Распределение признаков деградации углеводородов среди гетеротрофной микрофлоры, выделенной из почвы и нефтешламов

Размещено на http://allbest.ru

Кубанский государственный университет

УДК 579.266:574

Распределение признаков деградации углеводородов среди гетеротрофной микрофлоры, выделенной из почвы и нефтешламов

Мельников Д.А. - аспирант

Карасева Э.В. - к. б. н., профессор

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что черноземные почвы отличаются высокой концентрацией микроорганизмов [1], нефтешламы также характеризуются присутствием в них гетеротрофных микроорганизмов [2].

Очевидно, что при исследовании процесса биодеградации нефтепродуктов в различных объектах необходимо изучение разнообразия трофических возможностей у гетеротрофной микрофлоры по отношению к индивидуальным углеводородам - компонентам поллютантов. Это поможет понять принципы функционирования углеводородокисляющих сообществ.

Целью данной работы стала оценка и сравнение разнообразия спектров потребляемых углеводородов у микроорганизмов, выделенных из нефтешламов, почвы и грунта на завершающем этапе биоремедиации.

В своем исследовании мы стремились выделить как можно больше изолятов гетеротрофных бактерий с учетом концентрации бактерий в высеве и исследовать спектр потребляемых углеводородов у выделяемой микрофлоры.

На основании полученных данных выделили минимальную группу углеводородов, которая позволяет оценить углеводородокисляющую направленность штамма.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы выделяли из чистой почвы (чернозема), нефтешлама на завершающей стадии детоксикации и двух образцов нефтешламов, не подвергавшихся очистке. Нефтешлам №1 представлял собой твердую черную массу, концентрация нефтепродуктов 345 г/кг, срок хранения более 40 лет, отобран из амбара накопителя. Нефтешлам №2 отобран из нефтеловушки, он содержал нефтяные отходы, полученные при зачистке резервуаров. Концентрация нефтепродуктов в данном образце составила 340 г/кг.

Нефтешлам на завершающем этапе очистки (в дальнейшем грунт) отобран с площадки биологической очистки нефтешлама, обрабатываемого по технологии центра "Биотехнология" КубГУ. К моменту отбора пробы он представлял собой грунт с остаточным содержанием углеводородов - 34,8 г/кг. Принципы технологии детоксикации описаны в работе [3]. В очищаемый шлам в процессе биоремедиации вносили биогенные элементы, структурирующие вещества, регулировали водный режим.

Содержание нефтепродуктов в нефтешламах определяли флюориметрически на "Флюорат 02-3М" по стандартной методике согласно ПНДФ 16.1.21-98 КХА почв МВИ массовой доли нефтепродуктов в пробах почв на анализаторе жидкости "Флюорат 02".

Выделение и количественный учет микроорганизмов проводили методом кратных разведений почвы (нефтешлама, грунта), суспендированной в физиологическом растворе.

Четыре грамма почвы (нефтешлама, грунта) разводили в 40 мл физиологического раствора. Далее по стандартной методике производили десятикратные разведения, а начиная с четвертого разведения для нефтешламов (грунта) и с пятого для почвы - двукратные разведения.

Соответственно посевы (0,1 мл почвенной суспензии) производили из последнего десятикратного разведения и двух первых двукратных разведений на стандартный питательный агар для гетеротрофных микроорганизмов.

Такой способ разведений дал возможность выделить в чистой культуре оптимальное количество изолятов для дальнейших исследований.

Для оценки способности к росту на различных углеводородах производили посев чистых культур штрихом на плотную минеральную среду с углеводородами.

Состав плотной минеральной среды: нитрат калия - 4,0 г, однозамещенный фосфат калия - 0,6 г, двузамещенный фосфат натрия (двенадцативодный) - 1,4 г, сульфат магния - 0,8 г, агар - 20 г, вода (водопр.) до 1 л. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали индивидуальные н-алканы ряда гексан - октадекан, бензол (Benz) и его производные - 1,2,4-триметилбензол (псевдокумол - Psk), бутилбензол (b-Benz), о-ксилол (o-Xyl), толуол (Tol).

Также производили посевы выделенной микрофлоры на минеральную среду с хлороформенным экстрактом соответствующего объекта (нефтешламы и грунт).

