такой технологии получения лизина его содержание в реакционной смеси по завершении рабочего цикла достигает свыше 150 г/л.

Продуцентами гидролазы б-амино-е-капролактама служат некоторые штаммы дрожжей из рода Cryptococcus, Candida, Trichosporon. Дрожжи выращивают в щелочной оптимизированной для синтезе фермента питательной среде, содержащей активаторы - ионы магния, марганца и цинка. Для ферментативной реакции превращения капролактама в лизин может использоваться клеточная суспензия дрожжевых клеток с активным ферментом, клеточный экстракт (после разрушения и отделения клеток) или очищенный фермент. Рацемазу, катализирующую превращение D-капролактама в L-изомер, получают на основе бактерий Achromobacter, Flavobacterium и др.

Процессы изомеризации D-капролактама в L-изомер и превращение L-капролактама в лизин можно проводить одновременно. Для этого в водный раствор D, L- капролактама вводится необходимое количество дрожжевых и бактериальных клеток, задаются оптимальный температурный режим, рН, аэрация. На выходе из реактора образуется преимущественно один продукт - L-лизин, который выделяют из смеси, очищают и сушат.

Микробиологический синтез триптофана

Для производства триптофана применяют как одноступенчатый синтез с помощью бактериальных ауксотрофных мутантов с нарушенной регуляцией синтеза аминокислот, так и двухступенчатый синтез, включающий вначале получение предшественника триптофана, а затем его ферментативное превращение в конечный продукт - триптофан.

У бактерий и у других организмов триптофан образуется из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпировиноградной кислоты через ряд последовательных реакций, включающих образование шикимовой и хоризмовой кислот, а непосредственным предшественником триптофана является антраниловая кислота.

Синтез триптофана аллостерически ингибируется конечными продуктами, которые действуют на ферменты, катализирующие начальные этапы превращений, связанные с образованием хоризмовой кислоты.

Для смещения метаболических реакций по пути преимущественного образования триптофана необходимо блокировать превращение хоризмовой кислоты в префеновую, что достигается действием мутагенных факторов. У мутантов с пониженной активностью ферментов, катализирующих превращение хоризмовой кислоты в префеновую, наблюдается повышенный синтез триптофана, но для нормального развития этих мутантов, в питательную среду необходимо добавлять дефицитные аминокислоты - фенилаланин и тирозин - в количествах, не вызывающих регуляторное ингибирование ферментов синтеза триптофана.

Для промышленного получения триптофана разработаны технологии на основе использования ауксотрофных мутантов: бактерий рода Bacillus subtilis с нарушенным синтезом фенилаланина и тирозина. Все технологические процессы организованы примерно по той же схеме, что и получение лизина с помощью мутантных штаммов коринебактерий. Ферментация длится 48 ч при 37 °С, концентрация триптофана в культуральной жидкости достигает 10 г/л. После отделения культуральной жидкости от клеток бактерий она упаривается и высушивается при 110 - 120 °С. Высушенный продукт называют кормовым концентратом триптофана (ККТ).

При получении высококонцентрированных препаратов триптофана культуральную жидкость подвергают дополнительной очистке. Вначале ее подкисляют соляной кислотой до рН 1,0 и затем центрифугированием отделяют образовавшийся осадок. Далее центрифугат, содержащий триптофан, пропускают через ионообменные колонки с катионитом, в результате чего происходит связывание аминокислоты и, таким образом, отделение ее от культуральной жидкости. После промывки колонок производят десорбцию триптофана 5 %-ным раствором аммиака в смеси изопропанола и воды. Элюат направляют на вакуум-выпарительный аппарат, после чего кристаллизуют аминокислоту при 4 - 8 °С. Выделенную в кристаллическом виде соль триптофана промывают этанолом и высушивают под вакуумом при 60 °С. Высушенный кристаллический препарат содержит не менее 99 % триптофана в виде хлорида. Осадок после отделения культуральной жидкости, содержащий клетки культуры бактерий, также высушивают и используют как высокобелковую кормовую добавку, содержащую повышенное количество триптофана.

Синтез триптофана в нашей стране производится преимущественно по двухступенчатой схеме. Вначале методом химического синтеза получают предшественник триптофана - антраниловую кислоту, которую затем с участием ферментов микробного происхождения превращают в триптофан.

