Генотипирование новых перспективных технических протоклонов винограда с использованием микросателлитных маркеров

Размещено на http://www.allbest.ru/

Кубанский государственный аграрный университет

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ НОВЫХ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ТЕХНИЧЕСКИХ ПРОТОКЛОНОВ ВИНОГРАДА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЁРОВ

Милованов Александр Валериевич

учебный мастер, аспирант

Звягин Андрей Сергеевич к.б.н.

Трошин Леонид Петрович д.б.н., профессор

Краснодар, Россия

В представленной статье освещена работа по генотипированию продуктивных протоклонов десяти технических сортов винограда

Ключевые слова: ВИНОГРАД, ПРОТОКЛОН, СОРТ, SSR-МАРКЁР, ПЦР, МИКРОСАТЕЛЛИТЫ, ДНК, НУКЛЕОТИД.

Существующий сортовой состав Краснодарского края отвечает практически всем требованиям современного виноградарства. Как спрос рождает предложение, так и этот фактор сортоулучшения виноградных насаждений двигает клоновую селекцию вперед, появляется еще большее количество генотипов. Совершенствование клоновой селекции и молекулярно-генетических методов анализа позволило улучшать существующие промышленные сорта путем отбора наиболее продуктивных и адаптивных форм, особенно после открытия наличия микросателлитных аллелей, которые сильно полиморфны и легко подвержены мутационной изменчивости. Идентифицировать их уникальность позволяет использование ПЦР-анализа вместе с ДНК-маркёрами [1-3].

ДНК-маркеры являются характеристикой генотипа и не зависят от фенотипа: этим обеспечивают богатство полиморфизмов, позволяющих идентифицировать сорта и строить точные генетические карты во многих высших растениях. Высокий уровень генетического разнообразия у винограда, который распространен по всему миру, вызывает интерес к оценке генетического родства внутри рода Vitis, а также необходимость улучшения распознающих систем, пригодных для идентификации виноградных сортов. Это поощряет попытку интегрировать и эксплуатировать данные генотипов, которые выявлены среди микросателлитных локусов в винограде [4-5, 11].

Генетический резерв винограда в настоящее время представляет собой смесь древних и совсем недавно выведенных сортов. Перед тем как новые сорта заменят старые, кажется разумным сделать усилие, дабы идентифицировать ценные древние генотипы и редкие сорта, которые могли бы сделать производство вина более типичным. В настоящее время сорта идентифицируются различными молекулярными маркерами. Среди них микросателлиты, или SSRs, стали маркёрами, на которые выпал выбор. Они представляют собой короткие последовательности ДНК, 1-6 нуклеотидов длиной, повторяемых несколько раз при каждом локусе. В связи с ошибками полимеразы во время репликации ДНК, локусы породили множество аллелей, которые отличаются по длине из-за различного количества повторов последовательности. В растениях микросателлиты, по оценкам, встречаются часто, на один из каждых 1-2.4 кб в наборе видов, включая арабидопсис, рис, сою, кукурузу и пшеницу. Множество SSRs уже обнаружено в винограде и выявлен высокий уровень гетерозиготности вида, что повышает полиморфизмы SSR-маркеров и приводит к решению многих проблем, связанных с сортовой идентификацией и анализом родословных [10].

Молекулярные маркеры имеют огромный потенциал для поиска генетических различий между генотипами на уровне ДНК и, следовательно, определения уровня разнообразия среди генотипов. Среди молекулярных маркеров SSR-маркеры являются наиболее подходящими из-за их кодоминантности, очень большого числа повторов, высокой частоты и обилия в селективно нейтральной области. Высоко насыщенные карты сцепления на основе одних только микросателлитных маркеров или их интеграция с другим типом маркеров доступны в винограде. Микросателлитные маркеры оказались полезными для установления «личности» генотипов, фингерпринтинга и анализа разнообразия, подвоев и сортов и межвидовых гибридов [6].

Первые результаты по дифференциации клонов генетическими маркерами показывают, что эта тема ограничивается не инструментами, а количеством использованных локусов. Если используется большое количество маркёров, вероятность найти различные аллели увеличивается. RAPD (случайная амплификация полиморфной ДНК), ИнтерSSR, AFLP (амплификация полиморфного фрагмента) и даже SSR-маркеры могут применяться, чтобы найти полиморфизм среди популяций Траминера белого и других культурных сортов. Для идентификации клонов только последовательно характеризующие маркеры будут воспроизводимыми и стабильными в анализе [9].

В 2013 году на кафедре виноградарства продолжилась работа по генотипированию ранее отобранных продуктивных технических протоклонов винограда по шести нейтральным микросателлитным маркерам. Образцы при этом по морфологической схожести поделены на соответствующие группы молекулярного анализа. Результаты работы приведены ниже в виде фото фореграмм (рис. 1-8).

