Отбор эффективных штаммов клубеньковых бактерий Rhizobium trifolii для инокуляции семян клевера лугового

Размещено на http://www.allbest.ru/

2

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Биологический факультет

Кафедра микробиологии

Дипломная работа

ОТБОР ЭФФЕКТИВНЫХ ШТАММОВ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ RHIZOBIUM TRIFOLII ДЛЯ ИНОКУЛЯЦИИ СЕМЯН КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО

студентки 6 курса

Януть Е.С.

Научный руководитель:

доктор биол. наук

Алещенкова З.М.

«Допустить к защите»

Минск 2013

Содержание

Перечень условных обозначений

Введение

Обзор литературы

1. Бобово-ризобиальный симбиоз при возделывании клевера

1.1 Универсальность клевера и его кормовая ценность

1.2 Создание эффективного симбиоза - основа высокой продуктивности клевера

1.3 Биопрепараты на основе клубеньковых бактерий клевера

1.4 Эффективность применения биопрепаратов при возделывании бобовых культур

2. Материалы и методы исследования

2.1 Объекты исследования

2.2 Среды и растворы

2.3 Методы исследования

3. Результаты и обсуждение

3.1 Выделение и отбор наиболее эффективных изолятов клубеньковых бактерий клевера

3.2 Отбор эффективного и наиболее технологичного штамма клубеньковых бактерий R. trifolii

3.3 Оптимизация параметров роста и условий культивирования штамма R. trifolii 9

3.4 Эффективность инокуляции семян клевера клубеньковыми бактериями R. trifolii в лабораторных и полевых условиях

Выводы

Литература

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

Число колониеобразующих единиц - КОЕ

Кормовые единицы - КОРМ. ЕД.

Введение

В современных условиях повышение урожайности сельскохозяйственных культур можно достичь на основе высокой культуры земледелия путем научно-обоснованного экологически безопасного применения биологических удобрений, широкого внедрения прогрессивных технологий с минимальным использованием средств химизации (Израильский и др., 1982).

Использование на протяжении многих лет в сельском хозяйстве химических средств защиты растений и минеральных удобрений в большом количестве отрицательно повлияло на почечную микрофлору и повлекло за собой изменение свойств почв, накопление токсических веществ, нарушение биоценоза в целом (Лазарев и др., 2003).

Практика показала, что решить задачи улучшения питательного режима почв массовым применением средств химизации не удается (Мильто, 1982). Это связано с ростом затрат на производство продукции, нарушением биологического равновесия агроландшафтов, увеличением загрязнения окружающей среды, а также получаемой продукции (Изральский и др., 1982).

Основным поставщиком биологического азота являются бобовые растения, обладающие уникальной способностью вступать в симбиоз со специфическими для каждого вида растений клубеньковыми бактериями, образовывать азотфиксирующие клубеньки и усваивать за вегетацию до 125-480 кг/га азота воздуха (Хотянович, 1991). Это обеспечивает высокие урожаи дешевого растительного белка без применения дорогостоящих и экологических небезопасных минеральных азотных удобрений. С пожнивно-корневыми остатками многолетних бобовых трав в почве остается в среднем около 50 % фиксированного из воздуха азота, который на 2-3 года существенно повышает плодородие почвы и урожай последующих культур (Колешко, 1981).

Чрезвычайно актуальной задачей является разработка теоретических и методических основ селекции бобовых культур на повышение интенсивности азотфиксации, что позволит создать формы растений, способные максимально использовать потенциал симбиотического взаимодействия (Жученко, 1995).

Актуальность данной проблемы возрастает в связи с новой парадигмой, возникшей в сельском хозяйстве Белоруссии, связанной с резким снижением производства азотных удобрений, с одной стороны, и, с другой, - выявлением неблагоприятных экологических последствий высоких доз их применения. Это обуславливает расширение посевов бобовых культур, что связано с необходимостью создания сортов с гарантированным созреванием семян и активной симбиотической активностью (Новикова, 1996).

В связи со стратегией развития кормопроизводства в Республике Беларусь до 2020 года требуется восстановить площади многолетних трав на пашне на уровне 840 тыс. га и оптимизировать их структуру, в которой 85-90 % должны составлять бобовые и бобово-злаковые травы (т.ч. и клевер).

1. Бобово-ризобиальный симбиоз при возделывании клевера

1.1 Универсальность клевера и его кормовая ценность

Создание прочной кормовой базы, обеспечение животных кормами высокого качества, содержащих, достаточное количество энергии, протеина и других компонентов является определяющим при производстве продуктов животноводства. Качество кормов в настоящее время не соответствует предъявляемым требованиям для получения дешевой продукции. Например, на 1 кормовую единицу приходится 90-95 г перевариваемого протеина, в то время, как потребность составляет 105-110 г. В результате общий дефицит протеина в рационах животных составляет 25-30 %, что приводит к недобору животноводческой продукции на 30-35 %, повышению ее себестоимости в 1,5 раза, значительному увеличению расхода кормов на единицу продукции, в том числе дорогостоящих концентрированных (Слесаравичус и др., 2001).

Основной задачей аграрной науки является разработка энергоресурсосберегающих, экологически безопасных, учитывающих природные и социально-экономические условия технологий устойчивого развития сельскохозяйственного производства. Она достигается только за счет роста наукоемкости технологий выращивания и использования сельскохозяйственной продукции, который обеспечивает достижение названных целей при снижении удельных затрат техногенной энергии в физических (механических) процессах. Одним из примеров такого роста наукоемкости и приобретений человечества К.А. Тимирязев (1891; 1957) считал введение в культуру земледелия бобовых трав. Возделывание последних в значительной степени обеспечивает решение проблемы азота в земледелии, сохранение и повышение плодородия почвы. Кроме того, перед растениеводством стоит проблема увеличения производства и качества растительного белка, повышения биологической ценности получаемой продукции и энергетической продуктивности агроценозов (Доросинский, 1970).

Введение в севооборот бобовых культур, способных обеспечить себя азотом благодаря азотфиксации в симбиозе с клубеньковыми бактериями, вносит значительный вклад в обеспечение азотного питания последующих сельскохозяйственных культур за счет фиксированного азота из атмосферы. По данным РУП «Институт почвоведения и агрохимии НАН Беларуси», наибольший интерес как азотфиксаторы представляют многолетние бобовые травы, которые усваивают 250-350 кг азота на гектар, а однолетние зернобобовые культуры за сезон могут связывать 150-200 кг азота на гектар. При этом около половины биологического азота остается в почве.

Среди культур, возделываемых на корм, большое значение имеют многолетние травы. Одной из наиболее распространенных трав является клевер луговой. Его выращивают как в чистом виде, так и в составе травосмесей (Толкачев, 2003).

