Сравнительная характеристика функциональных показателей спермы баранов северо-кавказской породы при внесении ее в среды для экстракорпорального оплодотворения

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный аграрный университет

Сравнительная характеристика функциональных показателей спермы баранов северо-кавказской породы при внесении ее в среды для экстракорпорального оплодотворения

Гвоздецкий Николай Алексеевич аспирант кафедры терапии и фармакологии, факультета ветеринарной медицины

Аннотация

Рационное использование интенсивных методов воспроизводства стада позволит повысить продуктивность овец и рентабельность отрасли в целом. Одним из таких методов является экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО). Для успешного проведения процедуры экстракорпорального оплодотворения важным требованием является наличие качественных питательных сред, позволяющих сохранить генетический материал и способствующие дальнейшему развитию зиготы. Основным требованием к средам для спермы является способность сред не вызывать их агглютинацию. Целью нашей работы явился поиск новых методов снижения агглютинации спермиев при подготовке свежеполученной спермы к процессу оплодотворения in vitro. Для ликвидации агглютинации спермиев на этапе подготовки спермы, мы использовали ГЦЖ среду, с последующим снесением семенного материала в среду SOFw, что позволило достичь значительного (практически в 15 раз!) снижения числа связанных сперматозоидов.

По нашему мнению, снижение агглютинации в ГЦЖ буфере связанно со специфическим влиянием входящих в его состав компонентов на спермии. Вывод: Таким образом, предложенный нами метод подготовки свежеполученной спермы для экстракорпорального оплодотворения позволяет достичь резкого снижения агглютинации сперматозоидов, что обеспечит повышение оплодотворяемости яйцеклеток в процессе получения эмбрионов овец in vitro.

Ключевые слова: сперма, агглютинация, экстракорпоральное оплодотворение, бараны, питательные среды.

Введение

Искусственное осеменение (ИО) является важным и эффективным инструментом для генетического улучшения многих хозяйственно полезных качеств овец. Внедрение новых репродуктивных технологий, связанных с использованием процесса экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и получения эмбрионов in vitro является важным направлением в современном животноводстве и активно развивается во всем мире [1,6]. Однако, в настоящее время в России этот метод практически не применяется в связи с его сложностью и отсутствием серьезных научных исследований отечественных ученых в этом направлении.

Одной из проблем, возникающих при выполнении экстракорпорального оплодотворения является качество спермы, используемой для этого процесса. Если при оплодотворении внутри организма животного требуется наличие единичных спермиев в яйцеводе, то при выполнении ЭКО в контакт с клеткой должны вступить миллионы спермиев [3,4]. Одним из важнейших шагов в ЭКО овец является сохранение спермиев либо в жидком или замороженном состоянии. Не смотря на то, что криоконсервация спермиев барана может значительно продлить их срок хранения, остается риск повреждения сперматозоидов вследствие замерзания-оттаивания из-за образования внутриклеточного и внеклеточного льда, холодового шока, химической токсичности криопротекторов, осмотической травмы, оксидативного повреждения и апоптоза, что может привести к серьезному повреждению структуры сперматозоидов и оплодотворяющей способности [2,7]. В ряде случаев причиной низкой фертильности спермиев при проведении ЭКО является повышенная их агглютинация при внесении в культуральную среду.

Агглютинация или склеивание сперматозоидов -- один из показателей спермограммы, который отражает наличие в сперме явления склеивания сперматозоидов и степень этого склеивания. Агглютинация сперматозоидов -- патологическое состояние, являющееся одной из причин мужского бесплодия, однако даже у полностью здорового мужчины может содержаться некоторое количество слипшихся спермиев. В норме спермии несут отрицательный электрический заряд и поэтому отталкиваются друг от друга и от других клеток, при нарушении этого механизма и развивается агглютинация.

Различают два вида этого патологического процесса:

1. Истинная агглютинация - так называется явление склеивания сперматозоидов между собой. Спермии могут склеиваться хвостами, головками или образовывая комплексное слипание головкой и хвостом. Слипшиеся между собой сперматозоиды теряют подвижность и теряют функции, позволяющие им оплодотворить яйцеклетку, в результате развивается мужское бесплодие.