Биохимическое превращение антраниловой кислоты в триптофан происходит в три этапа: на первом этапе из антраниловой кислоты с участием фосфорибозилпирофосфата (ФРПФ) образуется аминогликозид-N-(5ў-фосфорибозил)-антраниловая кислота, которая в результате внутримолекулярной перегруппировки и декарбоксилирования превращается в индол-3-глицерофосфат. На последнем этапе под действием фермента триптофансинтетазы из индол-3-глицерофосфата и аминокислоты серина образуется триптофан. В связи с тем, что в качестве активной группы у фермента триптофансинтетазы служит пиридоксальфосфат, от наличия в среде этого кофермента зависит скорость превращения антраниловой кислоты в триптофан. В качестве источника ферментов используют дрожжи.

Производственный процесс биохимического превращения антраниловой кислоты в триптофан проводится в две стадии.

На первой стадии производится наращивание биомассы дрожжей, являющихся продуцентами ферментов. Питательная среда для выращивания дрожжей готовится из свекловичной мелассы, мочевины, минеральных солей. Ферментация продолжается в течение 24 ч при 30 °С. Далее в ферментер начинают вводить спиртовой 5 %-ный раствор антраниловой кислоты и 50 %-ный раствор мочевины. Через 3 - 4 ч после добавления антаниловой кислоты в ферментер дополнительно подается углеродный субстрат - меласса в виде 25 %-го раствора. На последующих этапах ферментации периодически производится подача антраниловой кислоты и мочевины через каждые 6 ч и раствора мелассы - через каждые 12 ч. Длительность ферментации около 120 ч, а с учетом времени наращивания биомассы дрожжей - 144 ч. Содержание триптофана культуральной среде составляет 0,3 - 0,5 % (6 г/л). После выпаривания и сушки получают кормовой концентрат триптофан (ККТ), содержащий 90 % сухого вещества, 48 - 54 % белков, 1 - 3 % триптофана, 1,5 - 1,9 мг (%) витамина В1, 2,5 - 3,3 мг (%) витамина В2, 62 - 68 мг (%) витамина РР.

Синтез аминокислот с помощью ферментов

Основные группы ферментов, используемые для получения аминокислот.

Гидролитические ферменты (гидролазы), например L-б-капролактамлиаза (для синтеза L-лизина). Для того чтобы можно было использовать неочищенные ферменты, в частности гидролазы, целые клетки обрабатывают ПАВ, вызывающими изменение их проницаемости. Разработаны также пути получения мутантов, у которых искомый продукт не вовлекается более в обмен веществ.

Лиазы используют в основном в реакциях дезаминирования, например, для образования L-аспартата из фумарата аммония может использоваться аспартаза или L-аспартат-аммиак-лиаза.

Ферменты, содержащие пиридоксальфосфат: участвуют в процессах метаболизма аминокислот, так как они катализируют такие реакции, как рацемизацию, трансаминирование, реакции замещения и элиминации, декарбоксилирования и являются универсальными. По-видимому, роль этих коферментов состоит в активации аминокислот. Например, L-тирозин-фенол-лиаза (в-тирозиназа) катализирует реакцию в-элиминации, в которой тирозин распадается с образованием пирувата, фенола и аммиака. При оптимальных условиях Erwinia herbicola может синтезировать большое количество этого фермента (до 10 % растворимого белка). Его используют для синтеза в основном в иммобилизованной форме, что является важным условием для осуществления непрерывного производства. Субстратная специфичность этого фермента такова, что он может осуществить реакцию в-замещения между Д, L-серином и пирокатехолом, в результате которой образуется L-ДОФА.

Дегидрогеназы аминокислот, например лейцин - и аланиндегидрогеназы. Эти ферменты катализируют обратимые реакции дезаминирования. Их применяют в непрерывных процессах синтеза аминокислот из соответствующих кетоаналогов.

Глутаминсинтетаза - этот фермент катализирует АТФ-зависимую реакцию аминирования глутамата, сопряженную со сбраживанием сахара дрожжами. Высвобождающаяся при брожении энергия используется для синтеза глутамина. При использовании бесклеточного экстракта пекарских дрожжей и глутаминсинтетазы из глюкозы, глутамата и ионов аммония в качестве субстрата с высоким выходом был получен глутамин.

Размещено на Allbest.ru

...