Так как чистая почва не содержала нефтепродукты, микроорганизмы, выделенные из нее, культивировали на минеральной среде с сырой нефтью, взятой в качестве модельного поллютанта. Все субстраты вносили в расплавленную среду в концентрации 0,2 % (об).

Чашки с легкими углеводородами (н-алканы ряда гексан - додекан, бензол и его производные) помещали в закрытый эксикатор, на дно которого наливали 10 мл углеводорода.

Нафтид нефтешлама вносили в плотную минеральную среду в бензольной эмульсии. Расплавленную среду нагревали и выдерживали в течение одного часа на кипящей водяной бане в вытяжном шкафу для удаления растворителя и периодически встряхивали. В результате получали дисперсию нефтепродукта в плотной минеральной среде. Культивировали при комнатной температуре в течение 7 суток. Учитывали результаты по системе "+" (наличие роста) и "-" (отсутствие роста).

Для группировки признаков деградации углеводородов в зависимости от качественных особенностей спектра потребляемых углеводородов использовали многомерное шкалирование, модуль (PROXSCAL, порядковая модель с разрешением связанных наблюдений) программы SPSS 11.5 for Windows. В качестве дистанции между объектами использовали Евклидову меру для бинарных данных.

Для измерения взаимосвязи между количеством деградируемых углеводородов и способностью к росту на поллютанте использовали тест хи-квадрат и коэффициент неопределенности в качестве меры связи. Анализ провели в программе SPSS 11.5 for Windows.

Для измерения разнообразия выделенной микрофлоры с учетом степени сходства индивидуальных характеристик роста штаммов на различных углеводородах использовали коэффициент Евклидова разнообразия (EDC - Euclidean diversity coefficient) [4]. Формула коэффициента Евклидова разнообразия:

,

где p - доли i-того и j-того фенотипа, - дистанция между i-тым и j-тым фенотипом, измеряемая как

,

где - мера сходства между фенотипами. В данном исследовании использовали следующую меру сходства: отношение количества совпадающих признаков у пары штаммов к общему количеству признаков -

,

где в стандартной нотации для бинарных данных a (1,1), b (1,0), c (0,1), d (0,0).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для выделения чистых культур углеводородокисляющих микроорганизмов и оценки роли гетеротрофных микроорганизмов в процессах деградации углеводородов проводили исследование содержания микрофлоры данной группы в чистой почве, двух образцах нефтешлама и образца грунта на завершающем этапе биоремедиации, содержащего остаточный нафтид нефтешлама. Изоляты, выделенные из разных объектов, приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Распределение изолятов, выделенных из чернозема, и нефтешламов в зависимости от разведения и среды выделения

Примечание: для нефтешламов и грунта разведение 1 - в раз, разведение 2 - в раз, разведение 3 - в раз, для почвы разведение 1, 2 и 3, соответственно, в , , раз.

микробиологический детоксикация нефтепродукт почва

Для микрофлоры, выделенной из нефтешлама №1 и №2, было характерно отсутствие углеводородокисляющих микроорганизмов в исследуемом разведении. Микрофлора, выделенная из почвы и грунта, характеризовалась значительно большей долей изолятов, способных расти на углеводородах.

Среди 85 изолятов, выделенных из грунта, было обнаружено 47 фенотипов, которые различались по спектру потребляемых углеводородов.

Из 69 изолятов, выделенных из почвы, было описано 35 фенотипов, отличающихся по спектру потребляемых углеводородов. Среди микроорганизмов, выделенных из почвы, 17,4 % были способны утилизировать сырую нефть, а среди выделенных из грунта 38,8 % поддерживали рост на остаточном нафтиде данного грунта.

Такое распределение можно объяснить тем, что почва не была загрязнена нефтью, а грунт содержал собственно тот нафтид, на котором испытывали рост выделяемых микроорганизмов. Тем не менее можно признать значительной долю нефтеокисляющих микроорганизмов, присутствующих в чистой почве.

Особенности распределения уникальных фенотипов (по признакам роста на углеводородах) среди микроорганизмов, выделенных из разных разведений из почвы и грунта, показали некоторое несовпадение с моделью кратных разведений.

В случае почвы из первого разведения (табл. 1) выделено 88,5 % изолятов, уникальных по фенотипу, из второго - 91,3 %, а все изоляты, выделенные из третьего разведения имели уникальные фенотипы. Под уникальным фенотипом подразумевали спектр потребляемых углеводородов, не встретившийся более чем у одного штамма, выделенного со всех трех разведений.