Материалы и методы

Для анализа были отобраны листья сортов и протоклонов винограда (табл. 1). Сбор образцов для молекулярно-генетического анализа производился на участках учхоза «Кубань» Кубанского госагроуниверситета и в насаждениях агрофирмы «Фанагория» Темрюкского района Краснодарского края. Для сохранения листья нижеперечисленных генотипов были помещены в морозильную камеру при - 20⁰С.

Таблица 1

Исследуемые протоклоны и сорта винограда

Выделение ДНК из свежих листьев осуществляли модифицированным СТАБ-методом [1-3]. ПЦР проводилась по параметрам, описанным в монографии А.С.Звягина «Молекулярно-генетические исследования полиморфизма винограда» [11-13]. Для анализа генетического разнообразия были использованы 6 нейтральных микросателлитных маркеров (праймеров): VrZag62, VrZag79, VVMD5, VVMD7, VVMD27 и VVS2 [7-8, 12-14].

Разделение продуктов амплификации проводили методом электрофореза в 6% акриламидном геле. Далее пластины вымачивались в течение 10-15 минут в бромистом этидии и фотографировались в ультрафиолетовом свете. Анализ полученных фотоснимков проводили в программе Gel-ProAnalyser [1-5].

Задача исследований - поиск фенотипических сходств и генетических различий среди представленных в табл. 1 образцов по 6 аллелям.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Результаты исследований представлены в виде фотографий фореграмм и таблицы 2 с данными, полученными после их анализа.

Ниже приводятся восемь фото фореграмм локусов (рис. 1-8). Всего описывалось 25 образцов, которые составили группу технических сортов, произрастающих в Темрюкском районе Краснодарского края.

Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VrZag62 mw К* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 mw 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 mw**

*- где К - отрицательный контроль, **- mw - маркер молекулярного веса.

Рис. 2 Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VrZag62 mw 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 mw 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 mw

Рис. 3 Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VrZag79 mw К 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 mw 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 mw

Рис. 4 Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VVMD5 mw 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 mw 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 mw

Рис. 5 Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VVMD7 mw 30 29 28 27 26 25 mw 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 K mw

Рис. 6 Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VVMD7 mw 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 mw 50 51 52 53 54 55 56 mw

Рис. 7 Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VVMD27 mw 30 29 28 27 26 25 mw 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 k mw

Рис. 8 Результат разделения фрагментов ПЦР-реакции, проведенной с использованием нейтрального микросателлитного праймера VVS2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 mw 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

В качестве ссылок-«камертонов» в наших исследованиях, согласно дескриптору OIV, были использованы сорта Каберне-Совиньон и Пино гри (Пино серый).

Следует сказать, что отсутствие аллелей остается спорным фактом ввиду отсутствия более продвинутого оборудования и химических реактивов. Также следует заметить, что ввиду погрешности акриламидного геля существенным не считалось различие в 3 и менее нуклеотидов, хотя различие и в 4-5 тоже, зачастую, вызывает вопросы.

Таблица 2

Размер микросателлитных аллелей исследуемых протоклонов и сортов винограда

*- размер аллелей указан в парах нуклеотидов;

**- аллель не амплифицировалась после четырех-пяти кратного повтора.

Обсуждение

1. В блоке «Алиготе» контрольным образцом был использован типичный по фенотипу протоклон Алиготе 7-7; протоклон Алиготе 7-10 по микросателлиту VrZag62 отличается от предыдущего на 10 нуклеотидов по обоим локусам, по VrZag79 на 16 нуклеотидов, не отличается по VVS2, на 30 и 22 нуклеотида по VVMD5, на 15 нуклеотидов по VVMD7, а аллель VVMD27 не амплифицировалась у Алиготе 7-10 (рис. 9-10).

2. В группе «Мерло» контрольным образцом был французский сорт-клон Мерло 348. От него по локусу VrZag62 протоклон Мерло 10-8 не отличается, протоклон Мерло 10-9 отличается но 8 и 4 нуклеотида, по локусу VrZag79 Мерло 10-8 отличается на 35 и 15 нуклеотидов, Мерло 10-9 отличается на 23 и 27 нуклеотидов, по локусу VVS2 Мерло 10-8 отличается на 15 и 24 нуклеотида, Мерло 10-9 отличается 8 и 6 нуклеотидами, по локусу VVMD5 Мерло 10-8 отличается на 9 нуклеотидов, Мерло 10-9 отличается на 7 нуклеотидов, по локусу VVMD7 Мерло 10-8 отличается на 4 нуклеотида, Мерло 10-9 отличается на 8 нуклеотидов, по локусу VVMD27 Мерло 10-8 отличается на 14 и 16 нуклеотидов, как и Мерло 10-9.