2. Ложная (неспецифическая) агглютинация - процесс слипания сперматозоидов не друг с другом, а с клетками эпителия, макрофагами, частицами разрушенных клеток, слизью и другими составляющими семенной жидкости. Скорость спермиев при этом тоже теряется.

Обычно для подготовки спермы и индукции капацитации используется внесение свежеполученной спермы в раствор SOF wash [6]. Однако при проведении экспериментов нами часто наблюдалась интенсивная агглютинация после попадания спермиев в эту среду, приводящая к крайне низкому выходу зигот в процессе ЭКО. В доступной нам литературе практически не имеется данных о методах предотвращения агглютинации спермиев при проведении процедуры ЭКО с использованием свежеполученной спермы, так как большинство авторов предпочитают использовать для работы свежезамороженный материал [5].

Известен способ приготовления синтетической среды для разбавления и замораживания спермы баранов, включающая лактозу, ксилит, трис-(оксиметил)-аминометан, трилон-б, глицерин, желток куриного яйца, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что среда дополнительно содержит костный клей при следующем соотношении ингредиентов, мас. %: лактоза 6,0, костный клей 1,8, ксилит 0,18, трис-(оксиметил)-аминометан 0,07, трилон-б 0,1, глицерин 4,3, желток куриного яйца 14,2, вода дистиллированная до 100 (8).

Для оплодотворения используется замороженная сперма, что снижает ее качество и эффективность процесса оплодотворения.

Известен способ получения зародышей овец после созревания и оплодотворения ооцитов и культивирования зародышей in vitro, включающий использование свежеполученной спермы барана, 100 мкл которой помещают в 1 мл среды SOF с добавлением 20 мМ HEPES и 8 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 45 минут инкубируют в термостате при 39єС. Далее супернатант в объеме 800 мкл отбирают в новую пробирку, дважды отмывают в 3 мл среды с центрифугированием при 200 оборотах в течение 3 минут. Для оплодотворения используют объем 5 мкл с содержанием сперматозоидов 1 000 000 в мл, который добавляют в каплю среды с добавлением 20 % инактивированной сыворотки овец во время течки объемом 45 мкл, находящуюся под парафиновым маслом из расчета 10 ооцитов в одной капле (9)

Способ имеет ряд недостатков. Для капацитации спермиев используется инактивированная сыворотка крови овец во время течки, добавляемая в среду оплодотворения, что не является оптимальным методом, так как ее состав может существенно варьировать, а это не позволяет стандартизировать условия оплодотворения ооцитов.

Целью нашей работы явился поиск новых методов снижения агглютинации спермиев при подготовке свежеполученной спермы к процессу оплодотворения in vitro.

сперма агглютинация оплодотворение эмбрион

1. Материалы и методы

Исследования проводились на базе лаборатории вспомогательных репродуктивных технологий Научно - диагностического и лечебного ветеринарного центра ФГБОУ ВПО Ставропольский государственный аграрный университет в период с января по май 2014 года.

Объектом исследования служили бараны северо-кавказcкой породы в возрасте 2 - 3 лет в количестве 10 голов. Получение спермы проводили у каждого животного два раза в неделю с интервалом в 2 дня. Всего было выполнено 10 экспериментов. Сперму получали в манеже пункта искусственного осеменения уретральным методом, используя искусственную вагину. Микроскопическую оценку качества спермы на разных этапах исследования проводили при помощи микроскопа «Микмед-2» (ЛОМО, Россия) согласно методическим рекомендациям (С. И. Новопашина, 2013).