Многолетнее травянистое растение семейства бобовых высотой 20-50 см, корень стержневой, ветвистый, часто с клубеньками азотфиксирующих бактерий. Главный стебель укорочен, из пазух прикорневых листьев выходят цветущие стебли с тройчатыми листьями, складывающимися на ночь. Листочки нижних листьев яйцевидные, мелкозубчатые по краю, верхние - продолговатые, цельнокрайние. Цветет с мая по сентябрь, цветки неправильной формы, розовые или красные расположены в головчатых соцветиях, у основания два последних листа сближены. Плод - боб.

Универсальность клевера заключается в его широком использовании. Из него можно приготовить все виды объемистых кормов - сено, сенаж, силос. В ранние фазы вегетации заготавливают травяную муку, гранулы и брикеты. Сочетание клевера и злаковых трав (в особенности клевера ползучего) позволяют создать долголетние культурные пастбища, дающие дешевый, полноценный сбалансированный корм. Зеленая масса многолетних трав (основной укос и отава) широко используется для подкормки животных при стойлово-выгульном содержании (Белимов и др., 1993).

Клевер луговой и ползучий очень ценные кормовые растения. Под их посев отводятся большие территории. Клевер ползучий из-за своей низкорослости годится в основном для пастбищ, а клевер луговой используют для получения сена. На территории нашей страны распространенно около 70 видов клевера, из которых 15 видов выращивают специально на корм скоту.

Клевер луговой используют как приправу, высушенные головки клевера - отличная заправка для супов. Порошок из толченных сухих листьев клевера, добавленный в хлеб при выпечке, улучшает его качество. Благодаря обилию витаминов, микроэлементов и других ценных веществ, клевер лечит воспаление, заживляет раны, ожоги, снимает головные боли, помогает при расстройствах желудка, при малокровии, рахите и многих других заболеваниях (Федоров, 1989).

Урожайность клевера, при соблюдении агротехнических требований, может достигать до 100 ц/га сухого вещества. Из-за нарушения технологии возделывания, недостатка вносимых минеральных удобрений, а также неправильной эксплуатации травостоя урожайность многолетних трав в настоящее время остается низкой и составляет в 1,5-2 раза ниже своего потенциала.

С экономической точки зрения корм из клевера является дешевым и его возделывание выгодно практически во всех регионах страны. На 1 га посева клевера затраты совокупной энергии составляют около 12-13 ГДж, а коэффициент энергетической эффективности 10 и в 2-2,5 раза выше, чем у кукурузы и зерновых культур. Зеленая масса бобовых содержит значительное количество протеина, витаминов, минеральных веществ и имеет высокую энергетическую ценность. Все виды кормов из клевера сбалансированы по белку. Так, в среднем в 100 кг зеленой массы клевера лугового содержится 19,7 корм. ед. и 2,6 кг перевариваемого протеина. В правильно приготовленной травяной муке из клевера количество белка и каротина еще выше, а по кормовой ценности она приравнивается к концентрированным зерновым кормам (Муромцев и др., 1993).

В почвенно-климатических условиях республики многолетние бобовые травы - культуры больших возможностей. При соблюдении агротехнических требований они дают по 85-100 ц/га сухого вещества и обеспечивают получение 12-16 ц/га сырого протеина. При обеспечении их всеми известными факторами урожайность клевера можно увеличить в 1,5-2 раза и более.

В структуре посевных площадей приоритетную роль должны занимать многолетние бобовые травы, такие как люцерна, клевер, козлятник восточный и другие. Возделывание клевера по сравнению со злаковыми травами, имеет ряд преимуществ. Во-первых, повышает плодородие почвы благодаря накоплению органической массы и фиксации атмосферного азота. Во-вторых, экономически выгодно снижается потребность клевера в структуре посевных площадей (Ефимов др., 1996). Увеличение производства растительного белка -- задача многоплановая и должна решаться путем осуществления комплекса мероприятий, из которых основными являются следующие:

-- повышение урожайности кормовых культур на основе улучшения культуры земледелия, дальнейшего укрепления материально-технической базы, использования высокопродуктивных культур и сортов, мелиорации земель;

-- повышение содержания белка в урожае соответствующей агротехникой, правильным размещением кормовых культур по зонам страны;

-- совершенствование структуры посевных площадей -- расширение посевов ячменя, овса, кукурузы, гороха, люпина, вики, кормовых бобов, подсолнечника, люцерны, клевера эспарцета, горца Вейриха, маральего корня, козлятника восточного и других культур; около 60 % всего производства зерна должно составлять зерно фуражных и бобовых культур;

-- расширение площадей смешанных посевов силосных и однолетних злаковых трав с бобовыми культурами;

-- более широкое возделывание кормовых культур в промежуточных посевах;

-- сокращение потерь белка вследствие нарушения рекомендуемых сроков и технологий уборки урожая;

-- промышленная переработка семян, листостебельной массы с целью получения высокобелковых продуктов (Самсонов, 1998).

Решить проблему кормового белка предполагается за счет увеличения площади под зернобобовые культуры до 380 тыс. га, а площади под многолетними травами предполагается сохранить примерно на 1 млн. га. В структуре же посевов многолетних трав долю бобовых рекомендуется увеличить до 60 процентов (Кудриш, 2001).

Эффективность возделывания бобовых культур будет зависеть от функционирования микробно-растительной системы. Разработка новых биопрепаратов на основе активных штаммов клубеньковых бактерий и применение их в технологии возделывания бобовых культур будет способствовать решению проблемы растительного белка (Базилинская, 1989).

В последнее время появились фундаментальные знания, позволяющие предположить принципиально новые подходы к оптимизации микробно-растительного взаимодействия.

