Адаптация вируса африканской чумы свиней к перевиваемым культурам клеток

Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии

Адаптация вируса африканской чумы свиней к перевиваемым культурам клеток

Прудникова Елена Юрьевна, аспирант

Балышев Владимир Михайлович, д.б.н.

Юрков Сергей Григорьевич, д.б.н.

Гальнбек Татьяна Валерьевна, к.б.н.

Балышева Вера Ивановна, д.б.н.

Покров

Аннотация

В статье представлены результаты адаптации вируса африканской чумы свиней к первичным и перевиваемым культурам клеток. Определенны условия адаптации и подобрана наиболее пермиссивная линия клеток для размножения вируса

Ключевые слава: вирус африканской чумы свиней, адаптация, культура клеток, цитопатогенное действие.

Африканская чума свиней (АЧС) является одной из наиболее значимых и трудно контролируемых болезней домашних и диких свиней. Свойства вируса, обуславливающие особенности эпизоотологии, патогенеза, иммуногенеза, в сочетании с отсутствием эффективных вакцин [7,12], превращают африканскую чуму свиней в глобальную угрозу свиноводству. Единственно эффективными средствами контроля болезни до настоящего времени являются быстрая диагностика в специально оснащенных центрах, уничтожение свинопоголовья в очагах, жесткое карантинирование неблагополучных территорий [2,5,6]. Разработка и совершенствование эффективных мер борьбы с АЧС требуют дальнейшего многостороннего изучения этой болезни и ее возбудителя.

При проведении молекулярно-генетических исследований с возбудителями вирусных болезней, а также при разработке вакцинных и диагностических препаратов широко используют культуральный вируссодержащий материал, который, как правило, получают в перевиваемых культурах клеток. Учитывая имеющиеся в литературе сведения о размножении вируса африканской чумы свиней в первичных культурах клеток (культура костного мозга свиней, лейкоцитов свиней, альвеолярных макрофагов легкого свиньи, почек свиньи) [3, 9, 11, 13] были проведены исследования по адаптации вируса АЧС к первичным и перевиваемым культурам клеток.

В работе использовали изоляты вируса АЧС, выделенные от больных и павших свиней в Волгоградской, Ставропольской, Астраханской, Мурманской областях, республике Кабардино-Балкария. Вирус африканской чумы свиней штамм Ставрополь в виде вируссодержащей крови и культурального вируса, прошедшего 16 пассажей в культуре клеток костного мозга свиней, с активностью 7,0-7,5 и 6,0-6,5 lg ГАЕ₅₀/см³ соответственно; первичные культуры клеток костного мозга свиней (КМС), лейкоцитов свиней (ЛС); перевиваемые культуры клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК - 60), почки свиньи (РК - 15), почки африканской зеленой мартышки (Vero, CV - 1), получены из музея клеточных культур ГНУ ВНИИВВиМ РАСХН, А₄С₂ - гибридная линия клеток СПЭВ с лейкоцитами свиньи, получена из ГНУ ВИЭВ РАСХН; среда ИГЛА-МЕМ, 0,1% ГЛА на солевом растворе Эрла, сыворотка крови свиньи, сыворотка крови крупного рогатого скота, фетальная сыворотка крови теленка, ФИТЦ - коньюгат, чашки карреля, 96 - луночный культуральный планшет.

Клетки КМС получали из эпифизов крупных трубчатых костей (бедренной, берцовой, лучевой, плечевой, тазовых костей, позвонков), лейкоциты свиней - из дефибрированой крови здоровых подсвинков живой массой 30-45 кг [1]. Культивирование вируса АЧС в первичных культурах клеток КМС и ЛС проводили без адсорбции вируса на клетках и смены питательной среды, множественность заражения составляла 0,1-0,5 ГАЕ/кл. Инкубировали зараженную культуру 4 - 5 суток при 37 ⁰С. Инфекционную активность исследуемых материалов определяли титрованием в культуре клеток КМС и ЛС общепринятым методом. Учет титрования проводили по феномену ГАд, основанному на адсорбции эритроцитов свиней на инфицированных вирусом АЧС клетках.