3. Протоклон Солярис 70-16 (рис. 11-12) отличается от протоклона Солярис 70-21 на 6 и 14 нуклеотидов по локусу VrZag62, по локусу VrZag79 отличается на 46 и 37 нуклеотидов, по локусу VVS2 отличается на 11 нуклеотидов, по локусу VVMD5 отличается на 23 и 21 нуклеотид, по локусу VVMD7 отличается на 17 нуклеотидов и по локусу VVMD27 отличается на 6 и 16 нуклеотидов.

Рис. 10 Протоклон 7-10 сорта винограда Алиготе

Рис. 11 Протоклон 70-16 сорта Солярис

Рис. 12 Протоклон 70-21 сорта Солярис

4. В блоке «Каберне-Совиньон» контрольным образцом был выбран французский сорт-клон Каберне-Совиньон № 217. У образца Каберне-Совиньон 210-8 не амплифицировались аллели VVS2 и VVMD27. От контрольного образца по локусу VrZag62 отличаются протоклон Каберне-Совиньон 210-4 на 12 нуклеотидов, Каберне-Совиньон 210-8 отличается на 10 и 14 нуклеотидов, Каберне Мысхако (К-С 15) отличается на 6 и 10 нуклеотидов, Кабернек отличается на 8 и 8 нуклеотидов, по локусу VrZag79 Каберне-Совиньон 210-4 отличается на 28 и 38 нуклеотидов, Каберне-Совиньон 210-8 отличается на 20 и 20 нуклеотидов, Каберне Мысхако (К-С 15) отличается на 33 и 33 нуклеотида, Кабернек отличается на 18 и 5 нуклеотидов, по локусу VVS2 Каберне-Совиньон 210-4 отличается на 11 и 4 нуклеотидов, Каберне Мысхако (К-С 15) отличается на 17 и 21 нуклеотид, по локусу VVMD5 Каберне-Совиньон 210-4 отличается на 9 нуклеотидов, Каберне-Совиньон 210-8 отличается на 4 нуклеотида, Каберне Мысхако (К-С 15) отличается на 32 и 12 нуклеотидов, Кабернек отличается на 4 нуклеотида, по локусу VVMD7 Каберне-Совиньон 210-4 отличается на 8 нуклеотидов, Каберне-Совиньон 210-8 отличается на 4 и 23 нуклеотида, Каберне Мысхако (К-С 15) отличается на 14 нуклеотидов, Кабернек не отличается, по локусу VVMD27 образцы также идентичны.

5. В блоке «Пино» контрольными образцами были выбраны протоклоны Пино белый 31 и Пино черный 50-11. Пинок белый отличается от Пино белый 31 по локусам VrZag62, VrZag79, VVS2, VVMD5, VVMD7 при соответствующем количестве нуклеотидов: 8, 24 и 23, 4, 7, 8 и 6, а также не отличается по последнему локусу VVMD27. Пино белый 06 отличается по локусам VrZag62 и VVS2, соответственно, на 4 и 4 нуклеотида. По остальным маркёрам различий не обнаружено.

Пиногрик (рис. 13) отличается по локусам VrZag62, VrZag79, VVMD7, VVMD27 по количеству нуклеотидов, равным 4 и 4, 4, 8 и 29, 8, аллель VVS2 в образце Пиногрик не обнаружена. Фенотип сорта-клона Пиногрик лишь незначительно отличается от материнского сорта Пино серый (рис. 14).

Протоклон Пино черный 50-8 отличается по локусам VrZag79, VVMD5, VVMD7 и VVMD27 на следующее число нуклеотидов: 6 и 18, 7, 10 и 7, 12. Сорт-клон Пинофагр отличается по локусам VrZag62, VrZag79, VVMD7, VVMD27 на количество нуклеотидов, равное 4, 14, 25, а также 10.

Рис. 13 Урожай винограда сорта-клона Пиногрик (авторы сорта Вертеба А.П., Звягин А.С., Милованов А.В., Трошин Л.П.)

6. Протоклон Каберне Карбон 525-6 отличается от протоклона Каберне Карбон 525-4 на 4 нуклеотида по локусу VrZag62, на 43 и 46 нуклеотидов по локусу VrZag79, на 5 и 10 нуклеотидов по локусу VVS2, на 36 и 18 нуклеотидов по локусу VVMD5, по локусу VVMD7 на 9 нуклеотидов, аллель VVMD27 не была выявлена у исследуемых образцов.

Рис. 14 Сорт винограда Пино серый

7. Протоклон Каберне Кортис 271-2 отличается от протоклона Каберне Кортис 271-7 по локусам VrZag62, VrZag79, VVS2, VVMD5 и VVMD7 на 4, 7 и 4, 14, 4, 10, 4 нуклеотида.