Прежде всего речь идет об открытии явления интеграции генетических систем микроорганизмов и растений в процессе взаимодействия. Особенно глубоко это явление было исследовано на модели «клубеньковые бактерии - бобовые растения». В результате молекулярно-генетического изучения микро- и макросимбионтов удалось показать, что как бактерии, так и растения обладают наборами симбиотических генов, которые не экспрессируют (молчат) в отсутствии соответствующего партнера. Давно известное явление специфичности (способность устанавливать симбиоз только между партнерами с определенными генотипами), предшествующее установлению симбиотических отношений, получило исчерпывающее объяснение на уровне передачи сигналов. Каждое бобовое растение обладает определенным химическим «портретом», который определяется спектром флавоноидных соединений, специфичных для каждого вида бобового. Сигнальные молекулы флавонов и флавоноидов способны регулировать экспрессию бактериальных генов так, что одни соединения вызывают экспрессию Sym генов бактерий при специфичном взаимодействии (нарингенин - у клубеньковых бактерий гороха, лютеолин - у клубеньковых бактерий люцерны, дайдзеин - у клубеньковых бактерий сои и т.д.), а при неспецифичном взаимодействии те же соединения могут играть роль ингибиторов клубенькообразования. Экспрессия симбиотических генов бактерий ведет к выработке ответного сигнала, известного под названием нод-фактора, который является одним из наиболее активных гормонов, индуцирующих деление клеток у растений и запускающий симбиотические программы бобового растения. Структура нод-факторов у разных видов клубеньковых бактерий в основе сходна - это хитиноподобные молекулы, состоящие из 4-5 остатков глюкозамина. Специфичность в отношении индукции клубенькообразования у различных бобовых достигается за счет декорирования базовой структуры разными заместителями. Их разнообразие и создает уникальность комбинаций сигналов и рецепторов, обеспечивающую возможность различить партнера среди многочисленных форм неспецифических клубеньковых бактерий и патогенной микрофлоры. Таким образом, процесс установления симбиотических взаимоотношений - это экологический процесс, протекающий в почве, поэтому почвенные условия должны обеспечивать возможность прохождения сигналов между растения и бактериями (Кирюшин, 2005).

1.2 Создание эффективного симбиоза - основа высокой продуктивности клевера

Получение высокой продуктивности бобовых культур обусловлено формированием эффективного симбиоза с клубеньковыми бактериями. Для активного функционирования микробно-растительной системы необходимы определенные условия внешней среды. Неблагоприятные условия среды оказывают влияние на вирулентность. Конкурентная способность и активность спонтанных и интродуцированных в почву ризобий снижаются при неблагоприятных условиях среды.

Установлено, что для формирования активных клубеньков на корнях растений оптимальная влажность должна составлять 60-70 % от полной влагоемкости, минимальная - 16 % от полной влагоемкости. При влажности ниже этого предела клубеньковые бактерии не размножаются, но длительное время сохраняются в неактивном состоянии. Недостаток влаги приводит и к отмиранию уже сформировавшихся клубеньков. Нередко в районах с недостаточным увлажнением многие бобовые растения развиваются, не образуя клубеньков. Избыточная влажность, как и ее недостаток, также неблагоприятна для симбиоза. Из-за снижения количества кислорода в зоне корней ухудшаются условия развития корневой системы растений. Недостаточная аэрация отрицательно влияет на жизнедеятельность клубеньковых бактерий и почвы. Повышенное содержание кислорода в почве приводит к снижению степени азотфиксирующей активности клубеньковых бактерий.

Продуктивность бобовых культур зависит от эффективности формирующегося симбиоза с клубеньковыми бактериями. Rhisobium trifolli являются специфичными клубеньковыми бактериями для Trifolium prаtense, они индицируют корневую систему клевера и формируют с ним симбиотический аппарат. Условия формирования эффективного симбиоза определяются как почвенно-климатическими условиями окружающей среды, так и эффективностью микросимбионтов (Тихонович, 1998).

Важную роль во взаимоотношениях клубеньковых бактерий и бобовых растений играет температурный фактор. Температурные характеристики разных видов бобовых растений различны. Штаммы клубеньковых бактерий различаются по устойчивости к понижению и повышению температуры. Следует отметить, что оптимальные температурные развития бобовых растений, образования клубеньков и азотфиксации не совпадают. Так, в природных условиях образование клубеньков может наблюдаться при температуре выше 0 °С. Температурный оптимум для азотфиксации - 10 °С и выше. Максимальной температурой, обеспечивающей азотфиксирующую способность клубеньковыми бактериям является температура равная 20-25 єС. Температура выше 30 °С отрицательно влияет на процесс азотнакопления (Libbert, 1998).

Большое значение в создании эффективного симбиоза между клубеньковыми бактериями и бобовыми растениями имеет фосфорное питание. При незначительном содержании фосфора в среде проникновение бактерий в корень происходит, но клубеньки при этом не образуются. У бобовых растений фосфор используется сравнительно равномерно при формировании всех органов, начиная с прорастания до образования семян с максимальным накоплением в корневой системе растения. Поэтому в ранние сроки развития бобовые растения, в отличие от злаковых, в большей степени удовлетворяют свои потребности в фосфоре за сет семядолей, а не запасов почвы (Муромцев, 1995). При симбиотическом способе существования, потребность бобовых растений в фосфоре выше чем при автотрофном. В связи с этим потребность в фосфоре увеличивается. При его недостатке потребность в фосфоре увеличивается у инокулированных производственным способом растений, ухудшается процесс формирования симбиотического аппарата и его функции. Таким образом, для повышения продуктивности бобовых культур необходимо создание оптимальных условий формирования эффективного симбиоза (Brewin, 1993).

1.3 Биопрепараты на основе клубеньковых бактерий клевера

Продуктивное возделывание клевера лугового обусловлено применением эффективного производства штаммов. Создавая основу для длительного и устойчивого эффективного функционирования клевера травостоев, а также рационального использования пахотных и пастбищных земель, учитывается не только имеющийся сортовой фонд макросимбионтов, но и конкурентоспособность и эффективность микросимбионтов (Сеги, 1993).

В Институте микробиологии НАН Беларуси разработан микробный препарат Сапронит на основе эффективных конкурентоспособных клубеньковых бактерий. Он предназначен для предпосевной инокуляции семян люпина, гороха, клевера, люцерны, галеги восточной и других бобовых культур. Исследования, проведенные на кафедре агрохимии УО «БГСХА», а также в научно-исследовательских институтах и хозяйствах республики, показали, что урожайность клевера при инокуляции семян Сапронитом повышается - 6-8 ц/га. Использование Сапронита усиливает азотфиксирующую способность клевера (Тихонович и др., 2005).

При этом, система «почва-растение» обогащается активной расой клубеньковых бактерий. Применение активного штамма ризобий, создание благоприятных условий для симбиотической деятельности клевера повышает его продуктивность. За счет использования малозатратных приемов: обработка семян клевера микроэлементами, внесение малых доз удобрения, оптимизация ширины междурядий, рациональный выбора вида и сроков уборки, послевсходового уничтожения сорняков, усиливает эффективность используемого инокулянта. Продуктивность культуры значительно возрастает. Эффект, полученный в начале формирования агроценоза, сохраняется и усиливается со временем за счет многолетнего взаимодействия макро- и микросимбионта.

Доказана целесообразность создания таких условий за счет обработки семян клевера активным штаммом Rhizobium.