Для микрофлоры, выделенной из грунта, наблюдали аналогичную картину: из первого разведения выделено 84,6 % изолятов, уникальных по фенотипу, из второго - 67,7 %, из третьего разведения 80,0 % изолятов имели уникальные фенотипы. Эти данные позволяют говорить об эффекте разведения, что, впрочем, согласуется с современными представлениями в области почвенной микробиологии [5].

Распределение показателя роста на нефти (нефтешламе) среди изолятов с различным количеством потребляемых углеводородов представлено на рисунке 1 для почвы и рисунке 2 для грунта.

Рисунок 1 - Распределение изолятов, выделенных из почвы, в зависимости от количества потребляемых углеводородов и

способности к росту на нефти

Рисунок 2 - Распределение изолятов, выделенных из грунта, подвергнутого биоремедиации, в зависимости от количества потребляемых углеводородов и способности к росту на остаточном нафтиде

На основании полученных данных предположили, что чем большее количество углеводородов способен потреблять штамм, тем вероятнее обнаружить способность к росту на нефтепродукте-поллютанте.

Для выяснения такой взаимосвязи применили тест хи-квадрат для таблицы сопряженности, где одна переменная - это способность расти на нафтиде грунта, или нефти в случае почвы, а другая - количество углеводородов, на которых росли штаммы. Силу взаимосвязи оценивали с помощью коэффициента неопределенности, результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Статистические показатели для таблицы сопряженности "рост на нефтепродукте-поллютанте" - "количество потребляемых углеводородов"

В обоих случаях получены высокозначимые уровни точности, что позволяет говорить о наличии связи между количеством потребляемых углеводородов и способностью расти на нефтепродукте-поллютанте.

Важно отметить, что использованные в данном исследовании углеводороды составляют лишь незначительную часть веществ нефтепродуктов, так как отдельные вещества в составе нефтепродуктов редко имеют массовую долю более 1 %.

Максимально возможное значение коэффициента неопределенности для почвы отражает возможность предсказать рост штамма на данной нефти с максимальной точностью, основываясь на знании спектра потребляемых углеводородов.

В случае грунта получено меньшее значение коэффициента неопределенности, и можно предположить, что используемый набор углеводородов недостаточно отражает состав остаточного нафтида. Тем не менее и здесь наличие связи подтверждено достаточно убедительно.

Для отбора штаммов по способности к росту на углеводородах имеет смысл ограничить набор субстратов, на которых проводится исследование способности к росту.

Рост на различных углеводородах в исследуемых выборках изолятов был распределен асимметрично. Наиболее часто встречался рост на н-алканах (от 14,5 % до 33,3 % изолятов для почвы и от 9,4 % до 45,9 % изолятов для грунта), значительно реже на ароматических углеводородах (от 0,0 % до 4,3 % изолятов для почвы и от 5,9 % до 9,4 % изолятов для грунта). Для поиска минимальной группы субстратов, которая позволяла бы оценивать углеводородокисляющую направленность штамма, использовали метод многомерного шкалирования.

Результаты для штаммов, выделенных и чернозема и грунта, представлены на рисунках 3 и 4. В процедуре многомерного шкалирования были получены следующие значения "стресса": для почвы Stress-I = 0,090, Stress-II = 0,195, S-Stress = 0,023, для грунта Stress-I = 0,079, Stress-II = 0,151, S-Stress = 0,010. Такие значения "стрессов" говорят о хорошем качестве отображения взаимосвязей между переменными в пространстве меньшей размерности.

В обоих случаях почти все признаки были распределены довольно хаотично, только н-алканы ряда тридекан - октадекан и ароматические углеводороды образовали отдельные группы.

Это означало, что большинство штаммов имели по данным группам углеводородов похожие ответы, и можно рассматривать данные группы углеводородов как единый показатель (важно подчеркнуть вероятностную суть такого показателя).