8. Протоклон Совиньон белый 23-8 отличается от протоклона Совиньон белый 23-11 по аллелям VrZag62, VrZag79, VVS2, VVMD5 на 6, 32 и 36, 4 и 6 и 10 нуклеотидов. Аллель VVMD7 не амплифицировалась в протоклоне Совиньон белый 23-8, а по VVMD27 они не отличимы.

Таким образом, можно видеть, что выбранные по фенотипу протоклоны заметно отличны от контрольных образцов, и отличия, полученные в результате ДНК-исследований, позволяют им войти в категорию геноизмененных протоклонов винограда, тем более, что генетические изменения подкреплены молекулярно-биохимическими анализами.

Выводы

сорт клон генетический маркер

По результатам многолетнего ампелографического скрининга технических популяций вышеназванных десяти сортов винограда и подкрепленного молекулярно-генетического анализа их выделенных протоклонов на государственные испытания в разные годы были переданы сорта-клоны Алиготе фанагорийское, Каберне Мысхако, Каберне фанагорийский, Мерло фанагорийский, Пиногрик, Пинок белый, Пинофагр и Совиньон фанагорийский [4-5].

Литература

1. Звягин А.С. Выделение ДНК из гербарных листьев Vitis vinifera / Звягин А.С. // Научный журнал КубГАУ. 2010. № 58 (04).

2. Милованов А.В. Выделение ДНК при помощи peqgold plant dna mini kit / А.В. Милованов, Л.П. Трошин // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ) [Электронный ресурс]. Краснодар: КубГАУ, 2013. № 06 (090). С. 167 - 176. IDA [article ID]: 0901306011. Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2013/06/pdf/11.pdf, 0,625 у.п.л., импакт-фактор РИНЦ=0,581.

3. Милованов А.В. Генотипирование сортов винограда по молекулярным маркёрам / А.В. Милованов, Л.П. Трошин // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ) [Электронный ресурс]. Краснодар: КубГАУ, 2014. №02(096). С. 53 - 65. IDA [article ID]: 0961402005. Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2014/02/pdf/05.pdf, 0,812 у.п.л., импакт-фактор РИНЦ=0,346.

4. Трошин Л.П. Ампелографическая и селекционная научно-исследовательская работа Кубанского госагроуниверситета / Л.П. Трошин // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ) [Электронный ресурс]. Краснодар: КубГАУ, 2012. № 07 (081). С. 524 - 544. IDA [article ID]: 0811207039. Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2012/07/pdf/39.pdf, 1,312.

5. Трошин Л.П., Радчевский П.П. Виноград: иллюстрированный каталог. Районированные, перспективные, тиражные сорта. Ростов н/Д: Феникс, 2010. 271 с.: ил. (Мир садовода).

6. Ajitpal Singh, Krishan Kumar, ManavIndra Singh Gill1, Parveen Chhuneja, Naresh Kumar Arora and Kuldeep Singh. Genotype identification and inference of genetic relatedness among different purpose grape varieties and rootstocks using microsatellite markers // African Journal of Biotechnology, 9 January 2013. Vol. 12 (2). P. 134-141.

7. Bowers J.E., Dangl G.S. and Meredith C.P. Development and characterization of additional microsatellite DNA markers for grape // Am. J. Enol. Vitic. 1999. V. 50, № 30. P. 243-246.

8. Bowers J.E., Dangl G.S., Vignani R. and Meredith C.P. Isolation and characterization of new polymorphic simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera L.) // Genome. 1996. V. 39. P. 628-633.

9. Regner F., Hack R. and Santiago J. L. Highly variable Vitis microsatellite loci for the identification of Pinot Noir clones // HBLA u. BA fьr Wein und Obstbau, Klosterneuburg, Austria. Vitis, 45 (2), 85-91 (2006).

10. Zulini L., Russo M. and Peterlunger E. Genotyping wine and table grape cultivars from Apulia (Southern Italy) using microsatellite markers // Dipartimento di Produzione Vegetale e Tecnologie Agrarie (Universitа di Udine, Udine, Italia). Vitis, 41 (4), 183-187 (2002).

11. Maria Stella Grando, Claudia Frisinghelli. Grape microsatellite markers: Sizing of DNA alleles and genotype analysis of some grapevine cultivars // Istituto Agrario di San Michele all'Adige (San Micheleall'Adige, Italia). Vitis, 37 (2), 79-82 (1998).

12. Sefc K.M., Regner F., Tureschek E., Glossl J. and Steinkellner H. Identification of microsatellite sequences in Vitis riparia and their application for genotyping of different Vitis species // Genome. 1999. V. 42. P. 367-373.

13. Thomas M.R. and Scott N.S. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphism when analysed as sequence-tagged sites (STSs) // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 86. P. 985-990.

14. Thomas M.R., Matsumoto S., Cain P. and Scott N.S. Repetitive DNA of grapevine: classes present and sequences suitable for cultivar identification // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 86. P. 173-180.

Размещено на Allbest.ru