Затраты при возделывании клевера с использование Сапронита составляют 2,0-2,5 доллара США на 1 га. Ризоторфин - микробное удобрение на основе клубеньковых бактерий под бобовые культуры. Обработка семян Ризоторфином повышает урожайность бобовых культур на 10-30 %, а сбор белка на 1-2 ц/га.

Ризобин - современный инокулянт, представляющий собой биомассу клубеньковых бактерий, смешанную с каолином или другим наполнителем. Обычно для инокуляции применяют метод бактеризации семян путем смачивания их водной суспензией (болтушкой) нитрагина (ризоторфина) в день посева. Это можно совместить с обработкой растворами микроэлементов и протравителями.

Азотовит - бактериальное азотное удобрение, полученное на основе почвенных микроорганизмов, действие которого основано на их способности усваивать азот из атмосферного воздуха, синтезировать ауксины и витамины группы В, а также вещества, подавляющие рост патогенной микрофлоры. Азотовит снижает вредное действие на растения длительного применения минеральных удобрений и пестицидов, способствует оздоровлению почвы и обогащает ее биологическим азотом (Потапова и др., 1997).

Ризофос марки «Клевер» на основе азотфиксирующих и фосфатфиксирующих бактерий снижает дозы N, P и способствует повышению урожайности клевера в климатических условиях Беларуси.

Для решения проблемы обеспечения растений фосфором применяется также использование почвенных микроорганизмов (бактерий, грибов, актиномицетов), способных переводить труднорастворимые формы фосфатов в легкоусвояемые растениями (Лазарев, 2003). Эти микроорганизмы широко применяются для создания препаратов Бактофосфин, Микоптил, ФМБ 32-2.

Бактофосфин - бактериальное фосфорное удобрение, полученное на основе почвенных микроорганизмов. Способствует мобилизации нерастворимых соединений фосфора в почве, повышает устойчивость растений к грибковым заболеваниям, мобилизирует нерастворимые соединения фосфора в почве (Мельников и др., 1997).

В Институте микробиологии НАН Беларуси на сегодняшний день разработаны новые препаративные формы биопрепаратов на основе эффективных штаммов клубеньковых бактерий. Установлено, что сочетание клубеньковых бактерий с ассоциативными фосфатмобилизующими микроорганизмами стимулирует рост и развитие растения-хозяина и является эффективным способом увеличения продуктивности бобовых культур.

Применение бактериального препарата способствует созданию благоприятных условий для функционирования бобово-ризобиального симбиоза. На начальных и последующих этапах взаимодействия макро- и микросимбионта стимулируется фотосинтетическая деятельность бобового компонента. За счет использования малозатратных приемов формируется высокий экологический и экономически - выгодный урожай зеленой массы и семян бобовых культур, полученный эффект усиливается со временем за счет многолетнего взаимодействия макро- и микросимбионтов (Мильто, 1992).

Доказана целесообразность создания таких условий за счет обработки семян активным штаммом Rhizobium, микроэлементами, улучшения обеспеченности растений минеральным питанием и влагой, повышения их выживаемости и конкурентоспособности в начальные периоды становления агроценоза, в том числе путем уменьшения засоренности всходов. Доказано, что эффективность инокуляции, несмотря на одноразовое применение, повышается при сочетании приемов и увеличивается от первого года жизни травостоя к последующим, т.е. возрастает разница между контролем и вариантом с комплексным использованием агромероприятий и применением микроорганизмов, благодаря накоплению эффекта интенсификации симбиотической азотфиксации (Воробьев, 1998).

В аграрно-развитых странах почти на трети площади, занятой зерновыми и зернобобовыми культурами, применяют диазотрофные биопрепараты, что позволяет на 25-40 % сократить потребление дорогостоящих и экологически небезопасных азотных удобрений. В Китае практически в каждой провинции есть фабрики по производству биопрепаратов, которые используются сельскохозяйственными производителями (Кожемяков и др., 1995).

В почвах Беларуси почти повсеместно встречаются клубеньковые бактерии клевера, но их количество и активность не всегда достаточны для обеспечения высокоэффективной ассимиляции азота.

Учитывая то, что в настоящее время в мировом сельском хозяйстве наблюдается устойчивая тенденция к снижению внесения больших доз химикатов, их замена на более экономичны и экологически чистые ресурсосберегающие технологии актуальна. Использование диазотрофных биопрепаратов на основе ассоциативных азотфиксаторов для небобовых культур и биопрепаратов, способных за счет микроорганизмов улучшать питание растений азотом и фосфором является одним из видов комплексных биопрепаратов.

В ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси» на основе ассоциативных микроорганизмов разработана серия биопрепаратов на основе полезной ассоциативной, ризобиальной, фосфатмобилизующей микрофлоры. Диазотрофный препарат Ризобактерин используют для инокуляции семян ячменя, овса и других зерновых культур. Фитостимофос используют для обработки семян сельскохозяйственных культур с целью увеличения содержания в почве усвояемой формы фосфора. Ризофос трех марок «Галега», «Люцерна», «Клевер» применяют для инокуляции семян галеги восточной, люцерны посевной, клевера лугового. Микробный препарат Ризофос посредством микроорганизмов, составляющих его основу, оказывает двойное действие: фиксацию биологического азота и фосфатмобилизацию.

В настоящее время в лаборатории взаимоотношений микроорганизмов почвы и высших растений идет разработка новых микробных препаратов препаративных форм для повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Планируется использование неплодородных земель за счет обогащение их полезной микрофлорой.

1.4 Эффективность применения биопрепаратов при возделывании бобовых культур

Повышения стабильности, снижения энерго- и ресурсозатрат в сельском хозяйстве и уменьшения глобальных нарушений процессов круговорота основных биогенных элементов в искусственных агроценозах можно достичь путём экологизации сельскохозяйственного производства.

В этой связи мобилизация биологических факторов приобретает всё большую актуальность и, являясь одним из основных звеньев экологизации сельскохозяйственного производства, позволяет получать высокие урожаи, обеспечивая при этом воспроизводство почвенного плодородия.

Одно из перспективных решений этих проблем - широкое внедрение экологически безопасных систем земледелия, базирующихся на: севооборотах с перспективными культурами и применении микробиологических препаратов комплексного действия (Троицкая и др., 1993).

Актуальной задачей при применении биопрепаратов является их эффективность. В связи с этим разрабатываются научные подходы в направлении эффективного использования биопрепаратов в условиях интенсивного земледелия с использованием химических мер защиты: гербицидов и протравителей (Кожемяков, 1995).

Биопрепараты на основе фосфатмобилизующих и ризобиальных бактерий повышают урожайность на 10-30 %, а сбор белка - на 1-2 ц/га (Завалин, 2005).