Рисунок 3 - Распределение показателей роста на различных углеводородах, полученное методом многомерного шкалирования, для штаммов, выделенных из почвы

Рисунок 4 - Распределение показателей роста на различных углеводородах, полученное методом многомерного шкалирования, для штаммов, выделенных из грунта, подвергнутого биоремедиации

Так как н-алканы ряда тридекан - октадекан наименее летучие и нетоксичные среди всех использованных углеводородов (то есть наиболее удобные для исследовательской работы), и рост хотя бы на одном из них был обнаружен практически у всех углеводородокисляющих изолятов, мы попытались выяснить, можно ли использовать показатели роста именно на этих углеводородах для оценки возможности роста штаммов на других углеводородах.

Для определения связи между количеством утилизируемых н-алканов ряда тридекан - октадекан и количеством потребляемых углеводородов (н-алканы ряда гексан - додекан и ароматические углеводороды) использовали коэффициент корреляции рангов Спирмана.

Получили следующие значения: R (почва) = 0,40 (p = 0,001), R (грунт) = 0,66 (p < 0,001).

Такие значения коэффициента корреляции позволяют сделать вывод о возможности использования н-алканов ряда тридекан - октадекан при первичном скрининге углеводородокисляющей микрофлоры.

Отсутствие роста на данных углеводородах позволяет исключить штаммы с заведомо малым спектром потребляемых углеводородов на ранних этапах отбора штаммов.

Для оценки и сравнения разнообразия спектров потребляемых углеводородов у микрофлоры, выделенной из разных источников, было бы логичным использовать какой-либо интегральный показатель.

Мы остановили свой выбор на коэффициенте Евклидова разнообразия (EDC), так как этот коэффициент слабо зависит от объема исследуемой выборки и позволяет учесть степень различий между объектами, которые характеризуются множеством показателей.

Были получены следующие значения: для почвы EDC = 0,12 и для грунта EDC = 0,18 (полученные значения составляют примерно треть от максимально возможных при таких объемах выборок штаммов). EDC для нефтешламов №1 и №2, соответственно, равняется 0,00.

Эти данные позволяют утверждать, что по характеристике разнообразия трофических возможностей по отношению к углеводородам у гетеротрофной микрофлоры грунт на завершающем этапе биоремедиации не уступал чистой почве и превосходил нефтешламы до очистки.

Благодарности: математическая обработка результатов сделана при содействии профессора кафедры генетики и микробиологии КубГУ доктора биологических наук Волчкова Ю.А. и кандидата биологических наук, доцента Тюрина В.В.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Микроорганизмы и охрана почв / Под ред. Д.Г. Звягинцева. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - 206 с.

2. Никитина Е.В. Особенности распределения и физиологического состояния микроорганизмов нефтешлама - отхода нефтехимического производства / Е.В. Никитина, О.И. Якушева, С.А. Зарипов, Р.А. Галиев, А.В. Гарусов, Р.П. Наумова // Микробиология. - 2003. - Том 72. - № 5. - С. 699-706.

3. Рукавцов Б.И. Принципы микробиологической утилизации нефтешламов / Б.И. Рукавцов, Э.В. Карасева, Т.Ю. Нечитайло, И.Е. Гирич, Р.И. Смоляр // Экологические проблемы биодеградации промышленных, строительных материалов и отходов производств: III Всероссийская конференция, сборник материалов. - Пенза, 2000. - С. 129-130.

4. Champely Stephane and Chessel Daniel Measuring biological diversity using Euclidean metrics // Environmental and Ecological Statistics. - 2002. - №9. - p. 167-177.

5. Полянская Л.М. Микронавески ризосферной почвы и лабораторные артефакты / Л.М. Полянская, М.Х. Оразова, О.А. Бурканова, Д.Г. Звягинцев // Микробиология. - 2000. - Том 69. - №4. - С. 581-585.

АННОТАЦИЯ

Распределение признаков деградации углеводородов среди гетеротрофной микрофлоры, выделенной из почвы и нефтешламов. Мельников Д.А. - аспирант, Карасева Э.В. - к. б. н., профессор. Кубанский государственный университет. УДК 579.266:574

В работе изучалась способность к росту гетеротрофных бактерий на н-алканах и ароматических углеводородах. Установили, что разнообразие спектров потребляемых углеводородов (коэффициент Евклидова разнообразия) у микрофлоры почвы, не загрязненной нефтепродуктами, практически не отличается от микрофлоры грунта в процессе микробиологической очистки.

Тот же показатель разнообразия спектров потребляемых углеводородов равняется нулю у микрофлоры нефтешламов до обработки.

Размещено на Allbest.ru