Апробация микросателлитных ДНК-маркеров для идентификации клоновых форм сортов яблони

Размещено на http://www.allbest.ru/

Апробация микросателлитных ДНК-маркеров для идентификации клоновых форм сортов яблони

В классических селекционных экспериментах исследователю для изучения интересующего гена приходится по большей части работать над его фенотипическими проявлениями, представляющими собой конкретный признак. Но морфологические признаки могут иметь сложный характер наследования и часто зависят от условий внешней среды и их информативность как генетических маркеров ограничена.

Развитие методов молекулярной генетики привело к появлению нового класса генетических маркеров - ДНК-маркеров, основанных на полиморфизме первичной структуры ДНК.

Возможность их идентификации не зависит от условий окружающей среды, они не являются тканеспецифичными и, главное, с использованием ДНК - маркеров, гены, интересующие селекционера, могут быть идентифицированы на любом этапе вегетации без проведения фенотипической оценки. Кроме идентификации целевых генов, ДНК-маркеры могут быть эффективно использованы для определения уровня генетического сходства исследуемых образцов за счет анализа их геномного полиморфизма.

ДНК - маркеры генетических систем разного уровня должны обладать определенными свойствами и отвечать следующим требованиям: высокий уровень полиморфизма, кодоминантный характер наследования, оптимальный уровень частоты встречаемости в геноме для решения конкретных задач, равномерное распределение в геноме по хромосомам, селективно нейтральное поведение, упрощенная оценка параметров маркера, возможность автоматизации оценки параметров маркера, высокая воспроизводимость оценки параметров маркера, возможность легкого обмена данными между лабораториями [1].

Многочисленными исследованиями было показано, что одна из наиболее информативных систем молекулярного маркирования сельскохозяйственных культур - так называемые микросателлитные последовательности ДНК (SSR). В геномы эукариот встроены тандемные повторы из простых последовательностей, которые могут состоять из 4, 3, 2 и даже одного нуклеотида. Позже эти регионы были названы «микросателлитами» [2].

Микросателлитные последовательности распространены повсеместно в ДНК высших растений. Они были обнаружены у 34 видов. Средняя частота встречаемости на ДНК - каждые 50 тысяч пар нуклеотидов. Обследование баз данных для 54 видов растений показало, что среди SSR последовательностей в геноме ядра преобладают ди-, три- и тетрануклеотидные повторы [3]. Источник полиморфизма этих последовательностей - в сайт-специфическом варьировании длины повтора, что в свою очередь обусловлено различием в числе единиц повтора [4].

Одна из наиболее крупных работ по идентификации и секвенированию SSR-локусов у яблони была выполнена Liebhard R. с соавторами (2002). Ее результатом стали 140 впервые идентифицированных микросателлитных локусов и праймерные пары, их фланкирующие. Для яблони построены детальные молекулярно - генетические карты с использованием SSR, ДНК - маркеров [5]. молекулярный маркирование селекционный клоновый

Данная маркерная система на настоящий момент одна из наиболее широко используемых в исследованиях, направленных на оценку внутривидового генетического полиморфизма данной культуры. Так, к примеру, исследователи провели оценку степени генетического родства и ДНК - фингерпринт в выборке из 41 сорта яблони с использованием SSR ДНК-маркерной системы [6]. В результате работы все сорта были идентифицированы по уникальным аллельным комбинациям.

В качестве одного из наиболее крупных проектов в области изучения микросателлитного полиморфизма следует отметить исследования группы ученых из Национального центра сохранения генетических ресурсов Государственного департамента США по сельскому хозяйству (USDA-ARS-National Center for Genetic Resources Preservation). С использованием анализа полиморфизма микросателлитных локусов ядерного генома, а также полиморфных маркеров хлоропластного генома выполнили оценку уровня генетического разнообразия коллекции образцов диких видов груши, собранных в Европе и на Ближнем востоке, а также коллекции сортов и видов яблони (порядка 1900 образцов) [7-8]. По результатам исследований был выявлен ряд дубликатных образцов, а данные генотипирования послужили основой для формирования базы данных геномных фингерпринтов.

В связи с высоким уровнем полиморфизма данного вида ДНК -маркерных систем, нами была поставлена задача апробации микросателлитных ДНК-маркеров для идентификации клоновых форм от исходных сортов яблони. Актуальность исследований обусловлена также и тем, что наличие методов ускоренной ДНК-маркерной идентификации генетических различий между исходным сортом и его клоновыми формами позволит повысить эффективность клоновой селекции за счет возможности проведения отбора форм на ранних этапах селекционного процесса.

Материал и методы исследований

Материалом для исследований послужили сорта яблони Апорт АСС, Память Есаулу, Щит, а также сорта Голден Делишес и Флорина и их клоновые формы - Золотая Корона и Фламенко, соответственно.