Для подготовки спермы к оплодотворению мы использовали разработанную нами комбинированную методику, согласно которой предварительно сперма вносится в глюкозо-цитратно - желточный разбавитель (ГЦЖ), приготовленный по ГОСТ 14746 - 69 (глюкоза медицинская безводная - 30,0 г., натрий лимоннокислый трехзамещенный, пятиводный - 14,0 г., желток куриного яйца - 200,0 мл., спермосан 3 - 750 - 900 тыс.ед., вода дистиллированная - 1000,0 мл). После чего переносится в среду SOF wash, приготовенную без глюкозы и глютамина (Cognie Y., Baril G., Poulin N., Mermillod P., 2003) с добавлением 6 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0,2 мг/мл кофеина и гепарина 50 мкг/мл.

Мы сравнивали подготовку спермы по двум методам: 1) с использованием ГЦЖ среды перед внесением в SOF w; 2) без использования ГЦЖ среды перед внесением в SOF w.

Методика с использованием ГЦЖ среды была выполнена следующим образом: в пробирку типа эппендорф (2 мл) вносили 450 мкл ГЦЖ среды и 50 мкл свежеполученной спермы, тщательно перемешивали. Затем центрифугировали 3 минуты при 200 G, удаляли супернатант и ресуспендировали в 200 мкл свежей ГЦЖ среды. Пробирку помещали в термостат на 15 минут (Т = 38,5 С; 5% СО2) для выполнения процедуры swim up. Технология swim-up необходима в целях удаления семенной плазмы и получения максимально полноценной фракции прогрессивно подвижных спермиев ( Irvine et al, 2000 ; Zini et al, 1993 , 2009 ). Погибшие и агглютинировавшие спермии оседают на дно пробирки, а активные находятся в верхнем слое надосадочной жидкости (Henkel et al., 2003). В это же время происходит капацитация, то есть приобретение спермиями оплодотворяющей способности (Л. В. Голубец и др., 2010). После инкубации надосадочную жидкость, содержащую живые спермии, отбирали и переносили в пробирку, содержащую 200 мкл среды SOF w. Пробирку помещали в термостат на 15 минут для повторения процедуры swim up. После чего проводили оценку качества сперматозоидов.

Методика без использования ГЦЖ среды была выполнена следующим образом: 50 мкл свежеполученной спермы сразу вносили в пробирку, содержащую 450 мкл среды SOF w, как это описано в статье ( Henkel et al., 2003). Центрифугировали 3 минуты при 200 G. Затем удаляли супернатант и ресуспендировали в 200 мкл среды SOF w. Пробирку помещали в термостат на 15 минут (swim up). После чего проводили оценку качества сперматозоидов.

Статистическую обработку результатов выполняли с помощью критерия Стьюдента в программе «Primer of Biostatistic 3. 01» для Windows на IBM совместимом компьютере. Достоверными считали различия при p<0.05.

2. Результаты исследований и обсуждение

Результаты оценки параметров спермы сразу после получения и при различных условиях подготовки к ЭКО приведены в таблице 1.

Таблица 1. Сравнительная характеристика функциональных показателей спермы баранов применяемых для эко при использовании различных сред

Примечание: * - различия со спермой, внесенной сразу в SOF w достоверны при р< 0,05; # - различия со спермой до проведения процедуры swim-up достоверны при р< 0,05.

Также отмечено, что после процедуры swim up в среде SOF w активность сперматозоидов, не подвергшихся агглютинации увеличилась на 0,8 балла. В SOF w + ГЦЖ среде активность достоверно не изменилась и осталась высокой.

При сравнении степени агглютинации установлено, что при помещении сперматозоидов сразу в среду SOF w агглютинация на 59,4% больше, чем при помещении спермиев предварительно в ГЦЖ-среду (Рис.1).

Рис. 1. Агглютинация сперматозоидов.

Однако отмечено, что после процедуры swim up в среде SOF w агглютинация снижается на 15,5 %, а в SOF w + ГЦЖ среде увеличивается на 1,4 %. Но анализ абсолютных значений показателя агглютинации показывает, что после процедуры swim up агглютинация в среде SOF w + ГЦЖ в 15 (!) раз меньше, чем при помещении спермиев сразу в среду SOF w.