Со времен обнаружения и изучения симбиоза стало развиваться направление искусственной инокуляции бобовых растений клубеньковыми бактериями, выращиваемыми в лабораторных и промышленных условиях. При этом оказалось, что искусственная инокуляция обеспечивает повышение урожайности и качества бобовой продукции не только на почвах, не содержащих природных вирулентных культур клубеньковых бактерий, но так же и на почвах, где такие бактерии имеются, и существует естественный симбиоз. Это объясняется тем, что клубеньковые бактерии рода Rhizobium способны размножаться либо в корневых клубеньках бобовых растений, либо в искусственных условиях. В почве они способны только сохраниться некоторое время.

Важнейшим условием повышения эффективности производственного возделывания клевера является использование вирулентных видов клубеньковых бактерий с повышенной азотфиксирующей активностью. Установлено, что для эффективного симбиоза требуется внесение в почву во время посева около 500 миллиардов вирулентных клеток клубеньковых бактерий на 1 га площади посева (Возняковская, 1999).

Институте микробиологии НАН Беларуси разработаны высокоэффективные микробиологические препараты на основе полезных ризосферных бактерий, обладающих полифункциональным действием. Микроорганизмы, являющиеся основой этих биопрепаратов, тесно взаимодействуют с растениями (образуя «ассоциативный симбиоз») и способны выполнять ряд функций, полезных для растений:

- усиливать фиксацию атмосферного азота на корнях растения, заменяя при этом 30-50 кг/га минеральных азотных удобрений;

- стимулировать рост и развитие растений за счёт продуцирования физиологически активных веществ (ускоряя созревание продукции на 10-15 дней);

- подавлять развитие фитопатогенных микроорганизмов, обеспечивая снижение поражаемости растений болезнями от 1,5 до 10 раз, улучшая при этом фитосанитарную обстановку в почве;

- усиливать устойчивость растений к неблагоприятным условиям (засуха, заморозки, повышенное содержание солей, неблагоприятная реакция почвенного раствора);

- повышать коэффициенты использования минеральных удобрений и поступление питательных веществ из почвы;

- регулировать накопление в растениях тяжёлых металлов, радионуклидов, нитратов и других вредных соединений.

Постоянно ведётся поиск и разрабатываются научно-обоснованные способы эффективного использования новых микроорганизмов с полифункциональными свойствами, которые обеспечивают растениям реализацию их потенциальной продуктивности, в том числе за счёт повышения их адаптивных свойств. В экспериментах использовались производственные и перспективные штаммы симбиотических и ассоциативных азотфиксирующих бактерий, выделенных из почв и ризосферы растений различных регионов мира.

В настоящее время в мире выделено, отобрано и поддерживается в искусственных условиях множество штаммов клубеньковых бактерий клевера. Однако, как не прекращаются работы по селекции клевера, так и активно ведутся поиски новых конкурентоспособных симбиотически активных штаммов клубеньковых бактерий для повышения эффективности выращивания бобовых культур в различных регионах Белоруссии.

Таким образом, опыт разработки и использования биопрепаратов для инокуляции сельскохозяйственных культур является доказательством эффективного их применения при возделывании бобовых культур, что способствует получению экологически чистой продукции (Толкачев, 2003).

Целью настоящей работы было выделение и отбор симбиотически активных штаммов клубеньковых бактерий R. trifolii, обеспечивающих формирование эффективной микробно-растительной системы с Trifolium. pratense.

2. Материалы и методы исследования

2.1 Объекты исследования

Микробиологические объекты:

- изоляты клубеньковых бактерий R. trifolii 1, 3-9, выделенные из клубеньков клевера лугового;

- штаммы клубеньковых бактерий R.trifolii 4, R. trifolii 9, отобранные как наиболее эффективные.

Растительные объекты:

- клевер луговой Tr. pratense, раннеспелый сорт «МАРС».

2.2 Среды и растворы

Выращивание растений клевера и инокуляцию его семян проводили в условиях светокультуры. Для изучения и оценки эффективности предпосевной инокуляции семян клевера лугового выделенными изолятами клубеньковых бактерий и отбора наиболее эффективных использовали среду Jensen:

CaHPO4 1,0 г

K2HPO4 0,2 г

MgSO4 • 7H2O 0,2 г

NaCl 0,2 г

FeCl3 0,1 г

H2O 1,0 л

рН 7,0

Агар 7-15 г (добавляется после установления рН)

Микроэлементы:

B (0,005% раствор):

маточный раствор - 0,28 г (H3BO3) + 100 мл (H2O)

рабочий раствор - 2 мл маточного раствора + 100 мл (H2O)

Zn (0,005% раствор):

маточный раствор - 0,223 г (ZnSO4 • 7 H2О) + 50 мл (H2O)

рабочий раствор - 2 мл маточного раствора + 100 мл (H2O)

Cu (0,005% раствор):

маточный раствор - 0,25 г (CuSO4) + 100 мл (H2O)

рабочий раствор - 1 мл маточного раствора + 100 мл (H2O)

Mo (0,005% раствор):

маточный раствор - 0,26 г (NH4)6 Mo7O24 • 4 H2O)+ 50 мл (H2O)

рабочий раствор - 2 мл маточного раствора + 50 мл (H2O)

Mn (0,005% раствор):

маточный раствор - 0,223г (MnSO4 • 5 H2O) + 100 мл (H2O)

рабочий раствор - 2 мл маточного расвора + 100 мл (H2O)

Добавляем все по 1 мл/л (Jensen, 1992).

Для изучения физиолого-биохимических свойств и хранения использовали жидкую агаризованную бобовую среду:

Горох отварной - 100 г/л.

Необходимо отварить 100 г гороха в течение 45 минут в 1000 мл воды,

процедить и довести до метки.

Сахар - 10 г/л.

Сахароза - 10 г/л.

После стерилизации рН довести до значения 7,2 - 7,4.

Для хранения клубеньковых бактерий использовали агаризованную бобовую среду:

Горох отварной - 100 г/л;

сахар - 10 г/л;

сахароза - 10 г/л;

агар-агар - 20 г/л.

Горох отваривали в течение 45 минут в 1 литре воды, процеживали, доводили до метки.

После стерилизации рН довести до значения 7,2 - 7,4 (Хотянович и др., 1980)

Для отбора оптимальной питательной среды и изучения закономерностей роста клубеньковых бактерий клевера в периодических условиях культивирования использовали жидкую бобовую, кукурузно-мелассную и заводскую питательные среды: бобовая, %: гороховый отвар - 10,0; сахар пищевой - 2,0; pH 7,2 - 7,4 и заводская, %: гороховый экстракт - 10,0; дрожжевой экстракт - 0,05; сахароза - 0,5; (NH4)2SO4 - 0,05; K2HPO4 • 3H2O - 0,025; MgSO4•7H2O - 0,020 (Хотянович и др., 1980) и опытной, кукурузно-мелассная: кукурузный экстракт - 1,0; меласса - 0,5; (NH4)3PO4 - 0,05; pH - 7.