При адаптации вируса к перевиваемым культурам клеток использовали односуточную культуру, выращенную в пластиковых флаконах или чашках Карреля. Адаптацию проводили общепринятым методом с использованием адсорбции вируса в течение 60 минут и заменой ростовой питательной среды на поддерживающую среду с 2% сыворотки крови крупного рогатого скота и свиньи с последующим культивированием в течение 5 - 7 дней. В конце периода инкубации инфицированную культуру замораживали и оттаивали, чтобы разрушить структуру клеток и обеспечить полный выход вируса [4,8].

При отработанных условиях культивирования исследуемые изоляты вируса АЧС размножались в культурах клеток КМС и ЛС без адаптации с проявлением гемадсорбции, которая характеризовалась многослойным прикреплением к пораженным клеткам эритроцитов свиней, в результате чего они напоминали вид «красных ягод малины». В течение первых 24-48 часов эритроциты прочно удерживались на клетках и не отделялись при встряхивании. Через 48 - 72 часа после проявления гемадсорбции наблюдали лизис инфицированных клеток. Титр вируса в исходных, поступивших на исследование материалах варьировал от 1,5 до 5,0 lg ГАЕ₅₀/см³. В последующих пассажах накопление вируса АЧС в этих культурах достигало 6,0-7,0 lg ГАЕ₅₀/см³.

У изолята Североморск, выделенного в Мурманской области, титр вируса был несколько выше и на уровне 3-го пассажа достигал 7,5 lg ГАЕ₅₀/см³ (рис. 1).

Рис.1. Накопление штаммов вируса АЧС в клетках КМС и ЛС.

Оптимальными условиями выращивания вируса АЧС в культурах клеток костного мозга и лейкоцитов свиней являлись: посевная концентрация клеток 3,0-3,5 млн/см³ (костный мозг) и 6,0-7,0 млн/см³ (лейкоциты); питательная среда 0,1% ГЛА на солевом растворе Эрла с 10,0% сыворотки крови свиней; длительность выращивания культуры клеток до заражения 48-72 часа; множественность заражения 0,1-0,5 ГАЕ/кл без адсорбции вируса на клетках и смены питательной среды; культивирование вируса при 37 ⁰С 96-120 час. При этих параметрах выращивания накопление вируса АЧС в культурах КМС и ЛС составляло 6,5-7,0 lg ГАЕ₅₀/см³.

Для адаптации вируса АЧС к перевиваемым культурам клеток на первом этапе использовали вирус в виде вируссодержащей крови. Однако он не размножался в перевиваемых культурах клеток в течение 10 последовательных пассажей. Поэтому в дальнейших исследованиях использовали вирус АЧС, прошедший 16 пассажей в культуре клеток КМС.

Вирус АЧС при использовании поддерживающей среды с сывороткой крови крупного рогатого скота не размножался. В дальнейшем использовали поддерживающую среду, содержащую 2% сыворотки крови свиньи.

В процессе репродукции вируса АЧС на уровне 4-го пассажа на 5 день инкубации в зараженной культуре клеток А₄С₂ образовывались тяжи, в то время как в контрольной культуре изменения не обнаруживали. С седьмого пассажа цитопатогенное действие вируса характеризовалось образованием тяжей на 4 сутки, на 6-7 день - округлением клеток. С 9 пассажа в зараженной культуре клеток уменьшилась интенсивность образования тяжей, преобладало округление клеток, увеличение межклеточного пространства. На уровне 14 - 16 пассажей цитопатогенное действие характеризовалось округлением клеток, образованием агломератов и отслоением клеток от субстрата. Последующие пассажи характеризовались на 2 - 3 день инкубации вируса округлением клеток, увеличением межклеточного пространства, клетки увеличивались в размере, теряли митотическую активность; на 4 - 5 день клетки отслаивались от субстрата, поражение монослоя составляло 70-80% (рис. 2). С 18 пассажа длительность инкубации составляла 4 - 5 суток.