Для экстракции ДНК использовали метода ЦТАБ, основанный на применении цетилтриметиламмоний бромида в качестве основного детергента в составе лизирующего буфера [9].

Изучали полиморфизм восьми SSR-локусов: CH01g12, CH03a04, CH01f03b, CN581493, AJ 320188, Hi04d02, Hi03с04, CH02a04 . Постановку ПЦР проводили по следующей программе: 5 минут при 94^оС - начальная денатурация, следующих 30 циклов: 30 секунд денатурация при 94 ^оС,30 секунд отжиг праймеров при 58 ^оС, 30 секунд синтез при 72^оС; последний цикл синтеза - 3 минуты при 72С^о.

В состав ПЦР смеси входили: 40-50 нг ДНК, 0,05мМ dNTPs, 0,3M каждого праймера, 1 единица Taq-полимеразы, 25 mM KCI, 60 mM Tris-HCI, pH 8,5, 0,1% Тритон Х-100, 10мМ 2-меркаптоэтанол, 1,5мМ MgCI2, в общем объеме реакционной смеси 25мкл. Реакция была проведена в амплификаторе Eppendorf Mastercycler gradient.

Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР использовали 8% акриламидный гель на основе 1ЧТрис-боратного буфера (0,09 М Трис, 0,09 М Борной кислоты, 2мМ ЭДТА, рН=8,2). Электрофорез проводили при напряжении 200V в течение 3 часов. Гелевые пластины окрашивали в раствор бромистого этидия 5мкг/мл и фотографировали в ультрафиолете.

Для определения относительной молекулярной массы амплифицированных фрагментов использовали программу Gel-Pro Analyzer 3.1.

Несмотря на то, что используемые микросателлитные ДНК - маркеры ранее были нами использованы в сортовой идентификации яблони [10] и проявили уровень полиморфизма, достаточный для дифференциации сортов и подвоев, в данное исследование было включено дополнительно три сорта местной селекции: Апорт, Память Есаулу, Щит помимо сортов Голден Делишес и Флорина и их клоновых форм. Это было сделано для более объективной сравнительной оценки уровня полиморфизма изучаемых SSR-маркеров выявляемого при оценке межсортового полиморфизма и полиморфизма сорт/клон сорта.

Следует отметить, что все используемые в работе ДНК-маркеры проявили высокий уровень межсортового полиморфизма - от трех до пяти аллелей на локус в изучаемой выборке из пяти сортов. Результаты микросателлитного генотипирования сортов представлены в таблице 1. Наличие двух фрагментов, разделенных косой чертой, говорит о гетерозиготности локусов.

Таблица 1 - Полиморфизм микросателлитных локусов у изученных сортов яблони*

* - размер ПЦР фрагмента указан в парах нуклеотидов

Из результатов микросателлитного генотипирования видно, что каждый из сортов обладает уникальным, специфичным лишь для него набором аллелей по изученным восьми микросателлитным локусам. Это подтверждает высокий уровень полиморфизма SSR - локусов, использованных в работе.

На рисунках 1-3 продемонстрированы результаты электрофоретического разделения продуктов амплификации с праймерными парами, фланкирующими SSR-локусы, изученные в ходе выполнения исследований.

На электрофореграммах, наряду с сортами яблони, вовлеченными в исследование, представлены также и клоновые формы сортов Голден Делишес и Флорина. Для сорта Голден Делишес было изучено шесть клоновых форм (Золотая корона), для сорта Флорина - три формы (Фламенко). Кроме того, с целью определения генетической чистоты образцов сорта Апорт, изучали полиморфизм SSR-локусов у двух различных образцов: Апорт АСС 68-32 и Апорт АСС 68-2.

 MВ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 MВ

Рисунок 1. Результаты анализа изученных образцов яблони по микросателлитному локусу CH01f03b

МВ - маркер молекулярного веса ДНК (pBR322/BsuR1); 1-16 сорта и формы яблони: 1 - Апорт АСС 68-2, 2 - Апорт АСС 68-32, 3 - Память Есаулу, 4 - Щит, 5 - Фламенко 64-32, 6 - Фламенко 64-27, 7 - Фламенко 64-II-24, 8 - Флорина, 9 - Золотая Корона 64-16, 10 - Золотая Корона 64-II-18, 11 - Золотая Корона 64-II-36, 12 - Золотая Корона 64-1, 13 - Золотая Корона 64-7, 14 - Золотая корона 64-8, 15 - Голден Делишес

1 MВ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 MВ

Рисунок 2. Результаты анализа изученных образцов яблони по микросателлитному локусу Hi03C04

МВ - маркер молекулярного веса ДНК (pBR322/BsuR1); 1-16 сорта и формы яблони: 1 - Апорт АСС 68-2, 2 - Апорт АСС 68-32, 3 - Память Есаулу, 4 Флорина , 5 - Фламенко 64-32, 6 - Фламенко 64-27, 7 - Фламенко 64-II-24, 8 -Щит, 9 - Золотая Корона 64-16, 10 - Золотая Корона 64-II-18, 11 - Золотая Корона 64-II-36, 12 - Золотая Корона 64-1, 13 - Золотая Корона 64-7, 14 - Золотая корона 64-8, 15 - Голден Делишес