2.3 Методы исследований

Стерилизация и проращивание семян клевера

Отбирали нужное количество семян. Заливали концентрированной серной кислотой так, чтоб покрыть слой семян и выдерживали в течение 1 мин. Затем промывали семена водопроводной водой и несколько раз стерильной водой. В стерильные чашки Петри закладывали стерильные фильтры в асептических условиях и, стерилизуя пинцет обжиганием в спирте, выкладывали семена на фильтры, увлажняли стерильной водой. Пинцетом убирали воздух из-под фильтра, чтобы он плотно примыкал ко дну чашки Петри. Далее равномерно распределяли семена на фильтре, периодически стерилизовали пинцет обжиганием в спирте.

Чашки закрывали и ставили в термостат для проращивания семян при 27 °С в течение 3 суток, проростки ежедневно увлажняли.

Получение культуральной жидкости штаммов клубеньковых бактерий

Биомассу штамма клубеньковых бактерий, полученную на скошенном бобовом агаре одной пробирки, смывали 10 мл стерильной питательной среды. Полученную суспензию переносили в коническую колбу с 50 мл жидкой бобовой среды. Посевы инкубировали в роторной качалке при 28 оС в течение 48 часов. По истечении срока культивирования делали высевы культуральной жидкости методом предельных разведений на чашки Петри с агаризованной бобовой средой методом Коха. Для подсчёта колониеобразующих единиц культуру на чашках оставляли для выращивания в термостате при 28 °С на 72 ч. Полученную культуральную жидкость использовали для инокуляции семян для изучения ростстимулирующего действия штаммов ризобий следующим образом: семена с/х культур обрабатывали культуральной жидкостью, инкубировали в термостате в течение 2 часов, затем смывали стерильной водой и раскладывали на стерильные фильтры в чашках Петри. Проращивали 3 суток. Затем проростки внедряли в среду Jensen в пробирках и выращивали в условиях светокультуры в течение трёх недель. Вели учет длины и веса 100 проростков.

Инокуляция проростков клевера клубеньковыми бактериями R. trifolii 9

Проростки клевера внедряли в агаризованную среду Йенсена в пробирках. Проростки инокулировали 0,2 мл культуральной жидкости 3-суточной бактериальной культуры клубеньковых. За ростом и развитием клевера наблюдали в условиях светокультуры (освещенность 104 лк, t = 20-25 0C, длина светового дня - 12 ч) в течение одного месяца. Определяли симбиотические свойства выделенных изолятов: вирулентная и нодулирующая способность.

Выделение и отбор R.trifolii

Выделение изолятов клубеньковых бактерий проводили из клубеньков, сформировавшихся на корнях клевера в условиях светокультуры в результате инокуляции семян почвенной суспензией. Отбор наиболее эффективных изолятов клубеньковых бактерий проводили по симбиотической активности (Доросинский, 1970).

Метод определения азотфиксирующей активности Rhizobium

Для определения азотфиксирующей активности клубеньков отбирали растения, выращенные в условиях светокультуры в течение 45 суток, в период бутонизации - цветения, в пик предполагаемой активности клубеньковых бактерий. Растения извлекали из среды Jensen, корни с клубеньками обмывали водопроводной водой и просушивали фильтровальной бумагой. Затем помещали в пенициллиновые флаконы, закрывали стерильной резиновой пробкой, герметично зажимали флаконы стаперами. Через резиновую пробку вводили ацетилен в количестве 10 % от объема склянки и инкубировали в течение часа при 27 єС. Затем процесс останавливали, путем введения во флакон 2 мл реактива Несслера. Через 2 минуты отбирали пробу газа из флакона шприцом. Содержание этилена в образцах определяется путем анализа экспериментальных проб в сравнении с эталоном - контроль показателей точности измерений содержания этилена - С2H4 на газовом хроматографе Хром-5. Использовали компьютерную установку и на основании программы L-net системы UniChrom и определяли содержание этилена С2H4 в нМ образцах проб (Кириченко, 2001).

Учет количества колониеобразующих единиц, выросших на плотной питательной среде (Кожемяков, 1982) и изучение динамики роста бактериальных культур проводили методом предельных разведений и посева на плотные питательные среды (по Коху, 1881) Для этого:

1) на чашки с агаризованной средой наносили 50 мкл соответствующего разведения исследуемой культуры,

2) стеклянным шпателем осуществляли равномерное распределение капли бактериальной суспензии по поверхности агара,

3) чашки Петри помещали в термостат с температурой 30 єС,

4) повторность опыта - 3-х кратное,

5) учет количества выросших колоний микроорганизмов производили через 4-5 суток.

Хранение клубеньковых бактерий на скошенном бобовом агаре

осуществляли посев клубеньковых бактерий на скошенную агаризованную бобовую среду. Посевы инкубировали при 28 єС в течение 3 суток (быстрорастущие). Хранение культуры - 2-3 месяца в холодильнике при температуре 5 єС.

Изучение влияния инокуляции семян с/х культур медленно и быстрорастущими клубеньковыми бактериями на их рост и развитие

Оценка влияния продуктов жизнедеятельности клубеньковых бактерий клевера на показатели роста и развития с/х культур (сухой вес и длина проростков) проводили по методам, изложенным в руководстве Ю.М. Возняковской (Возняковская, 1999): бактериальную суспензию штаммов клубеньковых бактерий R. Trifolii готовили следующим образом: биомассу микроорганизмов, полученную смывом с 1 косяка с бобовым агаром, ресуспендировали в 10 мл стерильной воды и наносили на исследуемые семена различных с/х культур: не бобовые - кресс-салат, горчица, рапс, пшеница, рожь, редис, огурец, бобовые - вика, люпин, горох, фасоль, клевер. Затем замоченные семена инкубировали при 28 єС в термостате. Через 6 часов семена отмывали от бактериальной суспензии водопроводной водой на воронке с фильтром. Затем раскладывали в чашки Петри на увлажненные фильтры. Проращивали в течение 3-5 суток. Учитывали сухой вес и длину проростков. Контролем служили семена с/х культур, замоченные в воде. Проростки внедряли в полужидкую среду Jensen. Количество семян, используемых для опыта: бобовых - 150 штук, не бобовых - 150 штук (Badnoch - Jones, 1998).