Рис. 2. Цитопатогенное действие вируса АЧС штамм Ставрополь в перевиваемой культуре клеток А₄С₂: А) нормальная культура клеток; Б) инфицированная культура клеток 3 день после заражения; В) инфицированная культура клеток 4 день после заражения; Г) инфицированная культура клеток 5 день после заражения.

Прошедший более 20 пассажей вирус АЧС размножался в перевиваемой культуре клеток А₄С₂ с использованием поддерживающей среды Игла - МЕМ с 2% фетальной сыворотки крови теленка, не теряя своей вирусной активности. Однако срок инкубации увеличился до 7 суток и изменился характер ЦПД, которое характеризовалось образованием тяжей, состоящих из округлых клеток, образованием окон с последующей гибелью клеток и отслоением их от субстрата. Максимальные деструктивные изменения наблюдали на 6 - 7 сутки культивирования.

Одним из характерных свойств вируса АЧС является способность образовывать гемадсорбцию на инфицированных клетках КМС и ЛС. Однако в перевиваемых культурах вирус АЧС размножался без проявления гемадсорбции. Так как перевиваемая культура клеток А₄С₂ является гибридной линией клеток СПЭВ и лейкоцитов свиньи, то была изучена способность вируса к гемадсорбции в данной культуре. При добавлении 0,5 % взвеси эритроцитов свиней к инфицированной культуре клеток А₄С₂ на 2 - 3 день инкубации через 24 - 48 часов на поверхности инфицированных вирусом АЧС клетках отмечали «плотную» гемадсорбцию (рис. 3).

Рис. 3. Гемадсорбция на перевиваемой культуре клеток А₄С₂: А) нормальная культура клеток; Б) зараженная культура клеток.

На уровне 7-8 пассажей штамм Ставрополь при аналогичных условиях культивирования вызвал ЦПД в перевиваемых культурах клеток РК-15 и ПСГК-60, ЦПД характеризовалось разрушением клеток, образованием «окон» в монослое.

В культуре клеток CV - 1 штамм Ставрополь не вызывал ЦПД в течение 15 последовательных пассажей.

Вирус АЧС, прошедший более 20 пассажей в перевиваемой культуре клеток А₄С₂, вызывал с первого пассажа ЦПД в культурах как гомологичного (ПСГК, РК - 15), так и гетерологичного происхождения (CV - 1, Vero) (рис. 4).

Рис. 4. Цитопатогенное действие вируса АЧС штамм Ставрополь в перевиваемых культурах клеток. Нормальная культура клеток: А - CV; В - ПСГК - 60; Д - РК - 15; зараженная культура клеток: Б - CV; Г - ПСГК - 60; Е - РК - 15.

Накопление вируса определяли титрованием в культурах клеток КМС и ЛС или в реакции прямой иммунофлуоресценции (РПИФ). Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lg ГАЕ₅₀/см³ или БОЕ₅₀/см³ [8, 10].

В процессе адаптации к перевиваемой культуре клеток А₄С₂ в первых пассажах отмечали снижение титра вируса с 6,0 до 2,0 lg ГАЕ₅₀/см³ (на уровне 6 пассажа), с 7 по 12 пассаж титр вируса увеличивался, а с 14 пассажа оставался стабильным и составлял 6,0 - 6,5 lg ГАЕ₅₀/см³. В перевиваемых культурах клеток ПСГК - 60, РК - 15 титр вируса был на 1,5 - 2 lg ГАЕ₅₀/см³ ниже. африканский чума свинья

Вирус АЧС в инфицированной культуре клеток РПИФ не обнаруживали со 2 по 10 пассажи. Однако с нарастанием титра вируса увеличивалось количество инфицированных клеток, показанных РПИФ. При определении титра вируса его значение, как правило, было на 1,0 - 1,5 lg ниже, чем определяемый в реакции гемадсорбции.