MВ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 MВ

Рисунок 3. Результаты анализа изученных образцов яблони по микросателлитному локусу AJ 320188 SSR

МВ - маркер молекулярного веса ДНК (pBR322/BsuR1); 1-16 сорта и формы яблони: 1 - Голден Делишес, 2 - Золотая Корона 64-16, 3 - Золотая Корона 64-II-18, 4 - Золотая Корона 64-II-36, 5 - Золотая Корона 64-1, 6 - Золотая Корона 64-7, 7 - Золотая корона 64-8, 8 - Щит, 9 - Флорина, 10 - Фламенко 64-32, 11 - Фламенко 64-27, 12 - Фламенко 64-II-24, 13 - Память Есаулу, 14 - Апорт АСС 68-2, 15 - Апорт АСС 68-32

Из результатов электрофоретического анализа продуктов ПЦР с праймерными парами, фланкирующие микросателлитные локусы, видно, что межсортовой полиморфизм может быть четко идентифицирован. К примеру, по микросателлитному локусу AJ 320188 SSR, все сорта отличаются друг от друга по размеру амплифицированных фрагментов (1-Голден Делишес, 8-Щит, 9-Флорина, 13-Память Есаулу, 14,15- Апорт АСС). Это выражено в наличии электрофоретических фрагментов на разных позициях на электрофореграмме.

Несмотря на высокий уровень межсортового полиморфизма, при сравнительной оценке результатов SSR--анализа полиморфизма на уровне сорт/клон сорта было выявлено, что сорта Голден Делишес и Флорина имеют идентичные микросателлитные ДНК - фингерпринты с их клоновыми формами. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Полиморфизм микросателлитных локусов между сортами яблони Голден Делишес и Флорина и их клонами

Как видно из таблицы, все изученные микросателлитные ДНК-маркеры не позволили идентифицировать генетические различия на уровне сорт/клон сорта.

Все клоновые формы имеют ПЦР - фрагменты идентичные по размеру с сортом, из которого были выделены. Это свидетельствует о необходимости значительного увеличения количества SSR-маркеров, используемых для клоновой идентификации.

Наряду с микросателлитными маркерами, перспективным может оказаться использование других типов ДНК-маркеров, в том числе и мультилокусных. Независимо от типа ДНК-маркеров очевидна необходимость вовлечения в исследование большего количества ДНК-маркеров, в сравнении с сортовой идентификацией.

Список литературы

1 Конарев А.В. Использование молекулярных маркеров в работе с генетическими ресурсами растений // Сельскохозяйственная биология.- 1998.- №5.- С.3-25.

2 Litt M., And Luty J.A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene // Am.J.Hum.Genet.- 1989.- V.44.- P. 388-396.

3 Diwan N., Cregan P.B. Automated sizing of fluorescent-labeled simple sequence repeat (SSR) markers to assay genetic variation in soybean // Theor. Appl. Genet. - 1997.- V.95. - P. 723-733.

4 Schlotterer C., Soller M. Polymorphism and locus-specific effects on polymorphism at microsatellite loci in natural Drosophila melanogaster populations// Genetics.- 1997.- V.146. P. 309-320.

5 Silfverberg-Dilworth E. Microsatellite markers spanning the apple (Malus domestica Borkh.) genome // Tree Genetics & Genomes.- 2006.- V. 2.- P. 202-224.

6. Goulao, L. and C.M. Oliveira. Molecular characterization of cultivars of apple (Malus X domestica Borkh.) using microsatellite (SSR and ISSR) markers // Euphytica.- 2001.- V.- 122.- P. 81-89.

7 Volk, G. M. The USDA-ARS national plant germplasm system malus collection: diversity of cultivars and wild species / M. Volk, C. Richards, B. Gross [et al.] // Sixth Rosaceous Genomics Conference (RGC6): program and book of abstracts (30th September - 4th October 2012) / Mezzocorona (Trento), Italy, 2012. - P. 131.;

8 Gross, B. L. Identification of interspecific hybrids among domesticated apple and wild relatives / B. L. Gross, A. D. Henk, P. L. Forsline [et al.] // Tree Genetics & Genomes. - 2012.]

9 Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA // Nucleic Acids Research.- 1980.- V.10.- P. 4321-4325.

10. Супрун И.И., Токмаков С.В., Малюченко О.П., Ушакова Я.В., Бабаков А.В. Генотипирование сортов яблони российской селекции с использованием микросателлитных маркеров // Известия ТСХА.-№ 2011.- №6.- С.162-166.

Размещено на Allbest.ru