Статистическую обработку данных проводили по Рокицкому.

Скорость размножения бактерий оценивалась по рассчитанному периоду удвоения числа клеток (время генерации g), а также по показателю средней удельной скорости роста µср (Ждан-Пушкина, 1983). Расчет производили по формулам [1], [2]:

µср.=2,3(lgXn-lgX0)/(tn-t0), (1)

где X1 - титр в точке n;

Xo - исходный титр культуры;

µср. - средняя удельная скорость роста, час-1.

g =ln2/µ=0,693/µ, (2)

где g - время генерации, час;

Хранение клубеньковых бактерий.

Хранение клубеньковых бактерий клевера осуществляли на скошенной агаризованной бобовой среде в течение 3-х месяцев при температуре + 5 єС.

3. Результаты и обсуждения

3.1 Выделение и отбор наиболее эффективных изолятов клубеньковых бактерий клевера

Выделение и отбор изолятов клубеньковых бактерий R. trifolii проводили в условиях светокультуры с растениями клевера лугового Tr. pratense раннеспелого сорта «МАРС». Стерильные семена клевера инокулировали почвенной суспензией и вели учет за временем появления клубеньков и их количеством. Оценивали биометрические показатели растений и по комплексу положительных биометрических и симбиотических показателей вели отбор вариантов для селекции изолятов Rhizobium. Образовавшиеся на корнях клевера розовые крупные клубеньки отбирали и использовали для выделения изолятов клубеньковых бактерий. В результате селекции по симбиотическим показателям: вирулентность, нодулирующая способность и азотфиксирующая активность было отобрано 8 изолятов клубеньковых бактерий R. trifolii (таблица 1).

Таблица 1 - Морфологическая характеристика изолятов R. trifolii

Вариант опыта (изолят)	Форма колоний	Нодулирующая способность	Азотфиксирующая активность, нМ С2Н4
		Количество клубеньков, шт./1 кл.	Размер клубеньков	Цвет клубеньков
1	Округлые, выпук-лые, в центре - полупрозрачные ко-лонии молочно-кремового цвета с не-ровными краями	6	Мелкие	Серые	2,34
3	Округлые, выпуклые, в центре - непрозрачные, по краям - полупроз-рачные колонии мо-лочно-кремового цвета с неровными краями	7	Крупные	Серые	1,89
4	Округлые, непроз-рачные, слизистые, умерен но выпуклые колонии цвета топ-леного молока с ровными краями	9	Крупные	Розовые	10,5
5	Округлые, выпук-лые, в центре - полупрозрачные ко-лонии молочно-кремового цвета с неровными краями	6	Мелкие	Серые	8,4
6	Округлые, непроз-рачные, слизистые, умеренно выпуклые	4	Крупные	Розовые	9,95
7	Округлые, непроз-рачные, слизистые, уме-ренно выпуклые колонии цвета топленного молока с ровными краями	7	Мелкие	Розовые	6,3
8	Округлые, полупро-зрачные, слизистые, умеренно выпуклые колонии цвета топ-леного молока с неровными краями	7	Мелкие	Серые	1,8
9	Округлые, полупро-зрачные, слизистые, умеренно выпуклые колонии цвета топленого молока с ровными краями	14	Крупные	Розовые	18,3

Изоляты клубеньковых бактерий 4 и 9, имеющие наибольшие показатели азотфиксирующей активности (10,5 и 18,3 нМ С2Н4 соответственно), у которых при инокуляции растений Tr. pratense отмечено образование максимального количества крупных клубеньков розового цвета (9 и 14 соответственно) были отобраны для дальнейшего исследования (рисунок 1). Установлено, что при посеве на агаризованную бобовую среду у изолята 9 на 3-4 день появляются колонии (быстрорастущий), изолята 4 - на 6-7 день (медленнорастущий).

Рисунок 1 - Образование клубеньков на корнях Tr. pratense при инокуляции изолятами R. trifolii 4 и 9

Отобранные изоляты клубеньковых бактерий 4 и 9 идентифицированы как штаммы R. trifolii, являются конкурентоспособными и симбиотически активными и формируют эффективный симбиоз с Tr. pratense.

3.2 Отбор эффективного и наиболее технологичного штамма клубеньковых бактерий R. trifolii

Необходимыми условиями разработки технологии производства микробного препарата является эффективный штамм, оптимальные условия и параметры его культивирования.

С целью отбора наиболее перспективного штамма клубеньковых бактерий клевера с минимальным периодом культивирования и максимальным титром клеток были проведены исследования по изучению динамики роста отобранных штаммов R. trifolii 4 и 9 в периодических условиях культивирования в колбах на качалке в течение 96 часов (таблица 2).

Таблица 2 - Параметры роста штаммов R. trifolii

Штаммы R. trifolii	Период культивирования, час	pH	Титр культуры
			КОЕ/мл	Lg числа клеток
4	0	6,3	(9,8±1,1)·106	6,9
	4	6,3	(1,0±0,08)·107	7,0
	6	6,3	(2,0±0,5) 107	7,3
	12	6,3	(4,7±0,6)·107	7,7
	18	6,3	(7,2±0,7)·107	7,9
	24	5,95	(9,4±0,8)·107	8,0
	36	5,95	(3,0±0,5)·108	8,5
	48	5,90	(5,9±1,19)·108	8,8
	72	5,85	(9,9±0,9)·108	9,0
	96	5,70	(1,3±0,02)·109	9,1
9	0	6,8	(8,7±1,08)·106	6,9
	4	6,8	(1,6±0,5)·107	7,2
	6	6,8	(3,1±0,07)·107	7,5
	12	6,8	(8,1±0,75)·107	7,9
	18	6,8	(2,8±0,05)·108	8,5
	24	6,0	(7,1±0,8)·108	8,9
	36	6,0	(5,3±0,5)·109	9,7
	48	5,7	(1,9±0,06)·1010	10,3
	72	5,5	(5,0±0,96)·1010	10,7
	96	5,4	(5,5±0,09)·1010	10,74

Примечание:·pH исх. среды 7,85

На рисунке 2 представлены динамика роста клеток штаммов клубеньковых бактерий R. trifolii 4 и 9.