Заключение

Таким образом, для адаптации вируса АЧС к перевиваемым культурам клеток необходимо проведение пассажей вируса в первичных культурах клеток КМС или ЛС с применением поддерживающей среды с сывороткой крови свиньи. При адаптации к перевиваемым культурам клеток гомологичного (А₄С₂, ПСГК-60, РК-15) и гетерологичного (CV - 1) происхождения, установлено, что наиболее пермиссивной линией клеток является линия А₄С₂. Получен адаптированный вариант вируса АЧС штамм Ставрополь в культуре клеток А₄С₂, прошедший более 30 пассажей. Полученное на его основе сырье может быть использовано для проведения вирусологических и молекулярно-генетических исследований с этим возбудителем.

Литература

1. Африканская чума свиней // Инфекционная патология животных: в 2 - х т. / гл. ред. А.Я. Самуйленко и др. - М. - Т.1. 2006. - 807 - 817 с.;

2. Африканская чума свиней - главная проблема для свиноводства России/ В.В. Куриннов, Д.В. Колбасов, С.Ж. Цыбанов// Жизнь без опасностей. Здоровье. Профилактика. Долголетие. - 2010 . - N°3 - С. 82-87;

3. Патология клеток лимфоидной ткани, in vitro инфицированных вирусом африканской чумы свиней / Е. М. Каралова, Г. Е. Восканян, Х. В. Саркисян, Л. О. Аброян, А. С. Аветисян, Л. А. Акопян, З. Б. Семерджян, О. С. Закарян, Г. А. Арзуманян, З. А. Каралян // Вопросы вирусологии. - 2011. - №1. - С. 33 - 37;

4. Репин, В.И., Петров, Ю.И., Киселев, А.В., Юрков, С.Г., Черятников, Л.Л., Черных, Н.В., Симонова, Э.Г. Использование перевиваемых линий клеток для размножения штамма «Катанга - 350» вируса АЧС // Классическая чума свиней - неотложные проблемы науки и практики: Материалы научно - практической конференции ВНИИВВиМ / ГНУ ВНИИВВиМ. - Покров, 1995. - С. 139 - 140;

5. African swine fever: how can global spread be prevented? / S. Costard, B. Wieland, W. Glanville, F. Jori, R. Rowlands, W. Vosloo, F. Roger, D.U. Pfeiffer, L.K. Dixon // Phil. Trans. R. Soc. B. - 2009.- Vol. 364.- P. 2683-2696;6. Arias, M. African swine fever/ M. Arias, J.M. Sanchez-Vizcaino// Trends in Emerging Viral Infections of Swine.- Burlington: Iowa State University Press, 2002. - Р. 119-124;7. Botija, S. Modification of the African swine fever virus by passage in cell cultures/ Bull. Off. Int. Epiz.- 1963.- Vol. 60. - P. - 901-919;

8. Enjuanes, L. Titration of African Swine Fever Virus/ L. Enjuanes, A.L. Carrascosa, M.A. Moreno, E. Vinuela // J. gen. Virol.- 1976.- Vol. 32.- P. 471-477;

9. Experimental African Swine fever: apoptosis of lymphocytes and virus replication in other cells / J.C. Gomes - Villamandos, J. Hervas, A. Mendez, L. Carrasco, J. M. Mulas, C. J. Villeda, P, J. Wilkinson, M.A. Siarra // J. Gen. Virol. - 1995. - Vol. 76. - P. 2399 - 2405;

10. Immunofluorescence Plaque Assay for African Swine Fever Virus / J. Tessler, W. R. Hess, I. C. Pan, R. Trautman // Can. J. comp. Med. - 1974. - Vol. 38, - P. 443 - 447;

11. Greig, A.S. African Swine Fever V. Cultivation of the Virus in Primary Pig Kidney Cells // A.S. Greig, P. Boulanger, G.L. Bannister// Can. J. Comp. Med. Vet. Sci. - 1967.- Vol. 31. -P. 24-31;

12. Tulman, E.R. African swine fever virus / E.R. Tulman, G.A. Delhon, B.K. Ku // Curr. tor. microbial and immunol. - 2009. - № 328. - P. 43 - 87;

13. Wardley, R.C. African Swine Fever Virus Replication in Porcine Lymhocytes / R.C. Wardley, P. J. Wilrinson, F. Hamilton // J. gen. Virol. - 1977. - Vol. 37, № 5. - P. 425 - 427.

Размещено на Allbest.ru