В связи с этим, возможно авторами и не уделялось такого внимания агглютинации, так как они использовали сперму замороженную, то есть, прошедшую этап подготовки в разбавителе. Однако мы считаем, так же, как ряд зарубежных исследователей, что предпочтительной является работа со свежей спермой потому, что количество активных спермиев в ней значительно выше, чем в замороженной сперме (L. O'Hara., J et al., 2009). Спермии в свежеполученной сперме обладают большей оплодотворяющей способностью, чем в заморожено - оттаянной (Watson, 2000; Niu et al., 2006). Жизнеспособность спермиев после криоконсервации и оттаивания снижается с 85,6 до 34,3 % (Hiemstra et al., 2005; Marco - Jimenez et al., 2006). Тем более после криоконсервации может быть изменен механизм процесса капацитации, что существенно влияет на фертильность сперматозоидов (Maxwell and Watson, 1996; Morrier et al., 2002).

Для ликвидации агглютинации спермиев на этапе подготовки спермы мы использовали ГЦЖ среду, с последующим снесением семенного материала в среду SOFw, что позволило достичь значительного (практически в 15 раз!) снижения числа связанных сперматозоидов. По нашему мнению снижение агглютинации в ГЦЖ буфере связанно с со специфическим влиянием входящих в его состав компонентов на спермии.

Вывод: Таким образом, предложенный нами метод подготовки свежеполученной спермы для экстракорпорального оплодотворения позволяет достичь резкого снижения агглютинации сперматозоидов, что обеспечит повышение оплодотворяемости яйцеклеток в процессе получения эмбрионов овец in vitro.

Список литературы

1. Багиров В.А. /Фертильность сперматозоидов и состояние хроматина /Сельскохозяйственная биология. - 2012. - №2. - с. 3 - 12.

2. Дьяконов Л.П. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии). / Под общ. ред. проф. Дьяконова Л.П. - М.: Издательство «Спутник+», 2009. - 656 с.

3. Salamon, S. Storage of ram semen / S. Salamon, W.M.C. Maxwell // Animal Reproduction Science. - 2000. - № 69. - р. 77-111.

4. Cognie, Y. Current status of embryo technologies in sheep and goat / Y. Cognie, G. Baril, N. Poulin, P. Mermillod // Theriogenology. - 2003. - № 59. - p. 171-188.

5. Трухачев В.И., Трансплантация зародышей у овец/ В.И. Трухачев, В.Я. Никитин, В.М. Михайлюк, Н.В. Белугин, Н.А. Писаренко, В.С. Скрипкин. // Российский Ветеринарный Журнал. М.: КолосС. 2007. 36 с.

6. Пат. 2525714 Российская Федерация, МПК:A01K67/02, A61D19/04. Способ получения эмбрионов овец in vitro/ Трухачев В.И., Криворучко А.Ю., Беляев В.А., Квочко А.Н., Шахова В.Н.; заявитель и патентообладательФГБОУ ВО "Ставропольский государственный аграрный университет». - № 2013121616/10 ; заявл. 07.05.2013 ; опубл. 20.08.2014, Бюл. № 23. - 19 с.

7. Watson A.D., Berliner J.A., Hama S.Y., et al. Protective effect of high density lipoprotein associated paraoxonase. Inhibition of the biological activity of minimally oxidized low density lipoprotein. //- J Clin Invest. - 1995. Dec; 96(6): 2882-91.

8. Пат. 2436299 Российская Федерация, МПК: A01N 1/02 , A61D 19/02, C12N 5/02. Среда для криоконсервации спермы козлов/ Аксенова П.В., Айбазов А.-М. заявитель и патентообладатель Ставропольский научно-исследовательский институт животноводства и кормопроизводства Российской академии. - № 2010118373/13; заявл. 06.05.2010 ; опубл. 20.12.2011. - 9 с.

9. The Effect of Macromolecule Source and Type of Media During in vitro Maturation of Sheep Oocytes on Subsequent Embryo Development. / A. Shirazi, M. A. Ardali, E. Ahmadi, H. Nazari., M. Mamuee, B. Heidari. // J. Reprod. Infertil. - 2012. Vol. 13, № 1. - Р. 13-19.

Размещено на Allbest.ru