Рисунок 2 - Динамика роста клеток и штаммов клубеньковых бактерий

R. trifolii

Установлено, что через 72 часа культивирования максимальный титр клеток штамма R. trifolii 9 составил 5,0?1010 КОЕ/мл, тогда как у максимальный титр клеток штамма R. trifolii 4 составил 1,3?109 КОЕ/мл через 96 часов культивирования, что на порядок ниже, чем у штамма R. trifolii 9 и по длительности культивирования - на 24 часа больше. Максимальной азотфиксирующей активностью обладает штамм R. trifolii 9 (18,3 нМ С2Н4/1 раст.), что на 7,8 нМ С2Н4/1 раст. выше по сравнению с
R. trifolii 4 (10,5 нМ С2Н4/1 раст.) Для дальнейших исследований был отобран симбиотически активный штамм клубеньковых бактерий R. trifolii 9, являющийся наиболее эффективным и перспективным по сравнению со штаммом R. trifolii 4. В результате проведенных исследований по полученным данным был отобран наиболее эффективный и экономически выгодный штамм клубеньковых бактерий R. trifolii 9. Оптимизацию параметров и условий культивирования отобранного штамма R. trifolii 9 проводили в условиях периодического культивирования на качалке.

Подбор и оптимизацию питательной среды проводили в колбах на качалке. В течение 96 часов глубинного культивирования штамма
R. trifolii 9 на питательных средах: бобовой, кукурузно-мелассной и заводской установлено, что максимальные титры культуры получены через 72 часа на бобовой (5,4·1010 КОЕ/мл) и кукурузно-мелассной (5,0·1010 КОЕ/мл) средах. Скорость вращения качалки - 200 об/мин, температура культивирования - + 26 - +28 оС (таблица 2, рисунок 2 ).

Таблица 3 - Численность клеток штамма R. trifolii 9 в процессе глубинного культивирования в колбах на качалке на разных питательных средах

Время культивирования, час	R. trifolii 9
	бобовая	заводская	кукурузно - мелассная
	КОЕ/мл	lg	КОЕ/мл	lg	КОЕ/мл	lg
0	(7,8±0.6)·106	6,9	(8,2±0,8)·106	6,9	(8,7±1,28)·106	6,9
24	(8,4±1,2)·109	9,9	(5,2±1,5)·108	8,7	(7,1±1,2)·108	8,9
48	(2,4±1,0)·1010	10,4	(0,5±0,08)·1010	9,7	(1,9±0,15)·1010	10,3
72	(5,4±0,8)·1010	10,7	(4,6±1,2)·1010	10,7	(5,0±1,161)·010	10,7
96	(6,8±1,4)·1010	10,8	(4,8±1,21)·010	10,7	(5,5±1,281)·010	10,7



Рисунок 3 - Динамика роста штаммов клубеньковых бактерий R. trifolii

Из таблицы 3 и рисунка 3 видно, что клубеньковые бактерии штамма R. trifolii 9 активно развиваются на всех испытываемых питательных средах. Установлено, что максимальный титр культуры получен через 48 часов культивирования на бобовой среде и составил 2,4?1010 КОЕ/мл. Анализ полученных данных показал, что максимальный титр культуры, полученный на кукурузно-мелассной среде составляет 1,9?1010 КОЕ/мл, что ниже, чем на бобовой в 1,2 раза.. Однако учитывая экономичность компонентов кукурузно - мелассной среды и высокий титр жизнеспособных клеток штамма R. trifolii 9, полученный через 48 часов культивирования, кукурузно-мелассная среда отобрана как наиболее приемлемая.

3.3 Оптимизация параметров и условий культивирования штамма R. trifolii 9

Отработку параметров и условий культивирования проводили на ферментере АНКУМ - 2 М (3 литра) при подаче воздуха 2 и 1л/л среды и температуре +28 оC на кукурузно-мелассной питательной среде. Установлено, что в процессе глубинного культивирования штамма R. trifolii 9 в ферментере на кукурузно-мелассной среде через 24 часа при подаче воздуха 1л/л среды получен высокий титр культуры, который составил 8,70·109 КОЕ/мл при скорости роста 0,16 час-1 и периоде генерации популяций 4,3часа. В процессе культивирования максимальная удельная скорость роста бактерий R. trifolii 9 составила 0,23час-1 через 6 часов культивирования.

3.4 Эффективность инокуляции семян клевера клубеньковыми бактерия R. trifolii в лабораторных и полевых условиях

В результате проведенных исследований установлено, что ростстимулирующий эффект от инокуляции семян клевера в лабораторных условиях составил 64,7 % (таблица 4).

В условиях производственного опыта за счет инокуляции получена прибавка урожая зеленой массы клевера, которая составила 18 % от контроля (без инокуляции), что соответствует 40 ц/га (таблица 5).

Ростстимулирующий (высота растений) эффект инокуляции в производственных условиях составил 12,6 %.

Таблица 4 - Ростимулирующий эффект инокуляции семян клевера клубеньковыми бактериями штамма R. trifolii 9 (лабораторные условия)

Вариант опыта	Длина проростков	Вес 100 проростков
	мм	% к контролю	г	% к контролю
Контроль (без инокуляции)	17	100	1,2	100
R. trifolii 9	28	164	2,5	208

Таблица 5 - Влияния предпосевной инокуляции семян клевера клубеньковыми бактериями штамма R. trifolii 9 (полевые условия)

Варианты	Высота растений, см	Урожайность зеленой массы, ц/га
Контроль	79	220,0
R. trifolii 9	89	260,0
НСР0,5	0,19	0,13

Применяемый для инокуляции штамм клубеньковых бактерий R. trifolii 9 обладает высокой вирулентной, нодулирующей и азотфиксирующей активностью (таблица 6). За счет инокуляции клубеньковыми бактериями семян клевера формируется на 409 мг/1 раст. большая зеленая масса растений по сравнению с контролем, накопление сухого вещества увеличивается на 44 мг/раст. Азотфиксирующая активность штамма R. trifolii 9 в симбиозе с клевером по сравнению со спонтанной ризобиальной микрофлорой выше на 35 С2H4 в нМ.

Таблица 6 - Симбиотические показатели штамма клубеньковых бактерий клевера R. trifolii 9 (полевые условия)

Вариант	Вирулент-ность, сутки	Нодулирующая способность, шт. клубеньков /1 раст.	Фитомасса, сырой/сухой вес, мг	Азотфикси-рующая активность, С2H4 в нМ/1раст.
Контроль	22	4	711,0/56,0	12,0
R. trifolii 9	15	14	1120,0/100,0	47,0

Влияние инокуляции штамма проверяли на других бобовых культурах: вика, люпин, горох, фасоль.

Установлено, что клубеньковые бактерии клевера стимулируют рост и развитие не только растения хозяина (клевера), но и других бобовых. Из таблицы 7 видно, что штамм R. trifolii 9 оказывает значительное стимулирующее действие на ростовые процессы растения-хозяина и вики, которое составило 80 %. Под действием неспецифичных ризобий увеличивается длина проростков гороха (50 %), люпина (18 %), фасоли (15 %).

...